JPH04208298A - 新規ペプチドおよびこれを含有する抗アレルギー剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規ペプチドおよびこれを含有する抗アレル
ギー剤に関する。

従来の技術および発明が解決しようとする課題生体は、
非自己を認識し、排除することによって、自身を防御し
ている。即ち、異物の一部を抗原として認識し、抗原に
対する抗体を産生ずる。

産生された抗体は、新たに侵入してくる抗原と反応し、
抗原・抗体複合体を形成し、異物は排除される。このよ
うな抗原抗体反応が逆に生体に対して不都合な反応とな
って、自己の組織に障害を引き起こす場合を、一般にア
レルギーと称している。

アレルギー反応は、その機構に基づいてＧｅ１ｌとＣｏ
ｏｉｂｓによって４つの型に分類されている（Ｒ，Ｒ。

Ａ’、　Ｃｏｏｍｂｓ　ａｎｄ　Ｐ、Ｇ、！（、Ｇｅ１
ｌ、”Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｓｐｅｃｔｏｆ　ｊｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ”、　ａｄ、　ｂｙ　Ｐ、Ｇ、Ｈ，Ｇｅ１
ｌ　ａｎｄ　Ｒ，Ｒ。

Ａ、　Ｃｏｏｍｂｓ、　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅ
ｎｔ、、　Ｐｕｂｌ、、　０ｘｆｏｒｄ。

１９６８、ρ、５７５）。■型からＩＩＩ型までは抗原
と液性抗体との反応に基づいており、短時間で起こるの
で即時型アレルギーといい、ＩＶ型は細胞性免疫による
もので比較的ゆっくりした反応であり、遅延型アレルギ
ーと呼ばれている。このうち、１型アレルギーは、アレ
ルギーの代表的なものであり、この型に属する疾患とし
て、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー（
じんましん、腸管アレルギーなど）などが挙げられる。

これらのアレルギー性疾患は、近年、その患者数が急増
し、社会的な問題にもなっている。

Ｉ型アレルギー反応は、アレルギーの原因物質となる抗
原（アレルゲン）に対する免疫グロブリンＥ　（Ｉｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｅ＋　ＩｇＥＪ抗体と組織中
の肥満細胞及び血中の好塩基球表面上に存在するＩにＥ
レセプターが結合することが基本となる。即ち、アレル
ゲンが生体に侵入すると、それに対するｉ＞、Ｅ抗体が
、Ｂ細胞から産生され、肥満細胞や好塩基球表面上のＩ
ｇＥレセプターに結合する。ＩｇＥレセプターに結合し
たＩｇ’Ｅに再侵入してくる多価のアレルゲンが結合し
、これを介していくつかのＩ　’ｇ　Ｅ分子が架橋化さ
れる。これが引き金となって、レセプター分子間になん
らかの相互作用が生じ、細胞膜内の酵素系の活性化が起
こる。その結果、肥満細胞や好塩基球中に存在する顆粒
の脱顆粒現象が起こり、それに伴って、顆粒内に存在す
るヒスタミン、ＳＲ５−Ａ（ｓｌｏｗ−ｒｅａｃｔｉｎ
ｇ　５ｕｂｓｔａ’ｎｃｅ　ｏｆａｎａｐｈｙｌａ’ｘ
ｉｓ）、血小板活性化因子等の化学伝達物質が細胞から
放出され、血管透過性の元通、平滑筋の収縮、分泌機能
の元通などをきたし、種々のアレルギー性疾患が惹起さ
れると考えられている。

従って、肥満細胞や好塩基球からのヒスタミンの遊離を
抑制することによって、アレルギーの発症を妨げること
ができると考えられる。

このような考えに基づいたアレルギー疾患の治療薬とし
ては、クロモグリク酸ナトリウム等の化性伝達物質遊離
抑制剤、１，３−ジメチルキサンチンｉのヒスタミン活
性抑制剤等々が一般的に用いられている。しかし、これ
らの使用には副作用や投与法等で制限があり、副作用の
少ない安全性の高い薬剤の開発が重要となっている。

課題を解決するための手段 前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明者
らは、知られている免疫グロブリンＥの一次構造を基本
とし、その部分アミノ酸配列を有するペプチドおよびそ
の誘導体を種々検討し、下記ペプチドを新規に合成する
ことに成功し、かつ、抗アレルギー剤として優れている
ことを見出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発
明は、下記構造式のいずれかで示される新規ペプチドお
よびその塩で、これらの少なくとも一種を有効成分とし
て含有子る抗アレルギー剤である。

Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−ｅｕｌｌｅ 、ａｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
＾ｒｇ−Ｔｈｒ−ＬｅｕＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−＾５ｐＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＡｓｐＧ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ 本発明のペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる液
相法または固相法で製造される。即ち。

ペプチド結合の任意の位置で二分される二種のフラグメ
ントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原
料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を
有する原料をＤＣＣ法、活性エステル法などを用いて縮
合させ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保
護基を除去させることによってｇ造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の、保護基として
は、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオ
キシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボ
ニルなどが挙げられる。

カルボキシル基の保護基としては、例えば、アルキルエ
ステル、ベンジルエステルなどを形成し得る基が挙げら
れる。固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロ
ルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、４−（オキシメチル
）フェニルアセタミドメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベン
ジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、ジシクロへキシルカルボジイミド等の縮合
剤の存在下か、或いは、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル
またはペプチド活性エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合
は、さらに、ペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断す
る。

さらに、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製され
る。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体
クロマトグラフィー、アフイニテイ酸または有機酸と処
理することにより、塩類に導くことができる。これらの
塩類としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩
、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及び酢酸塩、トリフル
オロ酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、
酒石酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、Ｐ−）ルエン
スルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。さらに、アル
カリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、或いは、有
機塩基と処理することによっても、塩類に導くことがで
きる。例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム
塩、Ｌｙｓ塩などが挙げられる。

本発明のペプチドまたはその塩は、優れた抗アレルギー
作用を示すので、抗アレルギー剤として気管支喘息、ア
レルギー性鼻炎、じんましん、アトピー性皮膚炎、湿疹
、アレルギー性眼炎のようなアレルギー疾患の予防並び
に治療に使用することができる。

本発明のペプチドまたはその塩の投与経路としては、経
口投与、非経口投与、直腸内投与あるいは局所投与のい
ずれでもよいが、経口投与または局所投与が好ましい。

本発明のペプチドまたはその塩の投与量は、化合物の種
類、投与方法、患者の症状・年齢等により異なるが、通
常１回０．Ｏ１〜１０００　ｍｇ、好ましくは１〜１０
０　Ｂを１日当たり１〜３回である。本発明のペプチド
またはその塩は通常、製剤用担体と混合して調製した製
剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野に
おいて常用され、かつ本発明のペプチドまたはその塩と
反応しない物質が用いられる。具体的には、例えば、乳
糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキ
ストリン、デンプン、白糖、メタケイ酸アルミン酸マグ
ネシウム、合成ケイヒ酸アルミニウム、結晶セルロース
、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシ
プロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシ
ウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、
アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換
度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ−〜４ キシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン
、ポリビニルアルコール、軟質無水ケイヒ酸、ステアリ
ン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト
、ビーガム、カルボキシビニルポリマー、酸化チタン、
ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、
グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン
、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、
植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワ、セリン、フル
オロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコ
ール、水等が挙げられる。剤型としては。

錠剤、カプセル剤１、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁
剤、半開、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤
、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って
調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水また
は他の適当な媒体に溶解または懸濁する形であってもよ
い。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングして
もよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドまたはそ
の塩く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドまたはその塩を０．
２％以上、好ましくは０．５〜７０％の割合で含有する
ことができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある他
の成分を含有していてもよい。

叉膏貫 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

なお、本発明細帯中で用いた略号は、次の意味を有する
。

Ａｒｇ　　アルギニン Ａｓｐ　　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン １１ｅ　　イソロイシン Ｌ　ｅ　ｕ　　ロイシン Ｌｙｓ　　リジン Ｓｅｒ　　セリン Ｔｈｒ　　スレオニン Ｂｏｃｔ−ブチルオキシカルボニル基 Ｂｕｔｔ−ブチル基 Ｆｍｏｃ　　フルオレン−９−イルメトキシカルボニル
基 Ｍｔｒ　　４−メトキシ−２，３，６，−トリメチルベ
ンゼンスルホニル基 ＤＭＦ　　Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドＨＯＢｔ　　
ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールＥＤＴＡ　　エチレ
ンジアミン４酢酸 なお、アミノ酸は全てＬ型を使丁した。

実施例Ｉ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ’ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ４ｙｓ−＾
ｒｚ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−’Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｌｅｕ−１
１ｅ Ｆｍｏｃ−ｒｌｅ樹脂　（Ｆｍｏｃ−１１ｅが０．５３
ミリモル／ｇ樹脂の割合で導入されているｐ−アルコキ
シベンジルアルコール樹脂）　５７０　ＩＩＩｇを、半
自動式固相法ぺ一″ Ｐｍｏｃ−１１ｅ樹脂を膨潤させた。

これを、以下のＦｍｏｃ基除去サイクルに付した。

ａ）　ＤＭＦ　２０　ｍｌ中、１分間振とう後、口過し
た（２回）。

ｂ）２０％ピペリジン−〇ＭＦ溶液２０ＩＩ１１中、３
分間振どう後、口過した。

ｃ）２０％ピペリジン−〇ＮＦ溶液２０　ｍｌ中で１０
分間振とう後、口過して、Ｆｉｏｃ基を脱離した。

；３ ｄ）　ＤＭＦ　２０　ｍｌ　で２回洗浄。

ｅ）イソプロパツール２０　ｍｉ　で２回洗浄。

ここで、Ｋａｉｓｅｒ法［Ｅ、Ｋａｉｓｅｒ法　ｅｔ　
ａｌ、、　Ａｒ＋ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　３４．５９５　（１９７０）コに
より、Ｆｉｏｃ基が完全に除去されたことを確認した（
もし、不完全ならば上記の除去サイクルを繰り返した）
。完全に除去されているならば、以下に示す合成サイク
ルに供した。

ｆ）　Ｆｍｏｃ基除去サイクルで得られたＨ−１１ｅ樹
脂をＤＭＦ　２０ＩＩ１１で２回振とうすることによっ
て膨潤させた。

；ｉ）　Ｆｉｏｃ−Ｌｅｕ（３４８ＩＩＩｇ、　Ｏ’−
９ミリモル）　、ｌｌ０Ｂ七１４６ＩＩ１ｇ、１．０８
ミリモル）の０にＦ溶液（２０ｍｌ）を加え、１分間振
とうした。

ｈ）　Ｉ　Ｍ　ジシクロへキシルカルボジイミド／塩化
メチレン溶液０．９９　ｍｌを添加し、７０分間振とう
した。

ｉ’）　ＤＭＦ　２０’ｍｌ　で２回洗浄。

ｊ）イソプロパツール２０　ｍｌで２回洗浄。

ここで、Ｋａｉｓｅｒ法法によって縮合が完了している
か否かを確認した（もし、不完全ならば、上記の縮合サ
イクルを繰り返した）。完全に縮合が完了していること
を確認し、続いて、Ｆｍｏｃ基除去サイクルに供した後
、ｇ）ステップをＦｍｏｃ−５ｅｒ（Ｂｕｔ）で行う縮
合サイクルに付した。以後、同様に、Ｆｍｏｃ基除去サ
イクルとＦｍｏｃアミノ酸縮合サイクルを繰り返してＴ
ｈｒ（Ｂｕｔ）、　Ｌｅｕ、　Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）、　Ａ
ｒｇ（Ｍｔｒ）。

Ｌｙｓ（Ｂｏｅ）＋　Ａｓｐ（ＯＢｕ’）、　Ｌｙｓ（
ＢｏＣ）、　Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）。

Ｇｌｕ（ＯＢｕＬ）＋　Ｇｌｕ（ＯＢｕＬ）を順次縮合
した。こうして得られたＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）
−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−〜ｅ）の
Ｆｍｏｃ基除去サイクルに付した後、樹脂からのａ離工
程に供した。

即ち、塩化メチレン２０ｍ１で２回洗浄し、塩化メチレ
ン（１０ｍｌ）−アニソール（２，００ｌ１ｌ）−チオ
フェノール（０，６ｍ１）混合溶液に懸濁、続いて、ト
リフルオロ酢酸（２０ｍｌ）−塩化メチレン（２，４ｍ
ｌ）を加え１時間振とうした。樹脂を０去し、得られた
０液にエーテルを加え口過し、エーテルで２回洗浄次い
で、にｔｒ基を完全に脱離するためにこの白色粉末を、
トリフルオロ酢酸（１３，５ｍｌ）−チオアニソール（
１，５ｍｌ）−チオフェノール（０，５ｍｌ、）混合溶
液に溶解し、５時間攪拌した。この反応溶液に、エーテ
ルを加え口過し、２回エーテルで洗浄することによって
白色粉末（５１０ｍｇ）を得た。得られた白色粉末を分
取用逆相液体クロマトグラフィーに供し、求めるＧｌｕ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１６画分
を分取し、得られ、た溶出画分を濃縮乾固した。ついで
、蒸留水を加え数回濃縮乾固を繰り返した後、少量の蒸
留水にとかし、凍結乾燥した。こうして精製されたＧｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−丁ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ　
２１４　ｍｇを得た（収＄　４５．７％）。

精製物の一部をとり、気相プロテインシークエンサーで
アミノ酸配列を調べたところＧｌｕ、　Ｇｌｕ。

Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ、　Ａｓｐ、　Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、　
Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、　Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ。

Ｌｅｕ、Ｉｌｅの順となり求めるペプチド配列と一致し
た。また、ＦＡＢ質量分析器による分子量測定において
、ｍ／ｚ　１５６１　［Ｍ＋Ｈ］＋となり理論値（１５
６１）に−致した。さらに、６Ｎ−ＨＣＩ水溶液で加水
分解し、アミノ酸分析に供したところＡｓｐ　１．０６
．　Ｔｈｒ　１．９２゜Ｓｅｒ　　Ｏ，８７，Ｇｌｕ　
　２．８５．　　Ｉｌｅ　　１．０３．　　Ｌｅｕ　　
２．０９．　　Ｌｙｓ２．１１．Ａｒｇ　１．０５の比
となり、理論値と一致した。

また、薄層クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラ
フィーで単一であることを確認した。

実施例１同様の反応、処理を行ない下記の実施例２〜５
のペプチドを合成した。

実施例６ 健常人男性から採血した末梢血５０ｍ１に、採血直後に
０．　Ｉ　Ｍ　ＥＤＴ４４　ｍｌを加えた。この血液に
６％デキストラン−３％　グルコース生理食塩水溶液１
２．５ｍＭを加えて混和したのち、室温で６０分間静置
した。分取した上層を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分
離して得た沈さ（白血球）をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（
ｐＨ７，６，２５ｍＭ）リス、１２０ｍＷＮａｉｌ、５
ｍＭＫＣｌ、４ｍにＥＤＴＡおよび０．０３％　ヒト血
清アルブミンを含有）で１回、トリス−Ａ緩衝液（ｐＨ
７，６，２５ｍＭトリス、　１２０　ｍＭ　ＮａＣ１，
５ｍＭ　ＫＣＩおよび０．０３％　ヒト血清アルブミン
を含有）で２回洗浄した後、トリス−ＡＣＭ緩衝液（ｐ
Ｈ７，６，２５ｍＭ）リス、１２０ｍＭＮａＣ１，、５
ｍＮ　ＫＣＩ、　１　ｍＭ　ＪＣ１２，ｏ、ｓ　ｍＭ　
ＣａＣｌ２および０，０３％　ヒト血清アルブミンを含
有）で１〜１０ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度の細胞浮遊液を
調整した。この細胞浮遊液１＋＋＋１に被検化合物の水
溶液の１００μｍを添加して３７°Ｃで１２０分間イン
キュベートしたのち、抗ヒトＩｇＥヒツジ抗体（１：１
．２ｘｌＯ’　、　ＩＩＣＪａｐａｎ）１００μｌを加
えてさらに４５分間インキュベートした。

水冷により反応を停止し、１１０００ｒｐで８分間遠心
分離した。その上滑１ｍｌに６０％過塩素酸溶液２５μ
ｌを加えて激しく振とうしたのち３０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し、その上清中のヒスタミン濃度を３ｉＨ
ｇａｎｉａｎの蛍光法［Ｒ，Ｐ、　Ｓｉｒａｇａｎｉａ
ｎ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５７．３８３（１９７４）］で測
定した。被検化合物のヒスタミン遊離抑制率は、対照１
＃（被検化合物無添加で抗ヒトＩｇＥヒツジ抗体添加群
）との比較により算出し、本発明のペプチドについての
抑制率を表１に示す。

表　　１ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１
ｅ　　　９０．６Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−＾
５ｐ−Ｌｙｓ−ＡｒＫ−Ｔｈｒ４ｅｕ　　　　　　　７
０．０ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ　　　　９２
．５Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　　　　
９０．４表１の結果より、本発明のペプチドは、ヒスタ
ミン遊離抑制作用を有するという知見を得た。

発明の効果 以上の結果から、本発明の新規ペプチドは、抗アレルギ
ー剤として有用であり、本発明は医薬産業上型−である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記構造式のいずれかで示されるペプチドおよびそ
   の塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、下記構造式のいずれかで示されるペプチド、または
   、その医薬上許容される塩を有効成分として含有する抗
   アレルギー剤。 ▲数式、化学式、表等があります▼