JPH04117292A - クローニングベクタープラスミド、それから誘導されるベクタープライマー及びそれを用いたｃＤＮＡバンクの作製方法 - Google Patents
クローニングベクタープラスミド、それから誘導されるベクタープライマー及びそれを用いたｃＤＮＡバンクの作製方法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、多機能を有するクローニングベクター、それ
から誘導されるベクタープライマー及びそれを用いたｃ
ＤＮＡバンクの作製方法に関する。この方法により、医
薬として有用なタンパク質を大量に生産するために利用
できるｃＤＮＡを容易に得ることが出来る。
から誘導されるベクタープライマー及びそれを用いたｃ
ＤＮＡバンクの作製方法に関する。この方法により、医
薬として有用なタンパク質を大量に生産するために利用
できるｃＤＮＡを容易に得ることが出来る。
［従来の技術］
我々の体の細胞を構成するタンパク質は、細胞骨格とし
て、反応の触媒として、あるいは情報伝達の媒体として
生命を司る上で中心的な役割を有している。従って、新
しいタンパク質を発見し、その構造と機能を解明するこ
とは生命を知る上で重要であるばかりでなく、医薬や診
断薬として用いる上でも重要である。これまで我々の体
の中で機能しているタンパク質を医薬として用いようと
する試みは数多く行なわれてきたが、目的とするタンパ
ク質を大量に調製することが困難なため。
て、反応の触媒として、あるいは情報伝達の媒体として
生命を司る上で中心的な役割を有している。従って、新
しいタンパク質を発見し、その構造と機能を解明するこ
とは生命を知る上で重要であるばかりでなく、医薬や診
断薬として用いる上でも重要である。これまで我々の体
の中で機能しているタンパク質を医薬として用いようと
する試みは数多く行なわれてきたが、目的とするタンパ
ク質を大量に調製することが困難なため。
限られた物しか実用化されていなかった。ところが最近
の遺伝子工学の目覚ましい発達のおかげで、ヒト由来の
タンパク質をコードしている遺伝子を取り出し、それを
用いて細菌や動物細胞内でそのタンパク質を大量に発現
させる事が出来るようになった。すでにこのような手法
で多くのタンパク質が医薬としての開発段階に入ってい
る。
の遺伝子工学の目覚ましい発達のおかげで、ヒト由来の
タンパク質をコードしている遺伝子を取り出し、それを
用いて細菌や動物細胞内でそのタンパク質を大量に発現
させる事が出来るようになった。すでにこのような手法
で多くのタンパク質が医薬としての開発段階に入ってい
る。
ヒトのタンパク質は、我々の体内で機能しているので、
どれもが医薬として利用できる可能性を秘めている。ま
た多くの遺伝病は重要な機能を有しているタンパク質の
欠損によって起こる事が知られている。従って、未知の
ヒトタンパク質を大量に生産してその機能を明らかにし
、さらには疾患との関連性を明らかにすることは、今後
の医薬開発に於て重要なステップとなる。そこで従来ど
おり目的とする活性を有するタンパク質の精製から始め
ようとすると、材料を大量に入手する必要があるため多
（の時間と労力を要する。そこで本発明者らは、遺伝子
から攻める戦略を採ることにした。すなわち、タンパク
質のアミノ酸配列情報はゲノム遺伝子上にコードされて
おり、ｍＲＮＡに転写された後タンパク質に翻訳される
ので、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、得られた全
てのｃＤＮＡバンクを作製し、その後これらのタンパク
質の性質を明らかにして行こうとする計画である。
どれもが医薬として利用できる可能性を秘めている。ま
た多くの遺伝病は重要な機能を有しているタンパク質の
欠損によって起こる事が知られている。従って、未知の
ヒトタンパク質を大量に生産してその機能を明らかにし
、さらには疾患との関連性を明らかにすることは、今後
の医薬開発に於て重要なステップとなる。そこで従来ど
おり目的とする活性を有するタンパク質の精製から始め
ようとすると、材料を大量に入手する必要があるため多
（の時間と労力を要する。そこで本発明者らは、遺伝子
から攻める戦略を採ることにした。すなわち、タンパク
質のアミノ酸配列情報はゲノム遺伝子上にコードされて
おり、ｍＲＮＡに転写された後タンパク質に翻訳される
ので、このｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、得られた全
てのｃＤＮＡバンクを作製し、その後これらのタンパク
質の性質を明らかにして行こうとする計画である。
ヒトのゲノム上には、約ｌＯ５個程度の遺伝子が存在し
ていると考えられている。従ってヒトのタンパク質の種
類もその程度と見積られている。
ていると考えられている。従ってヒトのタンパク質の種
類もその程度と見積られている。
最近ヒトのゲノム遺伝子の全配列を決定しようとする計
画が世界的なレベルで討議されている。もしこれが実現
すれば、ヒトのタンパク質の全配列も解明されることに
なると期待されている。しかし現実には、一つのタンパ
ク質をコードしている遺伝子はエキソンとイントロンか
らなり、ゲノムの塩基配列だけからタンパク質のアミノ
酸配列を決定するには無理がある。細胞内ではゲノム上
の遺伝情報はｍ ＲＮ Ａに読み取られた後、ｍＲＮＡ
からイントロンの部分がプロセスされ、エキソン部分の
みからなるｍＲＮＡがリポソーム上でタンパク質に翻訳
される。従って、この段階のｍＲＮＡの塩基配列を決定
できればそれがコードしているタンパク質のアミノ酸配
列も決定できることになる。遺伝子組換え技術は、ｍＲ
ＮＡをｃＤＮＡに変換しこれを大腸菌に導入することを
可能にした。
画が世界的なレベルで討議されている。もしこれが実現
すれば、ヒトのタンパク質の全配列も解明されることに
なると期待されている。しかし現実には、一つのタンパ
ク質をコードしている遺伝子はエキソンとイントロンか
らなり、ゲノムの塩基配列だけからタンパク質のアミノ
酸配列を決定するには無理がある。細胞内ではゲノム上
の遺伝情報はｍ ＲＮ Ａに読み取られた後、ｍＲＮＡ
からイントロンの部分がプロセスされ、エキソン部分の
みからなるｍＲＮＡがリポソーム上でタンパク質に翻訳
される。従って、この段階のｍＲＮＡの塩基配列を決定
できればそれがコードしているタンパク質のアミノ酸配
列も決定できることになる。遺伝子組換え技術は、ｍＲ
ＮＡをｃＤＮＡに変換しこれを大腸菌に導入することを
可能にした。
これによって１個のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含む
プラスミド即ちｒｃＤＮＡベクター」が得られ、これら
のｃＤＮＡベクターを含む大腸菌からなる集団、すなわ
ちｒｃＤＮＡライブラリー」が作製できる。もしこのよ
うにして得られた全ｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定
すれば、細胞内に存在する全ｍ ＲＮ Ａの塩基配列、
すなわち細胞内で合成されている全タンパク質のアミノ
酸配列を決定出来ることになる。このようにして塩基配
列の決定されたｃＤＮＡ集団をｒｃＤＮＡバンク」と呼
ぶことにする。もし得られたｃＤＮＡベクターを適当な
動物細胞に導入して発現出来れば、その発現産物を用い
て活性のスクリーニングを行なうことが出来る。すなわ
ち、このような戦略を用いれば一次構造の解った、しか
も０甫乳動物細胞内で発現可能なヒトのタンパク質のｃ
Ｄ＼Ａバンク（［ホモ・プロティンＪ ｃＤＮＡバンク
）を作製することか可能となる。なお、ここではヒトを
例にあげたが、他の動物や植物について同様のｃＤＮＡ
バンクが作製できれば、その私用価値はヒトの場合と同
様に大きい。
プラスミド即ちｒｃＤＮＡベクター」が得られ、これら
のｃＤＮＡベクターを含む大腸菌からなる集団、すなわ
ちｒｃＤＮＡライブラリー」が作製できる。もしこのよ
うにして得られた全ｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定
すれば、細胞内に存在する全ｍ ＲＮ Ａの塩基配列、
すなわち細胞内で合成されている全タンパク質のアミノ
酸配列を決定出来ることになる。このようにして塩基配
列の決定されたｃＤＮＡ集団をｒｃＤＮＡバンク」と呼
ぶことにする。もし得られたｃＤＮＡベクターを適当な
動物細胞に導入して発現出来れば、その発現産物を用い
て活性のスクリーニングを行なうことが出来る。すなわ
ち、このような戦略を用いれば一次構造の解った、しか
も０甫乳動物細胞内で発現可能なヒトのタンパク質のｃ
Ｄ＼Ａバンク（［ホモ・プロティンＪ ｃＤＮＡバンク
）を作製することか可能となる。なお、ここではヒトを
例にあげたが、他の動物や植物について同様のｃＤＮＡ
バンクが作製できれば、その私用価値はヒトの場合と同
様に大きい。
上述した戦略の成否の鍵を握っているのはｃＤＮＡライ
ブラリーの質である。従来法に従ってｃＤＮＡを合成し
た場合、それをシーケンスしたり、それをプローブとし
て用いて完全長のクロンをスクリーニングしたり、ある
いはそのｃＤＮＡを発現させたりするには、ｃ ＤＮＡ
を含む断片を一度ベクターから切り出した後、そのまま
用いるかあるいはそれぞれの目的にあったベクターにサ
ブクローニングする必要があった。しかし数多くのクロ
ーンに於てこのような操作をすることは多大の労力と時
間を要するので、最初に作製したｃＤＮＡベクター上で
これらの操作を全て行なえる方法が望まれる。すなわち
、このようなｃＤＮＡベクターに最低要求される条件は
、ｌ）挿入方向の決まったしかも完全長のｃＤＮＡクロ
ーンを含むこと、２）シーケンスが容易であること、３
）プローブを容易に調製できて各種スクリーニングが可
能であること、４）インビトロあるいはインビボの系で
発現可能であることの４つである。なお１）で云う「完
全Ｊ ｃ Ｄ Ｎ Ａクローン」とは、厳密な意味では
鋳型となるｍＲＮＡと完全に同じ５０末端から始まりポ
リＡテールまでを含むｃＤＮＡクローンを意味するが、
この明細書ではｍＲＮＡ上でタンパク質をコードしてい
る部分を全て含むｃＤＮＡクローンの意味で使用する。
ブラリーの質である。従来法に従ってｃＤＮＡを合成し
た場合、それをシーケンスしたり、それをプローブとし
て用いて完全長のクロンをスクリーニングしたり、ある
いはそのｃＤＮＡを発現させたりするには、ｃ ＤＮＡ
を含む断片を一度ベクターから切り出した後、そのまま
用いるかあるいはそれぞれの目的にあったベクターにサ
ブクローニングする必要があった。しかし数多くのクロ
ーンに於てこのような操作をすることは多大の労力と時
間を要するので、最初に作製したｃＤＮＡベクター上で
これらの操作を全て行なえる方法が望まれる。すなわち
、このようなｃＤＮＡベクターに最低要求される条件は
、ｌ）挿入方向の決まったしかも完全長のｃＤＮＡクロ
ーンを含むこと、２）シーケンスが容易であること、３
）プローブを容易に調製できて各種スクリーニングが可
能であること、４）インビトロあるいはインビボの系で
発現可能であることの４つである。なお１）で云う「完
全Ｊ ｃ Ｄ Ｎ Ａクローン」とは、厳密な意味では
鋳型となるｍＲＮＡと完全に同じ５０末端から始まりポ
リＡテールまでを含むｃＤＮＡクローンを意味するが、
この明細書ではｍＲＮＡ上でタンパク質をコードしてい
る部分を全て含むｃＤＮＡクローンの意味で使用する。
現在ｃＤＮＡ作製法として最も広く使用されている方法
は、以下に示すＧｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｅ
ｎｅ２５：２６３−２６９ ｆ１９８３１］である。こ
の方法では、まず細胞から単離したポリ（Ａ） ＲＮ
Ａを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとして逆転写酵
素により第１鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで大腸菌ＲＮ
ａｓｅＨ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡ
リガーゼにより第２鎖を合成する。得られた２本領ｃＤ
ＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、適
当なオリゴヌクレオチドリンカーを付加し、ファージベ
クターやプラスミドベクターに挿入した後大腸菌の形質
転換を行なう。この方法では、第２鎖ＤＮＡを合成する
ときｍＲＮＡの５ 末端に相当する部分をブライマーと
して用いていることや、ＤＮＡポリメラーゼ■やＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性のため末端
の欠失が起こりやすく、完全長クローンを得ることは困
難である。哺乳動物細胞用オリジンとプロモーター １
本鎖ファージの複製開始点とファージのＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーターを有するベクター、例えばｐＣＤＭ８
［Ｂ、 ５ｅｅｄ。
は、以下に示すＧｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｅ
ｎｅ２５：２６３−２６９ ｆ１９８３１］である。こ
の方法では、まず細胞から単離したポリ（Ａ） ＲＮ
Ａを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとして逆転写酵
素により第１鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで大腸菌ＲＮ
ａｓｅＨ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡ
リガーゼにより第２鎖を合成する。得られた２本領ｃＤ
ＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、適
当なオリゴヌクレオチドリンカーを付加し、ファージベ
クターやプラスミドベクターに挿入した後大腸菌の形質
転換を行なう。この方法では、第２鎖ＤＮＡを合成する
ときｍＲＮＡの５ 末端に相当する部分をブライマーと
して用いていることや、ＤＮＡポリメラーゼ■やＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性のため末端
の欠失が起こりやすく、完全長クローンを得ることは困
難である。哺乳動物細胞用オリジンとプロモーター １
本鎖ファージの複製開始点とファージのＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーターを有するベクター、例えばｐＣＤＭ８
［Ｂ、 ５ｅｅｄ。
Ｎａｔｕｒｅ ３２９： ８４０−８４２ （１９８７
）］ を用いれば、シーケンス用の１本鎖ＤＮＡの調製
、ＲＮＡプローブの調製、インビトロあるいはインビボ
翻訳用のｍＲＮＡの合成、捕乳動物細胞における発現な
どが可能である。しかしベクターへのｃＤＮＡの挿入の
向きが一定でないという欠点がある。すなわちＧｕｂｌ
ｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法を用いてｃＤＮＡを合成する場
合、１）の条件を満足しない。またｐＣＤＭ８は４８ｋ
ｂｐと長く、長いｃＤＮＡのクローニングには適しない
。
）］ を用いれば、シーケンス用の１本鎖ＤＮＡの調製
、ＲＮＡプローブの調製、インビトロあるいはインビボ
翻訳用のｍＲＮＡの合成、捕乳動物細胞における発現な
どが可能である。しかしベクターへのｃＤＮＡの挿入の
向きが一定でないという欠点がある。すなわちＧｕｂｌ
ｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法を用いてｃＤＮＡを合成する場
合、１）の条件を満足しない。またｐＣＤＭ８は４８ｋ
ｂｐと長く、長いｃＤＮＡのクローニングには適しない
。
完全長ｃＤＮＡクローンを高頻度で得る方法としては、
Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法［Ｍｏ１． Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ２１６１−１７０ ｆ１９８２＋１が挙げ
られる。この方法はｄＴＣテール付加たベクタープライ
マーをブライマーとしてポリ（Ａ） ＲＮＡから逆転写
酵素によって第１鎖ｃＤＮＡを合成し、これにｄＣテー
ルを付加した後、ｄＧデテールたリンカ−ＤＮＡを連結
し、大腸菌ＲＮａｓｅＨ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ
、大腸菌ＤＮＡリガーゼを作用させてＲＮＡをＤＮＡに
置き換える。第１鎖合成後のｄＣテール付加は、第１鎖
合成が途中で停止しているような３ 末端には起こり難
（、従ってｄＣチルされた物はほぼ完全長クローンとい
ってよい。
Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法［Ｍｏ１． Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、 ２１６１−１７０ ｆ１９８２＋１が挙げ
られる。この方法はｄＴＣテール付加たベクタープライ
マーをブライマーとしてポリ（Ａ） ＲＮＡから逆転写
酵素によって第１鎖ｃＤＮＡを合成し、これにｄＣテー
ルを付加した後、ｄＧデテールたリンカ−ＤＮＡを連結
し、大腸菌ＲＮａｓｅＨ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ
、大腸菌ＤＮＡリガーゼを作用させてＲＮＡをＤＮＡに
置き換える。第１鎖合成後のｄＣテール付加は、第１鎖
合成が途中で停止しているような３ 末端には起こり難
（、従ってｄＣチルされた物はほぼ完全長クローンとい
ってよい。
またベクタープライマーを用いているため挿入されたｃ
ＤＮＡＯ向きが一義的に決まる。リンカ−ＤＮＡにＳＶ
４０の複製開始点とプロモーターを組み込もことにより
、動物細胞内で発現可能な系も作られている。［ｔ（、
Ｏｋａｙａｍａ及びＰ、 ＢｅｒｇＭｏｌ、 Ｃｅ１１
． Ｂｉｏｌ、 ３： ２８０−２８９ ｆ１９８３）
］。本庶はリンカ−ＤＮＡにＳＰ６フロモーターを組み
込み、カエルの卵で発現可能なｍＲＮＡを合成できる系
を開発した（特開昭６２−７４２９１）。しかし、これ
らＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法に基づく方法は高度の技
術が要求される為限られたグループでしか使用されてい
ない。またｄＧテール数が多いため５゛末端側からのシ
ーケンスが困難であることや、プローブの調製が容易で
ない等の為上記の目的にそぐわない。すなわち上記２）
及び３）の条件を満たさない。
ＤＮＡＯ向きが一義的に決まる。リンカ−ＤＮＡにＳＶ
４０の複製開始点とプロモーターを組み込もことにより
、動物細胞内で発現可能な系も作られている。［ｔ（、
Ｏｋａｙａｍａ及びＰ、 ＢｅｒｇＭｏｌ、 Ｃｅ１１
． Ｂｉｏｌ、 ３： ２８０−２８９ ｆ１９８３）
］。本庶はリンカ−ＤＮＡにＳＰ６フロモーターを組み
込み、カエルの卵で発現可能なｍＲＮＡを合成できる系
を開発した（特開昭６２−７４２９１）。しかし、これ
らＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法に基づく方法は高度の技
術が要求される為限られたグループでしか使用されてい
ない。またｄＧテール数が多いため５゛末端側からのシ
ーケンスが困難であることや、プローブの調製が容易で
ない等の為上記の目的にそぐわない。すなわち上記２）
及び３）の条件を満たさない。
これらの欠点を改良した方法もいくつか試みられている
が、上記４条件の全てを満足するｃＤＮＡベクターは得
られていない。上記４条件のうち何れが欠けても、先に
示した戦略を遂行するには不十分であり、これらをすべ
て満足する方法の開発が必要不可欠である。
が、上記４条件の全てを満足するｃＤＮＡベクターは得
られていない。上記４条件のうち何れが欠けても、先に
示した戦略を遂行するには不十分であり、これらをすべ
て満足する方法の開発が必要不可欠である。
［発明が解決しようとする課題１
従って、本発明の目的は、１）挿入方向の決まった完全
長クローンを含む、２）シーケンスが容易である。３）
完全長ｃＤＮＡに相補的なプローブを調製することがで
き、それを用いて容易にスクリーニングを行なうことが
できる、４）哺乳動物細胞内で発現可能であるという４
条件をすべて満足するｃＤＮＡベクターを合成する方法
並びに該方法に必要なりローニングベクター及びこれか
ら誘導されるベクタープライマーを提供することである
。
長クローンを含む、２）シーケンスが容易である。３）
完全長ｃＤＮＡに相補的なプローブを調製することがで
き、それを用いて容易にスクリーニングを行なうことが
できる、４）哺乳動物細胞内で発現可能であるという４
条件をすべて満足するｃＤＮＡベクターを合成する方法
並びに該方法に必要なりローニングベクター及びこれか
ら誘導されるベクタープライマーを提供することである
。
［課題を解決するための手段］
本願発明者らは、鋭意研究の結果、上記４条件を満足す
るｃＤＮＡクローニングベクターを構築し、それを用い
てヒトｃＤＮＡバンクを作製することに成功し本発明を
完成した。すなわち、本発明は、哺乳動物細胞用プロモ
ーターＰＲＩと、その下流に位置し、真核細胞遺伝子に
出現頻度の少ないユニークな制限酵素部位ＲＥＩ及びＲ
ＮＡポリメラーゼのプロモーターＰＲ２と、その下流に
位置し、ｄＧオリゴマーからなる３°突出末端を生成す
るユニークな制限酵素部位ＲＥ２と、その下流に位置す
るユニークな任意の制限酵素部位ＲＥ３と、その下流に
位置するユニークな任意の３゛突出末端生成制限酵素部
位ＲＥ４と、その下流に位置し、真核細胞遺伝子に出現
頻度の少ないユニクな制限酵素部位ＲＥ５及びＲＮＡポ
リポリーゼプロモーターＰＲ３と、制限酵素部位ＲＥＩ
の上流の任意の位置に存在する少なくとも１種類の任意
の３°突出末端生成制限酵素部位ＲＥ６と、さらに上記
以外の任意の位置に、哺乳動物細胞用複製オリジンＯＲ
Ｉ、１本鎖ファージの複製オリジンＯＲ２、大腸菌用複
製オリジンＯＲ３及び選択マーカーを有するクローニン
グベクタープラスミドを提供する。
るｃＤＮＡクローニングベクターを構築し、それを用い
てヒトｃＤＮＡバンクを作製することに成功し本発明を
完成した。すなわち、本発明は、哺乳動物細胞用プロモ
ーターＰＲＩと、その下流に位置し、真核細胞遺伝子に
出現頻度の少ないユニークな制限酵素部位ＲＥＩ及びＲ
ＮＡポリメラーゼのプロモーターＰＲ２と、その下流に
位置し、ｄＧオリゴマーからなる３°突出末端を生成す
るユニークな制限酵素部位ＲＥ２と、その下流に位置す
るユニークな任意の制限酵素部位ＲＥ３と、その下流に
位置するユニークな任意の３゛突出末端生成制限酵素部
位ＲＥ４と、その下流に位置し、真核細胞遺伝子に出現
頻度の少ないユニクな制限酵素部位ＲＥ５及びＲＮＡポ
リポリーゼプロモーターＰＲ３と、制限酵素部位ＲＥＩ
の上流の任意の位置に存在する少なくとも１種類の任意
の３°突出末端生成制限酵素部位ＲＥ６と、さらに上記
以外の任意の位置に、哺乳動物細胞用複製オリジンＯＲ
Ｉ、１本鎖ファージの複製オリジンＯＲ２、大腸菌用複
製オリジンＯＲ３及び選択マーカーを有するクローニン
グベクタープラスミドを提供する。
また、本発明は、上記本発明のクローニングベクタープ
ラスミドを制限酵素部位ＲＥ４で切断後、末端デオキシ
ヌクレオチド転移酵素によりｄＴＣテール付加行ない、
さらに制限酵素部位ＲＥ３で切断することにより調製し
たベクタープライマーを提供する。
ラスミドを制限酵素部位ＲＥ４で切断後、末端デオキシ
ヌクレオチド転移酵素によりｄＴＣテール付加行ない、
さらに制限酵素部位ＲＥ３で切断することにより調製し
たベクタープライマーを提供する。
さらに、本発明は、上記本発明のベクタープライマーを
ブライマーとして用いて、細胞から羊離したポリ（Ａ）
ゝＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡ含有プラ
スミドを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換
体にヘルパーファージを感染させることによりｃＤＮＡ
プラークライブラリーを調製し、この中の独立したプラ
ークから１本鎖ＤＮＡを用いてｃＤＮＡインサートの５
０末端からシーケンスすることにより、塩基配列が決定
され且つ哺乳動物細胞内で発現可能なｃＤＮＡベクター
からなるｃＤＮＡバンクを作製する方法を提供する。
ブライマーとして用いて、細胞から羊離したポリ（Ａ）
ゝＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡ含有プラ
スミドを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換
体にヘルパーファージを感染させることによりｃＤＮＡ
プラークライブラリーを調製し、この中の独立したプラ
ークから１本鎖ＤＮＡを用いてｃＤＮＡインサートの５
０末端からシーケンスすることにより、塩基配列が決定
され且つ哺乳動物細胞内で発現可能なｃＤＮＡベクター
からなるｃＤＮＡバンクを作製する方法を提供する。
さらにまた、本発明は、上記本発明の方法で２種のｃＤ
ＮＡライブラリーＬＡならびにライブラリーＬＢを作製
し、ライブラリーＬＡがらＲＮＡポリメラーゼを用いて
センス鎖のＲＮＡプローブ集団を調製し、一方ライブラ
リーＬＢからアンチセンス鎖の１本領ｃＤＮＡ集団を調
製し、ＲＮＡプローブ集団と１本領ｃＤＮＡ集団の両者
を混合してハイブリダイズさせた物をプローブとして用
いてライブラリーＬＡをスクリーニングすることにより
、ライブラリーＬＡに特異的なｃＤＮＡクローンを得、
これを５′末端からシーケンスし、ライブラリーＬＡに
特異的で、塩基配列か決定され且つ哺乳動物細胞内で発
現可能なｃＤへＡバンクを作製する方法を提供する。
ＮＡライブラリーＬＡならびにライブラリーＬＢを作製
し、ライブラリーＬＡがらＲＮＡポリメラーゼを用いて
センス鎖のＲＮＡプローブ集団を調製し、一方ライブラ
リーＬＢからアンチセンス鎖の１本領ｃＤＮＡ集団を調
製し、ＲＮＡプローブ集団と１本領ｃＤＮＡ集団の両者
を混合してハイブリダイズさせた物をプローブとして用
いてライブラリーＬＡをスクリーニングすることにより
、ライブラリーＬＡに特異的なｃＤＮＡクローンを得、
これを５′末端からシーケンスし、ライブラリーＬＡに
特異的で、塩基配列か決定され且つ哺乳動物細胞内で発
現可能なｃＤへＡバンクを作製する方法を提供する。
［発明の効果］
本発明により、上記４つの条件を全て満たすｃＤＮＡの
クローニングが可能になった。従って、本発明クローニ
ングベクターを用いると、サブクローニングのような手
数のかかる操作を必要とすることなく、完全長のｃＤＮ
Ａをクローニングし、その塩基配列を決定し、ｃＤＮＡ
に相補的なプローブを作製してスクリーニングを行ない
、哺乳動物細胞内でｃＤＮＡを発現させることができる
。従って、本発明のクローニングベクターは、ｃＤＮＡ
バンク（本明細書では、塩基配列の決定されたｃＤＮＡ
ライブラリーをｃＤＮＡバンクと呼ぶ）を作製する場合
のように、多数のｍＲＮＡを処理する必要がある場合に
特に威力を発揮する。従って、本発明により、ヒト又は
伯の動物の全タンパク質のアミノ酸配列を決定すること
も、従来の方法を用いて行なう場合に比べてはるかに短
い時間で終了させることが可能となる。
クローニングが可能になった。従って、本発明クローニ
ングベクターを用いると、サブクローニングのような手
数のかかる操作を必要とすることなく、完全長のｃＤＮ
Ａをクローニングし、その塩基配列を決定し、ｃＤＮＡ
に相補的なプローブを作製してスクリーニングを行ない
、哺乳動物細胞内でｃＤＮＡを発現させることができる
。従って、本発明のクローニングベクターは、ｃＤＮＡ
バンク（本明細書では、塩基配列の決定されたｃＤＮＡ
ライブラリーをｃＤＮＡバンクと呼ぶ）を作製する場合
のように、多数のｍＲＮＡを処理する必要がある場合に
特に威力を発揮する。従って、本発明により、ヒト又は
伯の動物の全タンパク質のアミノ酸配列を決定すること
も、従来の方法を用いて行なう場合に比べてはるかに短
い時間で終了させることが可能となる。
［発明の詳細な説明］
本発明のｃＤＮＡベクターの機能をまとめて第１図に示
した。以下、クローニングベクターの構築法、これを用
いたｃＤＮＡベクター作製法、このｃＤＮＡベクターが
上記４条件を満足することを示す実施例について述べる
。
した。以下、クローニングベクターの構築法、これを用
いたｃＤＮＡベクター作製法、このｃＤＮＡベクターが
上記４条件を満足することを示す実施例について述べる
。
（１）クローニングベクター
本発明の最大の特徴は、ｃＤＮＡ合成に用いるクローニ
ングベクターにある。上記４条件のうち、１）の条件を
満たすためにベクタープライマーを用い、２）、３）、
４）の条件を満たすために、それぞれの機能をこのベク
タープライマーに付与している。すなわち、上述のよう
に、本発明のクローニングベクターは、嘩乳動物細胞用
プロモーターＰＲ１、その下流に真核細胞の遺伝子に出
現頻度の少ないユニークな制限酵素部位ＲＥ１とＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターＰＲ２、その下流にｄＧオ
リゴマーからなる３°突出末端を生成するユニークな制
限酵素部位ＲＥ２、その下流にユニークな任意の制限酵
素部位ＲＥ３、その下流にユニークな任意の３゛突出末
端生成制限酵素部位ＲＥ４、その下流に真核細胞の遺伝
子に出現頻度の少ないユニークな任意の３゛突出末端生
成制限酵素部位ＲＥ５とＲＮＡポリポリーゼプロモータ
ーＰＲ３、制限酵素ＲＥＩの上流の任意の位置でしかも
他の機能を損なわない位置に少なくとも１種類の任意の
３゛突出末端生成制限酵素部位ＲＥ６、さらに上記以外
の任意の位置に、哺乳動物細胞用複製オリジンＯＲＩ、
１本鎖ファージの複製オリジンＯＲ２、大腸菌用複製オ
リジンＯＲ３、選択マーカーを有するプラスミドからな
る。
ングベクターにある。上記４条件のうち、１）の条件を
満たすためにベクタープライマーを用い、２）、３）、
４）の条件を満たすために、それぞれの機能をこのベク
タープライマーに付与している。すなわち、上述のよう
に、本発明のクローニングベクターは、嘩乳動物細胞用
プロモーターＰＲ１、その下流に真核細胞の遺伝子に出
現頻度の少ないユニークな制限酵素部位ＲＥ１とＲＮＡ
ポリメラーゼのプロモーターＰＲ２、その下流にｄＧオ
リゴマーからなる３°突出末端を生成するユニークな制
限酵素部位ＲＥ２、その下流にユニークな任意の制限酵
素部位ＲＥ３、その下流にユニークな任意の３゛突出末
端生成制限酵素部位ＲＥ４、その下流に真核細胞の遺伝
子に出現頻度の少ないユニークな任意の３゛突出末端生
成制限酵素部位ＲＥ５とＲＮＡポリポリーゼプロモータ
ーＰＲ３、制限酵素ＲＥＩの上流の任意の位置でしかも
他の機能を損なわない位置に少なくとも１種類の任意の
３゛突出末端生成制限酵素部位ＲＥ６、さらに上記以外
の任意の位置に、哺乳動物細胞用複製オリジンＯＲＩ、
１本鎖ファージの複製オリジンＯＲ２、大腸菌用複製オ
リジンＯＲ３、選択マーカーを有するプラスミドからな
る。
上記表記の中で、「ユニークな」とはプラスミド上でた
だ１箇所だけ存在することを意味する。
だ１箇所だけ存在することを意味する。
ＰＲＩからＰＨ１までの位置関係を第２区に示す。ＲＥ
ＩとＰＨ１の順序はどちらが先でも構わない。同様に、
ＰＨ５とＰＨ１の順序もどちらが先でも構わない。また
これらの部位間には出来るだけ余分な塩基配列が無いこ
とが好ましい。１）の条件を満たすために、ＰＨ２、Ｐ
Ｈ３、ＰＨ４を２）の条件を満たすために、ＯＲ２、Ｐ
Ｈ６を、３）の条件を満たすために、ＰＨ１、ＰＨ１、
ＲＥｌ、ＰＨ５、ＯＲ２を、４）の条件を満たすために
、ＯＲＩ、ＰＲＩをそれぞれ必要としている。
ＩとＰＨ１の順序はどちらが先でも構わない。同様に、
ＰＨ５とＰＨ１の順序もどちらが先でも構わない。また
これらの部位間には出来るだけ余分な塩基配列が無いこ
とが好ましい。１）の条件を満たすために、ＰＨ２、Ｐ
Ｈ３、ＰＨ４を２）の条件を満たすために、ＯＲ２、Ｐ
Ｈ６を、３）の条件を満たすために、ＰＨ１、ＰＨ１、
ＲＥｌ、ＰＨ５、ＯＲ２を、４）の条件を満たすために
、ＯＲＩ、ＰＲＩをそれぞれ必要としている。
哺乳動物細胞用プロモーターＰＲＩとしては、ＳＶ４０
の初期プロモーターや後期プロモーター、アデノウィル
ス２の後期プロモーター、レトロウィルスの５０ロング
ターミナルリピート（ＬＴＲ）等が例示出来る。真核細
胞の遺伝子に出現頻度の少ないユニークな制限酵素部位
ＲＥ１やＰＨ５としては、ＮｏｔＩ、５ｎａＢ Ｉ、５
ｆｉ１．Ｓｐｅ工などが例示出来る。ｄＧオリゴマーか
らなる３°突出末端を生成するユニークな制限酵素部位
ＲＥ２としては、ＢｓｔＸＩ、５ｆｉＩ、ＤｒａＩＩＩ
、ＢｇｌＩなどが例示できる。これらの制限酵素の切断
部位は任意のヌクレオチド対で置き換えることが８来る
ので、この任意のヌクレオチドをｄＧにすれば、切断後
ｄＧオリゴマーからなる３°突出末端を生成する。
の初期プロモーターや後期プロモーター、アデノウィル
ス２の後期プロモーター、レトロウィルスの５０ロング
ターミナルリピート（ＬＴＲ）等が例示出来る。真核細
胞の遺伝子に出現頻度の少ないユニークな制限酵素部位
ＲＥ１やＰＨ５としては、ＮｏｔＩ、５ｎａＢ Ｉ、５
ｆｉ１．Ｓｐｅ工などが例示出来る。ｄＧオリゴマーか
らなる３°突出末端を生成するユニークな制限酵素部位
ＲＥ２としては、ＢｓｔＸＩ、５ｆｉＩ、ＤｒａＩＩＩ
、ＢｇｌＩなどが例示できる。これらの制限酵素の切断
部位は任意のヌクレオチド対で置き換えることが８来る
ので、この任意のヌクレオチドをｄＧにすれば、切断後
ｄＧオリゴマーからなる３°突出末端を生成する。
ＢｓｔＸＩの切断部位の塩基配列は、
５０−ＣＣＡへＸＮ入ＮＮＴＧＧ ３３’ −ＧＧＴ
ＮＮＮＮ＼ＮＡＣＣ−５なので、＼をＧにすれば、Ｂｓ
ｔＸＩ切断後、次のような末端となる。
ＮＮＮＮ＼ＮＡＣＣ−５なので、＼をＧにすれば、Ｂｓ
ｔＸＩ切断後、次のような末端となる。
５０−ＣＣＡＧＧＧＧＧ−３
３°−ＧＧＴＣ−５゜
従って、ＰＨ２としては、その切断部が任意のヌクレオ
チドである３°突出末端生成制限酵素部位であればいか
なるものでも良く、上述の例に限定されない。
チドである３°突出末端生成制限酵素部位であればいか
なるものでも良く、上述の例に限定されない。
制限酵素部位ＲＥＩの上流の任意の位置に存在する少な
くとも一種類の任意の３゛突出末端生成制限酵素部位Ｒ
Ｅ６としては、ＲＥＩ、ＰＨ２、ＰＨ３、ＰＨ４、ＰＨ
５のいずれとも異なる制限酵素部位であれば、いかなる
３°突出末端制限酵素部位でも良い。ただし、真核細胞
遺伝子に出現頻度の低い制限酵素部位であることが望ま
しい。・例えば、５ｆｉＩ等が例示できるが、これに限
定されるものではない。また、ＰＨ６は一種類だけでは
なく、複数種類存在することが望ましい。
くとも一種類の任意の３゛突出末端生成制限酵素部位Ｒ
Ｅ６としては、ＲＥＩ、ＰＨ２、ＰＨ３、ＰＨ４、ＰＨ
５のいずれとも異なる制限酵素部位であれば、いかなる
３°突出末端制限酵素部位でも良い。ただし、真核細胞
遺伝子に出現頻度の低い制限酵素部位であることが望ま
しい。・例えば、５ｆｉＩ等が例示できるが、これに限
定されるものではない。また、ＰＨ６は一種類だけでは
なく、複数種類存在することが望ましい。
ＰＨ６は必ずしもユニークである必要はないが、いずれ
もＲＥｌより上流に存在する必要がある。
もＲＥｌより上流に存在する必要がある。
ＲＮＡポリポリーゼプロモーターＰＲ２やＰＨ１として
は、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーター、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ
プロモータなどが例示できる。哺乳動物細胞用複製オリ
ジンＯＲ１としては、ＳＶ４０のオリジンなどが例示で
きる。１本鎖ファージの複製オリジンＯＲ２としては、
ｆ１ファージのオリジンやＭ１３ファージのオリジンが
例示できる。大腸菌用複製オリジンＯＲ３としては、ｐ
ＢＲ３２２のオリジンやｐＵＣ系のプラスミドのオリジ
ンなどが例示できる。選択マーカーとしては、アンピシ
リン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、カ
ナマイシン耐性マーカーなどのような薬剤耐性マカー、
栄養要求性及び温度感受性等が例示できる。さらに哺乳
動物細胞に導入した際の薬剤耐性マーカーとしてネオマ
イシン耐性遺伝子等をそれ用のプロモーターと一緒に導
入しても良いが、その場合ベクターが長（なり過ぎる欠
点を有する。
は、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーター、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ
プロモータなどが例示できる。哺乳動物細胞用複製オリ
ジンＯＲ１としては、ＳＶ４０のオリジンなどが例示で
きる。１本鎖ファージの複製オリジンＯＲ２としては、
ｆ１ファージのオリジンやＭ１３ファージのオリジンが
例示できる。大腸菌用複製オリジンＯＲ３としては、ｐ
ＢＲ３２２のオリジンやｐＵＣ系のプラスミドのオリジ
ンなどが例示できる。選択マーカーとしては、アンピシ
リン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、カ
ナマイシン耐性マーカーなどのような薬剤耐性マカー、
栄養要求性及び温度感受性等が例示できる。さらに哺乳
動物細胞に導入した際の薬剤耐性マーカーとしてネオマ
イシン耐性遺伝子等をそれ用のプロモーターと一緒に導
入しても良いが、その場合ベクターが長（なり過ぎる欠
点を有する。
また、哺乳動物細胞に導入した場合、その発現効率を向
上させるためにスプライス部位及びポリＡ付加シグナル
を含めるのが望ましい。
上させるためにスプライス部位及びポリＡ付加シグナル
を含めるのが望ましい。
ｃＤＮＡは制限酵素部位ＲＥ２とＰＨ４の間に、ｍＲＮ
Ａの５゛側がＰＨ２側になるような向きで導入される。
Ａの５゛側がＰＨ２側になるような向きで導入される。
１本鎖ファージの複製オリジンの向きによって、２本鎖
のうちどちらかの鎖が１本鎖になるかが決まるが、本ベ
クターにおいて１本鎖ファージの複製オリジンはｃＤＮ
Ａのアンチセンス鎖が１本鎖になるような向きに挿入さ
れる。なお、本明細書においては、ｍ ＲＮ Ａと同じ
塩基配列（ただしＴとＵは同じと考えて）を有するもの
をセンス鎖、ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するもの
をアンチセンス鎖と呼んでいる。
のうちどちらかの鎖が１本鎖になるかが決まるが、本ベ
クターにおいて１本鎖ファージの複製オリジンはｃＤＮ
Ａのアンチセンス鎖が１本鎖になるような向きに挿入さ
れる。なお、本明細書においては、ｍ ＲＮ Ａと同じ
塩基配列（ただしＴとＵは同じと考えて）を有するもの
をセンス鎖、ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するもの
をアンチセンス鎖と呼んでいる。
５゛末端から塩基配列を決定するためのシーケンス用ブ
ライマーとして、ＰＨ２の上流の任意の部位の塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを田いることが出来る
が、広く利用されているＭ１３用シーケンスブライマー
の配列をベクター中に組み込んでもよい。
ライマーとして、ＰＨ２の上流の任意の部位の塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドを田いることが出来る
が、広く利用されているＭ１３用シーケンスブライマー
の配列をベクター中に組み込んでもよい。
ＲＮＡポリポリーゼプロモーターＰＲ２は、生成する１
本鎖ＲＮＡが鋳型ｍＲＮＡに対して、センス鎖となるよ
うな方向に、またＰＨ１は、１本鎖ＲＮＡがアンチセン
ス鎖になるような方向に組み込む。以上の構成からなる
プラスミドは、公知のプラスミドおよび合成オリゴヌク
レオチドから容易に作製することが出来る。以下の実施
例に記載されたプラスミドｐＫＡ１は、ＰＲＩとしてＳ
Ｖ４０初期プロモーター、ＲＥＩとして５ｎａＢＩ、Ｐ
Ｈ１としてＴ７プロモーターＲＥＩとして５ｎａＢ１．
ＰＨ１としてＴ７プロモーター ＰＨ２としてＢｓｔＸ
Ｉ、ＰＨ３としてＥｃｏＲＶ、ＰＨ４としてＫｐｎｌ、
ＰＨ５としてＮｏｔｌ、ＰＨ１としてＴ３プロモーター
ＲＥ６として５ｆｉ１．ＰｓｔＩとｓｐｈ Ｉ、ＯＲ１
としてＳＶ４０のオリジンＯＲ２としてｆｌのオリジン
、ＯＲ３としてｐＢＲ３２２のオリジン、藁斉り耐性マ
ーカーとしてアンピシリン耐性マーカー（β−ラクタマ
ーゼ遺伝子）、シーケンス用ブライマーが張り付（部位
としてＭ１３のユニバーサルブライマー（ｔＪ）とリバ
ースブライマー（Ｒ）に相当する塩基配列をそれぞれ使
用している（第３図）。さらにｐＫＡｌのＳＶ４０プロ
モーターの下流に１６Ｓスプライス部位が、また、Ｔ３
プロモーターの下流にポリＡ付加シグナルが含まれてい
る。ｐＫＡｌは３．６ｋｂｐからなり、公知の多機能を
有するクローニングベクターに比較して短く、従って長
いｃＤＮＡのクローニングにも適している。
本鎖ＲＮＡが鋳型ｍＲＮＡに対して、センス鎖となるよ
うな方向に、またＰＨ１は、１本鎖ＲＮＡがアンチセン
ス鎖になるような方向に組み込む。以上の構成からなる
プラスミドは、公知のプラスミドおよび合成オリゴヌク
レオチドから容易に作製することが出来る。以下の実施
例に記載されたプラスミドｐＫＡ１は、ＰＲＩとしてＳ
Ｖ４０初期プロモーター、ＲＥＩとして５ｎａＢＩ、Ｐ
Ｈ１としてＴ７プロモーターＲＥＩとして５ｎａＢ１．
ＰＨ１としてＴ７プロモーター ＰＨ２としてＢｓｔＸ
Ｉ、ＰＨ３としてＥｃｏＲＶ、ＰＨ４としてＫｐｎｌ、
ＰＨ５としてＮｏｔｌ、ＰＨ１としてＴ３プロモーター
ＲＥ６として５ｆｉ１．ＰｓｔＩとｓｐｈ Ｉ、ＯＲ１
としてＳＶ４０のオリジンＯＲ２としてｆｌのオリジン
、ＯＲ３としてｐＢＲ３２２のオリジン、藁斉り耐性マ
ーカーとしてアンピシリン耐性マーカー（β−ラクタマ
ーゼ遺伝子）、シーケンス用ブライマーが張り付（部位
としてＭ１３のユニバーサルブライマー（ｔＪ）とリバ
ースブライマー（Ｒ）に相当する塩基配列をそれぞれ使
用している（第３図）。さらにｐＫＡｌのＳＶ４０プロ
モーターの下流に１６Ｓスプライス部位が、また、Ｔ３
プロモーターの下流にポリＡ付加シグナルが含まれてい
る。ｐＫＡｌは３．６ｋｂｐからなり、公知の多機能を
有するクローニングベクターに比較して短く、従って長
いｃＤＮＡのクローニングにも適している。
上述したプラスミドを制限酵素部位ＲＥ４で切断し、３
“突出末端とした後、常法により末端デオキシヌクレオ
チド転移酵素を用いてｄＴデテール加を行なう。ｄＴデ
テール付加数は３０〜７０塩基が好ましく、さらに好ま
しくは５０〜６０塩基である。次いで制限酵素部位ＲＥ
３で切断し、ベクターを含む長い断片をアガロースゲル
電気泳動法などにより単離精製する。これをベクタープ
ライマーとして使用する。
“突出末端とした後、常法により末端デオキシヌクレオ
チド転移酵素を用いてｄＴデテール加を行なう。ｄＴデ
テール付加数は３０〜７０塩基が好ましく、さらに好ま
しくは５０〜６０塩基である。次いで制限酵素部位ＲＥ
３で切断し、ベクターを含む長い断片をアガロースゲル
電気泳動法などにより単離精製する。これをベクタープ
ライマーとして使用する。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製性
細胞から公知の方法で取得したポリ（Ａ） ” ＲＮＡ
を、上述のベクタープライマーとアニールさせた後、逆
転写酵素により第１鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで末端
デオキシヌクレオチド転移酵素によりｄＣテール付加を
行なう。ｄＣテールの付加数は４個から１０個が好まし
い。次いでこれを制限酵素部位ＲＥ２で切断後、大腸菌
ＤＮＡリガーゼによりセルフライゲーションを行なう。
を、上述のベクタープライマーとアニールさせた後、逆
転写酵素により第１鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで末端
デオキシヌクレオチド転移酵素によりｄＣテール付加を
行なう。ｄＣテールの付加数は４個から１０個が好まし
い。次いでこれを制限酵素部位ＲＥ２で切断後、大腸菌
ＤＮＡリガーゼによりセルフライゲーションを行なう。
次いで大腸菌ＲＮａｓｅＨ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌ＤＮＡリガーゼにより第２鎖を合成する。以
上の工程は第４図に示した。得られたｃＤＮＡ含有混合
プラスミド溶液で、大腸菌Ｆ゛因子含有株の形質転換を
行なう。大腸菌Ｆ因子含有株としては、ＮＭ５２２、Ｊ
ＭＩＯＩ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＤＨ
５αＦ゛等が例示できる。形質転換体、すなわち、ｃＤ
ＮＡライブラリーを適当な培地、例えばＬブロスや２ｘ
ＴＹ培地（薬剤耐性マーカーとしてアンピシリン耐性遺
伝子を含む場合はアンピシリンを含有する）などで培養
し菌を増幅した後、グリセロールやＤＭＳＯを添加して
凍結保存する。ｃＤＮＡライブラリーを液体培地中で培
養した後、ヘルパーファージを感染させると、各大腸菌
は含有しているｃＤＮＡベクターに由来する１重鎖ｃＤ
ＮＡを含むファージが菌体外に放出される。なおこの１
重鎖ｃＤＮＡは鋳型となったｍＲＮＡに対してアンチセ
ンス鎖を有している。そこでｃＤＮＡライブラリーにヘ
ルパーファージを感染させた後、遠心して菌体な集め、
次いで培地で十分洗浄してヘルパーファージを除去した
後、培地で希釈したものをｃＤＮＡベクターを含まない
宿主大腸菌のみの溶液と軟寒天あるいは軟アガロース溶
液と混合し、これを寒天培地上に流して培養すると、ｃ
ＤＮＡ含有閑のあるところにプラークが生成する。単一
プラークからつまようじなどで菌を拾い２ｘＴＹなとの
液体培地に移して培養する。
Ｉ、大腸菌ＤＮＡリガーゼにより第２鎖を合成する。以
上の工程は第４図に示した。得られたｃＤＮＡ含有混合
プラスミド溶液で、大腸菌Ｆ゛因子含有株の形質転換を
行なう。大腸菌Ｆ因子含有株としては、ＮＭ５２２、Ｊ
ＭＩＯＩ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＤＨ
５αＦ゛等が例示できる。形質転換体、すなわち、ｃＤ
ＮＡライブラリーを適当な培地、例えばＬブロスや２ｘ
ＴＹ培地（薬剤耐性マーカーとしてアンピシリン耐性遺
伝子を含む場合はアンピシリンを含有する）などで培養
し菌を増幅した後、グリセロールやＤＭＳＯを添加して
凍結保存する。ｃＤＮＡライブラリーを液体培地中で培
養した後、ヘルパーファージを感染させると、各大腸菌
は含有しているｃＤＮＡベクターに由来する１重鎖ｃＤ
ＮＡを含むファージが菌体外に放出される。なおこの１
重鎖ｃＤＮＡは鋳型となったｍＲＮＡに対してアンチセ
ンス鎖を有している。そこでｃＤＮＡライブラリーにヘ
ルパーファージを感染させた後、遠心して菌体な集め、
次いで培地で十分洗浄してヘルパーファージを除去した
後、培地で希釈したものをｃＤＮＡベクターを含まない
宿主大腸菌のみの溶液と軟寒天あるいは軟アガロース溶
液と混合し、これを寒天培地上に流して培養すると、ｃ
ＤＮＡ含有閑のあるところにプラークが生成する。単一
プラークからつまようじなどで菌を拾い２ｘＴＹなとの
液体培地に移して培養する。
培養液の一部を凍結保存し、残りの培養液を遠心して菌
体からは常法に従いプラスミドを単離する。また上清か
らは、公知の方法に従いファージを単離し、さらにこの
ファージから１重鎖ｃＤＮＡを単離精製する。又上清の
一部も冷蔵保存しておくことが好ましい。なおここで用
いるヘルパーファージとしては、旧３ＫＯ？［Ｊ、 Ｖ
ｉｅｉｒａ ａｎｄ ＪＭｅｓｓｉｎｇ、 ”Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ。１５
３゜１）、３．１９８７］、ＶＣ３−Ｍ１３． Ｒ４０
８（以上５ｔｒａｔａＨｅｎｅ社）等を例示できる。
体からは常法に従いプラスミドを単離する。また上清か
らは、公知の方法に従いファージを単離し、さらにこの
ファージから１重鎖ｃＤＮＡを単離精製する。又上清の
一部も冷蔵保存しておくことが好ましい。なおここで用
いるヘルパーファージとしては、旧３ＫＯ？［Ｊ、 Ｖ
ｉｅｉｒａ ａｎｄ ＪＭｅｓｓｉｎｇ、 ”Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ。１５
３゜１）、３．１９８７］、ＶＣ３−Ｍ１３． Ｒ４０
８（以上５ｔｒａｔａＨｅｎｅ社）等を例示できる。
ヘルパーファージを感染させる前にｃＤＮＡライブラリ
ーを寒天培地上に蒔いて単一コロニーとした後、各コロ
ニーを培養し、それぞれにヘルパーファージを感染させ
、以下上と同様にして１本鎖ＤＮＡを単離しても良い。
ーを寒天培地上に蒔いて単一コロニーとした後、各コロ
ニーを培養し、それぞれにヘルパーファージを感染させ
、以下上と同様にして１本鎖ＤＮＡを単離しても良い。
以上のような方法により、一つのｍＲＮＡに由来するｃ
ＤＮＡベクターを含む形質転換体、該ｃＤＮＡベクター
からなる２本鎖プラスミド、１本鎖ＤＮＡからなる該ｃ
ＤＮＡベクター、１本鎖ＤＮＡを含むファージの各ライ
ブラリーが出来上がる。
ＤＮＡベクターを含む形質転換体、該ｃＤＮＡベクター
からなる２本鎖プラスミド、１本鎖ＤＮＡからなる該ｃ
ＤＮＡベクター、１本鎖ＤＮＡを含むファージの各ライ
ブラリーが出来上がる。
（３）塩基配列決定法
塩基配列の決定は、１本鎖あるいは２本鎖いずれのＤＮ
Ａを用いて行なう事も出来るが、１本鎖ＤＮＡを使用し
た方が多くの塩基配列を読むことが出来るので好ましい
。制限酵素部位ＲＥ２の直前の塩基配列に相当する１７
〜２０マ一程度のシーケンス用合成オリゴヌクレオチド
ブライマー用いて、放射性化合物あるいは蛍光色素で標
識した基質を用いジデオキシ法により塩基配列を決定す
る。酵素としては、フレノウ断片、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを用
いることが出来る。ｐＫＡｌを用いる場合には、ブライ
マーとしてＭ１３用ユニバーサルブライマーを使用する
ことが出来る。このブライマーでｃＤＮＡの５０末端か
ら約４００塩基程度の配列を決定できる。もし完全長ク
ローンの場合はこの中に開始コドンが見出され、開始コ
ドンから始まるオーブンリーディングフレームが存在す
る。もしこの中に停止コドンが見出されない場合には、
さらに塩基配列を決定する必要がある。その場合には、
決定された塩基配列の３°末端に近い部位の塩基配列を
基にして新たなるシーケンス用ブライマーを合成し、こ
れをブライマーとして塩基配列の決定を行なう。また本
発明のプラスミドを用いれば、該ｃＤＮＡを含むプラス
ミドを制限酵素部位ＲＥＩと制限酵素部位ＲＥ６で切断
後、公知の方法によりエキソヌクレアーゼで処理するこ
とにより、ｃＤＮＡの５゛末端からの欠失体を作製する
事が出来、この欠失体についてＲＥ６の直前の塩基配列
に基づくシーケンス用ブライマーを用いて塩基配列を決
定することも出来る。ｐＫＡｌの場合には制限酵素部位
ＲＥ６の直前にＭ１３用リバースブライマ一部位が存在
するのでこれを利用できる。
Ａを用いて行なう事も出来るが、１本鎖ＤＮＡを使用し
た方が多くの塩基配列を読むことが出来るので好ましい
。制限酵素部位ＲＥ２の直前の塩基配列に相当する１７
〜２０マ一程度のシーケンス用合成オリゴヌクレオチド
ブライマー用いて、放射性化合物あるいは蛍光色素で標
識した基質を用いジデオキシ法により塩基配列を決定す
る。酵素としては、フレノウ断片、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを用
いることが出来る。ｐＫＡｌを用いる場合には、ブライ
マーとしてＭ１３用ユニバーサルブライマーを使用する
ことが出来る。このブライマーでｃＤＮＡの５０末端か
ら約４００塩基程度の配列を決定できる。もし完全長ク
ローンの場合はこの中に開始コドンが見出され、開始コ
ドンから始まるオーブンリーディングフレームが存在す
る。もしこの中に停止コドンが見出されない場合には、
さらに塩基配列を決定する必要がある。その場合には、
決定された塩基配列の３°末端に近い部位の塩基配列を
基にして新たなるシーケンス用ブライマーを合成し、こ
れをブライマーとして塩基配列の決定を行なう。また本
発明のプラスミドを用いれば、該ｃＤＮＡを含むプラス
ミドを制限酵素部位ＲＥＩと制限酵素部位ＲＥ６で切断
後、公知の方法によりエキソヌクレアーゼで処理するこ
とにより、ｃＤＮＡの５゛末端からの欠失体を作製する
事が出来、この欠失体についてＲＥ６の直前の塩基配列
に基づくシーケンス用ブライマーを用いて塩基配列を決
定することも出来る。ｐＫＡｌの場合には制限酵素部位
ＲＥ６の直前にＭ１３用リバースブライマ一部位が存在
するのでこれを利用できる。
得られた塩基配列はセンス鎖であり、従ってｍＲＮＡと
同じ配列を有しているので、この塩基配列あるいはオー
プンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列を
用いてＤＮＡあるいはタンパク質のデータベースの検索
を行ない、類似配列の有無を調べることが出来る。もし
類似配列が存在する場合、得られたｃＤＮＡがコードす
るタンパク質の種類や性質を推定することが出来る。
同じ配列を有しているので、この塩基配列あるいはオー
プンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列を
用いてＤＮＡあるいはタンパク質のデータベースの検索
を行ない、類似配列の有無を調べることが出来る。もし
類似配列が存在する場合、得られたｃＤＮＡがコードす
るタンパク質の種類や性質を推定することが出来る。
（４）スクリーニング法
全ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を決定しようとする
場合、同じクローンを重複してシーケンスする事を避け
るために、既にシーケンスしたクローンと同じ物を前も
って除去することが望ましい。本発明はこのための方法
即ちサブトラクション法を提供する。この手法は細胞特
異的なりロンや、刺激によって誘導されて来るクローン
を得る場合にも利用できる。
場合、同じクローンを重複してシーケンスする事を避け
るために、既にシーケンスしたクローンと同じ物を前も
って除去することが望ましい。本発明はこのための方法
即ちサブトラクション法を提供する。この手法は細胞特
異的なりロンや、刺激によって誘導されて来るクローン
を得る場合にも利用できる。
ここで２種のｃＤＮＡライブラリーＬＡとＬＢがあり、
ＬＡからＬＢを差引く場合を考える。即ちライブラリー
ＬＡが新規クローンや特異的クローンを含み、ライブラ
リーＬＢが既にシーケンスの決定したクローンや共通り
ローンからなる場合に相当する。まずライブラリーＬＡ
を培養して増幅した後、ｃＤＮＡを含有する総プラスミ
ドを単離する。これを制限酵素部位ＲＥ５で切断後、プ
ロモーターＰＲ２に作用するＲＮＡボリメラゼを、放射
能物質や蛍光物質などで標識したヌクレオチド基質と共
に反応させると各ｃＤＮＡのセンス鎖に相当する標識Ｒ
ＮＡ集団が得られる。次いでライブラリーＬＢを培養後
、ヘルパーファージを感染させ、その培養上清から１本
鎖ＤＮＡ集団を調製する。ライブラリーＬＡから調製し
た標識ＲＮＡ集団を、ライブラリーＬＢから調製した大
過剰の１本鎖ＤＮＡ集団と混合してハイブリダイゼーシ
ョンさせると、両ライブラリーに共通に存在するｃＤＮ
Ａクローンに由来するＲＮＡ （センス鎖）と１本鎖Ｄ
ＮＡ （アンチセンス鎖）同士はパイプリダイズするが
、ライブラリーＬＡにのみ存在するｃＤＮＡクローンに
由来する標識ＲＮＡ１′１ｉｌｆ離の状態で存在する。
ＬＡからＬＢを差引く場合を考える。即ちライブラリー
ＬＡが新規クローンや特異的クローンを含み、ライブラ
リーＬＢが既にシーケンスの決定したクローンや共通り
ローンからなる場合に相当する。まずライブラリーＬＡ
を培養して増幅した後、ｃＤＮＡを含有する総プラスミ
ドを単離する。これを制限酵素部位ＲＥ５で切断後、プ
ロモーターＰＲ２に作用するＲＮＡボリメラゼを、放射
能物質や蛍光物質などで標識したヌクレオチド基質と共
に反応させると各ｃＤＮＡのセンス鎖に相当する標識Ｒ
ＮＡ集団が得られる。次いでライブラリーＬＢを培養後
、ヘルパーファージを感染させ、その培養上清から１本
鎖ＤＮＡ集団を調製する。ライブラリーＬＡから調製し
た標識ＲＮＡ集団を、ライブラリーＬＢから調製した大
過剰の１本鎖ＤＮＡ集団と混合してハイブリダイゼーシ
ョンさせると、両ライブラリーに共通に存在するｃＤＮ
Ａクローンに由来するＲＮＡ （センス鎖）と１本鎖Ｄ
ＮＡ （アンチセンス鎖）同士はパイプリダイズするが
、ライブラリーＬＡにのみ存在するｃＤＮＡクローンに
由来する標識ＲＮＡ１′１ｉｌｆ離の状態で存在する。
従ってこれをプローブとして、ライブラリーＬＡをプラ
ークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリ
ダイゼーション法によりスクリーニングすれば、ライブ
ラリーＬＡにのみ存在するクローンを得ることが出来る
。第５図に以上述べたサブトラクション法の原理を示し
た。
ークハイブリダイゼーションあるいはコロニーハイブリ
ダイゼーション法によりスクリーニングすれば、ライブ
ラリーＬＡにのみ存在するクローンを得ることが出来る
。第５図に以上述べたサブトラクション法の原理を示し
た。
本発明で作製されたｃＤＮＡベクターはｃＤＮＡの３′
末端側にＲＮＡポリポリーゼプロモーターＰＲ３を有す
るので、制限酵素ＲＥＩで切断後ＰＲ３に作用するＲＮ
Ａポリメラーゼと反応させると、ｃ ＤＮＡに対してア
ンチセンス鎖を有するＲＮＡプローブを調製することが
出来る。これはノザンハイブリダイゼーション用のプロ
ーブとして利用できる。
末端側にＲＮＡポリポリーゼプロモーターＰＲ３を有す
るので、制限酵素ＲＥＩで切断後ＰＲ３に作用するＲＮ
Ａポリメラーゼと反応させると、ｃ ＤＮＡに対してア
ンチセンス鎖を有するＲＮＡプローブを調製することが
出来る。これはノザンハイブリダイゼーション用のプロ
ーブとして利用できる。
（５）動物細胞での発現法
本発明のｃＤＮＡベクターは晴乳動物細胞内で機能する
複製オリジンならびにプロモーターを有しているので、
単離したｃＤＮＡ含有プラスミドをそのまま適当な動物
細胞にリン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法
など公知の方法を用いて導入することにより、動物細胞
内で発現することが可能である。導入されたプラスミド
上のｃＤＮＡがレセプターや分泌タンパク質をコードし
ている場合は、この方法で活性のスクリーニングが可能
となる。
複製オリジンならびにプロモーターを有しているので、
単離したｃＤＮＡ含有プラスミドをそのまま適当な動物
細胞にリン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法
など公知の方法を用いて導入することにより、動物細胞
内で発現することが可能である。導入されたプラスミド
上のｃＤＮＡがレセプターや分泌タンパク質をコードし
ている場合は、この方法で活性のスクリーニングが可能
となる。
また制限酵素部位ＲＥ５で切断後、プロモーターＰＲ２
に作用するＲＮＡポリメラーゼをＣＡＰ Ｈ似のヌクレ
オチド基質ｍ’Ｇｐｐｐ、Ｇと共に反応させると、イン
ビトロ翻訳系やカエル卵細胞を用いた翻訳系で利用可能
なＲＮＡが得られる。
に作用するＲＮＡポリメラーゼをＣＡＰ Ｈ似のヌクレ
オチド基質ｍ’Ｇｐｐｐ、Ｇと共に反応させると、イン
ビトロ翻訳系やカエル卵細胞を用いた翻訳系で利用可能
なＲＮＡが得られる。
［実施例］
以下、実施例に基づき本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
ｔＩＮＡの組換えに関する基本的な操作および反応は文
献［Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 （１９８
２１，”Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ″、 ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］
に従って行った・実」１例」２ クローニングベクターｐＫＡ１の構築 （１） ｐＴＺ１８ＲＰｌ（７）作製（第６区）プラス
ミドｐＴ２１８Ｒｆファルマシア社）１０μｇを１００
単位のＢａｍＨｌ、次いで１００単位のＥ ｃｏＲＩで
二重消化した後、０．８％のアガロースゲル電気泳動（
ＡＧＥＩにかＬす、ゲルから２．９ｋｂｐの断片な単離
精製した。これに制限酵素部位ＥｃｏＲ１，ＢｓｔＸｌ
、 ＥｃｏＲＶ、Ｎｏｔｌ、 Ｋｐｎｌ、 ＢａｍＨＩ
を含む合成オリゴマーＬ１とＬ２をｌＣ１ｐｍｏｌづつ
混合してアニールさせた後、ライゲーション反応を行な
った。
献［Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、 （１９８
２１，”Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ″、 ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］
に従って行った・実」１例」２ クローニングベクターｐＫＡ１の構築 （１） ｐＴＺ１８ＲＰｌ（７）作製（第６区）プラス
ミドｐＴ２１８Ｒｆファルマシア社）１０μｇを１００
単位のＢａｍＨｌ、次いで１００単位のＥ ｃｏＲＩで
二重消化した後、０．８％のアガロースゲル電気泳動（
ＡＧＥＩにかＬす、ゲルから２．９ｋｂｐの断片な単離
精製した。これに制限酵素部位ＥｃｏＲ１，ＢｓｔＸｌ
、 ＥｃｏＲＶ、Ｎｏｔｌ、 Ｋｐｎｌ、 ＢａｍＨＩ
を含む合成オリゴマーＬ１とＬ２をｌＣ１ｐｍｏｌづつ
混合してアニールさせた後、ライゲーション反応を行な
った。
Ｌ２ ＣＣＧＧＣＧＣＣＴＡＧ−５反応液で大腸
菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、形質転換体を培養後プラス
ミドを単離した。 Ｍ１３シーケンス用リバースブライ
マーを用いて合成オリゴマー挿入部位のシーケンスを行
い目的とする塩基配列を有するものをｐＴＺ１８ＲＰｌ
と命名した。
菌ＨＢＩＯＩを形質転換し、形質転換体を培養後プラス
ミドを単離した。 Ｍ１３シーケンス用リバースブライ
マーを用いて合成オリゴマー挿入部位のシーケンスを行
い目的とする塩基配列を有するものをｐＴＺ１８ＲＰｌ
と命名した。
（２） ｐＴＺ１８ＲＰ２（７）作製（第６図）ｐＴＺ
１８ＲＰｌのＴ７プロモーターの直前に点突然変異を導
入することにより５ｎａＢＩ部位を形成した。
１８ＲＰｌのＴ７プロモーターの直前に点突然変異を導
入することにより５ｎａＢＩ部位を形成した。
（１）で調製したプラスミドｐＴ２１８ＲＰ１を用いて
大腸菌ＣＪ２３Ｂ （バイオラット社）を形質転換し
、得られた形質転換体コロニーを５０μｇ ／ｍｌアン
ピシリン含有２ｘＴＹ培地５ｍｌ中で３７℃１時間培養
後、へルバーファージＭ１３ＫＯ７（ファルマシア社）
を添加して３７℃−晩培養した。この培養上清から１本
鎖ＤＮＡを精製した。次いでこの１本鎖ＤＮＡを、５末
端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した
合成オリゴマーＬ３ ｌｏｐπｏ１を混合してアニール
させた後、４単位のフレノウ断片、３５０単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、０．８ ｍＭ ｄＮＴＰ存在下４℃５分
間、室温５分間、３７℃２時間反応させた。
大腸菌ＣＪ２３Ｂ （バイオラット社）を形質転換し
、得られた形質転換体コロニーを５０μｇ ／ｍｌアン
ピシリン含有２ｘＴＹ培地５ｍｌ中で３７℃１時間培養
後、へルバーファージＭ１３ＫＯ７（ファルマシア社）
を添加して３７℃−晩培養した。この培養上清から１本
鎖ＤＮＡを精製した。次いでこの１本鎖ＤＮＡを、５末
端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した
合成オリゴマーＬ３ ｌｏｐπｏ１を混合してアニール
させた後、４単位のフレノウ断片、３５０単位のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ、０．８ ｍＭ ｄＮＴＰ存在下４℃５分
間、室温５分間、３７℃２時間反応させた。
Ｌ３ ５’−ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＴＡＡＴ
ＡＣＧＡ−３反応液で大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行
い、形質転換体からプラスミドを単離した、５ｎａＢＩ
で切断可能なものをさらにシーケンスし、目的とする塩
基配列を有することを確認したプラスミドをｐＴＺ１８
ＲＰ２と命名した。
ＡＣＧＡ−３反応液で大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行
い、形質転換体からプラスミドを単離した、５ｎａＢＩ
で切断可能なものをさらにシーケンスし、目的とする塩
基配列を有することを確認したプラスミドをｐＴＺ１８
ＲＰ２と命名した。
（３） ｐＴＺＩ８ＲＰ３の作製（第６図）ｐＴＺ１８
ＲＰ２のＢａｍＨ１部位にＴ３プロモーターを導入した
。（２）で調製したプラスミドｐＴ２１８ＲＰ２１０ｕ
ｇを１００単位のＢａｍＨＩで消化した後、（１，８％
アガロースゲル電気泳動にかけ、断片をゲルがら単離精
製した。これにＴ３プロモーターを含む合成オノゴヌク
レオチドＬ４とＬ５をそれぞれｌＯｐｍｏｌづつ混合し
てアニールした後、ライゲーション反応を行った。
ＲＰ２のＢａｍＨ１部位にＴ３プロモーターを導入した
。（２）で調製したプラスミドｐＴ２１８ＲＰ２１０ｕ
ｇを１００単位のＢａｍＨＩで消化した後、（１，８％
アガロースゲル電気泳動にかけ、断片をゲルがら単離精
製した。これにＴ３プロモーターを含む合成オノゴヌク
レオチドＬ４とＬ５をそれぞれｌＯｐｍｏｌづつ混合し
てアニールした後、ライゲーション反応を行った。
Ｌ４ ５’−ＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＧ
ＴＴＡＴＴＧ−３Ｌ ５ ３−ＡＧＧＧＡＡＡＴＣ
ＡＣＴＣＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＡＧ−５反応液で大腸菌
ＮＭ５２２を形質転換した後、形質転換体からプラスミ
ドを単離し、シーケンスによって目的とする塩基配列を
有していることを確計１したプラスミドなｐＴＺ１８Ｒ
Ｐ３と命名した。
ＴＴＡＴＴＧ−３Ｌ ５ ３−ＡＧＧＧＡＡＡＴＣ
ＡＣＴＣＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＡＧ−５反応液で大腸菌
ＮＭ５２２を形質転換した後、形質転換体からプラスミ
ドを単離し、シーケンスによって目的とする塩基配列を
有していることを確計１したプラスミドなｐＴＺ１８Ｒ
Ｐ３と命名した。
（４） ｐＴＺ１８ＲＰ４の作製（第６区）ｐＴＺ１８
ＲＰ３の５ｎａＢＩ部位にＸｈｏＩ部位とＭ１３シーケ
ンス用ユニバーサルブライマー配列（ｔＪ）を導入した
。（３）で調製したプラスミドｐＴＺ１８ＲＰ３１０
ｕ ｇを１００単位の５ｎａＢＩで切断し、０．８％ア
ガロースゲル電気泳動にかけた後、切断片をゲルから単
離精製した。これにＸｈｏＩ部位とＭ１３シーケンス用
ユニバーサルブライマー配列（ｔＪ）を有する合成オリ
ゴマーＬ６とＬ７をそれぞれＩＤｐｍｏｌづつ混合した
後、ライゲーション反応を行った。
ＲＰ３の５ｎａＢＩ部位にＸｈｏＩ部位とＭ１３シーケ
ンス用ユニバーサルブライマー配列（ｔＪ）を導入した
。（３）で調製したプラスミドｐＴＺ１８ＲＰ３１０
ｕ ｇを１００単位の５ｎａＢＩで切断し、０．８％ア
ガロースゲル電気泳動にかけた後、切断片をゲルから単
離精製した。これにＸｈｏＩ部位とＭ１３シーケンス用
ユニバーサルブライマー配列（ｔＪ）を有する合成オリ
ゴマーＬ６とＬ７をそれぞれＩＤｐｍｏｌづつ混合した
後、ライゲーション反応を行った。
Ｌ ６ ５−ＧにＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
（：ＧＧＣＣＡＧＴＡＣ−３゜Ｌ７ ３°−ＣＧＧＡ
ＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧ−
５反応液で大腸菌ＮＭ５２２ （ストラタジーン社よ
り市！１１ｉｉ）を形質転換したのち、形質転換体から
プラスミドを単離し、シーケンスによって目的とする塩
基配列を有していることを確認したプラスミドをｐＴ２
１８ＲＰ４と命名した。
（：ＧＧＣＣＡＧＴＡＣ−３゜Ｌ７ ３°−ＣＧＧＡ
ＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＡＴＧ−
５反応液で大腸菌ＮＭ５２２ （ストラタジーン社よ
り市！１１ｉｉ）を形質転換したのち、形質転換体から
プラスミドを単離し、シーケンスによって目的とする塩
基配列を有していることを確認したプラスミドをｐＴ２
１８ＲＰ４と命名した。
（５） Ｉ）ＴＺ１９ＵＤｌ（７）作製（第７図）プラ
スミドｐＴＺ１９１１のＢｇｌ ＩとＢａｍＨＩ間にＭ
１３用リバースブライマー配列（Ｒ）を導入した。
スミドｐＴＺ１９１１のＢｇｌ ＩとＢａｍＨＩ間にＭ
１３用リバースブライマー配列（Ｒ）を導入した。
ｐＴ２１９Ｕ （東洋結社）２ｕｇを２０単位（７）Ｂ
ｇｌＩで３７℃１５分間反応し部分消化したものを、１
．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、ＢｇｌＩで１箇
所切断された切断片（２，８ｋｂｐ）をゲルから単離精
製した。
ｇｌＩで３７℃１５分間反応し部分消化したものを、１
．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、ＢｇｌＩで１箇
所切断された切断片（２，８ｋｂｐ）をゲルから単離精
製した。
この断片を１００単位のＢａｍ旧で消化し再び１．２％
のアガロースゲル電気泳動にかけた後、２．７ｋｂｐの
断片をゲルから単離精製した。得られたｐＴＺ１９Ｕの
ＢａＩＩ旧−ＢｇｌＩ断片に、Ｍ１３シーケンス用リバ
すスブライマー配列（Ｒ）を有′する合成オリゴマーＬ
８とＬ９をそれぞれ１Ｏｐｍｏｌづつ混合した後、ライ
ゲーション反応を行った。
のアガロースゲル電気泳動にかけた後、２．７ｋｂｐの
断片をゲルから単離精製した。得られたｐＴＺ１９Ｕの
ＢａＩＩ旧−ＢｇｌＩ断片に、Ｍ１３シーケンス用リバ
すスブライマー配列（Ｒ）を有′する合成オリゴマーＬ
８とＬ９をそれぞれ１Ｏｐｍｏｌづつ混合した後、ライ
ゲーション反応を行った。
Ｌ ８ ５−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ
ＡＣＣＡＴ−３Ｌ ９ ３−ＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＧ−５反応液で大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した後、形質転換体からプラ
スミドを単離し、シーケンスによって目的とする塩基配
列を有していることを確認したプラスミドをｐＴ２１９
ｔｌＤｌと命名した。
ＡＣＣＡＴ−３Ｌ ９ ３−ＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ
ＴＧＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＧ−５反応液で大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した後、形質転換体からプラ
スミドを単離し、シーケンスによって目的とする塩基配
列を有していることを確認したプラスミドをｐＴ２１９
ｔｌＤｌと命名した。
（６） ｐＫＡＯの作製（第７図ン
（５）で作製したｐＴＺ１９ＵＤｌ ｌ（ｌ ｕ ｇを
１００単位のＢｇｌｌ、 １００単位のＨｉｎｄｌＩＩ
で完全消化した後、１．２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、 ｆ１オノジンを含む１ 、４ｋｂｐの断片を単
離精製した。 ｐＬｌ（ファルマシア社製）ｌＯＬＬ
ｇを１００単位のＨｉｎｄＩＩＩと１００単位のＢａｍ
ＨＩで消化後、１８％アガロースゲル電気泳動にかけ、
ＳＶ４０のオリジンと初期プロモータを含む４２０ｂｐ
の断片を単離精製した。ｐｃＤＶｌ （ファルマシア
社） １０μｇを１００単位のＢａｍ旧と１００単位の
Ｂ［ｌＩで消化した後、 ０．８％アガロースゲル電気
泳動にかけ、ポリＡ付加シグナルを含む１．６ｋｂｐの
断片を単離精製した。
１００単位のＢｇｌｌ、 １００単位のＨｉｎｄｌＩＩ
で完全消化した後、１．２％アガロースゲル電気泳動に
かけ、 ｆ１オノジンを含む１ 、４ｋｂｐの断片を単
離精製した。 ｐＬｌ（ファルマシア社製）ｌＯＬＬ
ｇを１００単位のＨｉｎｄＩＩＩと１００単位のＢａｍ
ＨＩで消化後、１８％アガロースゲル電気泳動にかけ、
ＳＶ４０のオリジンと初期プロモータを含む４２０ｂｐ
の断片を単離精製した。ｐｃＤＶｌ （ファルマシア
社） １０μｇを１００単位のＢａｍ旧と１００単位の
Ｂ［ｌＩで消化した後、 ０．８％アガロースゲル電気
泳動にかけ、ポリＡ付加シグナルを含む１．６ｋｂｐの
断片を単離精製した。
上記３つの断片をライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩ
の形質転換を行った。形質転換体からプラスミドを単離
し、ＢａｍＨｌ、 ＢｇＬｌ、 ＨｉｎｄｌＩＩによる
制限酵素地図から、目的とするプラスミドｐＫＡＯであ
ることを確証した。
の形質転換を行った。形質転換体からプラスミドを単離
し、ＢａｍＨｌ、 ＢｇＬｌ、 ＨｉｎｄｌＩＩによる
制限酵素地図から、目的とするプラスミドｐＫＡＯであ
ることを確証した。
（７） ｐＫＡｌａの作製（第８図）
（４）で作製したプラスミドｐＴ２１８ＲＰ４１０ｕｇ
を１００単位のＢａｍＨＩと１００単位のＸｈｏＩで消
化後、 １，８％アガロースゲル電気泳動にかけ、１１
７ｂｐの断片を単離精製した。次いで（６）で作製した
プラスミドｐＫＡ０１０ ｕｇを１００単位のＢａ＋ｎ
ＨＩと１００単位のＸｈｏＩで消化後、０．８％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、３．３ｋｂｐの断片を単離精
製した。両者の断片をライゲーション後、大腸菌）ＩＢ
ＩＯＩの形質転換を行った。形質転換体からプラスミド
を単離し、ＢａｍＨｌ、 ＸｈｏＩによる制限酵素地図
から、目的とするプラスミドｐＫＡ１ａであることを確
認した。
を１００単位のＢａｍＨＩと１００単位のＸｈｏＩで消
化後、 １，８％アガロースゲル電気泳動にかけ、１１
７ｂｐの断片を単離精製した。次いで（６）で作製した
プラスミドｐＫＡ０１０ ｕｇを１００単位のＢａ＋ｎ
ＨＩと１００単位のＸｈｏＩで消化後、０．８％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、３．３ｋｂｐの断片を単離精
製した。両者の断片をライゲーション後、大腸菌）ＩＢ
ＩＯＩの形質転換を行った。形質転換体からプラスミド
を単離し、ＢａｍＨｌ、 ＸｈｏＩによる制限酵素地図
から、目的とするプラスミドｐＫＡ１ａであることを確
認した。
（８） ｐＫＡｌｂの作製（第８区）
ｐＬｌ １０ｕ ｇを１００単位のＰｓｔＩで消化後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、これをＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化した後、 １８％アガロースゲル電
気亦動にかけ、ＳＶ４０プロモーターと１６ｓスプライ
ス部位を含む５００ｂｐの断片を単離精製した。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化し、これをＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化した後、 １８％アガロースゲル電
気亦動にかけ、ＳＶ４０プロモーターと１６ｓスプライ
ス部位を含む５００ｂｐの断片を単離精製した。
ｐＫＡｌａ １ ｕｇを１００単位のＸｈｏｌで切断後
、フレノウ断片により平滑末端化した。さらに １００
単位のＨｉｎｄＩＨで切断後、０８％アガロースゲル電
気泳動にかけ、３ｋｂｐの断片を単離精製した。
、フレノウ断片により平滑末端化した。さらに １００
単位のＨｉｎｄＩＨで切断後、０８％アガロースゲル電
気泳動にかけ、３ｋｂｐの断片を単離精製した。
両者の断片をライゲーション後、大腸菌ＨＢＩＯＩの形
質転換を行った。形質転換体からプラスミドを単離し、
ＨｉｎｄＴＩｌ、ＢａｍＨＩによる制限酵素地図から、
目的とするプラスミドｐＫＡ１ｂであることを確認した
。
質転換を行った。形質転換体からプラスミドを単離し、
ＨｉｎｄＴＩｌ、ＢａｍＨＩによる制限酵素地図から、
目的とするプラスミドｐＫＡ１ｂであることを確認した
。
（９）ｐＫＡｌの作製（第８図）
プラスミドｐＫＡ１ｂ １０μｇを１００単位のＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルから３．６ｋｂの断片を単離精製した。これ
に制限酵素部位５ｆｉＩを含む合成オリゴマーＬＩＯと
Ｌｌｌを１０μｗ＋ｏｌずつ混合してアニールさせた後
、ライゲーション反応を行なった。
ｄＩＩＩで消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に
かけ、ゲルから３．６ｋｂの断片を単離精製した。これ
に制限酵素部位５ｆｉＩを含む合成オリゴマーＬＩＯと
Ｌｌｌを１０μｗ＋ｏｌずつ混合してアニールさせた後
、ライゲーション反応を行なった。
Ｌ １０ ５’−ＡＧＣＴＡＧＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣ
ＣＡ−３’Ｌ １１ ３−ＴＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣ
ＣＧＧＴＴＣＧＡ−５゜反応液で大腸菌ＨＢＩＯＩを形
質転換し、形質転換体を培養後プラスミドを単離した。
ＣＡ−３’Ｌ １１ ３−ＴＣＣＧＧＡＴＧＴＡＣ
ＣＧＧＴＴＣＧＡ−５゜反応液で大腸菌ＨＢＩＯＩを形
質転換し、形質転換体を培養後プラスミドを単離した。
Ｍ１３シーケンス用リバースブライマーを用いて合成オ
ノゴマー挿入部位のシーケンスを行ない、目的とする塩
基配列を有するもの、すなわち制限酵素部位が５ｐｈｌ
−３ｆｉｌ−ＨｊｎｄＩＩＩの順になっているものをｐ
ＫＡｌと命名した。ｐＫＡｌの詳細な制限酵素地図はす
でに第３図に示した。
ノゴマー挿入部位のシーケンスを行ない、目的とする塩
基配列を有するもの、すなわち制限酵素部位が５ｐｈｌ
−３ｆｉｌ−ＨｊｎｄＩＩＩの順になっているものをｐ
ＫＡｌと命名した。ｐＫＡｌの詳細な制限酵素地図はす
でに第３図に示した。
１ｎヱユ
ｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）ベクタープライマーの作製（第９図）ｐＫＡｌ
ｌｏｎμｇを２００単位のにｐｎＩで完全消化後、０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ、切断片を単離精製
した。得られた切断片７０μｇを２０μＭｄＴＴＰ存在
下、末端ヌクレオチド転移酵素（宝酒造社製）３７５単
位を加え３７℃３０分間反応させた。
ｌｏｎμｇを２００単位のにｐｎＩで完全消化後、０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ、切断片を単離精製
した。得られた切断片７０μｇを２０μＭｄＴＴＰ存在
下、末端ヌクレオチド転移酵素（宝酒造社製）３７５単
位を加え３７℃３０分間反応させた。
部について ［α−”ｐ］ｄＴＴｐの取り込み量からｄ
Ｔデテール付加数を求めたところ、約６０個であった。
Ｔデテール付加数を求めたところ、約６０個であった。
次いで反応生成物をＥｃｏＲＶで切断し、０．８％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、長い方の切断片を単離精製
した。
ロースゲル電気泳動にかけ、長い方の切断片を単離精製
した。
（２）ポリ （Ａ）＋ＲＮＡの調製
ヒト培養細胞株ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、ｔｊ９
３７、ＨＴ−１０８０を培養後、細胞を集め、グアニジ
ウムイソチオシアネート法により総量ＲＮＡを抽出した
。これをオリゴｄＴカラムにかけてポリ（Ａ） ”ＲＮ
Ａを精製した。
３７、ＨＴ−１０８０を培養後、細胞を集め、グアニジ
ウムイソチオシアネート法により総量ＲＮＡを抽出した
。これをオリゴｄＴカラムにかけてポリ（Ａ） ”ＲＮ
Ａを精製した。
（３） ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡ合成の全工程はすでに第４図に示した。
反応条件はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇらの方法（ｔｔｉ
ｉ掲文献）に準じた。酵素は宝酒造社のものを用いた。
ｉ掲文献）に準じた。酵素は宝酒造社のものを用いた。
（２）で調製したポリ（Ａ）”ＲＮＡ ３μｇを（１）
で調製したベクタープライマー１．５μｇとアニールさ
せた後、逆転写酵素２０単位を加え、第１鎖ＤＮＡを合
成した。反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿後、
ｌｔＬＭｄｃＴＰ存在下１５単位の末端デオキシヌク
レオチド転移酵素を加えてｄＣテール付加反応な行った
。反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿後、５０単
位、のＢｓｔＸＩ にニーイングランドバイオラボ２
社）で消化した。反応液をフェノール抽出エタノール沈
殿後、アニールし、大腸菌ＤＮＡリガーゼによりライゲ
ーションを行った。反応液に、ｄＮＴＰ ｆｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ） 、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ＲＮａｓｅＨを加え、ＲＮＡ鎖
をＤＮＡ鎖に置換した。
で調製したベクタープライマー１．５μｇとアニールさ
せた後、逆転写酵素２０単位を加え、第１鎖ＤＮＡを合
成した。反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿後、
ｌｔＬＭｄｃＴＰ存在下１５単位の末端デオキシヌク
レオチド転移酵素を加えてｄＣテール付加反応な行った
。反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿後、５０単
位、のＢｓｔＸＩ にニーイングランドバイオラボ２
社）で消化した。反応液をフェノール抽出エタノール沈
殿後、アニールし、大腸菌ＤＮＡリガーゼによりライゲ
ーションを行った。反応液に、ｄＮＴＰ ｆｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰ） 、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌ＲＮａｓｅＨを加え、ＲＮＡ鎖
をＤＮＡ鎖に置換した。
（４）ｃＤＮＡライブラリーの作製
（３）で調製したｃＤＮＡベクター溶液で大腸菌ＮＭ５
２２の形質転換を行った。形質転換体を２ｘＴＹ（アン
ピシリン１００μｇ ７ｍｌ含有）培地に懸濁し３７℃
−晩培養した。一部を寒天培地上に蒔いて一晩培養した
後、コロニー数を数えライブラリーに含まれる独立した
クローン数を推定したところ、２ｘｌＯ’−１０’であ
った。培養液の一部を採り、ヘルパーファージＭ１３Ｋ
Ｏ７（ファルマシア社）を感染させ、カナマイシンを７
０μｇ ／ｍｌになるように添加して３７℃−晩培養し
た。培養液の一部を１５％グリセロール保存液として一
８０℃で保存した。
２２の形質転換を行った。形質転換体を２ｘＴＹ（アン
ピシリン１００μｇ ７ｍｌ含有）培地に懸濁し３７℃
−晩培養した。一部を寒天培地上に蒔いて一晩培養した
後、コロニー数を数えライブラリーに含まれる独立した
クローン数を推定したところ、２ｘｌＯ’−１０’であ
った。培養液の一部を採り、ヘルパーファージＭ１３Ｋ
Ｏ７（ファルマシア社）を感染させ、カナマイシンを７
０μｇ ／ｍｌになるように添加して３７℃−晩培養し
た。培養液の一部を１５％グリセロール保存液として一
８０℃で保存した。
（５）ｃＤＮＡベクタープラスミドの単離（４）で調製
したｃＤＮＡライブラリー大腸菌培養液を遠心し、得ら
れた菌体を２ ｘＴＹ培地で十分洗浄した後、大腸菌Ｎ
Ｍ５２２培養液並びに４７℃に保温した軟寒天培地と混
合し、２ｘＴＹ寒天培地上にすばや（流し込んだ。これ
を３７℃で一晩インキユベートしてプラークを形成させ
た。単一プラークを単離して２ ｘＴＹ培地に懸濁し３
７℃−晩培養した。
したｃＤＮＡライブラリー大腸菌培養液を遠心し、得ら
れた菌体を２ ｘＴＹ培地で十分洗浄した後、大腸菌Ｎ
Ｍ５２２培養液並びに４７℃に保温した軟寒天培地と混
合し、２ｘＴＹ寒天培地上にすばや（流し込んだ。これ
を３７℃で一晩インキユベートしてプラークを形成させ
た。単一プラークを単離して２ ｘＴＹ培地に懸濁し３
７℃−晩培養した。
培養液を遠心し、菌体と上清に分け、菌体から２本鎖プ
ラスミドを、培養上清から１本鎖ＤＮＡを単離した。培
養液は１５％グリセロール溶液として一８０℃で凍結保
存し、２本鎖プラスミドと１本鎖ＤＮＡはＴＥに溶解し
た後−２０℃で凍結保存、培養上清は４℃で冷蔵保存し
た。
ラスミドを、培養上清から１本鎖ＤＮＡを単離した。培
養液は１５％グリセロール溶液として一８０℃で凍結保
存し、２本鎖プラスミドと１本鎖ＤＮＡはＴＥに溶解し
た後−２０℃で凍結保存、培養上清は４℃で冷蔵保存し
た。
１血■１
ヒトｃＤＮＡバンクの作製
（１） ヒトｃＤＮＡインサートの大きさ決定実施例
２、（５）で単離した２本鎖プラスミドをＥｃｏＲｌ、
ＮｏｔＩで二重消化を行い、０．８アガロースゲル電
気泳動によりｃＤＮＡ断片の大きさを求めた。
２、（５）で単離した２本鎖プラスミドをＥｃｏＲｌ、
ＮｏｔＩで二重消化を行い、０．８アガロースゲル電
気泳動によりｃＤＮＡ断片の大きさを求めた。
（２）塩基配列の決定
実施例２、（５）で単離した１重鎖ｃＤＮＡベクタープ
ラスミドを、ＤＮＡシーケンサ−（アブライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて塩基配列の決定を行った。シー
ケンス反応は蛍光色素で標識したＭ１３ユニバーサルブ
ライマーとＴａｑポリメラーゼを用いジデオキシ法によ
り行った。この方法により５０末端から約４００ｂｐの
塩基配列を決定できた。５０末端には４＠〜１０個のｄ
Ｇデテール認められた。配列データは”ホモ・プロティ
ンｃＤＮＡデータベース−としてファイル化した。
ラスミドを、ＤＮＡシーケンサ−（アブライドバイオシ
ステムズ社製）を用いて塩基配列の決定を行った。シー
ケンス反応は蛍光色素で標識したＭ１３ユニバーサルブ
ライマーとＴａｑポリメラーゼを用いジデオキシ法によ
り行った。この方法により５０末端から約４００ｂｐの
塩基配列を決定できた。５０末端には４＠〜１０個のｄ
Ｇデテール認められた。配列データは”ホモ・プロティ
ンｃＤＮＡデータベース−としてファイル化した。
（３）塩基配列の解析
ファイル化された塩基配列は遺伝情報解析ソフトＧＥＮ
ＩＡＳ並びにタンパク質ペプチドー次構造解析ソフト
ＰＲＩＮＡＳ （いずれも三井情報開発社）を用いて
解析した。まず各塩基配列を用いて遺伝子データベース
ＧｅｎＢａｎｋ″の検索を行った。次いで塩基配列をア
ミノ酸配列に変換し、開始コドン並びにオーブンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＥ）の有無を調べた。もしＯＲＦ
が存在する場合には、変換されたアミノ酸配列を用いて
プロティンデータベースＰＲＩＮＡＳ ｉ三井情報開発
社）の検索を行った。
ＩＡＳ並びにタンパク質ペプチドー次構造解析ソフト
ＰＲＩＮＡＳ （いずれも三井情報開発社）を用いて
解析した。まず各塩基配列を用いて遺伝子データベース
ＧｅｎＢａｎｋ″の検索を行った。次いで塩基配列をア
ミノ酸配列に変換し、開始コドン並びにオーブンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＥ）の有無を調べた。もしＯＲＦ
が存在する場合には、変換されたアミノ酸配列を用いて
プロティンデータベースＰＲＩＮＡＳ ｉ三井情報開発
社）の検索を行った。
以上の方法によりｃＤＮＡインサートの大きさ、５′末
端からの塩基配列、ＯＲＦがコードするアミノ酸配列の
判ったｃＤＮＡベクターの集団、即ちｃＤＮＡバンクが
構築できた。これまでのところ、ＯＲＦが存在し、デー
タベース中の既知タンパク質とホモロジーのあるクロー
ンは約２０％であり、それらのほとんどは完全長クロー
ンであった。代謝系酵素、ＤＮＡ複製やタンパク質合成
に関与するタンパク質、分泌タンパク質、細胞外マトリ
ックスなど広範囲にわたるタンパク質のｃＤＮＡクロー
ンが得られた。表１に既知タンパク質とホモノロシーを
有するクローンの代表例を示す。
端からの塩基配列、ＯＲＦがコードするアミノ酸配列の
判ったｃＤＮＡベクターの集団、即ちｃＤＮＡバンクが
構築できた。これまでのところ、ＯＲＦが存在し、デー
タベース中の既知タンパク質とホモロジーのあるクロー
ンは約２０％であり、それらのほとんどは完全長クロー
ンであった。代謝系酵素、ＤＮＡ複製やタンパク質合成
に関与するタンパク質、分泌タンパク質、細胞外マトリ
ックスなど広範囲にわたるタンパク質のｃＤＮＡクロー
ンが得られた。表１に既知タンパク質とホモノロシーを
有するクローンの代表例を示す。
１血亘Ａ
ＲＮＡプローブによるプラークハイブリダイゼーション
ｉｌｌ ＲＮＡプローブの調製
ＲＮＡプローブの調製はストラタジーン社のキットを用
いて行った。２重鎖ｃＤＮＡベクタープラスミドをＮｏ
ｔ Ｉで切断後、５０ｕＣｉ （ａ −３２Ｐｌ ＣＴ
Ｐを基質として用い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｃ
ＤＮＡのセンス鎖に相当するＲＮＡプローブを合成した
。
いて行った。２重鎖ｃＤＮＡベクタープラスミドをＮｏ
ｔ Ｉで切断後、５０ｕＣｉ （ａ −３２Ｐｌ ＣＴ
Ｐを基質として用い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりｃ
ＤＮＡのセンス鎖に相当するＲＮＡプローブを合成した
。
（２）プラークハイブリダイゼーション実施例２、（５
）に記載した方法で寒天プレート上にｃＤＮＡプラーク
ライブラリーを形成させた。
）に記載した方法で寒天プレート上にｃＤＮＡプラーク
ライブラリーを形成させた。
寒天表面上に乾いたニトロセルロースフィルターを載せ
、プラーク周辺のファージをフィルター上に移した。同
様にして２枚のレプリカフィルターを調製した。フィル
ターを風乾後８０℃、３時間加熱処理を行った。フィル
ターを５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１０ｘデンハ
ルト溶液、０．１％ＳＤＳ溶液中で３７℃２時間プレイ
ンキューベートした後、（１）で調製したＲＮＡプロー
ブを添加し、さらに３７℃、１６時間インキニーベント
した。フィルターを０．２ ｘＳＳＣｌＱ、１％ＳＤＳ
Ｇ液で６５℃、１時間洗浄し、風乾後オートラジオグ
ラフィーにかけた。第１０図（Ａ）に、アクチンｃＤＮ
Ａを有するプラスミドベクターを用いたモデル実験の例
を示す。プラークの存在するところにシグナルが認めら
れる。
、プラーク周辺のファージをフィルター上に移した。同
様にして２枚のレプリカフィルターを調製した。フィル
ターを風乾後８０℃、３時間加熱処理を行った。フィル
ターを５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，１０ｘデンハ
ルト溶液、０．１％ＳＤＳ溶液中で３７℃２時間プレイ
ンキューベートした後、（１）で調製したＲＮＡプロー
ブを添加し、さらに３７℃、１６時間インキニーベント
した。フィルターを０．２ ｘＳＳＣｌＱ、１％ＳＤＳ
Ｇ液で６５℃、１時間洗浄し、風乾後オートラジオグ
ラフィーにかけた。第１０図（Ａ）に、アクチンｃＤＮ
Ａを有するプラスミドベクターを用いたモデル実験の例
を示す。プラークの存在するところにシグナルが認めら
れる。
（３）サブトラクションｌ去
アクチンｃＤＮＡを含むクローンからＲＮＡプロブと１
本鎖ＤＮＡを調製し、両者を前もってパイプリダイゼン
ーションした。この混合物をプローブとして、アクチン
１本鎮ＤＮＡを含むファージをスポットにしたフィルタ
ーとハイブリダイズさせたところ、第１０図（Ｂ）に示
す様にシグナルはまったく得られなかった。即ち、この
ことは、ＲＮＡプローブを対応する１本鎖ＤＮＡとブリ
ハイブリダイゼーションすることにより、プローブとし
ての機能を完全に抑えることが出来ることを意味し、第
５図に示したサブトラクション法が可能であることが示
された。
本鎖ＤＮＡを調製し、両者を前もってパイプリダイゼン
ーションした。この混合物をプローブとして、アクチン
１本鎮ＤＮＡを含むファージをスポットにしたフィルタ
ーとハイブリダイズさせたところ、第１０図（Ｂ）に示
す様にシグナルはまったく得られなかった。即ち、この
ことは、ＲＮＡプローブを対応する１本鎖ＤＮＡとブリ
ハイブリダイゼーションすることにより、プローブとし
ての機能を完全に抑えることが出来ることを意味し、第
５図に示したサブトラクション法が可能であることが示
された。
１胤？＋ ５
プリージョン法によるｃＤＮＡインサートの全塩基配列
決定 表１に示したＴＮＦ （腫瘍壊死因子）ｃＤＮＡを含む
クローンＮｏ、１６から単離したプラスミドｐにＡＴＴ
Ｅ１０１５μｇを２０単位の５ｐｈＩついで１５単位の
５ｎａＢ Ｉで切断後、エキソヌクレアーゼＩＩＩを加
え３７℃で反応させ１分間隔でサンプリングした後、マ
ングビーンヌクレアーゼ処理、ついでフレノウ処理後、
セルフライゲーションを行ないｃＤＮＡインサートの５
０末端を欠失したプラスミドを調製した。以上の反応は
宝酒造社製のキロデレージョンキットを用いて行なった
、それぞれの欠失体から実施例２ｆ４１．ｆ５１ に記
載した方法で１本鎖ＤＮＡを調製し、実施例３（２）と
同様の方法で塩基配列を決定した。ただし、この際シー
ケンス用ブライマーとしてＭ １３用リバースブライマ
ーを用いた。その結果５０末端からそれぞれ１５０ｂｐ
、３ｏｏｂｐ、６ｏｏｂｐ。
決定 表１に示したＴＮＦ （腫瘍壊死因子）ｃＤＮＡを含む
クローンＮｏ、１６から単離したプラスミドｐにＡＴＴ
Ｅ１０１５μｇを２０単位の５ｐｈＩついで１５単位の
５ｎａＢ Ｉで切断後、エキソヌクレアーゼＩＩＩを加
え３７℃で反応させ１分間隔でサンプリングした後、マ
ングビーンヌクレアーゼ処理、ついでフレノウ処理後、
セルフライゲーションを行ないｃＤＮＡインサートの５
０末端を欠失したプラスミドを調製した。以上の反応は
宝酒造社製のキロデレージョンキットを用いて行なった
、それぞれの欠失体から実施例２ｆ４１．ｆ５１ に記
載した方法で１本鎖ＤＮＡを調製し、実施例３（２）と
同様の方法で塩基配列を決定した。ただし、この際シー
ケンス用ブライマーとしてＭ １３用リバースブライマ
ーを用いた。その結果５０末端からそれぞれ１５０ｂｐ
、３ｏｏｂｐ、６ｏｏｂｐ。
５ｓｏｂｐ、１０５０ｂｐ、１３００ｂｐ欠失したプラ
スミドを得ることができ、これらの５゛末端シーケンス
によりｃＤＮＡの全領域をカバーする塩基配列を決定で
きた。なお、得られた塩基配列はすでに報告されている
ＴＮＦの塩基配列と−た。
スミドを得ることができ、これらの５゛末端シーケンス
によりｃＤＮＡの全領域をカバーする塩基配列を決定で
きた。なお、得られた塩基配列はすでに報告されている
ＴＮＦの塩基配列と−た。
叉上Ｕ吐旦
哺乳動物細胞によるｃＤＮＡの発現
実施例５で塩基配列を決定したｐＫＡＴＮＦｌをＣＯ３
７細胞（ＡＴＣＣより分譲）に導入し、その培養上清の
ＴＮＦ活性を測定した。まずプラスミドｐＫＡＴＮＦ
ｌを単離した後、エフトロボレーション法により５ｘｌ
Ｏ’個のＣＯ３７細胞に導入した。ＣＯ３７をＭＥＭ培
地中で３日間培養した後、培養上清を採り、マウス上９
２９細胞（ＡＴＣＣより分譲）を用いたＴＮＦアッセイ
にかけた。その結果、培養上清に２．９ ｘ １０’ｌ
Ｊ／ｍｌのＴＮＦ活性が認められ、ベクター上のＳＶ４
０プロモーターが正常に作動していることが示された。
７細胞（ＡＴＣＣより分譲）に導入し、その培養上清の
ＴＮＦ活性を測定した。まずプラスミドｐＫＡＴＮＦ
ｌを単離した後、エフトロボレーション法により５ｘｌ
Ｏ’個のＣＯ３７細胞に導入した。ＣＯ３７をＭＥＭ培
地中で３日間培養した後、培養上清を採り、マウス上９
２９細胞（ＡＴＣＣより分譲）を用いたＴＮＦアッセイ
にかけた。その結果、培養上清に２．９ ｘ １０’ｌ
Ｊ／ｍｌのＴＮＦ活性が認められ、ベクター上のＳＶ４
０プロモーターが正常に作動していることが示された。
表１ ｃＤＮＡバンクに含まれるクローンの例クロー
ン番号 ホモロジー有する既知蛋白質ＨＭＧ １ ４ ＨＭＧ １ ７ リポソーム蛋白質Ｓ１４ リポソーム蛋白質Ｓ１７ リポソームホスフオプロテインＰ１ 延長因子１ａ 開始因子ａ２ クリセルアルデヒド−３−リ ン酸脱水素酵素ピルビン
酸キナーゼ β−アクチン プロフィリン 熱シヨツク蛋白質９０ｋＤａ ガラクトシダーゼＡ ラミニン結合蛋白質 ブラスミノーケンアクチベーターインヒビター−２ＴＮ
Ｆ（腫瘍壊死因子） ミトコンドリアチトクロームｂ 第２区は、本発明のクローニングベクターにおけるプロ
モーターの配置を示す区、 第３図は、本発明のベクターｐＫＡ １の制限酵素地区
、 第４図は、本発明のベクタープラスミドを用いたｃＤＮ
Ａの合成工程を示す図、 第５区は、本発明のｃＤＮＡベクター系を用いたサブト
ラクション法を説明するための図、第６図ないし第８区
は、本発明のベクターを構築する工程を説明するための
図、 第９図は、本発明のベクタープライマーを作製する方法
を示す図。
ン番号 ホモロジー有する既知蛋白質ＨＭＧ １ ４ ＨＭＧ １ ７ リポソーム蛋白質Ｓ１４ リポソーム蛋白質Ｓ１７ リポソームホスフオプロテインＰ１ 延長因子１ａ 開始因子ａ２ クリセルアルデヒド−３−リ ン酸脱水素酵素ピルビン
酸キナーゼ β−アクチン プロフィリン 熱シヨツク蛋白質９０ｋＤａ ガラクトシダーゼＡ ラミニン結合蛋白質 ブラスミノーケンアクチベーターインヒビター−２ＴＮ
Ｆ（腫瘍壊死因子） ミトコンドリアチトクロームｂ 第２区は、本発明のクローニングベクターにおけるプロ
モーターの配置を示す区、 第３図は、本発明のベクターｐＫＡ １の制限酵素地区
、 第４図は、本発明のベクタープラスミドを用いたｃＤＮ
Ａの合成工程を示す図、 第５区は、本発明のｃＤＮＡベクター系を用いたサブト
ラクション法を説明するための図、第６図ないし第８区
は、本発明のベクターを構築する工程を説明するための
図、 第９図は、本発明のベクタープライマーを作製する方法
を示す図。
第１０図は、本発明の系を用いて、プラークハイブリダ
イゼーションとサブトラクション法を行った結果を示す
。
イゼーションとサブトラクション法を行った結果を示す
。
第１図は、本発明のｃＤＮＡベクターの機能を示す図、
ｍＲＮＡ
ベクタ
プライマ
５ｊＸＩ
Ｙｌｆ口
１１開平４−１１７２９２（１５）
湯３■
ｃｏＲＶ
口
Claims (6)
- （１）哺乳動物細胞用プロモーターＰＲ１と、その下流
に位置し、真核細胞遺伝子に出現頻度の少ないユニーク
な制限酵素部位ＲＥ１及びＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーターＰＲ２と、その下流に位置し、ｄＧオリゴマーか
らなる３′突出末端を生成するユニークな制限酵素部位
ＲＥ２と、その下流に位置するユニークな任意の制限酵
素部位ＲＥ３と、その下流に位置するユニークな任意の
３′突出末端生成制限酵素部位ＲＥ４と、その下流に位
置し、真核細胞遺伝子に出現頻度の少ないユニークな制
限酵素部位ＲＥ５及びＲＮＡポリメラーゼプロモーター
ＰＲ３と、制限酵素部位ＲＥ１の上流の任意の位置に存
在する少なくとも１種類の任意の３′突出末端生成制限
酵素部位ＲＥ６と、さらに上記以外の任意の位置に、哺
乳動物細胞用複製オリジンＯＲ１、１本鎖ファージの複
製オリジンＯＲ２、大腸菌用複製オリジンＯＲ３及び選
択マーカーを有するクローニングベクタープラスミド。 - （２）ｐＫＡ１である請求項１記載のプラスミド。
- （３）請求項１記載のプラスミドを制限酵素部位ＲＥ４
で切断後、末端デオキシヌクレオチド転移酵素によりｄ
Ｔテール付加を行ない、さらに制限酵素部位ＲＥ３で切
断することにより調製したベクタープライマー。 - （４）請求項２記載のプラスミドを、制限酵素Ｋｐｎ
I で切断後、末端デオキシヌクレオチド転移酵素により
ｄＴテールを付加し、さらに制限酵素ＥｃｏＲＶで切断
することにより調製した請求項３記載のベクタープライ
マー。 - （５）請求項３又は４に記載のベクタープライマーをプ
ライマーとして用いて、細胞から単離したポリ（Ａ）＾
＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡ含有プラ
スミドを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換
体にヘルパーファージを感染させることによりｃＤＮＡ
プラークライブラリーを調製し、この中の独立したプラ
ークから１本鎖ＤＮＡを調製し、この１本鎖ＤＮＡを用
いてｃＤＮＡインサートの５０末端からシーケンスする
ことにより、塩基配列が決定され且つ哺乳動物細胞内で
発現可能なｃＤＮＡベクターからなるｃＤＮＡバンクを
作製する方法。 - （６）請求項５記載の方法で２種のｃＤＮＡライブラリ
ーＬＡならびにライブラリーＬＢを作製し、ライブラリ
ーＬＡからＲＮＡポリメラーゼを用いてセンス鎖のＲＮ
Ａプローブ集団を調製し、一方ライブラリーＬＢからア
ンチセンス鎖の１本鎖ｃＤＮＡ集団を調製し、ＲＮＡプ
ローブ集団と１本鎖ｃＤＮＡ集団の両者を混合してハイ
ブリダイズさせた物をプローブとして用いてライブラリ
ーＬＡをスクリーニングすることにより、ライブラリー
ＬＡに特異的なｃＤＮＡクローンを得、これを５’末端
からシーケンスし、ライブラリーＬＡに特異的で、塩基
配列が決定され且つ哺乳動物細胞内で発現可能なｃＤＮ
Ａバンクを作製する方法。
Priority Applications (4)
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| EP19900311931 EP0426455B1 (en) | 1989-10-31 | 1990-10-31 | Cloning vector plasmid, vector-primer derived therefrom and preparation method of cDNA bank using the same |
| DE1990622165 DE69022165T2 (de) | 1989-10-31 | 1990-10-31 | Klonierungs-Plasmid-Vektor, Primer-Vektor davon und Herstellungsverfahren einer cDNA-Bank. |
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-
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-
1996
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|---|---|---|---|---|
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