KR100418015B1 - 단일 효소 절단에 의해 ｐｃｒ 산물을 클로닝할 수 있는ｐｃｒ ｔ/ａ 클로닝 벡터 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일 효소 절단에 의해 PCR(polymerase chain reaction) 산물을 클로닝할 수 있는 PCR T/A 클로닝 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 제한효소 XcmI의 단 한번의 절단에 의해 클로닝 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출(deoxythymine overhang)을 형성하게 하는 DNA 단편을 제조하고, 이를 이용하여 PCR 산물의 양쪽 3'-말단에 위치하는 데옥시아데닌 돌출(deoxyadenine overhang)과 용이하게 결합할 수 있으며 양쪽 3'-말단의 데옥시티민 돌출을 중심으로 양방향의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)를 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 단편은 기존의 벡터에 응용되어 단시간안에 간단한 방법으로 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조할 수 있으며, 이와 같이 제조된 PCR T/A 클로닝 벡터는 PCR 산물의 클로닝 뿐 아니라 재용출 및 재클로닝을 용이하게 하여 분자생물학 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

Description

단일 효소 절단에 의해 ＰＣＲ 산물을 클로닝할 수 있는 ＰＣＲ Ｔ/Ａ 클로닝 벡터 및 이의 제조방법{PCR T/A cloning vector for cloning PCR product by single enzyme digestion and process for preparing thereof}

본 발명은 단일 효소 절단에 의해 PCR(polymerase chain reaction) 산물을 클로닝할 수 있는 PCR T/A 클로닝 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 제한효소 XcmI의 단 한번의 절단에 의해 클로닝 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출(deoxythymine overhang)을 형성하게 하는 DNA 단편을 제조하고, 이를 이용하여 PCR 산물의 양쪽 3'-말단에 위치하는 데옥시아데닌 돌출(deoxyadenine overhang)과 용이하게 결합할 수 있으며 양쪽 3'-말단의 데옥시티민 돌출을 중심으로 양방향의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, 이하 "MCS"로 약칭함)를 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"로 약칭함)은 일반적으로 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)를 이용하여 특정 염기서열을 증폭하는 방법이다. Taq DNA 중합효소는 95℃의 고온에서도 성장가능한 고온성 미생물인 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 분리된 내열성(thermostable) DNA 중합효소로서, PCR의 변성단계(denaturation step)에서 열에 의해 불활성화되지 않으므로 기존의 DNA 중합효소를 사용할 경우 증폭단계(amplification step)에서 매회 새로운 효소로 바꾸어 주어야 하는 문제점을 해소하였다. 또한, Taq DNA 중합효소를 사용하여 PCR을 수행할 경우에는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)의 어닐링(annealing) 및 신장(extension)이 훨씬 높은 온도에서 이루어질 수 있으므로, 오인식(mispriming)되어 잘못 중합되는 확률을 줄일 수 있다. 이러한 결과는 PCR 증폭 반응의 특이성 및 효율을 향상시켰을 뿐 아니라 증폭되는 PCR 산물의 크기도 증가시키는 효과를 가져왔다.

한편, 이러한 장점을 가지는 Taq DNA 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편은 비주형-의존성 첨가(nontemplate-dependent addition)에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시아데닌 돌출(deoxyadenine overhang)이 형성되는데, 이러한 특성 으로 인하여 현재까지는 PCR 산물의 클로닝이 용이하지 않다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위하여 PCR 반응을 통해 증폭된 DNA를 용이하게 클로닝할 수 있는PCR T/A 클로닝 벡터(PCR T/A cloning vector)가 개발되어 상용화되고 있다. PCR T/A 클로닝 벡터는 선형화(linearized)된 형태로 존재하고 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출(deoxythymine)이 형성되어 있어 PCR 산물의 양쪽 3'-말단에 존재하는 데옥시아데닌 돌출과 중합(ligation)될 수 있도록 제작된 클로닝 벡터이다.

이러한 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하기 위한 방법은 우선, 플라스미드(plasmid) DNA 벡터를 특정한 제한효소(restriction enzyme)로 절단하여 선형화시킨다. 이때, 제한효소는 EcoRV, DraI 또는 HincII 등과 같이 벡터의 절단된 부위가 뭉툭한 형태(blunt type)가 되도록 블런트-말단(bunt-end)을 형성할 수 있는 제한효소를 사용한다. 일반적으로 상기와 같은 제한효소로 절단하여 블런트-형태의 말단을 형성시킨 후 양쪽 3'-말단에 데옥시티민을 첨가하여 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조한다. 하지만, 이러한 방법은 블런트-형태의 말단을 형성하기 위해 사용될 수 있는 제한효소가 한정되어 있고 제한효소 처리 후에 다시 데옥시티민을 터미널트랜스퍼레이즈 (terminal transferase) 의해 연결시켜야 하는 번거로움이 있어 제조방법이 복잡하고 시간과 비용 면에서 효율적이지 못한 단점이 있다. 또한, 이와 같이 제조된 기존의 PCR T/A 클로닝 벡터는 PCR 산물을 벡터에 클로닝 한 후 다시 PCR 산물을 용출(elution)하기 위하여 두 종류의 제한효소를 사용해야만 하는 단점을 가지고 있다.

이러한 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 제한효소 XcmI의 특성을 이용하여 플라스미드 DNA 벡터를 단 한번의 제한효소 처리에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성될 수 있는 DNA 단편을 고안하고 이를 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터를 개발하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 PCR T/A 클로닝 벡터의 양쪽 3'-말단에 형성된 데옥시티민 돌출을 중심으로 MCS(multi-cloning site)가 양방향으로 위치하게 고안함으로써 PCR 산물의 재용출 및 재클로닝을 용이하게 할 수 있는 PCR T/A 클로닝 벡터를 개발하였다. 따라서, 본 발명의 DNA 단편은 기존의 벡터에 응용되어 단시간안에 간단한 방법으로 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조할 수 있으며, 이와 같이 제조된 PCR T/A 클로닝 벡터는 PCR 산물의 클로닝 뿐 아니라 재용출 및 재클로닝을 용이하게 하여 분자생물학 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 단일 효소 절단에 의해 클로닝 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출(deoxythymine overhang)을 형성하게 하는 DNA 단편을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 DNA 단편을 포함하여 PCR 산물의 양쪽 3'-말단에 위치하는 데옥시아데닌 돌출(deoxyadenine overhang)과 용이하게 결합할 수 있는 PCR T/A 클로닝 벡터를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 PCR 산물의 재용출 및 재클로닝을 용이하게 하기위하여 양방향으로 MCS가 위치하는 PCR T/A 클로닝 벡터를 제공하는 것이다.

마지막으로, 본 발명의 목적은 상기 PCR T/A 클로닝 벡터의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 PCR 산물을 클로닝하기 위해 사용되는 T/A 벡터와 PCR 산물과의 일반적인 결합모습을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 DNA 단편 Ⅰ과 DNA 단편 Ⅱ가 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥 형태의 DNA 단편 Ⅲ을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 DNA 단편 Ⅲ을 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG의 모식도를 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 pLUG 벡터에 양방향으로 MCS를 삽입하여 제조한 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi의 모식도를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 pLUG-Multi 벡터에 PCR 산물을 클로닝하여 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,

레인 1 : 분자량 크기 마커 레인 2 : pLUG-Multi 벡터 DNA

레인 3 : PCR 산물(β-액틴)

레인 4 : pLUG-Multi 벡터 및 PCR 산물이 클로닝된 벡터의 모습

도 6a는 β-액틴 PCR 산물이 클로닝된 pLUG-Multi 벡터로부터 MCS 내 다양한 효소로 절단하여 재용출한 PCR 산물을 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,

레인 M : 분자량 크기 마커 레인 1 : EcoRI/ApoI

레인 2 : SacI 레인 3 : KpnI

레인 4 : SmaI/XbaI 레인 5 : BamHI

레인 6 : XbaI 레인 7 : SalI/AccI

레인 8 : HincII 레인 9 : PstI

레인 10 : SphI 레인 11 : HindIII

도 6b는 본 발명의 pLUG-Multi 벡터로부터 MCS 내 다양한 효소의 절단에 의해 PCR 산물이 재용출되는 모식도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 제한효소 XcmI으로 단 한번의 절단에 의해 플라스미드 DNA 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 형성할 수 있는 DNA 단편을 제공한다.

제한효소 XcmI 인식부위는서열번호 1로 기재되는 15개의 뉴클레오티드(nucleotides)로 구성되며, 상기 제한효소는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치를 절단한다. 제한효소 XcmI은 15개 뉴클레오티드 중 5'-말단의 CCA와 3'-말단의 GGT만을 인식하면 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치를 절단하고, 양쪽 말단 사이에 위치하는 9개의 뉴클레오티드는 A, G, T 및 C 중 어느 것이어도 무관한 특징을 갖고 있다. 따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 제한효소 XcmI의 인식부위가 갖는 특징을 이용하여 플라스미드 DNA 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 형성할 수 있는 DNA 단편을 제조하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 제한효소 XcmI의 인식부위 중 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치에 데옥시티민이 위치하는 DNA 단편을 고안하여 상기 제한효소 XcmI에 의해 절단될 경우 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되도록 하였다.

하지만, 상기와 같이 플라스미드 DNA 벡터에 제한효소 XcmI의 인식부위가 하나만 존재하면 제한효소 XcmI에 의해 절단될 경우 한쪽의 3'-말단에만 데옥시티민돌출이 형성되고 다른 한쪽의 3'-말단에는 데옥시아데닌 돌출이 형성되어, 양쪽 3'-말단에 데옥시아데닌 돌출이 존재하는 PCR 산물을 클로닝하기 위해서는 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 존재해야만 하는 PCR T/A 클로닝 벡터의 기본적인 형태와 다르게 형성되기 때문에 PCR T/A 클로닝 벡터로서의 완전한 기능을 수행할 수 없다.

이러한 문제점을 보완하기 위하여, 본 발명자들은 제한효소 XcmI의 인식부위를 두 군데 포함하는 DNA 단편을 개발하였다.

본 발명자들은 제한효소 XcmI의 인식부위를 두 개 포함하는 단일가닥(single stranded)으로서 서로 상보적인 염기서열을 갖는 두 종류의 DNA 단편을 제조하여 이들을 결합시켜 이중가닥(double stranded)의 DNA 단편을 형성하도록 고안하였다. 첫 번째 DNA 단편 Ⅰ은서열번호 2로 기재되는 42 bp 크기의 뉴클레오티드로 구성된 단일가닥의 DNA 단편으로서 두 개의 제한효소 XcmI 인식부위를 포함하는데, 첫 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치에 데옥시티민이 위치하고 두 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치에 데옥시아데닌이 위치하도록 하였다. 상기와 같이 제한효소 XcmI의 인식부위를 두 개 포함하는 단일가닥의 DNA 단편 Ⅰ을 제조한 후, DNA 단편 Ⅰ과 상보적인 염기서열을 갖는서열번호 3으로 기재되는 DNA 단편 Ⅱ를 제조하였다. DNA 단편 Ⅲ은 상기의 DNA 단편 Ⅰ과 DNA 단편 Ⅱ를 서로의 상보적 염기서열에 의해 결합시켜 제조하였으며(도 2참조), 제한효소 XcmI의 단 한번의 처리에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 형성하게 된다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 두 개의 제한효소 XcmI 인식부위를 포함하는 DNA 단편에 의해 PCR 산물을 용이하게 클로닝할 수 있는 PCR T/A 클로닝 벡터를 제공한다.

본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터에 사용될 수 있는 출발벡터는 상기 DNA 단편을 클로닝할 수 있는 기존의 모든 벡터가 이용가능하며, 특히 발현벡터를 이용하면 중간단계의 클로닝 과정 없이 바로 목적하는 DNA의 발현을 확인할 수 있는 장점을 갖는다.

본 발명은 바람직한 실시예로서 기존의 플라스미드 DNA 벡터 pUC18을 이용하여 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하였다. 구체적으로, 상기와 같이 제조된 제한효소 XcmI의 인식부위를 두 군데 포함하는 DNA 단편을 pUC18 플라스미드 DNA 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제조한 후 상기 재조합 플라스미드 벡터를 대장균에 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 선별하였다. 선별된 대장균 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하여 염기서열 분석(sequencing)을 수행한 결과, 상기 대장균 형질전환체로부터 분리한 플라스미드 DNA는 제한효소 XcmI 처리에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되며서열번호 4로 기재되는 염기서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 재조합 플라스미드 벡터를 pLUG로 명명하고(도 3참조), 대장균 형질전환체는 2000년 5월 9일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 18017P).

본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG로부터 제한효소 HindIII의 절단에 의해얻을 수 있는 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성된 DNA 단편은 기존의 모든 벡터에 이를 클로닝하여 PCR T/A 클로닝 벡터화하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 단편 및 이를 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터는 기존의 플라스미드 DNA 벡터에 응용되어 단시간안에 간단한 방법으로 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조할 수 있으며 PCR 산물을 용이하게 클로닝할 수 있어 분자생물학 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 벡터의 양쪽 3'-말단에 형성된 데옥시티민 돌출을 중심으로 양방향으로 MCS가 거꾸로 삽입된 PCR T/A 클로닝 벡터를 제공한다.

기존의 PCR T/A 클로닝 벡터는 PCR 산물을 벡터에 클로닝한 후 PCR 산물을 용출(elution)하기 위해서 두 종류의 제한효소를 사용해야만 하는 단점을 가지고 있는데, 이러한 문제점을 해소하기 위하여 본 발명자들은 한 종류의 제한효소만을 사용하여 PCR 산물을 용이하게 용출할 수 있는 PCR T/A 클로닝 벡터를 고안하였다.

구체적으로, 상기에서 제조된 pLUG 벡터를 제한효소로 절단한 후 양쪽 3'-말단에 형성된 데옥시티민 돌출을 중심으로 하여 양방향으로 MCS가 거꾸로 위치하도록 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였다. 이를 대장균에 형질전환시키고 상기와 동일한 방법으로 형질전환체를 선별하여 플라스미드 DNA를 분리한 후 DNA 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, 대장균 형질전환체로부터 분리한 플라스미드 DNA는 양쪽 3'-말단의 데옥시티민 돌출을 중심으로 양방향의 MCS가 거꾸로 위치하고 있으며서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되어 있음을확인하였다. 본 발명자들은 pLUG 벡터에 MCS가 삽입된 재조합 플라스미드 벡터를 pLUG-Multi 벡터로 명명하고(도 4참조), 대장균 형질전환체는 2000년 5월 9일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 18018P).

상기와 같이 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi는 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 중심으로 양방향으로 거꾸로 위치하는 MCS를 포함하고 있어 PCR 산물의 재용출 및 재클로닝이 매우 용이하다.

마지막으로, 본 발명은 상기의 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터의 제조방법은

ⅰ)서열번호 1로 기재되는 제한효소 XcmI의 인식부위에서 첫 번째는 CCA로부터 5번째 뉴클레오티드가 데옥시티민으로 구성되고 두 번째는 CCA로부터 5번째 뉴클레오티드가 데옥시아데닌으로 구성되는 두 군데의 인식부위를 포함하는 단일 가닥의 DNA 단편 Ⅰ을 제조하는 단계;

ⅱ) 상기 단일 가닥 DNA 단편 Ⅰ에 상보적인 단일 가닥의 DNA 단편 Ⅱ를 제조하는 단계;

ⅲ) DNA 단편 Ⅰ 및 Ⅱ의 상보적인 결합에 의해 이중 가닥의 DNA 단편 Ⅲ을 제조하는 단계;

ⅳ) 플라스미드 DNA 벡터에 상기 DNA 단편 Ⅲ을 클로닝하여 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하는 단계;

ⅴ) 상기 PCR T/A 클로닝 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계; 및

ⅵ) 상기 대장균 형질전환체로부터 PCR T/A 클로닝 벡터를 대량 생산하는 단계로 구성된다.

단계 ⅰ)에서 제조된 단일가닥 DNA 단편 Ⅰ은 제한효소 XcmI의 인식부위가 두 군데 중복되어 존재하며, 제한효소 XcmI의 인식부위를 효율적으로 인지하여 절단하기 위해서 두 군데의 인식부위는 일정한 거리를 두어 위치시킨다.

단계 ⅳ)에서 제조된 PCR T/A 클로닝 벡터는 제한효소 XcmI의 절단에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되기 때문에 PCR 산물의 양쪽 3'-말단에 형성된 데옥시아데닌 돌출과 결합할 수 있어 PCR 산물을 용이하게 클로닝할 수 있다.

또한, 한 종류의 제한효소만을 사용하여 PCR 산물을 용이하게 용출할 수 있는 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터의 제조방법은 상기 제조방법의 단계 ⅳ) 다음에

벡터의 양쪽 3'-말단 데옥시티민을 중심으로 양방향의 MCS를 꺼꾸로 삽입하는 단계가 추가되고 상위, 상하의 단계는 동일한 방법으로 진행된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 형성하는 DNA 단편의 제조

제한효소 XcmI으로 단 한번의 절단에 의해 플라스미드 DNA 벡터의 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 형성할 수 있는 DNA 단편을 뉴클레오티드 합성법을 이용하여 제조하였다.

구체적으로, 이들 DNA 단편은 제한효소 XcmI의 인식부위를 두 군데 포함하는 단일가닥(single stranded)의 DNA 단편으로서, 서로 상보적인 염기서열을 갖는 두 종류의 DNA 단편을 제조하여 이들을 결합시켜 이중가닥(double stranded)의 DNA 단편을 형성하도록 고안하였다.

<1-1> 제한효소 XcmⅠ의 인식부위를 두 군데 포함하는 DNA 단편 I 및 II의 제조

먼저, 두 종류의 DNA 단편 중에서 첫 번째 DNA 단편 Ⅰ은서열번호 2로 기재되는 42 bp 크기의 뉴클레오티드로 구성된 단일가닥의 DNA 단편으로서, 5'-말단에 제한효소 HindIII의 인식부위 AAGCTT 중 일부인 AGCTT가 처음에 위치하고, 그 뒤에서열번호 1로 기재되는 제한효소 XcmI의 첫 번째 인식부위가 위치하고 있다. 이 때, 제한효소 XcmI의 첫 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치에 데옥시티민이 위치하도록 하였다. 또한, CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드가 데옥시아데닌이 위치하는 제한효소 XcmI의 두 번째 인식부위를 제한효소 XcmI의 첫 번째 인식부위 다음에 6 bp의 간격을 두고 위치하도록 하였다. 마지막으로, DNA 단편 Ⅰ의 42번째 뉴클레오티드 위치에는 제한효소 HindIII의 인식부위 AAGCTT 중 나머지 부분인 데옥시아데닌(A)을 위치하도록 하였다. 상기와 같이 제한효소 XcmI의 인식부위를 두 개 포함하는 단일가닥의 DNA 단편 Ⅰ을 제조한 후, DNA 단편 Ⅰ의 염기서열과 상보적인서열번호 3으로 기재되는 DNA 단편 Ⅱ를 제조하였다.

<1-2> DNA 단편 Ⅰ과 DNA 단편 Ⅱ의 상보적 결합에 의한 DNA 단편 Ⅲ의 제조

상기 실시예 <1-1>에서 제조된 두 종류의 DNA 단편 I과 II를 각각 다른 튜브에 넣고 5분 동안 가열하여 열변성(heat denaturation)을 일으킨 후, 얼음에 급속냉동하여 단일가닥 형태를 유지하도록 하였다. 단일가닥 상태의 DNA 단편 Ⅰ 및 Ⅱ를 새로운 튜브에 동량 첨가한 후 서로의 상보적 염기서열에 의하여 결합할 수 있도록 실온에서 24시간 동안 방치하여 이중가닥의 DNA 단편 Ⅲ을 확보하였다(도 2).

<실시예 2> PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG의 제조

상기 실시예 <1-2>에서 제조한 이중가닥 형태의 DNA 단편을 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하기 위하여, 제한효소 HindIII로 절단한 pUC18 플라스미드 DNA 벡터(서울의대 암연구센터 유전자치료 연구실)에 이중가닥 형태의 DNA 단편 Ⅲ, T4 DNA 라이게이즈(T4 DNA ligase, Roche Co.) 및 완충용액(650 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM MgCl₂; 10 mM KCl; 1% Triton X-100)을 첨가하여 혼합한 후 16℃에서 16 내지 24시간 동안 반응시켜 pUC18 플라스미드 DNA 벡터에 DNA 단편 Ⅲ이 삽입(ligation)된 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였고, 이를 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG로 명명하였다(도 3). 상기 재조합 플라스미드 벡터 pLUG를 대장균(E. colicompetent cell, (주)인트론바이오테크놀로지)에 형질전환시킨 후 pLUG 벡터가 형질전환된 대장균을 선별하기 위하여 X-gal 및 IPTG가 들어있는 LB 한천 배지에 도말하여 16 내지 24시간 동안 배양하여 LB 한천배지에서 자란 콜로니 중에서 흰색 콜로니만을 선별하였다. 상기 대장균 형질전환체가 pLUG 벡터를 포함하고 있는지를 확인하기 위하여, 선별된 대장균 형질전환체를 LB 배지에 접종하여 대량으로 배양한 후 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 XcmI으로 절단하였다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA를 M13 역전사 효소(M13 reverse primer, (주)인트론바이오테크놀로지)를 이용하여 염기서열 분석(sequencing)을 수행한 결과, 상기 대장균 형질전환체는 제한효소 XcmI 처리에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되는 pLUG 벡터를 포함하고 있으며 pLUG 벡터는서열번호 4로 기재되는 염기서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 대장균 형질전환체를 2000년 5월 9일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 18017P).

이와 같이 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG는 제한효소 HindIII의 절단에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되는 DNA 단편을 제공함으로써, 기존의 모든 벡터에 이를 클로닝하여 PCR T/A 클로닝 벡터화하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 단편 및 이를 포함하는 PCR T/A 클로닝 벡터는 기존의 플라스미드 DNA 벡터에 응용되어 단시간안에 간단한 방법으로 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조할 수 있으며 PCR 산물을 용이하게 클로닝할 수 있어 분자생물학 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

<실시예 3> MSC가 양방향으로 삽입된 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi의 제조

상기 실시예 2에서 제조된 pLUG 벡터 내에 양방향의 MCS를 위치시켜 클로닝된 PCR 산물의 재용출 및 재클로닝을 용이하게 하기 위하여, pLUG 벡터에 제한효소 HindIII를 처리하여 절단한 후 MCS를 반대방향으로 위치시키고 중합반응을 수행하였다. 구체적으로, 연결자 DNA(linker DNA) 및 순응자 DNA(adaptor DNA)를 이용하여 MCS 내에 제한효소 HindⅢ, SphⅠ, Pst Ⅰ, SalⅠ/AccⅠ/HincⅡ, XbaⅠ, BamHⅠ, SmaⅠ/XbaⅠ, KpnⅠ, SacⅠ 및 EcoRⅠ/ApoⅠ의 인식부위를 차례로 위치시킨 후, 상기 제한효소들의 인식부위를 포함하는 MCS를 라이게이즈(ligase)를 이용하여 제한효소 HindⅢ 처리에 의해 절단된 pLUG 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였고, 이를 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi로 명명하였다(도 4). 상기 재조합 플라스미드 벡터 pLUG-Multi를 대장균에 형질전환시킨 후 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 pLUG-Multi 벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체를 선별하였다. 이와 같이 선별된 대장균 형질전환체가 pLUG-Multi 벡터를 포함하고 있는지를 확인하기 위하여, 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리한 후 DNA 염기서열 분석기(ABI 377, Perkin Elmer Co.)를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 상기 대장균 형질전환체는 양방향의 MCS가 거꾸로 삽입된 pLUG-Multi 벡터를 포함하고 있으며 pLUG-Multi 벡터는서열번호 5로 기재되는 염기서열로 구성되어 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 대장균 형질전환체를 2000년 5월 9일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 18018P).

상기와 같이 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi는 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출을 중심으로 양방향으로 거꾸로 위치하는 MCS를 포함하고 있어 PCR산물의 재용출 및 재클로닝이 매우 용이하다.

<실험예 1> pLUG-Multi 벡터를 이용한 PCR 산물의 클로닝

본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi가 실제로 PCR 산물을 용이하게 클로닝할 수 있는지를 확인하기 위하여 상기 pLUG-Multi 벡터에 PCR 산물의 클로닝 실험을 수행하였다.

이를 위하여, SNU-16 세포주((주) 인트론 바이오테크놀러지)로부터 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하고 β-엑틴 유전자에 특이적인 프라이머(β-actin primer, (주) 인트론 바이오테크놀러지)로 PCR 반응을 수행하여 상기 cDNA로부터 β-엑틴 유전자를 증폭시켰다. 이와 같이 증폭된 PCR 산물을 분리·정제한 후 본 발명의 pLUG-Multi 벡터에 라이게이즈를 이용하여 클로닝하여 재조합 플라스미드 벡터를 제조하였다. 상기 재조합 플라스미드 벡터를 대장균(E. colicompetent cell, (주)인트론바이오테크놀로지)에 형질전환시킨 후 대장균 형질전환체를 선별하기 위하여 X-gal 및 IPTG가 들어있는 LB 한천 배지에 도말하여 16 내지 24시간 동안 배양하였다. 상기의 LB 한천배지에서 자란 콜로니 중에서 흰색 콜로니만을 선별하고 선별된 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 전기영동을 수행하였다. 그 결과,도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi에 PCR 산물이 클로닝되었음을 확인하였다.

<실험예 2> pLUG-Multi 벡터를 이용한 PCR 산물의 재용출

상기 <실험예 1>에서 클로닝된 PCR 산물을 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi로부터 재용출하기 위하여, pLUG-Multi 벡터 내 MCS에 존재하는 여러 가지 제한효소를 단일 처리하여 PCR 산물을 절단하였다. 상기에서 선별된 대장균 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후 제한효소 EcoRI/ApoI, SacI, KpnI, SmaI/XbaI, BamHI, XbaI, SalI/AccI, HincII, PstI, SphI 또는 HindIII를 각각 처리하고 전기영동을 수행하여 PCR 산물의 재용출 여부를 확인하였다. 그 결과,도 6a및6b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 PCR T/A 클로닝 벡터 pLUG-Multi는 양방향 MCS를 거꾸로 포함하고 있기 때문에 상기의 단일 제한효소 처리에 의해서 PCR 산물이 용이하게 용출됨을 확인하였다.

본 발명은 두 개의 제한효소 XcmI 인식부위가 존재하는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 벡터를 단일의 효소 절단에 의해 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되고 이를 중심으로 양방향의 MCS가 꺼꾸로 위치하는 PCR T/A 클로닝 벡터에 관한 것으로서, 본 발명의 DNA 단편은 기존의 플라스미드 DNA 벡터에 응용되어 간단한 방법으로 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조할 수 있으며, 이와 같이 제조된 PCR T/A 클로닝 벡터는 PCR 산물의 클로닝 뿐 아니라 재용출 및 재클로닝도 용이하게 하여 분자생물학 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.

Claims (15)

1. 서열번호 1로 기재되는 제한효소 XcmI 인식부위가 3'-말단과 5' 말단의 두군데에 존재하는 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 산물의 클로닝에 유용한 PCR T/A 클로닝 벡터.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 제한효소 XcmI의 첫 번째 인식부위는서열번호 1의 CCA로부터 5번째 뉴클레오티드가 데옥시티민(deoxythimine)이고, 두 번째 인식부위는서열번호 1의 CCA로부터 5번째 뉴클레오티드가 데옥시아데닌(deoxyadenine)인 것을 특징으로 하는 PCR 산물의 클로닝에 유용한 PCR T/A 클로닝 벡터.
4. 제 1항에 있어서,서열번호 2로 기재되는 단일가닥 DNA 단편 Ⅰ과서열번호 3로 기재되는 단일가닥 DNA 단편 Ⅱ의 상보적인 결합에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 PCR 산물의 클로닝에 유용한 PCR T/A 클로닝 벡터.
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서,서열번호 4로 기재되고도 3의 모식도를 갖는 것을 특징으로 하는 pLUG PCR T/A 클로닝 벡터.
7. 제 1항에 있어서, 제한효소 XcmI의 절단에 의해 얻어지는 양쪽 3'-말단에 데옥시티민 돌출이 형성되는 것을 특징으로 하는 PCR 산물의 콜로닝에 유용한 PCR T/A 클로닝 벡터.
8. 제 6항의 pLUG PCR T/A 클로닝 벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체(수탁번호 : KCTC 18017P).
9. 제 1항에 있어서, MCS(multi-cloning site)가 XcmI 제한효소 절단에 의해 돌출되는 양쪽 3'-말단에 형성된 데옥시티민 돌출을 중심으로 거꾸로 위치하는 것을 특징으로 하는 PCR T/A 클로닝 벡터.
10. 삭제
11. 제 9항에 있어서, MCS는 제한효소 HindⅢ, SphⅠ, Pst Ⅰ, SalⅠ/AccⅠ/HincⅡ, XbaⅠ, BamHⅠ, SmaⅠ/XbaⅠ, KpnⅠ, SacⅠ 및 EcoRⅠ/ApoⅠ의 인식부위가 차례로 위치하는 것을 특징으로 하는 PCR T/A 클로닝 벡터.
12. 제 9항에 있어서,서열번호 5로 기재되고도 4의 모식도를 갖는 것을 특징으로 하는 pLUG-Multi PCR T/A 클로닝 벡터.
13. 제 12항의 pLUG-Multi PCR T/A 클로닝 벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체(수탁번호 : KCTC 18018P).
14. ⅰ) 제한효소 XcmI의 첫 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드가 데옥시티민이고 두 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드가 데옥시아데닌인 단일 가닥 DNA 단편 Ⅰ을 제조하는 단계;

    ⅱ) 상기 단일 가닥 DNA 단편 Ⅰ에 상보적인 단일 가닥 DNA 단편 Ⅱ를 제조하는 단계;

    ⅲ) 상기 DNA 단편 Ⅰ 및 Ⅱ를 결합하여 이중 가닥의 DNA 단편을 제조하는 단계;

    ⅳ) 플라스미드 DNA 벡터에 상기 DNA 단편을 클로닝하여 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하는 단계;

    ⅴ) 상기 PCR T/A 클로닝 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계; 및

    ⅵ) 상기 대장균 형질전환체로부터 PCR T/A 클로닝 벡터를 대량 생산하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 제 1항의 PCR T/A 클로닝 벡터의 제조방법.
15. ⅰ) 제한효소 XcmI의 첫 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드가 데옥시티민이고 두 번째 인식부위는 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드가 데옥시아데닌인 단일 가닥 DNA 단편 Ⅰ을 제조하는 단계;

    ⅱ) 상기 단일 가닥 DNA 단편 Ⅰ에 상보적인 단일 가닥 DNA 단편 Ⅱ를 제조하는 단계;

    ⅲ) 상기 DNA 단편 Ⅰ 및 Ⅱ를 결합하여 이중 가닥의 DNA 단편을 제조하는 단계;

    ⅳ) 플라스미드 DNA 벡터에 상기 DNA 단편을 클로닝하여 PCR T/A 클로닝 벡터를 제조하는 단계;

    ⅴ) 상기 PCR T/A 클로닝 벡터에 양방향의 MCS를 꺼꾸로 삽입하는 단계;

    ⅵ) 상기 PCR T/A 클로닝 벡터를 대장균에 형질전환시키는 단계; 및

    ⅶ) 상기 대장균 형질전환체로부터 PCR T/A 클로닝 벡터를 대량 생산하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 제 1항의 PCR T/A 클로닝 벡터의 제조방법.