JPH03505327A - プロカルシトニンペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、骨芽細胞及び前骨芽細胞における細胞分裂を刺激するペプチドの製造方法 であって、 請求項１０又は１２に記載の宿主綿、胞を培養し；そして該宿主細胞から該ペプ チドを単離する；ことを含んで成る方法。

１３、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドを生理的に許容されるキャリヤ ー又は希釈剤と組合わせて含んで成る療法組成物。

１４、骨芽細胞及び前骨芽細胞におけるＤＮＡ合成を更に増加せしめるのに十分 な量において成長因子をさらに含んで成り、該成長因子がインシュリン、インシ ュリン様成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子α、形質転換成長因 子β及び表皮成長因子から成る群から選択されたものである、請求項１３に記載 の療法組成物。

１５、骨芽細胞及び前骨芽細胞におけるＤＮＡ合成をさらに増加せしめるのに十 分な量でインシュリン様成長因子■をさらに含んで成る、請求項１３に記載の療 法組成物。

浄書（内容に変更ない 明　　　細　　　書 プロカルシトニンペプチド 退ｆυと賢 本発明は、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂＩａｓｔ）及び前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓ　ｔ ｅ−ｏｂｌａｓｔ）の増殖を刺激するペプチド、該ペプチドの製造方法、該ペプ チドを含有する療法組成物、及び哺乳類における骨の増殖の促進方法に関する。

発旦ｐ宜景 骨の成長、維持及び修復は骨形成速度と骨吸収速度との間のバランスに関する。

これら２つの過程（−緒にして「レモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）　Ｊと 称する）は幾つかのホルモン及び増殖因子により制御され、これらには上皮小体 ホルモン、カルシトニン、インシュリン、ソマトメジン、甲状腺ホルモン、グル ココルチコイド、ビタミンＤ１アンドロゲン、エストロゲン、上皮成長因子、形 質転換成長因子β、繊維芽細胞成長因子及び血小板由来成長因子が含まれる。こ れらの化学的メンセンジャーは骨芽細胞及び前骨芽細胞（骨形成細胞）並びに破 骨細胞（骨吸収細胞）に影響を与える。骨のレモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎ ｇ）は鉱物質の蓄蔵場所とての骨格の役割に関連し、そして骨の生存性、流体交 換及び骨の強さの維持のために役立つ。骨代謝の不均衡な骨粗鬆症及びその他の 疾患をもたらすであろう。骨レモデリング過程はＲａ１ｓｚ及びＫｒｅａｍ　（ Ｎｅｉ＋Ｅｎ　］、Ｊ、Ｍｅｄ、３０９　：　２９−３５．８３−８９．１９８ ３）並びにＲａ１ｓｚ（拘止」延１工Ｌヱｅｄ、３１８：８１Ｂ−８２７，１９ ８８）により総説されている。

健康な個体においては骨成長は正常に進行しそして骨折は薬学的介在を必要とす ることなく治癒するが、ある場合には骨は弱化しそして正常に治癒しない。例え ば、治癒は老人又はコルチコステロイド治療を受けている患者、例えば移植患者 及び慢性肺疾患の治療を受けている患者においては、徐々に進行するであろう。

さらに、骨粗鬆症の罹患者は骨代謝の不均衡を有し、これは骨折及び奇形をしば しば導く。

骨粗髭症は現在エストロゲン、カルシトニン、カルシウム、弗化カルシウム、ビ スホスホネート、又はこれらの組合せにより治療される。これらの治療はおそら く疾患の基礎となる原因を正さず、そして限定された有効性を有するのみである 。

エストロゲン治療は子宮内膜癌の危険の増加と関連付けられている。エストロゲ ンは５５才以下の女性のみが応答し、より高齢者では骨のエストロゲン応答は低 下するので、エストロゲンは限定された有用性を有する。弗化ナトリウムの使用 は研究中でありまだ認可されていない。さらに、弗化物による刺激のもとで形成 された骨は異常であろう。さらに、弗素の投与には有意な毒性が伴う。粗食によ るカルシウム不足の場合を除き、カルシウム単独では有効でない。不足の症例に おいてさえ、カルシウム治療の利点は補給ビタミンＤの非存在下で制限される。

カルシトニンによる治療は骨吸収を低下せしめるようであるが、しかし骨董のな んらかの増加はおそら（一時的である。カルシトニンの最終的非有効性は、骨形 成と骨吸収とのカップリングの結果として起こる骨芽細胞活性の低下によると信 じられる。カルシトニンが骨粗鬆症患者における骨折の率を低下せしめることは 示されていない。胃腸管の問題及び鼻血を含めての副作用がカルシトニンの使用 を制限するであろう。最後に、ソマトメジン（インシュリン様成長因子）は今や オステオベニツク（ｏｓ　ｔｅｏｐｅｎ　ｉ　ｃ）状態の治療のために評価され つつあるが、これらの成長因子は軟組織の細胞に影響を与えるので、合併症及び 副作用があるようである。

骨形成を促進しそして／又は骨折を逆転させる物質の必要性が当業界において依 然として存在する。本発明はこの様な活性を有するペプチドを提供し、そしてさ らに他の関連する利点を提供する。

主里勿笠丞 要約すれば、本発明は骨芽細胞及び前骨芽細胞の増殖を刺激する単離されたペプ チド及び該ペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。このペプチドは一般に次 の特徴を有する。

（ａ）これらは少なくとも１２個のアミノ酸の長さを有する；（ｂ）これらはラ ットＮ−プロカルシトニン（Ｎ−ｐｒｏＣＴ）の少なくとも部分と実質的に相同 である；そして（Ｃ）これらは、骨芽細胞及び前骨芽細胞を最も強（刺激する濃 度において、繊維芽細胞に比べて２以上の係数をもって骨芽細胞及び前骨芽細胞 中でのＤＮＡの合成を増加せしめる。本発明の１つの観点において、このペプチ ドは、第一図に示すように、ラット、ヒト、ニワトリ及びサケのＮ−ｐｒｏＣＴ 並びにラット、ヒト及び・ニワトリのＮ−プロカルシトニン遺伝子関連ペプチド （Ｎ−ｐｒｏＣＧＲＰ）配列から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する。

本発明においては便宜上及び明瞭のためラットＮ−ｐｒｏＣＴとのホモロジーに よりペプチドを一般に定義する。しかしながら、本発明は他の種由来のペプチド 並びにそれらのペプチドの誘導体を包含すると理解されよう。本発明の関連する 観点において、ペプチドは、（ａ　’）　ＶＰＬＲＳＴＬＥＳＳＰＧ；　（ｂ　 ）　ＡＰＦＲＳＡＬＥＳＳＰＡ；ａｎｄ（Ｃ）　ＡＰＶＲＰＧＬＥＳＩＴＤ；及 び（ｄ　）　ＡＰＡＲＴＧＬＥＳＭＴＤから成る群から選択されたアミノ末端配 列を含んで成る。本発明の他の観点において、ペプチドは３２アミノ酸より短い 長さを有する。

本発明の関連する観点において、骨芽細胞及び前骨芽細胞の細胞分裂を刺激する ペプチドを単離する方法が開示される。

この方法は一般に、（ａ）カルシトニン又はカルシトニン関連遺伝子を発現する ことができる細胞の水性抽出物を調製し；（ｂ）該水性抽出物を分画して約１５ ，０００未満の分子量を有す″るペプチドを濃縮し；そして該濃縮された画分を 疎水性クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーにより分画 して、該濃縮された画分からペプチドを分離する、ことを含んで成る。好ましい 態様において、水性抽出物を分画する段階は該水性抽出物の逆相）ＩＰＬｃ及び ゲル濾過を含んで成る。所望の結果に実質的に影響を与えることなくこれらの段 階の順序を変更することができることが当業者にとって明らかであろう。

前記のペプチドをコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された転写プロモータ ーを含んで成る発現ベクターによりトランスフェクション又はトランスフォーメ ーションされた宿主細胞も開示される。これに関して適当な宿主細胞には酵母宿 主細胞が含まれる。

本発明の他の観点において、骨芽細胞及び前骨芽細胞の細胞分裂を刺激するペプ チドの製造方法が開示される。この方法は一般に、（ａ）前記の特徴を有するペ プチドをコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結された転写プロモーターを含ん で成る発現ベクターを宿主細胞に導入し；該宿主細胞を適当な条件下で培養し； そして（ｃ）該宿主細胞からペプチドを単離する、ことを含んで成る。

本発明の他の観点は、前記のペプチドを生理的に許容されるキャリヤー又は希釈 剤と組合わせて含んで成る療法組成物に向けられる。この様な方法において、組 成物は鼻内に又は注射により投与することができる。１つの態様において、この 組成物はさらに有効量の物質、例えばエストロゲン、弗化ナトリウム、カルシト ニン又はビスホスホネートを含んで成る。他の態様において、この組成物は、骨 芽細胞及び前骨芽細胞中でのＤＮＡ合成を一層増加せしめるのに十分な量におい て、成長因子、例えばインシュリン、インシュリン様成長因子、血小板由来成長 因子、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β又は表皮成長因子を含有するこ とができる。

本発明のこれらの及び他の観点は以下の詳細な説明及び添付図面に言及すること により明らかとなるであろう。

辺！礼豆 第１図は、骨芽細胞及び前骨芽細胞の増殖を刺激する代表的なペプチドのアミノ 酸配列を示す。箱は同一アミノ酸のブロックを示す。星印は相同性を最大にする ために導入されたギャップを示す。番号はラットの配列に関する。特にことわら ない限り、Ｎ−ｐｒｏＣＧＲＰ配列はそれぞれＮ−ｐｒｏＣＴ配列に対応する。

サケカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）については配列が報告されて いない。アミノ酸は標準的−文字コードで示される。

第２図は、ラットＮ−ｐｒｏＣＴ（ＮＣＡＰ）の最後の６残基に対して向けられ た抗血清を用いての、逐次希釈された合成ペプチド及び甲状腺細胞の抽出物（Ｅ ｘｔ）に対するイムノアッセイの結果を示す。

第３図は、ラットプロカルシトニン（ＮＴＰ）の最初の１２個のアミノ酸残基に 対して向けられた抗血清を用いての、逐次希釈されたペプチド及びラット１１ｗ ｊ細胞抽出物（ｓａｍｐｌｅ）に対するイムノアッセイの結果を示す。逆三角印 はカルシトニン、Ｃ−ｐｒｏＣＴ、　ＮＣＡＰ、　ＣＧＲＰ及びソマトスタチン を示す。

第４図は、甲状腺腫瘍細胞抽出物からのペプチドの逆相ＨＰＬＣ分画プロフィー ルを示す。３００Ａ１０ｃｔｙｌ逆相ＨＰＬＣカラムを使用し、１艷の画分を集 め、乾燥し、そして免疫反応性ＮＣＡＰ　（閉じた円）及び免疫反応性ＮＴＰ　 （中空四角形）について測定した。点線はアセトニトリル勾配を示す。

第５図は、ラット甲状腺髄癌（ＭＴＣ）からの部分精製されたＮ−ｐｒｏＣＴの ゲル濾過の結果を示す。矢印は分子量マーカーを示す。Ｎ−ｐｒｏＣＴは同時に ＮＴＰ　（中空四角形）免疫反応性及びる。

第６図は、ニワトリ骨芽細胞及び前骨芽細胞に対する代表的なプロカルシトニン 由来ペプチドのマイトジェン効果を示す。閉じた円は合成ＮＴＰ−Ｔｙｒ［ｐｒ ｏＣＴ（１−１２）−Ｔｙｒｌを示し、逆三角形は合成カルシトニンを示す。

第７図は、ニワトリ（Ａ）及びラット（Ｂ）の骨芽細胞及び前骨芽細胞に対する 部分精製されたラッ）Ｔ−ｐｒｏＣＴのマイトジェン効果を示す。

第８図は、部分精製されたＮ−ｐｒｏＣＴ及びカルシトニンを用いての、ラット 皮膚細胞及びニワトリ骨細胞についてのマイトジェン測定（＋ｉｉｔｏｇｅｎｅ ｓｉｓ　ａｓｓａｙ）の結果を示す。

第９図は、ニワトリ骨芽細胞及び前骨芽細胞の培養物に対する精製された合成ヒ トＮ−ｐｒｏＣＴのマイトジェン効果を示す。

第１０図は、骨関節炎を有する患者から調製したヒト骨芽細胞（ａ）及びヒト骨 肉腫細胞（ｂ）に対する合成ヒ）　−ｐｒｏＣＴのマイトジェン効果を示す。

第１１図は、酵母に好ましいコドンを含有するオリゴヌクレオチドから作製され たラットＮ−ｐｒｏＣＴのコード配列を示す。

第１２図は、ラットＮ−ｐｒｏＣＴコード配列の集成のダイアダラムである。

第１３図は、Ｎ−ｐｒｏＣＴの酵母発現ベクターの作製を示す。

第１４図は、プラスミドｐｃｐｏｒ及びｐＤＰＯＴを示す。

第１５図は、プロカルシトニン由、来ペプチドを製造するために用いる幾つかの 酵母発現ベクターを示す。

第１６図は、組換Ｎ−ｐｒｏＣＴを用いてのニワトリ骨細胞マイトジェン測定（ ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｓｓａｙ）の結果を示す。

第１７図は、サツカロミセス・セレビシェ−（５ＩＣｅｒｅｖ　ｉ　ｓ　１ａｅ ）ＴＰＩＩプロモーターのサブクローニングを示す。

第１８図は、プラスミドｐＭνＲ１の作製を示す。

第１９図は、ＴＰＩＩプロモーターへのＭＡＴα２オペレーター配列の挿入を示 す。

第２０図は、プラスミＦｐＳＸＲ１０９，ｐｓＸＲｌｌｏ、　ｐｓＸＲｌｌｌ　 、及びｐｓＸＲ１１２の作製を示す。

第２１図は、Ｎ−ｐｒｏｃＴにより処理されたマウス及び未処理対照マウスにお ける骨の成長を比較する実験の結果を示す。

■を　　するための最　の／能 本発明は、骨芽細胞及び前骨芽細胞の増殖を特異的に刺激しそしてそれ故に哺乳 類において骨の成長を促進するために有用な種々のペプチドを提供する。本発明 の好ましい観点において、これらのペプチドはプロカルシトニン又はｐｒｏＣＧ ＲＰのアミノ末端領域に由来することができる。これらははじめから合成するこ とができ、それらを天然に生産する適当な細胞又は組織から単離することができ 、又は組換ＤＮＡ技法を用いて製造することができる。

カルシトニンは甲状腺のＣ−細胞により、及びある種の甲状腺腫瘍により大量に 、生産される３２−残基ペプチドホルモンである。このホルモンは骨芽細胞の活 性を阻害しそしてこの機作により血中のカルシウムレベルを低下せしめる。カル シトニンは高カルシウム及び他の栄養シグナルに応答して分泌される。高脂肪飼 料を与えられたラットは増加したレベル］　　のカルシトニン生産を示し、脂肪 代謝における役割が示唆される。大量のカルシトニンの注射は食欲を阻害するこ とがあり、そしてまた鎮痛効果を有するであろう。

他の小ペプチドホルモンの生合成の場合のように、カルシトニンはより大きなプ ロモルモンから生ずる（Ｒｏｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、　６０：１１３４−１１４０．１９７ ４）。プロカルシトニンはまずラットにおいて特徴付けられ（Ｊａｃｏｂｓら、 ５ｃｉｅｎｃｅ。

２１３　：　４５７−４５９，１９８１：Ａｍａｒａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、　、　２５７：２１２９−２１３２゜１．９８２）　、ラットの配列は今日 ヒト及びニワトリの前駆体の配列に構造的に類似することが知られている（Ｇｋ ｏｎｏｓら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　、２６１　：　１４３８６−１４３９１．１９８６　；　Ｌａｓｍ ｏｌｅｓら、ＥＭＢＯＪ、１０　；２６０３−２６０７．１９８５）。ラットの プロカルシトニンは１１１残基をを有しくＢｉｒｎｂａｕｌら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ＋＋＋、　２５９：２８７０−２８７４）　、カルシトニンの配列（ｐｒ ｏｃＴｂｏ−’ｑ＋）は、フランキング多価開裂部位によりアミノ末端領域とカ ルボキシ末端領域から分離されて、前駆体内に囲まれている。カルシトニンの生 合成及び分泌の研究のために開発されたカルシト°ニンーリッチ細胞系は、カル シトニンとＣ−末端へキサデカペプチドＣ−ｐｒｏＣＴをもたらすプロカルシト ニンプロセシングの主たる経路を示す（Ｂｉｒｎ−ｂａｕｍら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、　２６１　：　６９９−７０３．１９８６；（Ｂｉｒｎｂａｕｍら 、カルシトニン遺伝子発現の研究（Ａ＋ｍａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ＋霊：２４０ −２４４．１９８２）は、遺伝子が２種類の別個の分泌性ペプチドをコードして いることを示した。「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」又はｒ　ＣＧＲＰ　Ｊ と称される第二のペプチドは異るＲＮＡスプライシングから生ずる。成ＰＣＧＲ Ｐは３７アミノ酸から成る。

これのペプチドの前駆体形（プロカルシトニン及びｐｒｏＣＧＲＰ）は最初の５ １アミノ酸残基にわたって同一である。カルシトニンと同様、ＣＧＲＰはそのア ミノ末端フランキング配列及びカルボキシ末端フランキング配列から、多価開裂 部位によって分離されている。ＣＧＲＰもまた、少なくとも高投与量においては 、血液カルシウムを低下せしめそして骨吸収を阻害することができる。カルシト ニン及びＣＧＲＰは別々の細胞受容体を有するが、しかし各々は他方の受容体と 結合することができる（Ｒｏｏｓら、勤り９士丘匡■９月、８．４６−５１．１ ９８６）。ＣＧＲＰ及びＣＧＲＰ類似体の使用が、血圧及び胃酸分泌を低下せし めるために提案されている（Ｅｖａｎｓら、米国特許Ｎｏ、４，５３０，８３８ 及び４，５４９．９８６）。

直接又は間接証拠が浮び上がっている少なくとも３種類の追加のカルシトニン関 連ヒト遺伝子又は偽遺伝子が存在する。

Ｆｉｓｈｅｒら（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、　５７： ｌ３１４−１３１６．１９８３）は、ヒトの甲状腺及び脳の中に免疫反応性サケ カルシトニン様物質を同定した。Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｈら（Ａ、Ｐｅｃｉｌｅ　 Ｈ集、Ｃａ１ｃｉｔｏｎｉｎ。

１９８４、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　１９８５．２３頁）は、ヒトカルシトニン偽遺 伝子の存在を示唆している。Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｈら（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｌ、、 　２０９　；９７．１９８６）は、カルシトニン様ペプチドを生産するために代 りの発現を経験しないと思われるし）ＣＧＲＰ−］Ｉの遺伝子を単離しそして特 徴付けた。さらに現在、第三のヒトカルシトニン関連遺伝子の示唆が存在する（ Ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｊ、Ｗ、Ｍ、Ｈｏｐｐｅｎｅｒ＋Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 ｏｆ　ｔｌｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ　Ｈｕｎ＋ａｎ　Ｃａ１ｃｉｔｏｎｉｎ／ＣＧ ＲＰ　Ｇｅｎｅｓ”。

１９８８年４月１２日）。

本発明者らが見出したところによれば、プロカルシトニン及びｐｒｏＣＧＲＰの プロセシングが、これらの前駆体に依存して、約５２〜５７アミノ酸の長さの安 定なＮ−末端ペプチド（それぞれＮ−ｐｒｏＣＴ及びＮ−ｐｒｏＣＧＲＰと称す る）を生成せしめる。標準的マイトジエネシス測定により試験した場合、これら のペプチドは骨芽細胞及び前骨芽細胞に対する特異的細胞増殖活性を有すること が見出された。さらに、ある１つの種に由来するペプチドは他の種からの骨芽細 胞及び前骨芽細胞に対して特異的細胞増殖活性を有することが見出された。

前記のように、ヒト、ラット及びニワトリを含めての多くの種からのカルシトニ ン及びＣＧＲＰ、並びにサケカルシトニンが単離されそして特徴付けられている 。これらのポリペプチドをコードする遺伝及びｃＤＮＡ配列が研究されている。

これらの研究が示すところによれば、カルシトニン及びＣＧＲＰは同一の遺伝子 によりコードされており、そして異るＲＮＡスプライシングから生ずる。さらに 、腫瘍においてのみ発現することが知られているカルシトニン偽遺伝子、及びサ ケカルシトニン様ペプチドがヒトにおいても同定されている。本発明のペプチド は、これらのカルシトニン遺伝子産物の任意のものの前駆体に由来するアミノ末 端配列に対応するであろう。例示されるペプチドには、ヒト、ニワトリ、ラット 及びサケのＮ−ｐｒｏＣＴ　　（５４又は５７アミノ酸）、並びにヒト、ニワト リ及びラットのＮ−ｐｒｏＣＧＲＰ（５２又は５５アミノ酸）が包まれ、これら の配列を第１図に示す。本発明のペプチドにはまた、プロカルシトニン及びｐｒ ｏＣＧＲＰのアミノ末端部分の断片も包含される。

例えば、プロカルシトニンのアミノ末端がらの１２−アミノ酸断片は骨芽細胞及 び前骨芽細胞に対する予想外の特異的マイトジェン活性を有することが見出され た。本発明はまた、この１２−アミノ酸断片、及び１２残基のこのアミノ酸配列 をより大きなプロカルシトニン由来ペプチドを包含する。これに関して好ましい ペプチドにはヒト、ニワトリ、ラット及びサケのＮ−ｐｒｏＣＴ並びにヒト、ニ ワトリ及びラットのＮ−ｐｒｏＣＧＲＰのアミノ末端からの３１−アミノ酸ペプ チドが含まれる。追加の生物活性ペプチドが、蛋白質分解酵素又は臭化シアン（ ＣＮＢｒ）によるＮ−ｐｒｏＣＴ又はＮ−ｐｒｏＣＧＲＰの開裂により生ずるで あろう。

例えば、ヒトＮ−ｐｒｏＣＴのＣＮＢｒ開裂が３６及び２１アミノ酸のヒトＮ− ｐｒｏＣＴを生成せしめる。当業者に理解されるように、これらのペプチドの有 用な性質を変えることなくアミノ酸配列の微小な変更を行うことができる。アミ ノ酸の置換及び欠失を、含めてのこれらの変化は、遺伝子的形性又は種多様性か ら生じ、あるいは遺伝工学によりペプチドに導入され得るであろう。この様な変 化を導入する場合、高レベルの種間相同性を示す配列（第１図に示す）を保持し 、そしてペプチドの化学的性質（例えば、荷電、疎水性など）の大きな変化を行 うことを回避することが一般に好ましい。前記のように、本発明のペプチドは一 般にラットＮ−ｐｒｏＣＴに関連させて定義される。

一般に、本発明のペプチドは、ラットＮ−ｐｒｏＣＴの部分に対して実質的に相 同であり、第１図に示される種間相同性のレベルを反映して一般に少なくとも約 ４０％相同である。好ましくは、ペプチドはヒ）　Ｎ−ｐｒｏＣＴの部分に対し て実質的に相同であり、これはラットＮ−ｐｒｏＣＴに対して約６０％相同であ る。これに関して、ペプチドがラットＮ−ｐｒｏＣＴの最アミノ末端の３２アミ ノ酸の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸の部分に実質的に相同であること が好ましい。

本発明のペプチドは、それらを天然に生産する組織又は培養細胞から単離するこ とができ、常用の化学的方法で合成することができ、あるいは組換ＤＮＡ技法を 用いて製造することができる。

回収可能な量でカルシトニン、ＣＧＲＰ又は関連遺伝子産物を生産することが知 られている細胞及び組織をペプチド源として使用することができる。適当な細胞 タイプには正常の及び腫瘍性のＣ−細胞並びに脳細胞が含まれる。腫瘍Ｃ−細胞 の好ましい入手源は、Ｒｏｏｓら（ハｈ？カ匪国■５月臣：２６−３２゜１９７ ９）により開示されている１−２−４甲状腺髄癌である。

ペプチドは細胞又は組織から水性緩衝液を用いて抽出される。

好ましくは、組織を細断し、そして約１〜２Ｎの酸濃度を用いて有機酸の熱溶液 により抽出する。抽出温度は好ましくは７０℃以上であり、最も好ましくは沸点 である。特に好ましい態様においては、細断された組織を約１０〜２ｏ容量の１ ．５Ｎ酢酸に加え、そして２０〜３０分間沸騰せしめる０次゛に、得られるホモ ジネートを冷却し、そして不溶性物質及び脂質を水性抽出物から好ましくは遠心 分離により分離する。次に、水性抽出物をサイズ分画し、好ましくはこれを二段 階法で、回分式逆相クロマトグラフィー法とゲル濾過法とを組合わせて行う。

好ましいクロマトグラフィー媒体はＣ−１８シリカである。次に、この媒体から ペプチドを適当な有機溶剤により溶出する。

典型的には、９０％アセトニトリル１０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で 活性化されそして０．１％ＴＦＡ中で平衡化されたＶｙｄａｃ　Ｃ−１８、床孔 、３０−ミクロンシリカの５−グラムのカラム上で分画を行う。サンプルを適用 した後、カラムを２５Ｍ１の０．１％ＴＦＡで洗浄し、次に５０Ｊｄの２０％ア セトニトリル１０．１％ＴＦＡで洗浄する。Ｎ−ｐｒｏＣＴを４５％−９５％ア セトニトリル１０．１％ＴＦＡにより溶出する。次に、部分的に精製されたペプ チドを乾燥させ、そして６Ｍグアニジンに溶解しそしてさらにゲル濾過により精 製する。好ましいゲル濾過媒体はＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（Ｐｂａｒｍａｃｉ ａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）である。本発明のペプチドを含有す る画分をイムノアッセイ及び／又は培養骨細胞を用いての活性測定により同定す る。ゲル濾過ピークを逆相ＨＰＬＣのごとき疎水性クロマトグラフィーによりさ らに分画する。これに関して、Ｃ８リシカ、１０−ミクロン、逆相樹脂（Ｗａｔ ＋ｗａｎ）が特に好ましいクロマトグラフィー媒体である。

Ｎ−ｐｒｏＣＴはＣ−８シリカから３７％アセトニトリルにおいて溶出し、そし て８０分間にわたる３５％−４０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡグラジェン トにおける分画により他の蛋白質から分離され得る。ピーク分画は好ましくはイ ムノアッセイにより同定される。所望により、陰イオン交換クロマトグラフィー 、ＨＰＬＣ及びイムノアフィニティー・クロマトグラフィーのごとき常法により 追加の精製を行うことができる。あるいは、イムノアフィニティークロマトグラ フィー及びこれに続くＨＰＬＣによりペプチドを精製することができる。

約２０〜３２アミノ酸より短いペプチドを常用の化学的方法により合成すること ができる。ペプチド合成の方法は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（Ｊ、八ａ ｎ、ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、＋　、ξし５　：　２１４９−２１５４．１９６３）及 びＨｏｕｇｈｔｅｎ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８ ２　：　５１３１−５１３５．１９８５）により記載されている。ペプチドはま た、Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ　（Ｂｅｌｍｏｎｔ、カ リホルニア）　、Ｂｅｃｈｅｖ＋　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ。

（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｐｃ、）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、（Ｓ ａｎ　Ｒａｆａｅｌ、カリホルニア）、及びＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ＋５ｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、カリホルニア）を含む種々の商業的供給者か ら得ることができる。

本発明のペプチドは、好ましくは遺伝子操作された細胞から調製される。細菌、 真菌細胞、及び培養された高等真核細胞において組換蛋白質及びペプチドを製造 する方法は当業界においてよく知られている。要約すれば、注目のペプチドをコ ードするＤＮＡ配列を適当な転写プロモーターに連結しそして他の要素（転写タ ーミネータ−、ポリアゾニレ−ジョンシグナル、エンハンサ−１選択マーカー等 ）と共にベクターに挿入する。これらは選択された宿主細胞のタイプに従って選 択される。適当な要素の選択、発現ベクターの作製、及び宿主細胞のトランスフ ォーメーション及びイランスフェクションは当業者のレベルの範囲内である。

本発明のペプチドをコードする・ＤＮＡ配列は好ましくは合成される。合成され たオリゴヌクレオチドの使用は、宿主細胞の好みに従うコドンの選択を可能にす る。ＤＮＡの合成方法は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（米国特許Ｎｏ、４． ４５８．０６６）及びＩ　ｔａｋｕｒａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１９８　：　１ ０５６−１０６３．１９７７）に開示されている。但し、自動化された合成が一 般に好ましい。一般に、約５０〜６０塩基までの長さのオリゴヌクレオチドを調 製するのが好ましい。アニールされた場合にオーバーラツプする相補的末端が生 成されるようにオリゴヌクレオチド対を設計することによりさらに畏い配列の集 成が促進される９次に、オーバーランプする断片を連結して一層長い配列を生成 せしめる。

適当なりＮＡ配列はまた、カルシトニン又はＣＧＲＰの前駆体をコードするｃＤ ＮＡ又はゲノムクローンの酵素的消化によっても得ることができる。これらのク ローンはＡｍａｒａ　ら（Ｎａｔｕｒｅ。

２９８　　：　　２４０−２４４．１９Ｂ２ン　　、　Ａｍａｒａ　　　ら　　 （Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、、　　　２５７　　：　　２１２X −２１３２．１９８２）　、及びＢｉｒｎｔ）ａＨら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、＋　２５８　：　５４６３−５４６６、１９８３）により開示されている。

本発明を行うため使用される好ましい原核性宿主細胞は細菌である大腸菌（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であり、但しハシルス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ） 及び他の属も有用である。これらの宿主を形質転換しそしてその中にクローン化 された外来ＤＮＡ配列を発現せしめる技法は当業界においてよく知られている（ 例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒすｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、１９８２）。細菌宿主中でクローン化されたＤＮＡ配列を発現せ しめるために使用されるベクターは一般に選択マーカー、例えば抗生物質耐性の ための遺伝子、及び該宿主において機能するプロモーターを含有する。適当なプ ロモーターにはｔｒｐ（Ｎｉｃｈｏｌｓ及びＹａｎｏｆｓｋｙ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎ ｚ　ｍｏｌ、。

１０１、１５５−１６４．１．９８３）、ｌａｃ　（Ｃａｓａｄａｂａｎ　　ら 、Ｊ、Ｂａｘｔｅｒｉｏｌ、、　　１４３：９７１−９８０．１９８０）　、及 びファージλ（Ｑｕｅｅｎ＋　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　　１．Ｃｅｎｅｔ、。

叉：１〜１０．１９８３）プロモーター系が含まれる。細菌を形質転換するため に有用なプラスミドには、ｐＢＲ３２２（Ｂｏ　ｌ　ｉ　ｖｅｒら、販匣。

１９８２）　、ｐＣＱＶ２　（Ｑｕｅｅｎ、前掲）、及びこれらの誘導体が含ま れる。プラスミドはウィルス性要素及び細菌性要素の両方を含むことができる。

真核性微生物、例えば酵母サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ 　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びシゾサツカロミセス・ボンへ（匙坦μ王 目上旺姐と並と１回）、又は糸状真菌（例えば、アスペルギルス（ハ〃」匡は赳 ）ｓｐｐ、、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓ−凹）　ｓ　ｐ　ｐ、　も本発明の 宿主として使用することができる。Ｓ。

セレビシェ−°が特に好ましい宿主である。酵母を形質転換する方法は文献中に よく知られており、そして例えばＢｅｇｇｓ（Ｎａｔｕｒｅ、　２７５　：　１ ０４−１０８．１９７８）及びＭａｃｋａｙ　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　ａ＋ｏ１． 。

１０１　：　３２５−３４３．１９８３）により記載されている。アスペルギル スの種は既知の方法、例えばＹｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８１　：　１７４０−１７４７．１９８４）の方法に従って形質転換することが できる。好ましい酵母発現ベクターにはＹＲｐ７　（Ｓ　ｔｒｕｈ　ｌら、Ｐｒ ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７６　：　１０３５−１０３９．１９ ７９）　、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ、　　８　：　１２１−１３ ３．１９７９）、ｐＪＤＢ２４９及びｐＪＤＢ２１９　（Ｂａｇｇｓ。

前掲）、並びにこれらの誘導体が含まれる。これらのベクターは一般に選択マー カー、例えば旦皿変異を担持する宿主株において選択を可能にする栄養マーカー 」皿、又は好ましくはＫａｗａｓａｋｉ及びＢｅ１ｌ（ＥＰ　１７Ｌ１４２）に より記載されたような「必須遺伝子Ｊ　（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅ）を含 有するであろう。好ましいこの様な必須遺伝子マーカーはシゾサツカロミセス・ ボンベ（ＳｃｈＬｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｏｍｂｅ）のトリオース ホスフェートイソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴＩ遺伝子）であり、このものは富グル コース培地中で培養されたトリオースホスフェートイソメラーゼ欠失宿主細胞で のプラスミドの安定な維持を提供する。皿選択マーカーを含有する発現ベクター にはｐｃＰＯＴ（ＡＴＣＣ３９６８５）、ｐＭＰＯＴ２（ＡＴＣＣ６７７８８） 及びこれらの誘導体が含まれる。これらのベクターにおいては、転写の方向が皿 遺伝子のそれとは逆であるように、発現ユニットを挿入するのが好ましい。酵母 発現ベクター中で有用な好ましいプロモーターには、酵母解糖系遺伝子からのプ ロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉ、、　２５５　：　 １２０７３−１２０８０，１９９０　；　Ａｌｂｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ 、Ｍｏ１．Ａ　１．　Ｇｅｎｅｔ、、上：　４１９−４３４．１９８２　；　Ｋ ａｗａｓａｋｉ。

米国特許Ｎｏ、４．５９９．３１１）又はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ ）遺伝子のプロモーター（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉ吐担旺匣肛亘り妊Ｍｉｃ ｒｏｏｒ　ａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅ ｒら　（纒集）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＰＩｅｎｏｍ、ｌ９８２．３３５頁；　 Ａｍｍｅｒｅｒ、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　ｎ＋ｏ１．。

１０１　：　１９２−２０１．１９８３　；　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　　ら、Ｎａｔｕ ｒｅ’、　３０４　：　６５２−６５４゜１９８３〕、並びにこれらのプロモー ターの誘導体及び変異体が含まれる。誘導体及び変異体には天然に生ずる変異体 プロモーター（例えば、ＡＤＨ２−４ｃ”）　、操作されたバイブリドプロモー ター（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ、ＷＯ８６１０６０７７；　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　 ら、ＥＰ　１６４．５５６）及び他の操作された誘導体が含まれる。一般に、こ れらの誘導体は親プロモーターに比べて強化されたプロモーター強度又は変化し た制御性を提供するであろう。特に好ましい構成的プロモーターはトリオースホ スフェートイソメラーゼ（ＴＰＩＩ）プロモーター及びＡＤＨ２−４ｃプロモー ターである。

特に好ましい制御されるプロモーターには野性型ＡＤＨ２プロモーター及び温度 制御バイブリドプロモーターが含まれる。温度制御バイブリドプロモーターは、 米国特許出願シリアル番号Ｎα８８９．１００及びＮＯ，０３６，８２３明細書 に記載されているようにして、酵母交雑タイプ制御因子の１又は複数の、好まし くは２以上をプロモーター、例えばＴＰＩＩプロモーターに挿入することにより 作製される。得られるバイブリドプロモーターは、温度感受性的に交雑タイプ要 素を発現することができる宿主細胞中で用いられる。これに関して適当な酵母宿 主細胞には温度依存性１工変異体及び１週変異体が含まれる。プロモーター強度 は、一般に２３°Ｃと３６°Ｃの間で形質転換された細胞の増殖温度を変えるこ とによって制御される。さらに、発現ベクターにＴＰＩＩターミネータ−のごと き転写停止シグナルを含めるのが好ましい。酵母形質転換体中で生産されるペプ チドの精製を促進するため、好ましくは分泌される蛋白質をコードする酵母の遺 伝子からのシグナル配列を正しいリーディングフレームで注目のペプチドのため のコード配列に連結することができる。適当なシグナル配列には把α１遺伝子の プレープロ領域０［ｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｅ旦、　３０　 ：　９３３−９４３，１９８２；Ｋｕｒｊａｎら、米国特許１１ｈ４，５４６． ０８２）又は凹遺伝子（Ｍａｃｋａｙら、米国特許Ｎａ４．６１３，５７２）が 好ましい、酵母宿主株は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ　、又はＹｅａｓｔ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、カリホルニア、か ら広く入手可能である。注目のペプチドの蛋白質分解を減少させるために宿主株 がＬｕ変異を担持するのが好ましい。

高等真核細胞もまた本発明の適当な宿主細胞として役立つことができ、培養され た哺乳類細胞が好ましい、＠乳類細胞中で使用するための発現ベクターは、哺乳 類細胞に導入されたクローン化ＤＮＡ配列の転写を指令することができるプロモ ーターを含んで成るであろう。特に好ましいプロモーターはマウスメタロチオネ イン−１（ＭＴ−１）プロモーター（Ｐａｌ鱗ｉ　ｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ、 　２２２　：　８０９−８１４．１９８３）又はアデノウィルス２の支所後期プ ロモーター（Ｂｅｒｋｎｅｒ及び５ｈａｒｐ、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１２　：　１９２５−１９４１．１９８４）である。この様な発現ベクターには さらにＤＮＡ配列挿入部位の下流に位置するポリアゾニレ−ジョンシグナルが含 まれる。他の配列、例えばエンハンサ−及びＲＮＡスプライシングシグナルも含 まれることができる。一般に、注目のペプチドのためのコード配列は好ましいリ ーディングフレーム内で哺乳類分泌シグナル配列に連結され、ペプチドが細胞か ら分泌されるようにされる。

クローン化されたＤＮＡ配列は培養された哺乳類細胞に、例えばリン酸カルシウ ム介在トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒう、Ｇｅｎｅｔ、、　　７　：　６ ０３．１９８０　；　Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｅｒＥｂ、Ｖｉｒｏｌ。シレ ４５６、１９７３）又はエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ、　。

１　：　８４１−８４５．１９８２）により導入される０選択マーカーが一般に 注目の配列と供に細胞に導入され、こうしてクローン化されたＤＮＡをゲノムに 組込んだトランスフェクタントを同定できるようにする。好ましい選択マーカー にはネオマイシンのごとき薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる０選択 マーカーは注目の配列と同時に別の選択ベクターに乗せて細胞に導入することが でき、あるいはこれらは同じ発現ベクター上で導入することができる。

組込まれたＤＮＡ配列のコピー数は、ある種の選択マーカー、例えばメトトレキ セートに耐性を付与するＤＨＰＲを用いる場合に薬剤選択による増幅を逐して増 加させることができる。薬剤濃度を段階的に増加し、各段階で耐性細胞の選択を 行う。

増加したコピー数のクローン化された配列を選択することにより、発現レベルを 実質的に上げることができる。

他の高等真核生物に由°来する細胞中でのクローン化ＤＮＡ配列の発現方法が、 例えば、Ｍｉｙａｊｉｓ＋ａら（Ｇｅｎｅ、　５８　：　２７３−２８２゜１９ ８７）　：　Ｉｓａ及びＳｈｉｍａ（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、、　８８　：　２ １９−２２４．１９８７　Ｂ並びにＫｒｅｔｓｏｖａｌｉら（Ｇｅｎｅ、　５８ 　：　１６７−１７６．１９８７）により記載されている。

ペプチドを発現する宿主細胞は特定の宿主に適する培地中で増殖する。当業者に 自明のように、種々の培地が入手可能であり、そして適当な培地は宿主細胞の栄 養要求、プラスミドの選択等に基いて選択される。（培地の処方については例え ばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏ ｃｋｖｉｌｅ、Ｍｄ、を参照のこと。） 組換ペプチドは、組織からの抽出についてすてに一般的に記載されているように して、細胞培地から又は透明にされた細胞溶解物から精製される。典型的には、 注目のペプチドを含有するサンプルが高速液体クロマトグラフィー及びゲル濾過 の組合せにより分画される。ピーク画分がイムノアッセイ又は生物学的活性測定 により同定される。イムノアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換ク ロマトグラフィーを含めての他の常用の分離技法を用いることもできる。

本発明のペプチドは温血動物における骨の成長の促進のための療法剤として有用 である。これらのペプチドは骨粗髭症、パーゼット病、歯周疾患の予防及び治療 、並びに特に正常の治癒が起らない患者における骨折の治癒の促進のために使用 することができる。一般に、ペプチドは生理的に許容されるキャリヤー又は希釈 剤、例えば無菌水又は無菌塩水と混合されるであろう。あるいは、ペプチドは凍 結乾燥の形で包装され、そして投与の前にキャリヤー又は希釈剤と混合されるで あろう。約３２アミノ酸より短い長さのペプチドは鼻内投与のために適当であろ う、鼻内に組成物を投与する方法はよく知られている。要約すれば、注目のペプ チドを生理的に許容される緩衝液に溶解し、そして鼻の膜に噴霧する。鼻内投与 に適さないより長いペプチド及びより短いペプチドは注射により、好ましくは皮 下注射により投与される。ペプチドはまた生薬中で投与することができる。適当 な投与量は一般に患者の体重１ｋｇ１日当り約０．２ｇ／２ｍｇ、好ましくは約 ２　ｍ　／　２■／ｋｇ７日、最も好ましくは約２０〜２００ａｒ／ｋｇ／日の 範囲であり、治療されるべき状態の正確な性質に依存する。ペプチドを鼻内投与 する場合、１日の経過にわたり分割された量を用いるのが好ましい。実質的によ り高い投与量は低下した増殖活性をもたらすかもしれない、ペプチドはまた他の 療法剤と組合わせて投与することができる。これに関して好ましい添加剤にはエ ストロゲン、カルシトニン及びビスホスホネートが含まれ、これらは骨吸収を低 下せしめることが知られており、そしてそれ由に本発明のペプチドの作用を補完 することができる。さらに、ペプチドの作用は、それらを成長因子と組合わせる ことによって増強され得ることが見出された。

明らかに、この増強は、−膜化された成長促進効果を有すると報告されている投 与量又はそれより低い投与量の成長因子投与量において観察される。これに関し て有用な成長因子にはインシュリン、インシュリン様成長因子（ソマトメジン） 、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、形質転換成長因子（ＴＧＦα及びＴＧＦ β）及び上皮成長因子（ＥＧＰ）が含まれ、ＩＧＦ−１キヤリヤー蛋白質を伴う 又は伴わないインシュリン様成長因子１　（ＩＧＦ−１，ソマトメジンＣとして も知られている）が特に好ましい。

これらの成長因子の製造方法は当業界において知られている。

例えば、Ｍｕｒｒａｙら、米国特許Ｎｌ　４．７６６．０７３　；　Ｄｅｒｙｎ ｃｋら、ＥＰ　２００＋３４１　ｅ　Ｄｅｒｙｎｃｋら、米国特許に４．７４２ ．００３；Ｇｒｅｇｏｒｙら、米国特許に３．８Ｂ３．４９７；Ｅａｔｏｒ、Ｅ Ｐ　４６．０３９；Ｊａｎｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ。

３０６　：　６０９−６１１．１９８３　；及びＢｅ１ｌら、Ｎａｔｕｒｅ、　 ３１０　：　７５５−７７７＋１９８４を参照のこと。成長因子は、本発明のペ プチドと、軟組織への最小の影響を伴ってペプチドの増殖効果を増強することが 実験的に証明されている量において組合わされる。成長因子は一般に、それらが 単独で有効であることが臨床的に証明されているレベル又はそれより低いレベル で使用されるであろう。好ましい態様においては、本発明のペプチドは、患者の 体重当り１日当り０．０２〜２■のＩＧＦ−１と組合わせて使用される。

下記の実施例は限定的ではなく例示的に提供される。

プロカルシトニンのアミノ末端領域及びカルボキシ末端領域（第１表）中の配列 に対応する合成ペプチド（ＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得 た）に対して調製された抗血清を用いてイムノアッセイにより、Ｎ−ｐｒｏＣＴ が正常組織及び腫瘍組織中で検出された。１−エチル−３−（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミドを用いてキーホールリンベット・ヘモシアニンに接 合されたＮＣＡＰによりラビットを免疫感作することによりＮＣＡＰ抗血清を生 じさせた（Ｂｉｒｎｂａｕｍら、１９８２、前掲；Ｇｏｏｄｆｒｉｅｎｄら、５ ｃｉｅｎｃｅ、　　１４４　二１３４４−１３４６．１９６４）　、キーホール リンペットに接合させた合成ＮＴＰ−Ｔｙｒを用いてラビットを免疫怒作するこ とによりＮＴＰ抗血清を生じさせた（Ｇｏｏｄｆｒｉｅｎｄら、前掲）。

」」−表 ［ＴＹｒ’］　−ＮＣＡＰ　　　　　　　　　　（Ｔｙｒ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＳｅｒＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ−ＮＣＡＰ　　　 　＊（ＨＰＰＭ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ＊　ＨＰ Ｐ八：　３−　（４−ヒドロキシルフェニルド標準及びトレーサーとして放射性 ヨウ素化合成［Ｔｙｒ’ｌ−ＮＣＡＰを用いてＮＣＡＰラジオイムノアッセイを 展開した。すべてのヨウ素化はクロラミン−Ｔ法により行い、そしてロｕｓｏー ３２シリカ吸着により精製した（Ｒｏｏｓ及びｐ６［（＋３，　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆＨｏｒｍｏｎｅ　Ｒａｄｉｏａｓｓａ、第二版、Ｊａｆｆｅ及びＢｅｈｒ ｌＩｌａｎ編集、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ．１９７８．　 ４０１−４１８頁）。測定をＮ−ｐｒｏＣＴ配列の遊離カルボキシ末端部分に対 して特異的であるように展開した。修飾されたアミノ末端（チロシン又はＢｏｌ ｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒアダクト）を含む放射性ラベルされたＮＣＡＰ類似体によ り抗血清をスクリーニングすることにより、ＮＣＡＰのカルボキシ−末端部分に 向けられた抗血清を選択した。すべてのラジオイムノアッセイは、１ｍＭＥＤＴ Ａニナトリウム、０、００５％メルチオレートナトリウム、０．１ウシ血清アル ブミン（Ｐｅｎｔａｘ画分■）、及び０．０３％１３ｒｉｊ−３５洗剤を含有す る０、０２Ｍリン酸ナトリウム暖衝液（ｐ）１７．５）中で行われた。１：３、 ５００の最終希釈のＮＣＡＰ抗血清（ラビットから、ｒｏｄｅｓｓａ　Ｊ　）、 トレーサー、及び標準又はサンプルをチューブ当り５００Ｉの最終容量に加え、 そして４°Ｃにて一夜インキエベートした。

ＩＩｄ／チューブの０．　１％（Ｗ／　Ｖ　）　Ｉｇｇｓｏｒｂ　（Ｔｈｅ　Ｅ ｎｚｙ＋＋ｅＣｅｎ　ｔｅｒ）を添加することにより相分離を達成した。合成Ｔ ｙｒ−ＮＣＡＰ及びＮＣＡＰについての検出の測定限界は約０．２０ｐｍｏｌ／ チューブあり、およそ１．　８　ｐｍｏｌ／チューブにおいて、結合したトレー サーの５０％置換が起こる。ＮＣＡＰのＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ誘導体はＴ ｙｒ−ＮＣＡＰ及び未修飾ＮＣＡＰペプチドのそれに非常に類似した置換曲線を 有していた。これに対して、ＮＣＡＰ　（及びＮ−ｐｒｏｃＴ）の最後の２個の アミノ酸を欠＜　ｐｒｏｃＴａｂ−ｓｓを用いてはトレーサーの置換は観察され なかった。カルボキシ末端が延長されたＮＣＡＰ−含有ペプチドｐｒｏｃＴａｂ −ｓｑはＮＣＡＰより１．０００倍低い免疫反応性を有し、このＮＣＡＰアッセ イにおいてＮＣＡＰ−含有ペプチドが交叉反応するためには遊離カルボキシ末端 セリンが必要であることが示された。ＮＣＡＰイムノアッセイはＮ−ｐｒｏＣＴ （ｐｒｏｃＴ＋−ｓｔ）を認識すべきであるが、プロカルシトニン又は他のカル ボキシ末端延長を有するＮＣＡＰ−含有形体を検出すべきでない。

やはりＣＧＲＰへの前駆体のアミノ末端に見出されるセグメントであるＮＴＰ− Ｔｙｒに対する抗血清（Ａｗ＋ａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　。

２５７　：　２１２９−２１３２．　１９８２　；　Ｇｋｏｎｏｓら、前掲）を 、Ｎ−ｐｒｏＣＴのアミノ末端領域の検出のために用いた。ラビットからの抗血 清ｒ　Ｖａｎｅｓｓａ　Ｊを１：ｔｏｏｏの最終希釈で用いた。抗血清、トレー サー、標準又はサンプル、及び緩衝液をチューブ当り５００Ｉの最終容量に加え 、そして４℃にて一夜インキユベートした。抗体Ｖａｎｅｓｓａを用いてのＮＴ Ｐ−Ｔｙｒ標準の検出限界は典型的には１５０Ｉｇ（０．０８ｐｎ＋ｏｌ）　／ チューブであり、１．２ｎｇ（０．７４ｐｍｏｌ）／チューブで５０％置換であ った。このＮＴＰアッセイにおいて、カルシトニン、Ｃ−ｐｒｏＣＴ，　ＣＧＲ Ｐ、ソマトスタチン及びＮＣＡＰは交叉反応しなかった。１０〜２０ｉｄ／チユ ーブ量の６Ｍグアニジン−ＨＣｉがＶａｎｅｓｓａラジオイムノアッセイを妨害 したので、グアニジンを含有するゲル濾過画分を分析するために他のＮＴＰ抗血 清（ラビットから、’Ｐｅｇｇｙ」）を用いた。ｐｅｇｇｙ抗血清は４０ｄ／チ ユーブアリコートまでの６Ｍグアニジン−Ｈｌと共に使用することができるので この抗血清を選択した。前記の標準的５００ｕｌアツセイにおいてＰｅｇｇｙ　 ＮＴＰ抗血清を１：２０．ＯＯＯの最終濃度で用いた。ＮＴＰ−Ｔｙｒ標準の検 出限界は１２ｐｇ（　７　ｆｍｏｌ）／チューブであり、５０％置換は１８５Ｉ ｇ（０．１１ｐ■０１）／チューブにおいて起った。

ラフトカルシトニンのラジオイムノアッセイを、アミド化されたカルボキシ末端 について特異的なカルシトニン抗血清Ｒ−２、及びカルシトニンの中央領域を認 識する抗血清（Ｒｏｏｓら、１９７９、前掲；　Ｂｉｒｎｂａｕｍら、１９８４ ，前掲）を用いて行った６ラツトＣＧＲＰは、すでに記載されているように（Ｇ ｋｏｎｏｓら、前掲；　）ｆｕｌｌｅｒ−Ｂｒｅｗら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ 　　、１２１　　：１２７２−１２７７、１９８７）、ヒトＣＧＲＰ抗血清ＲＢ 　−　２０３５に基くイムノアッセイを用いて測定した。

Ｂ、細胞抽出物の調製 ＷＡＧ／Ｒｉｊ　ラットをＡＡＡＬＡＣ−認定動物施設で維持した。標準的任意 的飼料はゲラ歯動物飼料１５００１（ＴｅｋＬａｄ　Ｃｏ、、ＨａｒｌａｎＳｐ ｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｃ、）であった。この飼料は、通常のビタミン 及びミネラル補充物のすべてと共に４．５％の脂肪、２３％の蛋白質及び６％の 繊維を含有した。正常な甲状腺組織を得るため、６〜９月令の雌性ラットを殺し 、そしてその甲状腺を摘出した。Ｃ−細胞過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）を 誘導する（ＭｉｌｌｅｒシントンＤ、Ｃ，，１９８５）ため、雌性−＾Ｇ／Ｒｉ ｊの群を生後４〜７週において選択し、そしてその後特別の高脂肪飼料（Ｔｅｋ Ｌａｄ通常高脂肪飼料１Ｂ２３７６）で維持した。この飼料は正常レベルのすべ てのビタミン及びミネラル補充物と共に４５％の脂肪、２３％の蛋白質及び５％ の繊維を含有し、この高脂肪飼料と通常飼料（１１５００１）との唯一の差異は １０倍高い濃度の脂肪であった。

７〜ｌＯ月令において、これらのラットの群を殺し、そしてその甲状腺を測定に 使用するために取った。組織抽出物を後記のようにして抽出した。

カルシトニン富化シリーズ１−２−４甲状腺髄癌を、すでに報告されている（Ｒ ｏｏｓら、１９７９、前掲）ようにして、離乳した子への連続的被膜下腎移植に より生じさせた。１０〜４０ｇの腫瘍を外科的に摘出し、そして下記のようにし て抽出した。

組織抽出物を調製するため、最終的に細断された組織に１０容量（ｄ／ｇ）の２ Ｎ酢酸／１％ＴＦＡを添加し、そして次にこの懸濁液を２０分間沸騰せしめた。

サンプルをＢｒｉｎｋｍａｎｎＰｏｌｙｔｏｒｏｎを用いて１０の設定で十分に ホモジナイズし、そして次に氷上で冷却した。生ずるホモジネートを１５．００ ０ｘｇにて１５分間遠心分離し、そして上滑をペレットから吸引した。分解を最 小にしそして再現性あるクロマトグラフィープロフィールを得るため、ペプチド を上清から回分式逆相法により抽出した。この方法においては、上清を、アセト ニトリルで活性化されたＶｙｄａｃ　２１８　ＴＰＢ３０　Ｃ−１８、大孔シリ カビーズの２〜５ｇのカラムに通用した。カラムをまず０．１％ＴＦＡによりす すぎ、そして次に２０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡによりすすいだ０次に 、サンプルを少量の９０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡ中に溶出し、そして ５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄＶａｃ系において乾燥した。

樹立された甲状腺髄癌細胞系の単層培養物を、１．２８　ｇ　／　ｊ！のＮａＨ ＣＯ，，５ｐｇ　／　ｄｉのトランスフェリン、３０ｎＭ亜セレン酸及び５Ｒｔ ／Ｍｌのインシュリンが補充されたＤＭＥＭ／栄養混合物Ｆ−１０（Ｈａｍ’ｓ ）　（１：１）から成る無血清培地中で常法通りに増殖せしめた。この培養物を 、加湿した空気−８％ＣＯｔ雰囲気中で維持した。継代１５０〜１５５からのＣ Ａ　−７７細胞を、すでに記載されている方法（Ｍｕｓｚｙｎｓｋｉら、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５８：１１６７Ｂ−１１６８３、１９８３）を用いて ２５ｃｉｉフラスコ当り５Ｘ１０’細胞の密度でサブカルチュアーし、その後培 地を４８時間ごとに交換した。

分泌実験のため、細胞をＤＭＥＭのみの中で培養し、そして培地中のカルシウム 濃度を１００ｍＭ　ＣａＣｆ　ｚに調整した。各フラスコが約５Ｘ１０ｂ細胞を 含有するように、プレートした後１０日目に実験を始めた。試験及び対照インキ ュベーションの終りにおいて、組織培養培地を１６．ＯＯＯｘｇにて１０分間の 遠心分離によりきれいにし、ＰＭＳＦを０．３■／ｌｌ１１とし、そして分析の ために凍結して貯蔵した。細胞をフラスコから１％のＴＦＡ中にかき集め、そし て音波処理によりホモジナイズした。細胞破片を遠心分離によりペレット化しそ して廃棄し、上清をＰＭＳＦｏ、３［／ｄとし、そして分析のために凍結して貯 蔵した。培地及びきれいにされた細胞抽出物を組織抽出物と同様にしてＶｙｄａ ｃ　Ｃ＋ｓカラムに通した。

Ｃ，Ｃ−細胞抽出液中のＮ−ｐｒｏＣＴの同定甲状腺及び腫瘍Ｃ−細胞からの逐 次希釈された抽出物を用いるトレーサー競争曲線をＮＣＡＰ及び［Ｔｙｒ’］− ＮＣＡＰにより得たものと平行した（第２図）。精製されたプロカルシトニン、 ＮＴＰ−Ｔｙｒ　、並びにＣ−細胞生産物を含めての他の種々のペプチド、例え ばカルシトニン、Ｃ−ｐｒｏＣＴ、ＣＧＣＴ及びソマトスタチンとの交叉反応性 は観察されなかった。

ＮＴＰイムノアッセイにおいて、Ｃ−細胞抽出物の逐次希釈物によるトレーサー 置換曲線は合成ＮＴＰ−Ｔｙｒ標準のそれと平行した（第３図）。

Ｄ、腫瘍細胞抽出物中のＮ−ｐｒｏｃＴの同定腫瘍ペプチドを逆相ＨＰＬＣによ り分離した。１−２−４シリーズ甲状腺髄癌からの乾燥した熱−酸抽出物を１％ ＴＦＡ　（２００〜６００ｄ）中に再懸濁し、そして−ａｔｅｒｓ　Ｕ６に注入 器及びモジュール５ｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ　ＨＰＬＣ系を用い−ｈａｔ ｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｓｉ１３０００ｃｔｙｌ−２５分析カラムに注入した（Ｂｉ ｒｎｂａｕ＋＊ら、１９８４、前掲）、ペプチド分離を０．１％水性ＴＦＡ中ア 七トニトリルグラジエントにより行った。最初の１０分間、アセトニトリル濃度 を３０％から３５％に上昇せしめ、その後アセトニトリル濃度を次の７０分間に わたり３５％から４０％に直線的に上昇せしめた。

免疫反応性ＮＣＡＰ及びＮＴＰの主たる同時的ピークが４８〜４９分で溶出した （第４図）。これらの両分はカルシトニン免疫反応性を欠いていた。免疫反応性 ＮＣＡＰ／免疫反応性ＮＴＰ形はプロカルシトニン（６０分）より前でありカル シトニン（１８分）より後に溶出した。主たる免疫反応性ピークにお、ける免疫 反応性ＮＣＡＰ対免疫反応性ＮＴＰのモル比はＮ−ｐｒｏＣＴについて予想され るように１．０であった。

６ＭグアニジンＨＣｌ中でのゲル濾過を用いて免疫反応性ペプチドのサイズを予 想した。５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（スーパーファイン）の０．９　Ｘ６０ｃ ｍカラムを６Ｍグアニジン−ＨＣｊ！１０．０１％ウシ血清アルブミンにより平 衡化した（Ｂｉｒｎｂａｕｍら、１９８４、前掲）、クロマトグラフィーの前に 凍結乾燥されたサンプルを５％の２−メルカプトエタノールを補充したカラム緩 衝液に溶解し、そして７０℃にて１時間加熱した。クロマトグラフィーの直前に ブルーデキストラン及びフェノールレッドマーカーをサンプルに加えた。　　４ ６０ｄの画分を常法により集めた。

ブルーデキストラン（Ｖｏ）、チトクロームＣ（１２，８００）、ラフ）　ＣＧ ＲＰダイマー（７，６００）　、アドレ／コルチコトロビンサルモン（４、５０ ０）、ラットＣＧＲＰ（３，８００）、ラットカルシトニン（３，４５０）、γ −エンドルフィン（１，８６０）及びフェノールレッド（Ｖｓ）によりサイズ換 算を行った。

主たる）ＩＰＬｃビーク及びゲル濾過ピークの同一性をゲル濾過ピークのＨＰＬ Ｃ及びＨＰＬＣピークのゲル濾過により確認した。

ＣＧＲＰより３０倍多くのカルシトニンを有する１−２−４腫瘍において、免疫 反応性ＮＣＡＰ及びＮＴＰの両者を含有する主ピークは７．４　ＫＤａの見かけ サイズで溶出し、このサイズはＮ−ｐｒｏＣＴについて予想されたものであった （第５図）、免疫反応性ＮＣＡＰの他の有意なピークは観察されなかったが、免 疫反応性の微小なピークが１３ＫＤａ及び４　ＫＤａのサイズに対応する位置で 溶出した。７．５　ＫＤａビークにおける免疫反応性ＮＣＡＰ対免疫反応性ＮＴ Ｐの高い分子比はラジオイムノアッセイをグアニジンが妨害したためである。プ ロカルシトニン（１，３ＫＤａ）　ピークは中央領域カルシトニンラジオイムノ アッセイにおいてカルシトニンと交叉反応したが、７．４　ＫＤａ及び４　ＫＤ ａの免疫反応性ＮＴＰ　ピークはいずれも交叉反応しなかった。４　ＫＤａの免 疫反応性ＮＴＰはおそらくより大きな免疫反応性ＮＴＰ形の断片であった。なぜ なら、部分精製された７、　４　ＫＤａ免疫反応性ＮＴＰの貯蔵（１％ＴＦＡ中 、−２０°Ｃにて）が少量の４　ＫＤａ形を生成したからである。小形の免疫反 応性ＮＴＰ形の生成は０．３■／ｄのＰＭＳＦ及び６Ｍグアニジン−ＨＣｌ中で の貯蔵により低下させることができた。さらに、冷１％ＴＦＡではなく６Ｍグア ニジン−ＨＣｌ２による７０°Ｃでの組織の抽出が４　ＷＤａ免疫反応性ＮＴＰ のレベルを低下せしめた。

ＣＡ−７７甲状腺髄癌細胞は７．４　ＫＤａのＮＣＡＰ−含有ペプチドを分泌し 、そのＨＰＬＣプロフィールは１−２−４腫瘍及び甲状腺において観察された細 胞性Ｎ−ｐｒｏＣＴから区別されなかった。

このペプチドは基礎培地中にカルシトニンに近いモル比で存在した。既知のカル シトニン分泌促進剤である細胞外カルシトニンを０．５ｍＭから１．８又は４ｍ Ｍに上昇させることにより、カルシトニン分泌の刺激と同様に免疫反応性ＮＣＡ Ｐの分泌が刺激された。４Ｘ１０−’Ｍデキサメタシンによる４日間のこれらの 培養物の処理が、ＮＣＡＰ及びカルシトニンの細胞レベル並びにＮＣＡＰ及びカ ルシトニン分泌の基礎速度の両者を増加せしめた。未処理のＣ−細胞培養物にお けるように、ステロイド処理された培養物のカルシウム刺激がＮＣＡＰ及びカル シトニンの分泌を平行的に増加せしめた。

Ｅ、正常甲状腺及びＣ−細胞過形成を有する甲状腺における免疫反応性ペプチド 飼料で誘導したＣ−細胞過形成を有するラットを研究することによりＮ−ｐｒｏ ＣＴ及びカルシトニンの生体内同等制？１ｌｆｌ（ｃｏｏｒ−ｄｔｎａｔｅ　ｒ ｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の証拠を得た。この慢性高脂肪飼料により誘導された甲状 腺カルシトニン含量の生理的増加が免疫反応性ＮＣＡＰ及びＮＴＰ含量の対応す る増加により反映された（第２表）。これらの甲状腺における免疫反応性ＮＣＡ Ｐ及びＮＴＰ形は正常な甲状腺及び１−２−４腫瘍組織中に見出されるものと区 別できないゲル濾過移動度及びＩ（ＰＬＣ移動度を有することが見出された。こ のＨＰＬＣピーク内の免疫反応性ＮＣＡＰ対ＮＴＰのモル比は１．０であった。

イムノアッセイにより確認された免疫反応性ＮＣＡＰ、　ＮＴＰ及びカルシトニ ンのモル量は正常甲状腺においてほぼ同等であった（第２表）。正常なラットの 甲状腺からの免疫反応性ＮＣＡＰ及び免疫反応性ＮＴＰのＨＰＬＣ溶出位置は１ −２−４腫瘍組織中に見出されるそれと同じであった。正常甲状腺からのＨＰＬ Ｃビーク中の免疫反応性ＮＣＡＰ対免疫反応性ＮＴＰの見かけ上のモル比は１． ０であり、ｌ−２−４腫瘍ＨＰＬＣビークについて観察されたものと同じであっ た。正常ラット甲状腺の抽出物のグアニジンゲル濾過は、１−２−４腫瘍におい て見出される免疫反応性ＮＣＡＰ／ＮＴＰビークからサイズにより区別できない 主たる７．４　ＫＤａ免疫反応性ＮＣＡＰ／ＮＴＰビークを示した。

１１表 プロカルシトニン由来免疫反応性の組織濃度０１−２−４腫ｉ　　　　４．５０ ±０．２７　　４．７５±０．２１　３．２５±０．４５正常甲状腺　　　０． ９８±０．２９　　０．９６±０．３２　０．８８±０，２９肝臓及筋肉　　　 　＜０．０１　　　　　＜０．０１　　　　＜０．０１木値（±ＳＥＭ）は組繊 ■当りのｐｍｏ１当量で示され、そして４個の実験測定値の平均である。

ＮＣＡＰ抗血清の特異性が示すところによれば、７．４　ＫＤａペプチドのカル ボキシ末端は、プロカルシトニン中の第一の二価開裂部位にすぐ先行するセゾン （セゾンー５７）である、ＡＣ−７７細胞からの放射性ラベルされたペプチドの ＮＴＰ−免疫反応性及び部分釣機配列決定（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ） はプロカルシトニンと同じアミノ末端を示す。従って、免疫反応性ＮＴＰ−含有 ベプチド及び免疫反応性ＮＣＡＰ−含有ペプチドの生化学的性質はそれを５７− 残基Ｎ−ｐｒｏＣＴ種として同定する。

実施１　　と肛匹し■単ｌ ラット甲状腺髄癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ ）組織を秤量し、細断しそして１０容量（湿重量ｇ当り）の１．５Ｎ酢酸に加え た。この混合物を沸点に加熱し、そしてさらに２０分間沸騰させる。次に、この 熱混合物をＢｒ１ｎｋｎ＋ａｎｎポリトロン（設定１０）中でホモジナイズする 。次に、ホモジネートを氷水により迅速に冷却し、そしておよそ４℃にて２０分 間保持し、次に２０．０００ｘｇにて２０分間遠心分離した。ペレット又は浮ん でいる脂質層を撹乱しないように注意しながら水性上清を吸引する。

この上清を、０，１％ＴＦＡ中で平衡化したＶｙｄａｃ　Ｃ−１８、床孔、３０ −ミクロンシリカの５ｇのカラムに適用する。次に、カラムを２５−の０．１％ ＴＦＡにより洗浄し、次に５０ｄの２０％アセトニトリル１０．Ｉ％ＴＦＡによ り洗浄する。次にＮ−ｐｒｏｃＴを４５％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡで溶 出しそして加熱されていない５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥する。

乾燥したＮ−ｐｒｏＣＴを６Ｍグアニジンに溶解し、そして６Ｍグアニジ７−Ｈ Ｃｌ２　（ｐＨ５゜５）中で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５００カラムに 通用する。７．４　ＫＤａ　Ｉ）ＮＴＰ及びＮＣＡＰを含有する材料（第５図） をプールする。次に、このペプチドを、ＶｙｄａｃＣ−１８の１ｇのカラムへの 吸着及びそれからの溶出により、プールされたグアニジン画分から回収し、そし て前記のようにして５ｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥する。

ゲル濾過からのＮ−ｐｒｏＣＴの乾燥したピークを３００１１１の０．１％ＴＦ Ａに再懸濁し、そして−ｈａｔ論ａｎ　Ｃ−１８シリカ、ｌＯ−ミクロン（３０ ０Ａ　孔サイズ）、逆相樹脂の０．６Ｘ２５Ωのカラムに注入する。Ｎ−ｐｒｏ ＣＴペプチドはカラムから３７％アセトニトリルにおいて溶出し、そして８０分 間にわたる３５％−４０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡグラジェントでの分 画により他の蛋白質から分離することができる。一定の特異的免疫反応性のピー クをアミノ酸分析及び配列決定のために選択する。

イオン交換クロマトグラフィー、異るイオン対試薬及びＨＰＬＣマトリクスを用 いるさらなるＨＰＬＣ精製、及び／又は適当な高力価抗血清を用いる免疫吸着ク ロマトグラフィー、を用いて追加の精製を行う。

ｍ　　アミノ　ｒプロカルシトニンペプチドの　　８・■ Ａ、ラットＮ−ｐｒｏＣＴ ＲＩＡの生成（実施例１）のために使用されたＮＴＰ−Ｔｙｒペプチド（５７− 残基ラットＮ−ｐｒｏＣＴの最初のドデカペプチド断片を示す）を用いて、可能 性ある骨吸収及び／又は骨細胞増殖活性を評価した。

１６日−胚性ニワトリ及び新生ラットから頭蓋冠を取り、そしてコラーゼナーゼ で処理して骨細胞を調製した。細胞を無血清ＢＧＪｂ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａ ｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ、からのＦｉｔｔｏｎ−ＪａｃｋｓｏｎＭｏｄｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ）に懸濁し、そして２４時間にわたりプレートした。プレートを すすいで繊維芽細胞及び他の非骨芽細胞を除去した。合成ＮＴＰ−Ｔｙｒを０． ００１〜１００−の濃度で２２時間加え、この時点で細胞をトリチウム化チミジ ンにより４時間ラベルした。ＤＮＡ合成をＴＣＡで沈澱するトリチウム化チミジ ンとして測定しそして細胞増殖の指標として使用した。ＤＮＡ合成を未処理培養 物のそれと比較して表現した。合成Ｎ−ｐｒｏＣＴ断片を用いて、１〇−濃度に おいてマイトジェン応答が見られ、そして１岸において有意な効果が観察された 。カルシトニン及びＣＧＲＰのいずれもなんらのマイトジェン効果も示さなかっ た（第６図）。これらの実験の解釈において重要なことは、この特定の培養によ りプレートされる骨細胞がほとんど全部骨形成細胞（骨芽細胞）及びその前駆体 （前骨形成細胞）であることである。

Ｎ−ｐｒｏＣＴを、１−２−４°腫瘍組織から、沸騰酸抽出法と逆相Ｃ−１８シ リカ精製を用いて出発ホモジネートに対して約１００倍濃縮することにより部分 精製した。このＮ−ｐｒｏＣＴをＢＧＪｂ培地に再懸濁し、中和し、そして実質 上前記のようにしてラット又はニワトリの頭蓋冠骨芽細胞培養物に加えた。ニワ トリ（第７図Ａ）及びラット（第７図Ｂ）骨細胞培養物の両者においてチミジン の取込みが増加した。いずれの場合にも、部分精製されたＮ−ｐｒｏＣＴ調製物 が２〜３倍のマイトジェン応答を惹起し、最大応答が１０−７〜１０−”Ｍにお いて観察された。無傷のＮ−ｐｒｏＣＴについてのこの感受性は合成ペプチド断 片（ＮＴＰ−Ｔｙｒ）についてのそれに比べて１００〜１０００倍高いようであ る。ラットの骨芽細胞及び前骨芽細胞はニワトリ細胞に比べて、ラットのペプチ ドに対して幾分感受性が高いようであり、１０−　”　Ｍという低い投与量がラ ット骨芽細胞培養物において刺激効果を有していた。低カルシウム症アッセイ及 び骨吸収アッセイにおいて活性であるカルシトニン及びＣＧＲＰのいずれも平行 ニワトリ骨芽細胞マイトジェンアッセイにおいて１０”’〜１０−’Ｍの濃度で 効果を有さなかった。

骨細胞に対する対照培養物として、皮膚細胞培養物をラットの子から調製し、そ して血清の非存在下で２４時間にわたりプレートした。Ｎ−ｐｒｏＣＴがラット 皮膚細胞に添加された場合、骨芽細胞及び前骨芽細胞に対する同じ調製物の大き な効果とは異り、最も高い濃度においてさえわずかなマイトジェン効果が存在し た（第８図）。骨芽細胞及び前骨芽細胞に対するＮ−ｐｒｏＣＴのマイトジェン 効果は一貫して、骨芽細胞及び前骨芽細胞に対して最大に刺激的であることが見 出されている濃度において繊維芽細胞に対して観察される効果の２〜３倍であっ た。従って、Ｎ−ｐｒｏＣＴのマイトジェン効果は細胞特異的（骨芽細胞及び前 骨芽細胞に対して有効であるが繊維芽細胞に対してはを効でない）であり、そし てペプチド特異的（天然ペプチド及び合成ＮＴＰに対して有効であるがカルシト ニン又はＣＧＲＰに対しては特異的でない）である。このマイトジェン効果の効 力はインシュリン及びソマトスタチンのそれに類似する。

Ｂ、　ヒ　トＮ−ｐｒｏＣＴ ヒトＮ−ｐｒｏＣＴはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｍ５（Ｆｏｓｔｅｒ 　Ｃ１ｔｙ＋　　カリホルニア）により合成され、そして不純な調製物として適 当された。

ヒトペプチドを、Ｖｙｄａｃ　Ｃ−４逆相カラム上での高速液体クロマトグラフ ィー、及びこれに続＜　Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ　ＲＰ−１８（Ｃ−１８逆相シリ カ）カラム上での主ＨＰＬＣピークのクロマトグラフィーにより精製した。Ｌｉ ｃｈｒｏｐｒｅｐカラム（０，５ｇ）は、０６１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）を含有する１０ｍの９０％のＣ）ＩｆｆＣＮにより活性化した。次に、カラム を２０ｄの０．１％ＴＦＡにより洗浄し、そしてＮ−ｐｒｏＣＴサンプル（０， ５ｄ）をカラムに適用した。カラムを１０ｄの０．１％ＴＦＡにより洗浄し、次 に０．１％ＴＦＡを含有する１０ｍの２０％ＣｌｌＣＮにより洗浄した。Ｎ−ｐ ｒｏＣＴを４０％ＣＢ、ＩＣＮ／　０．１％ＴＦＡにより溶出した。９０％より 多くのＮ−ｐｒｏＣＴが４０％のＣＨ３ＣＮにより溶出した。

合成ペプチドの配列を分析し、そして天然ヒ）　Ｎ−ｐｒｏＣＴのそれと同一で あることが見出された（第１図）。

ニワトリ骨芽細胞及び前骨芽細胞に対する合成ヒ）　Ｎ−ｐｒｏｃＴのマイトジ ェン活性を前記のようにして測定した。測定結果を第９図に各実験群について平 均±ＳＥＭ（ｎ　＝　６　）として示し、そして対照群の平均に対して示す。「 対照」培養物にはＢＧＪｂ培地のみ与え、そして「インシュリン」培養物は陽性 対象として１０■／戚のインシュリン（約１．５Ｍ）を含有した。

合成ヒトＮ−ｐｒｏＣＴをまたヒト骨芽細胞及び前骨芽細胞に対する効果につい て試験した。ヒト骨芽細胞富化培養物を１人の老男性及び２人の老女性の外科的 大腿骨断片から調製した。

骨断片をコラ−ゲナーゼ中で消化した。消化物から細胞を集め、ＰＢＳ中ですす ぎ、そして１５％のウシ胎児血清を含有する無カルシウムＭＥＭ中、組織培養フ ラスコにプレートした。得られる骨芽細胞富化培養物を皿からトリプシン処理に より取。

り出し、ＰＢＳ中ですすぎ、５％のウシ胎児血清を含有するＢＧＪｂ培地に再懸 濁し、そして４５−ウェル・マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｉｎ ｃ、）にウェル当り５０．０００細胞の密度でプレートした。１６時間後、培地 を除去し、培養物をＰＢＳで２回すすぎ、そして無血清ＢＧＪｂ培地を加えた。

培養物を６時間増殖せしめ、この後培地を除去し、そして２００試験剤を含有す るＩのＢＧＪｂ培地を各ウェルに加えた。１６〜１８時間後、１又は２μＣｉの ３Ｈ−チミジンを含有する５０ｍのＢＧＪｂ培地を各ウェルに加えた。４時間後 培地を除去し、そしてウェルをＰＢＳで２回すすぎ、そして自然乾燥させた。次 に、各ウェルを、１２．５％ＴＣＡで湿した綿球でこすった。この綿球を１２． ５％ＴＣＡ中で１０分間づつ２回、及び９５％エタノール中で１０分間１回洗浄 し、乾燥し、４ｄのＥｃｏｌｏｒａｅ（ＩＣＮ＋　Ｉｒｖｒｎｅ、カリホルニア ）に入れ、そしてシンチレーションカウンター中で計数した。結果が示すところ によれば、１０河ＭのヒトＮ−ｐｒｏＣＴがＤＮＡへのチミジンの取込みの最大 の刺激（約倍）をもたらし、最大の半分の効諜が約１ｎＭにおいて得られた（第 １Ｏ図ａ）。インシュリンの最も効果的な量（１０ｔｒｇ　／　ｎｉｌ又は２− ）もこれらの培養物においてチミジンの取込みを倍化させた。類似の実験をヒト Ｕ−２Ｏ８骨肉腫細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ　９６）に対して行った。細胞をＢＧＪ ｂ培地中に維持し、コンフルエントのフラスコからトリプシン処理において収得 し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１％のウシ胎児血清を含有するＢＧＪｂ培地中培地 −４８ル・ミクロタイタープレートにプレートし、そして−夜培養した。細胞を 無血清ＢＧＪｂ培地に移し、そして６時間後３Ｈ−チミジンの取込みを上記のよ うにして測定した。ヒトＨ−ｐｒｏＣＨは、ＤＮＡへのチミジンの取込みを、＞ １０河Ｍにて最大（約２倍）の効果をもって、そして５０河にて最大の半分の効 果をもって刺激した（第１０ｂ図ン。

匹敵する最大効果が３０河ｇ／ｄのＩＧＦ−Ｉ　（ヒト血清から精製）又は１０ ｎ／−のインシュリンにより観察された。

ヒトＮ−ｐｒｏＣＴはまたラット骨芽細胞に対して刺激効果を有していたが、し かしラット皮膚細胞に対しては有しなかった。

ヒトＮ−ｐｒｏｃＩをインシュリンとの組合せにおいてヒトＵ−２Ｏ３細胞に対 して試験した。細胞を前記のようにして４８−ウェルマイクロタイタープレート にプレートし、そして次にＮ−ｐｒｏＣＴ　、インシュリン、又はＮ−ｐｒｏｃ Ｔ＋インシュリンの存在下で４８時間インキュベートした。この時間の終りに、 トリプシン及びεＤＴＡをそれぞれ２５■／ｄ及び１ｍＭの最終濃度に添加し、 そしてこの培養物を３７°Ｃにて、細胞の脱着が見えるまでインキュベートした 。次に、ウシ児胎血清を最終濃度１５％に加えてトリプシンを不活性化した。ピ ペット処理を繰返すことによって塊状の細胞を分散せしめ、そしてアリコートを 採取してヘマチトメーターでの直接計数を行った。第３表に示す結果は、Ｎ−ｐ ｒｏＣＴとインシュリンとの間の相乗効果を示している。

芽」１表 ＢＧＪｂ　（対照）　　　　　４．８３８（±７９６）　　　　　１　　（±０ ．１２）１　ｔｔｆ４　Ｎ−ｐｒｏｃＴ　　　　１３，２０Ｈ±１，４６２）　 　　　２．７２（±０．３０　）１０躇／ｄインシユリン　　　１２，９００（ ±７９６）　　　　　　　　２．６２（±０．１６）５　躍／ｉインシュリン　 　　　８，２３５（±６６７）　　　　　　　　１．７０（±０．１４）Ｃ，ヒ トＮ−ｐｒｏｃＴペプチド 合成ヒトＮ−ｐｒｏＣＴをリジルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ　Ｃｈｅ−ｎ＋ １ｃａｌｓ　ＵＳＡ＋Ｉｎｃ、、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘ）により消化した。３４ ５■の凍結乾燥したＮ−ｐｒｏＣＴを１１０４の８Ｍ尿素に溶解した。１０ｄの ５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）を加え、そしてこの混合物を３７℃にて３０分 間インキュベートした。１５０ｍの５０＋＋ｌ’ｌ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）を混合 物に加えた。リジルエンドペプチダーゼ（３■／ｄストツク溶液）を、酵素二基 質比が１：１００となるように加えた。この混合物を３７°Ｃにて一夜インキユ ベートし、そして凍結貯蔵した。生ずるペプチドＮ−ｐｒｏＣＴ　（１−３７） 及びＮ−ｐｒｏＣＴ　（３８−５７）を、０．１％ＴＦＡ中０％−７０％アセト ニトリルのグラジェントを用いてＶｙｄａｃ　Ｃ＝４カラム上でのクロマトグラ フィーにより回収した。

ヒトＮ−ｐｒｏＣＴ　（１−３７）及びＮ−ｐｒｏＣＴ　（３８−５７）を、ト レーサーとしてヨード化ヒトＮ−ｐｒｏＣＴを用いる競争結合アッセイにおける Ｕ−２０Ｓ細胞への結合について試験した。結合アッセイは実施例７に実質的に 記載するようにして行った。５戸のＮ−ｐｒｏｃＴ　（１−３７）は、結合につ いての競争において、同じ濃度の無傷のヒトＮ−ｐｒｏＣＴと少なくとも同程度 に効果的であることが見出された。断片（３８−５７）は結合について競争する 能力をほとんど示さなかった。

合成ＮＣＡＰ　（第１表）を、前記のようにしてニワトリ及びラットの骨芽細胞 に対するマイトジェン活性について測定した。

このペプチドは０．１−〜０．１ｍＭのレベルにおいてマイトジェン活性を示さ なかった。さらに、ＮＣＡＰは骨肉腫細胞に結合する無傷のヒトＮ−ｐｒｏＣＴ と競争しなかった。

実施五土　　　におけるラッ）Ｎ−工曵り包見里Ａ、　Ｎ−ｐｒｏＣＴコード配 列の合成５７−アミノ酸ラットＮ−ｐｒｏＣＴのコード配列を、第４表に示す６ 種類の合成されたオリゴヌクレオチドから作製した。オリゴヌクレオチドを、発 現ベクターの作製の促進のためのそれぞれ５′及び３′末端におけるＥｃｏＲＩ 及びＸｂａ　Ｉ制限部位：酵母のために最適化された翻訳開始部位；　ＡＴＧ開 始コドン；酵母のコドンの好みに基いて選択されたコドン、不要な制限部位の除 去及び更なる配列の操作を促進するための制限部位の導入；並びにＴＡＡターミ ネーションコドンを有するように設計する。オリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ａ　ＤＮＡ合成機上で合成し、そして変 性ゲル上での電気泳動により精製する。オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、 等モル量で混合し、そしてアニールした。次に、アリールされた対を連結し、そ して生ずる混合物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。次に、１９０ｂｐのコ ード配列（第１１図）を天然ポリアクリルアミドスラブゲル上での電気泳動によ り単離し、そしてゲルから抽出した。コード配列の集成を第１２図に示す。

ＺＣ１７８９ Ｂ、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターを用いての発現酵母での発現のため、Ｎ−ｐｒ ｏＣＴ断片をへ〇Ｈ２−４ｃプロモーター及びＴＰＩＩターミネータ−に連結し た。次に、生ずる発現ユニットを、ＰＯＴＩ選択マーカーを含有するベクターに 挿入した。

ＡＤＨ２−４ｃ７’０−Ｆ−一ターは、野性型並録（アルコールデヒドロゲナー ゼ■）の下流部分をＲｕ５ｓｅｌ　ｌら（Ｎａｔｕｒｅ、　３０４　：　６５２ −６５４、１９８３）により記載されているＡＤＨ２−４’プロモーターの上流 部分に連結することにより作製した。　ＡＤＨ２−４ｃ７ｔ）％−ターの上流配 列はその増強された機能に責任を持つ、このプロモーターの作製を第１２図に示 す、　ｐＢＲ３２２−ＡＤＲ２−ＢＳａ（Ｗｉｌｌｉａｓｓｏｎら、独、旦：　 ６０５−６１４．１９８１）からの野性型凹構造遺伝子及び５′−フランキング 配列を含有する２、２ｋｂのＢａ１ｌ旧断片を、Ｂａ５ａｌにより線状化された Ｍ１３＊ｐ１９に連結した。挿入部の方向を制限分析により決定した。オリゴヌ クレオチドＺＣ２３７（５’　−ＧＣＣＡＧＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＡＴ　ＴＧＴ 　ＧＴＡ　ＴＴＡ−３’　）をＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ■Ｓモデル３８ ０＾ＤＮＡ合成機上で合成し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により精 製した。プロモーターを単離するため、部位特異的インビトロ変異誘発（Ｚｏｌ ｌｅｒら、財値、　　３　：４７９−４８８．１９８４）をＭ１３■ｐｌＱ中の 凹挿入部に対して、変異原ブライマーとしてＺＣ２３７を用い、そして第２プラ イマーとしＴＺＣ８７（５’　ＴＣＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　３　’ 　）を用いて行った。陽性クローンにおいてはオリゴヌクレオチドＺｃ２′３７ が」股遺伝子の構造部分をプールアウトし、翻訳開始シグナルを含む５′−フラ ンキング配列をＭ１３ｏ＋ｐ１９ポリリンカーのＥｃｏＲ１部位ｑ融合せしめる 。変異誘発されたファージの複製形を作り、そしてＢａａ旧及びＥｃｏＲＩで切 断して１．２ｋｂプロモ一ター断片を単離した。この断片を、ＢａｍＨＩ及びＥ ｃｏＲＩで線状化されたｐＵｃ１３に連結してプラスミドｐ２３７−Ｗｔを生じ させた。このｐ２３７−Ｗｔプロモーターを「プロモーターアップ」変異体ＡＤ Ｉ１２−４’プロモーターに変えるため、プロモーター機能に影響を与えること が見出されている変更を含有するＹＲｐ７−ＡＤＲ３−４ｃ（Ｒｏｓｓｅｌｌら 、前掲）がらの１．１　ｋｂ　Ｂａｇ旧−５ｐｈ　Ｉ断片を、Ｂａｇ旧及びＳｐ ｈ　Ｉにより切断されたｐ２３７−Ｗｔのベクター断片にサブクローニングした 。生ずるプラスミドをｐ２３７−４ｃ（第１３図）と命名した。

次に、クローン化されたＡＤＨ２−４Ｃプロモーターを、末端制限エンドヌクレ アーゼ開裂部位の付加により修飾した０便宜上、プラスミドｐＡＴ−１中のヒト α−１−アンチブラスチン（ＡＡＴ）の成熟型の第一アミノ酸のコドンにプロモ ーターを融合せしめることによりこれを行った。プラスミドｐＡＴ−１はｐ２３ ７−ＷｔからのＡＤＨ２プロモーターの発現ユニット及びα−１−アンチトリプ シンのｃＤＮＡ　−ＴＰＩ　１ターミネータ−配列を含んで成る。これらの配列 をベクターｐｃＰＯＴ　（第１４図）の部分に挿入した。〔プラスミドｐｃｐｏ ｒはＡＴＣＣニＥ、　コ！Ｊ　（Ｅ、　Ｃｏ１１）Ｈ８１０１株形質転換体とし て寄託されており、そして寄託番号３９６８５が与えられている。このものは完 全な２−ミクロンプラスミドＤＮＡ　、　１ｅｕ２−ｄ遺伝子、ｐＢＲ３２２配 列及びシゾサツカロミセス・ボンベ（匙坦μμ目山顛視匹競匹二ヒ）匹旦遺伝子 を含んで成る。〕プラスミドｐｃＰＯＴをＢａｇ旧及び５ａｉｌにより切断して およそ１０ｋｂの線状ベクター断片を単離した。１．２　ｋｂＡＤＨ２プロモー ター断片をｐ２３７−ＷｔからＢａ＋＊ＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として単離し、そ して１．５ｋｂα−１−アンチトリプシンｃＤＮＡ−ＴＰＩＩプロモーター断片 （ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ）及び線状化されたｐｃＰＯＴと三部分連結によって連 結してｐＡＴ−１と称するプラスミドを得た。

プラスミドｐＡＴ−１はＡＤＨ２翻訳開始コドンと成熟形ＡＡＴの第一アミノ酸 コドンとの間に３個の余分のアミノ酸コドンを含有していた。これら３個のコド ンを部位特異的インビトロ変異誘発により除去した。プラスミドｐＡＴ−１を５ ｐｈＩ及びＢａｗｌ　１により切断して１９０ｂｐ　ＡＤＨ２プロモーター切断 を単離した。この断片を、Ｂａｇ旧及びｓｐｈ　Ｉにより線状化されたＭ１３ｓ ｐ１８に連結した。生ずる構成物を、変異原ブライマーとしてＺＣ４１１（５’ 　ＴＡＡＴＡＣＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＧＡ　ＴＣＣＣ−３’　）を用いそして第 ニブライマーとしてＺＣ８７を用いてインビトロ変異誘発にかけることによりＡ ＤＨ２翻訳開始シグナルを成熟α−１−アンチトリプシンの第１コドンに融合せ しめた。陽性クローンを、ＡＴＧから−１７０から融合点を通ってジデオキシ配 列決定法により確認した。操作を容易にするため、１７５ｂｐの５ｐｈＩ−Ｅｃ ｏＲＩ変異誘発プロモーター断片を、Ｓｐｈ　ｒ及びＥｃｏＲＩにより線状化さ れたｐＵｃ１９に連結した。」皿プロモーターの最も３′−側の１７０ｂｐ及び ベクターｐＵｃ１９中のＡＡＴの成熟形の第一アミノ酸コドンに融合したＡＤＨ ２翻訳開始コドンを含んで成る得られたプラスミドをｐ４１１と命名した。

成熟ＡＡＴの第一アミノ酸のコドンに融合した完全なＭＤＩ（２−４ｃプロモー ターを生じさせるため、プロモーター機能に影響を与えることがＲｕ５ｓｅｌｌ 　ら（前掲）により見出された変更を含有するＭＤＩ２−４Ｃプロモーターの最 も５′−側の配列をプラスミドル４１１中に存在するプロモーター断片に加えた 。プラスミドｐ４１１をｓｐｈ　Ｉ及びＥｃｏＲＩにより消化して１７５　ｐＨ プロモーター断片を単離した。プラスミドｐ２３７−４ｃをＥｃｏＲｌ及びｓｐ ｈ　Ｉにより切断して、ｐｔ＋ｃベクター配列及び「プロモーターアップ」表現 型を付与する最も５′側のプロモーター配列を含んで成る３、７１ｋｂ断片を単 離した。ｐ４１１からの１７５ｂｐプロモ一ター断片をｐ２３７−４ｃベクタ一 断片に連結した。成熟ＡＡＴ配列の第一アミノ酸コドンに融合した完全なＭＤＩ ２−４ｃプロモーターを含有する生じるプラスミドをｐ２３７−４’Ｍと命名し た。

プラスミドｐＡＴ−１からのＡＤＨ２プロモーターを、ρＡＴ−１中に存在する ＡＤ）１２翻訳開始領域及びｐＵｃ１８ポリリンカー配列を除去することにより 変形して「ユニバーサル」プロモーターを形成した。プラスミドｐＡＴ−１をＳ ｐｈ　ｒ及びＢａ１Ｉ旧により切断して１９０ｂｐの部分的ＡＤＨ２プロモータ ー断片を単離した。この断片を、ＢａｍＨＩ及び５ｐｈｌにより線状化したＭ１ ３ｍｐ１８に連結した。

生ずる構成物を、変異原プライマーとしてＺＣ４１０（５’　−ＣＧＴＡＡＴＡ ＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３’　）を用いそして第ニブライマーとしてＺＣ ８７を用いるインビトロ変異誘発にかけてＡＤＨ２翻訳開始シグナル及びｐＬｌ ｃ１８ポリリンカー配列を、Ｓｏ＋ａ１部位においてＭ１８ｍｐｌＢポリリンカ ーに融合した１個のＥｃｏＲ１部位により置換した。

陽性クローンをジデオキシ配列決定により融合点を通って確・認した。操作を容 易にするため、変異した部分的ＡＤＨ２プロモーター断片を１７５ｂｐ　５ｐｈ ｌ−ＥｃｏＲＩ断片として、Ｓｐｈ　Ｎ及びＥｅｏＲｉにより線状化されたｐＵ ｃ１９にサブクローニングした。ｐ４ＸＯＥｓと称する得られるプラスミドは耕 皿プロモーターの最も３′−側の１７５ｂｐを含有していた。次に、ｐ４１０Ｅ ｓプロモーター断−ターを修飾して前記３′配列を含有せしめた。２つのプロモ ーター断片を、ＢａｍＨ及びＥｃｏＲ１で切断したｐＵｃ１３に三部分連結によ り連結した。制限酵素分析により確認された得られたプラスミドは、翻訳開始コ ドンの代りにＥｃｏＲ１部位を置くことにより３′−末端において変異した完全 なＭＤＩ２−４’プロモーターを含有していた。このプラスミドをｐ４１０−４ ｃと命名した（第１３図）。

ｐ４１０−４ｃからのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ　ＭＤＩ２−４’プロモ一ター断 片及びＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ　Ｎ−ｐｒｏＣＴ断片を、Ｂａ＠ＨＩ及びＸｂａ　 Ｉにより消化したＭ１３ａ＋ｐ１８に連結した。この挿入部を含有するＭ１３ク ローンを配列決定し、そして全挿入部を含有するクローンから複製型（ＲＥ）　 ＤＮＡを調製した。ファージベクターをＢａ１ＩＩＨＩ及びＸｂａＩにより消化 し、そしてプロモーター−Ｎ−ｐｒｏＣＴ断片を単離した。次に、この断片をｐ ＫＰｌｏ　［ＥｃｏＲ１部位を欠＜　ｐＢＲ３２２ベクターに挿入されたｐｓＢ ｌ　（Ｍｕｒｒａｙら、米国特許Ｎα４．７６６、０７３）からのＴＰＩＩプロ モーターαファクター−ＶＳ−ＴＲＩＩターミネータ−発現ユニットを含んで成 るプラスミド〕からのＸｂａ　Ｉ−Ｂａｍ）ｌ　１皿ターミネータ−断片に連結 した。次に、正しい挿入部を含有するクローンをＢａｍＨにより消化し、そして 発現ユニントを単離した。

次に、最終発現ベクターを作製した。プラスミドｐｃＰＯＴをｓｐｈ　Ｉ及びＢ ａｍＨＩにより開裂せしめて７５０ｂｐの２ミクロン配列及びｐＢＲ３２２配列 を除去した。次に線状化したベクターをｐＢＲ３２２テトラサイクリン耐性遺伝 子由来の１８６ｂｐ　５ｐｈＩ−Ｂａｎ＋旧断片に連結した。次にｐｏｐｏｒと 称する得られるプラスミド（第１２図）をＢａｍＨＩにより消化し、そしてＢａ ｍＨＩ発現ユニット断片に連結し、そして得られるクローンの挿入領域を決定し た。弘遺伝子に隣接してＭＤＩ２−４ｃプロモーターを含有するプラスミドを選 択し、そしてｐＭ２７１−９と命名した。

発現ベクターｐＭ２７１−９を用いてＳ、セレビシェ−Ｚｌ’１ｌｌＢ株（ＭＡ Ｔａ　／　ＭＡＴα二倍体、次のものについてホモ接合性１ｅｕ２−３＋月ヱ肛 １丼月二四社と国旦匹Ｈ旦堕関二［ｃｉｒ’ｌ）、ＺＭ１３４株（ＭＡＴ　ａ　 　Ａ　　丼七遁囮１目（虱腓的１ｅｕ２　ｕｒａ３５ｉｒ３−８［ｃｉｒ”１、 及びχＢ１３−５Ｂ株（ＭＡＴｃｒｕｒａ３１ｅｕ２−３，１１２　ｂａｒｌ　 餅却旦二用県）を形質転換した。ＴＰＩ”コロニーを選択し、そしてグルコース 含有冨培地中で３０℃にて２日間培養せしめた。

粗細胞溶解物を調製しそして一８０°Ｃにて貯蔵した。細胞溶解物を解凍し、そ してきれいにし、そして実施例２に実質的に記載されているようにして、きれい にされた細胞溶解物からＮ−ｐｒｏＣＴを調製した。細胞溶解物中のＮ−ｐｒｏ ＣＴレベルをＮＣＡＰラジオイムノアッセイにより測定した。結果を第５表に示 す。

酵２−ミクロンプラスミドからのＲＥＰｌ、　ＲＥＰ２．　ＲＥＰ３及びｏｒｉ 配列、アンピシリン耐性マーカー、並びにシゾサツカロミセス・ボンベのトリオ ースホスフェートイソメラーゼ（ＰＯＴＴ）遺伝子を含有するベクターｐＭＰＯ Ｔ２にＮ−ｐｒｏＣＴ発現ユニットを挿入することにより第二セットの発現ベク ターを作製した。

ｐＭＰＯＴ２はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎにＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ形質転換体として寄託番号に６７７８Ｂと して寄託されている。

プラスミドｐ２７１−９をＢａａ＋旧で消化し、そしてＮ−ｐｒｏｃＴ発現ユニ ットを単離した。この断片をＢａｍ［で消化したｐＭＰＯＴ２に連結してベクタ ーｐＭ２７４−４及びｐＭ２７４−１５を作製した（第２０図）。

ブーｙ　スミｌ’ｐＭ２７４−４及びｐＭ２７４−１５をＳ、　セＬｙ　ヒシＩ 　−２Ｍ１１８株に形質転換した。形質転換体を３０℃にて、２８Ｉｒｇ／ｄの ロイシンを含有する酵母培地Ｉ　（２％酵母エキス、６％グルコース、０．５％ 硫酸アンモニウム）２Ｍ又は２００ｄ中で増殖せしめた。細胞を培地から遠心分 離により分離し、ＰＢＳに再懸濁し、そしてガラスピーズの存在下で渦動するこ とにより細胞溶解した。得られる粗細胞溶解物を凍結しそしてその後の測定のた めに貯蔵した。

組換えＮ−ｐｒｏＣＴ活性を、２２時間ニワトリ頭蓋冠細胞増殖アンセイにおい て、天然Ｎ−ｐｒｏＣＴ（１００ｎＭ　、ラット甲状ＩＩＪｊ髄癌からのもの） 及びインシュリン（１０Ｉ！ｇ／ｄ）を陽性対照として測定した。解凍した酵母 細胞溶解物を１６，８００ｘｇにて１５分間遠心分離した。次に、透明になった 細胞溶解物をＶｙｄａｃ広孔ビー床孔用いるＣ−１８シリカ逆相バツチクロマト グラフイーにより濃縮した。Ｖｙｄａｃビーズから３０％〜５０％アセトニトリ ル７０．１％トリフルオロ酢酸により溶出した両分を５ｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥 し、そしてＩＩＩＩｌのＢＧＪｂ培地中に再懸濁した。各サンプル中のＮ−ｐｒ ｏＣＴ濃度をＮＣＡＰ　ＲＩＡにより決定した。ペプチド調製物を細胞培養物に 適用した。１８時間後、３Ｈ−チミジンを各培養物に添加し、そしてさらに４時 間後、未処理（対照）培養物に対するＴＣＡ−沈澱料トリチウム量を各試験条件 について決定した。結果を第１５図に示す。サンプル（クローン及びＮ−ｐｒｏ ＣＴ濃度）は次の通りである：　Ａ、　ｐ２７４−４クローン１．１６ｎＭ　； 　Ｂ、　ｐ２７４−４クローン２．３ｎＭ　；　Ｃ，ｐＭＰＯＴ２対照；Ｄ。

ｐ２７４−１５クローン１．１３５ｎＭ　；　Ｅ、　ｐ２７４−１５．クローン ２、＞５ｎＭ。

Ｃ０温度制御バイブリドプロモーターを用いての発現部分的韮プロモーター断片 をプラスミドｐＴＰｔｃ１０（Ａｌｂｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、　Ｊ、Ｍｏ１ ．Ａ　　１．Ｇｅｎ旦、上：　４１０−４３４．１９８２）から得た。プラスミ ドｐＴＰＩｃ１０をユニークＫｐｎ　Ｉ部位で切断し、Ｂａ１３１エキソヌクレ アーゼによりせ旦コード領域を除去し、そしてＥｃｏＲＩ　リンカ−（配列：　 ＧＧＡＡＴＴＣＣ）をプロモーターの３′末端に加えた。ＢｇｌＩ［及びＥｃｏ ＲＩによる消化がＢｇｌ　Ｉｔ及びＥｃｏＲＩ付着末端を有するＴＰＩＩプロモ ーター末端を生じさせた。次に、この断片を、Ｂｇｌ　Ｉ［及びＥｃｏＲＩ　（ 部分消化）により切断したプラスミドＹＲｐ７’　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、 Ｎａｔｕｒｅ、　２８２：３９−４３．１９７９）に連結した。生ずるプラスミ ドＴＥ３２をＥｃｏＲＩ（部分消化）及びＢａｍＨＩで開裂してテトラサイクリ ン耐性遺伝子の部分を除去した。次に、線状化されたプラスミドをＥｃｏＲＩ− Ｂａｎ＋ＨＩ　リンカ−の付加によって再線状化し、てプラスミドＴＥＡ３２を 生成せしめた。プラスミドＴＥＡ３２をＢｇｌ　Ｉｆ及びＥｃｏＲＩにより消化 し、そして〜９００ｂｐ部分子ＰＩＩプロモーター断片をゲル精製した。プラス ミドｐＩｃ１９Ｈ（Ｍａｒｓｈら、Ｇｅｎｅ　３２　：　４８Ｌ４８６、１９８ ４）をＢｇｌ　Ｉｆ及びＥｃｏＲＩにより切断し、そしテヘクター断片をゲル精 製した。次に、ＴＰＩＩプロモーター断片を線状化されたｐＩｃ１９Ｈに連結し 、そしてこの混合物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換した。プラスミドＤＮＡを 調製し、そして〜９００ｂｐ　Ｂｇｌ　ｎ−ＥｃｏＲＩ断片の存在についてスク リーニングした。正しいプラスミドを選択し、そしてｐｌｃＴＰＩＦと命名した （第１７図）。

次に、完全なＴＰＩＩプロモーターを集成した。プラスミドｐＩＣ７（Ｍａｒｓ ｈら、前掲）をＥｃｏＲＩで切断し、断片の末端をＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｈ ｅｎｏｗ断片）により平滑化し、そして線状ＤＮＡヲＴ、ＤＮＡリガーゼを用い て再強化した。生ずるブラスミｐｌｃ７ＲＩ″″と命名した。プラスミドｐＩＣ ７ＲＩ’″を旧ｎｄｌ［Ｉ及びＮａｖＩで消化し、そして２５００ｂｐ断片をゲ ル精製した。部分せ旦プロモーター断片（約９００ｂｐ）を、ＮａｖＩ及び５ｐ ｈｌを用いてｐＩＣＴＰＩＦを取り出し、そしてゲル濾過した。ＴＰＩＩプロモ ーターの残りをプラスミドｐＦＡＴＰＯＴ（Ｋａｗａｓａｋｉ及びＢｅ１ｌ、Ｅ ｐ　１７１，１４２）から得た。ｐＦＡＴＰＯＴにより形質転換された。Ｓ、セ レビシェ−（ＺＹＭ−３と命名する）はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託番号Ｎ１１Ｌ２０６９９のもとに寄託され ている。ｐＦＡＴＰＯＴをｓｐｈ　！及びＨｉｎｄｌ［［により消化し、そして ＴＰＩｌプロモーターの部分を含む１７５０ｂｐ断片をゲル精製した。次に、ｐ ｌｃ７Ｒビ断片、ｐｌｃＴＰＩＦからの部分的ＴＰＩＩプロモーター断片、及び ｐＦＡＴＰＯＴからの断片を三重連結により連結してｐＭＶＲｌを作製した（第 １８図）。

次に、ＭＡＴα２オペレーター配列をＴＰＩＩプロモーターに挿入した。ｐＵｃ ９の２．７　ｋｂ　ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＭＶＲ１由来のせ 旦プロモーターの０．９　ｋｂ　Ｘｈｏｌ−Ｂａｍ［断片と連結することにより プラスミドｐｓＸＲ１０１を作製した。次に、プラスミドｐｓＸＲ１０１中のＴ ＰＩＩプロモーターの５ｐｈｌ部位をユニークＸｈｏ１部位に変えた。ｐｓＸＲ ｌｏｌ　ＤＮＡをｓｐｈ　Ｉで開裂せしめ、そして標準的方法に従って脱リン酸 化した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。

５ｐｈｌ−Ｘｈｏｌアダプター（ＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧ）を、２０ｐｍｏｌ のアダプター、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ４Ｃｊ２　（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　Ｍｇ Ｃｊ！　！＋　５ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、　０．１ｍＭスペルミジン、１＋ｓＭＡＴＰ 及び５ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを含有する反応混合物中で２０ｉｔ ！の体積中で３７℃にて３０分間キナーゼ処理した。キナーゼ処理された５ｐｈ ｌ−ＸｈｏＩアダプターを５ｐｈｌで切断されたｐｓＸＲｌｏｌ　と連結し、そ してこの連結混合物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換した。挿入されたアダプタ ーを有するプラスミドを制限分析により同定し、そしてｐｓＸＲ１０２と命名し た（第１８図）。ＭＡＴα２オペレーターを特定するオリゴヌクレオチド（５’ 　−ＴＣＧＡＧ　ＴＣＡ　ＴＧＴ　ＡＣＴＴＡＣＣＣＡ　ＡＴＴ　ＡＧＧ　ＡＡ Ａ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＴＧＧ−３’及び３’　−ＣＡＧＴ　ＡＣＡＴＧＡ　ＡＴ Ｇ　ＧＧＴ　ＴＡＡ　ＴＣＣＴＴＴ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　ＡＣＣＡＧＣＴ−５’　 ）を合成し、そして上記のようにしてキナーゼ処理した。プラスミドｐｓＸＲ１ ０２をＸｈｏＩにより切断し、そして標準的方法に従って脱リン酸化した。プラ スミドＤＮＡとオリゴヌクレオチドとのモル比がそれぞれ１：１．１：３及びｌ ：６である３種類の独立の連結を行い、得られる連結混合物を用いて大腸菌ＲＲ Ｉを形質転換した。挿入されたオリゴヌクレオチドを有するプラスミドをコロニ ーハイブリダイゼーション及び制限分析により同定した。これに続＜　ＤＮＡ配 列決定が示すところによれば、ｐｓＸＲ１０３はμけα２オペレーターの１個の コピーを含有し、ｐｓＸＲ１０４は２個のコピーを含有し、そしてｐｓＸＲ１０ ８は４個のコピーを含有していた（第１９図）。

次の断片において、プラスミドｐｓＸＲ１０２，ｐｓＸＲ１０３，ｐｓＸＲ１０ ４及びｐｓＸＲ１０８をＢａｎ＋ＨＩにより切断し、脱リン酸化し、そして大腸 菌圏４遺伝子を含有するプラスミドｐｌａｃ７からの３．２ｋｂＢａａ旧−Ｂａ ｍＨＩ断片と連結した。連結混合物を用いて大腸菌ＲＲＩを形質転換した。適切 なせ旦−厘融合を含有するプラスミドを制限分析により同定し、そして次の様に 命名した：ｐｓＸＲ１０９，ＭＡＴα２　オヘレーター無し；　ｐｓＸＲｌｌｏ 、　１個ノＭＡＴα２オペレーター、　ｐｓＸＲｌｌｌ、　２コピーのルσα２ オペレーター；及びｐｓＸＲ１１２，４コピーのＭＡＴｃｒ２オペレーター配列 （第２０図）。

次に、温度制御迂旦プロモーター、Ｎ−ｐｒｏＣＴ配列及びＴＰＩＩターミネー タ−から成る発現ユニットを作製した。プラスミドｐＭ２７１−９をＥｃｏＲＩ 及びＢａｍＨＩで消化してＡＤＨ２−４’を除去した。プラスミドｐｓＸＲ１１ １をＢｇｌ　ＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そして５ＸＲＩＩＩプロモ一タ ー断片を単離しそして線状化されたｐＭ２７１−９に連結した。生ずるプラスミ ドを、挿入方向に従ってｐＭ２７５−４及びｐＭ２７５−５と命名した（第１５ 図）。

プラスミドｐＭ２７５−４及びｐＭ２７５−５をサツカロミセス・セレビシェ− ＺＭ１３４株に形質転換した。形質転換体をＹＥＰＥ（１％酵母エキス、２％ペ プトン、２％グルコース、４０■／ｒアデニン）の２〇−培地中で３０°Ｃにて 一夜、約８Ｘ１０’細胞／ｄの細胞密度に増殖せしめた。温度を２３°Ｃ〜２５ °Ｃに低下せしめ、そして培養物をさらに２時間インキユヘートした。次に、細 胞をペレ・７ト化し、２０ｄの新鮮なＹＥＰＤに再懸濁し、そして２３゛Ｃ〜２ ５°Ｃにて２４時間増殖せしめた。次に前記のようにてて粗細胞溶解物を調製し 、そして−８０°Ｃにて凍結した。

Ｄ、野性型ＡＤＨ２プロモーターを用いての発現ｐ４１０Ｅｓからの部分的ＡＤ Ｈ２プロモーター断片を用いて野性型皿プロモーターを再生した。プラスミドｐ ４１０Ｅｓをｓｐｈ　Ｉ及びＥｃｏＲｒにより消化して１７５ｂｐ部分凹プロモ ーター断片を単離した。この断片を、ｐＢＲ３２２−２ＤＲ２−ＢＳａの由来の １　ｋｂ　ＢａｍＨＩ−５ｐｈｌ断片と共に、三部分連結により、ＢａｍＨＩ及 びＥｃｏＲＴを用いる消化により線状化されたｐＵｃ１３に連結した。ｐＢＲ３ ２２−ＡＤＲ２−ＢＳａ由来のｌｋｂ断片は野性型ＡＤＨ２プロモーター配列と 相同な配列を含有していた。前記の三部分連結から得られたプラスミドを制限分 析により確認しそしてｐ４１０−Ｗｔ　と命名した。

プラスミドｐＭ２７Ｌ９をＢａｍ）ＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐ４１ ０−ＷｔからのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ　ＡＤ）１２プロモ一ター断片をＡＤＨ ２−４Ｃプロモーターの代りに挿入した。生ずるプラスミドを挿入の方向に従っ て２Ｍ２７７−１５及びｐ門２７７−１６と命名した（第１４図）。

プラスミドル門２７７−１５及び２Ｍ２７７−１６を用いてＳ、セレビシェ−２ Ｍ１１８株を形質転換した。ＹＥＤＤ中２０−の培養物を３０°Ｃにて約４８時 間増殖せしめた。粗溶解物を調製しそして一８０゛Ｃにて凍結した。

細胞溶解物中のＮ−ｐｒｏＣＴレベルを、標準として合成ＮＣＡＰを用いてＮＣ ＡＰラジオイムノアッセイにより測定した。二連測定の結果を第５表に示す。

第５表 細胞質蛋白質に対する％ プラスミド　　菌　株　　　１　　　２　　　　平均ｐＭ２７７−１５　　　２ Ｍ１１８　　　０．４８　　　０．４１　　　０．４４ｐＭ２７７−１６　　　 ２Ｍ１１８　　　０　　　０．１８　　　０．０９Ｅ、ラットＮ−ｐｒｏｃＤの 分泌発現 ラットＮ−ｐｒｏＣＴのコード配列を実質上前記のようにして集成したが、ＺＣ １７９１及びＺＣ１７９２の代りにそれぞれオリゴヌクレオチドＺＣ２０４１（ ５’　−ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＣＣＣＴＴＡ　ＡＧＡ ＴＣＴ　ＡＣＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　Ｇ ＣＴ　ＡＣＣＴＴＧ　Ｔ−３’　）及びＺＣ２０４２（５’　−ＣＴＴ　ＣＡＧ 　ＡＣＡ　ＡＧＧ　ＴＡＧ　ＣＣＡ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＡＧＡＡＧ　ＡＴＴ　Ｃ ＣＡ　ＡＧＧ　ＴＡＧ　ＡＴＣＴＴＡ　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＣＴＣＴＣＴ　ＴＧＴ 　ＣＣＡ−３”）に旧ｎｄＩ［Ｉｒ付着末端」を含む。

発現ベクターの作製のため、この集成されたコード配列をｐＫＰｌｏからのＴＰ ＩＩターミネータ−断片（Ｘｂａｌ−ＢａｍＨ）に連結した。生ずる旧ｎｄ　ｍ −ＢａｍＨＩ断片をＡＤＨ２−４ｃプロモーター（ｐＭ２７１−９からのＢａｍ ＨＩ−ＥｃｏＲＩ）、α−ファクタープレープロ配列ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　ｍ 　）　、及びＢａｍＨＩで切断されたｐＤＰＯＴに結合した。生ずる発現ベクタ ーをｐＭ２９４−１　（Ｎ−ｐｒｏＣＴ発現ユニットが基マーカーに対して逆方 向）及びｐＭ２９４−４　（Ｎ−ｐｒｏＣＴ発現ユニットがＰＯＴＩと同じ方向 ）と命名した。

ベクターｐＭ２９４−１及びｐＭ２９４−４をＳ、セｔ、ビシＩ　−ＸＢ１３− ５Ｂ株に形質転換した。二連の２０ｍ１培養物を４８時間増殖せしめ、そして培 地サンプルを１：１０００で希釈し、そしてＮ−ｐｒｏＣＴ免疫反応性物質につ いて測定した。結果（全濃度培地に換算）を第６表に示す。

星旦表 プラスミド　　　　　　　　Ｎ　−ｐｒｏＣＴ　（ｚ　／　ｒｔｔｉ　）ヒ）　 Ｎ−ｐｒｏＣＴの配列を、該ペプチドを酵母にとって最適なコドンにより設計さ れたオリゴヌクレオチド（第７表）、５′−末端ＥｃｏＲ１部位及び３′−末端 Ｘｂａ　１部位から作製した。コードされた配列は開始メチオニン残基を含存し 、このメチオニン残基は生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより切除され て正しいペプチドが得られる。

！ビし表 ＣＴＧ　　ＡＡＧ　　ＡＣＧ　　ＡＡＧ　　ＣＴＡ　　ＧＡＴ　　ＴＧＴ　ＴＧ Ｔ　　ＴＧＧ　　ＣＴＧ　　ＣＡＣＴＡＧ　　ＴＴＣＺＣ１９５５ 細胞質発現のため、オリゴヌクレオチドＡ−Ｆを合成し、精製し、キナゼ処理し 、等比率で混合し、そしてアニールした。得られるオリゴヌクレオチド対（Ａ十 Ｆ、Ｂ＋Ｅ、Ｃ＋Ｄ）を連結し、そしてこの混合物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉ により消化した。コード配列を天然アクリルアミドスラブゲル上で電気泳動によ り単離し、そしてゲルから抽出した。

次に、発現ベクターを実質上実施例４に記載したようにして作製した。ＡＤＨ２ −４ｃプロモーターＣＢａｍ旧−ＥｃｏＲＩ断片）、野性型ＡＤＨ２プロモータ ー（Ｂａｎ＋ＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片）又は５ＸＲＩＩＩプロモーター（Ｂｇｌ　 Ｕ−ＥｃｏＲＩ断片）を、ｐＫＰｌｏからのＴＰＩＩターミネータ−と共にＮ− ｐｒｏＣＴ配列に連結した。次に、生ずる発現ユニットをｐＭＰＯＰ２又はｐＤ ＰＯＴに挿入し、そして挿入の方向を決定した。

発現のため、ヒ）　Ｎ−ｐｒｏＣＴ発現ベクターを適切な酵母宿主株に形質転換 した。ＡＤＨ２−４’プロモーター又は野性型ＡＤＨ２プロモーターを菌株ＺＭ １１８．　ＸＢ１３−５Ｂ及び２Ｍ１３４　ニ形質転換した。

５ＸＲＩＩＩプロモーターを含有するベクターを２Ｍ１３４に形質転換した。グ ルコース含有培地上での増殖により形質転換体を選択した。ペプチドの制御され た発現又は構成的発現のために適切な条件下で増殖せしめた。次に、細胞を溶解 し、そして測定のために無細胞溶解物を調製した。

ｐＤＰＯＴを基礎にしＰＯＴＩ遺伝子と同じ方向にＮ−ｐｒｏＣＴ発現ユニット と共にＡＤＨ２−４Ｃプロモーターを含有するプラスミドであるプラスミドｐＭ ２８６−７を２Ｍ１３４株に形質転換した。形質転換された細胞を実質的に前記 のようにして培養した。細胞を収得し、１Ｍ酢酸中で溶解し、そして遠心分離し た。生ずる透明な溶解物を、抗−ＮＣＡＰ抗血清を用いるラジオイムノアッセイ によりＮ−ｐｒｏＣＴ生産について測定した。透明になった細胞溶解物のサンプ ルを測定緩衝液（０，０２Ｍ　ＮａＰＯ４（ｐＨ７，４）。

０．０５％ＮａＮ、　０．０５％ＮＰ−４０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に希釈した 。二連のサンプル（１００１ｚｌ）を２００Ｉの測定緩衝液を含有するチューブ に加えた。測定緩衝液中に１＝７に希釈された（合計希釈１：３５００）抗体１ ００ＩＺｌを各チューブに加えた。次に、２０，０００ｃｐａ＋の１２ｓ１−ラ ベル化ヒトＰＪ−ｐｒｏＣＴを含有する測定緩衝液１００ｊ１１を各チューブに 加え、そしてチューブを室温にて４時間インキュベートした。スタフィロコッカ ス・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）細胞（Ｐａｎ ｓｏｒｂｉｎ；Ｓｉｇ＋＋＋ａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌＣｏ、　）　　を測定緩衝 液中に１：２００に希釈し、ｌＨＮの得られた懸濁液を各チューブに加え、そし てチューブを混合し、そして室温にて２０分間インキュベートした。チューブを ３００Ｏｒｐｍにて１５分間遠心分離し、上滑を注ぎ出し、そしてペレット中の 放射能を計数した。Ｎ−ｐｒｏＣＴレベルを、５００．２５０．１２５゜６２． ５．３１．２５．１５．６及び７．８　ｎｇ／ｌｌｌ１に希釈した合成ヒトＮ− ｐｒｏＣＴを用いて得た標準曲線と比較することにより決定した。

全可溶性蛋白質の約０．０２５％がＮ−ｐｒｏＣＴであることが見出された。

酵母によるヒトＮ−ｐｒｏＣＴの分泌のため、オリゴヌクレオチドＢ、Ｃ，Ｄ、 Ｅ、Ｇ及びＨを前記のようにしてアニールして対Ｇ＋Ｈ，Ｂ＋Ｅ及びＣ十りを生 じさせた。これらの対を連結し、混合物をＨｉｎｄＩ［［及びＸｂａｌにより消 化し、そして断片をゲル濾過した。

次に、分泌発現用ベクターを集成した。Ｎ−ｐｒｏＣＴ断片（Ｈｉｎｄｌ［Ｉ− Ｘｂａｌ）及びｐＫＰＯＩ（からのα−ファクターブレープロチューブ断片（Ｅ ｃｏＲＩ−Ｂｉｎｄｌｌ［）を連結しそして前記のようにＴＰＩＩプロモーター 及びターミネータ−を含有する発現ベクターに挿入してプラスミドｐＭ２８５− １３　（発現ユニットが皿と同じ方向）及び２Ｍ２８５−１５　（発現ユニット が逆方向）を作製した。

ｐ４１０−４ｃからのＡＤＦ１２−４’プロモーター及びｐＫＰｌｏからの■旦 ターミネーターを用いて第二セットの分泌発現ベクターを作製した。これらのベ クターを９Ｍ２８４−３（発現ユニットが皿と同じ方向）及び９Ｍ２８４−４（ 発現ユニットが逆の方法）と命名した。

プラスミドｐＭ２８４−３をＳ、セレビシェ−ＸＢ１３−５Ｂ株に形質転換した 。プラスミドｐＭ２８５−１３及び２Ｍ２８５−１５をＸＢ１３−５Ｂ株及び２ Ｍ１３４株に形質転換した。細胞を前記のようにして培養した。

培地を０．４５ミクロンフィルターを通して無菌濾過し、そして前記の抗−ＮＣ ＡＰ抗血清を用いるラジオイムノアッセイによりＮ−ｐｒｏＣＴについて測定し た。２セツトの実験の結果を第８表プラスミド　　宿主株　　輸出されたＮ−ｐ ｒｏＣＴ　（ｔｒｇ　／　ｄ−）９Ｍ２８４−３　　　　ＸＢ１３−５Ｂ　　　 ６．７１　　５．９７　　６．３４ｐＭ２８５−１３　　　　ＸＢ１３−５Ｂ　 　　５．１９　　３．６３　　４．４１ｐＭ２８５−１５　　　　ＸＢ１３−５ Ｂ　　　２．９６　　４．８０　　３．８８ｐＭ２８５−１５　　　２Ｍ１３４ 　　３．５１　　３．３３　　３．４２組換Ｎ−ｐｒｏＣＴを酵母培地から、該 培地に１％（容量）の酢酸及び３０％（容量）のア七ト二トリルを添加すること により精製した。混合物をＶｙｄａｃ　Ｃ−４逆相カラムに通し、そしてＨｚＯ 中３０％〜５０％アセトニトリルのグラジェントにより溶出した。溶出液を２１ ５ｎｍでの吸光についてモニターし、そしてＮ−ｐｒｏＣＴを含有するピーク画 分を集めた。

ＩＬ例６．　　Ｎ−ｒｏＣＴの化体　゛離乳したスイスウェブスターマウス（２ １日令；平均体重１６ｇ　：　ｎ　＝８）に１日２回１４日間、１０珂の合成ヒ トＮ−ｐｒｏＣＴ（０，０１Ｍ酢酸に溶解したもの）を皮下投与した。対照マウ ス（ｎ＝７）にビヒクルを注射した。処置されたマウスと対照マウスとの間に体 重の有意差は生じなかった。すなわち、Ｎ−ｐｒｏＣＴはマウスに対して毒性で なかった。マウスに実験の２日目及び１３３日目テトラサイクリンを注射して組 織形態について骨をラベルした。動物を１４４日目殺し、そして骨から軟組織を 除去しそして中性緩衝化ホルマリン中で固定した。脛骨腓骨連結部の脛骨切片（ ５０，ｍ）を各動物から調製し、次にイメージ分析プログラムによりテトラサイ クリンラベル化について定量した。平均骨肉膜テトラサイクリンラベル化面積は 対照に比べてＮ−ｐｒｏＣＴで処理された動物において有意に大（＋４６％、ｐ 　＜０．０２）であった（第２１図）。対照に対してＮ−ｐｒｏＣＴ処理マウス において二次海綿質における破骨細胞の数／ｌｌ１１［１面積の有意な減少（− ３４，４％、ｐ　＜０．００１）が存在した。従って、これらのデーターは、Ｎ −ｐｒｏＣＴが生体内に骨形成に影響を与える証拠を提供し、そしてこのＣ−細 胞産物が骨成長の重要な調節因子であることを示唆する。

ＩＬＬ１２　　Ｊｊｂ　　　　上のＮ−ｒｏＣＴ　　”　　の！骨芽細胞用細胞 に対するＮ−ｐｒｏＣＴの作用の機作を解明するため、放射性ヨウ素化ヒトＮ− ｐｒｏＣＴを、ヒト骨内膜由来の培合成ヒトＮ−ｐｒｏＣＴ（逆相ＨＰＬＣによ り精製したもの）をクロラミンＴ法により放射性ヨウ素化し、そしてΩｕｓｏ　 Ｇ−３２シリカ／Ｄｏｕｅｘ　ＡＧＩ−×８　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリホルニア）からの溶出により精製した 。これらの研究において、このラベルされたヒトＮ−ｐｒｏＣＴ　（６０，ＯＯ Ｏｃｐｍ／ｎｇ）をトレーサーとして使用した。ヒ）　［１−２０Ｓ細胞を２０ ，０００細胞／ウエルで４８−ウェルマイクロタイタープレートにプレートした 。実験の開始の６時間前、及びすべての結合研究中、細胞を無血清ＢＧＪｂ組織 培養培地に維持した。約０．５％の添加されたトレーサーがこれらの細胞に特異 的に結合する。（高濃度〔５〜８オ〕の非ラベル化Ｎ−ｐｒｏＣＴの存在下での インキュベーション後に残留する放射能の量より少ない、合成Ｎ−ｐｒｏＣＴの 非存在下での結合として定義される。）５戸ヒトカルシトニン及びインシュリン は細胞への’　２５１−Ｎ−ｐｒｏＣＴについて競争しなかった。未うベルヒ） 　Ｎ−ｐｒｏＣＴとの競争的結合は１０ｎＭの見かけＫｄ（最大結合の半分）を 有し、そして合成ヒトＮＴＰ−Ｔｙｒとの競争は２００ｎＭのＫｄを有する。こ れらの推定される解離定数は、Ｕ−２Ｏ５細胞増殖の最大の半分の刺激を惹起す るのに必要な各ペプチドの濃度とよ（一致する。平衡条件及び結合実験の終りで の約２０　、０００細胞／ウエルを仮定して、細胞当り少なくとも３０００個の 結合部位が存在する。これらの結果は、Ｎ−ｐｒｏＣＴが直接作用を介して骨芽 細胞上での結合の形成を促進するＣ−細胞ペプチドホルモンであるという更なる 証明を提供する。

前記の発明は理解を明瞭にするために説明及び実施例により幾分詳細に記載され たが、添付される請求の範囲内である種の変化及び変更を行うことができること は自明であろう。

−二 こ二 臣− αつ こク ロ→ Δ や ト ロ× 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、７ ０× 入 口× 浄書（内容に変更なし） −二 ロー ＦＩＧ。■４ ＦＩＧ。１８ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ビヒクル（７マウス）　平均　　　　　平均　　　Ｎ−ｐｒｏｃＴ　（８マウス ）ビヒクル　　　Ｎ−ρ「口ＣＴ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１８５６ 平成１年特許願第５０６２６９号 ２、発明の名称 プロカルシトニンペプチド ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ザイモジェネティクス。

インコーホレイティド　（外１名） ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）委任状 （４）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）（３）別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （４）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　　　　　　　　 　　１　通（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　１　通（３）委任状及び その翻訳文　　　　　各　２　通（４）図面の翻訳文　　　　　　　　　　　１ 　通国＠調査報告 ｍ−Ｎｎ＠Ｍｌ＾ｅｅｎ＋ｍＩｎ−１１・ＰＣＴ、Ｉ：Ｓ：ｇ９７Ｑ：３５６

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．次の性質： 少なくとも１２個のアミノ酸の長さである；ラットＮ−ｐｒｏＣＴと少なくとも 部分的に相同である；及び骨芽細胞及び前骨芽細胞に対して最大の刺激を与える 濃度において繊維芽細胞に比べて少なくとも２の係数をもって骨芽細胞及び前骨 芽細胞においてＤＮＡ合成を増加せしめる；を有する、単離されたペプチド。
2. ２．前記ペプチドが約５２〜５７個のアミノ酸から成る、請求項１に記載の単離 されたペプチド。
3. ３．前記アミノ酸配列が、（ａ）ＶＰＬＲＳＴＬＥＳＳＰＧ；（ｂ）ＡＰＦＲＳ ＡＬＥＳＳＰＡ；（ｃ）ＡＰＶＲＰＧＬＥＳＩＴＤ；及び（ｄ）ＡＰＡＲＴＧＬ ＥＳＭＴＤから成る群から選択されたアミノ末端配列を含んで成る、請求項１に 記載の単離されたペプチド。
4. ４．前記ペプチドが、第１表に示す、ラット、ヒト、ニワトリ及びサケのＮ−ｐ ｒｏＣＴ並びにラット、ヒト及びニワトリのＮ−ｐｒｏＣＧＲＰ配列から成る群 から選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
5. ５．前記ペプチドが３２アミノ酸の長さより短い、請求項１に記載の単離された ペプチド。
6. ６．（ａ）ＶＰＬＲＳＴＬＥＳＳＰＧ；（ｂ）ＡＰＦＲＳＡＬＥＳＳＰＡ；（ｃ ）ＡＰＶＲＰＧＬＥＳＩＴＤ；及び（ｄ）ＡＰＡＲＴＧＬＥＳＭＴＤから成る群 から選択された配列から成る単離されたペプチド。
7. ７．骨芽細胞及び前骨芽細胞における細胞分裂を刺激するペプチドの単離方法で あって、 カルシトニン又はカルシトニン−関連遺伝子を発現することができる細胞の水性 抽出物を調製し；前記水性抽出物を分画して約１５，０００未満の分子量を有す るペプチドについて濃縮し；そして 前記濃縮された画分を疎水性クロマトグラフィー及び／又は陰イオン交換クロマ トグラフィーにより分画して該濃縮された画分からペプチドを単離する； ことを含んで成る方法。
8. ８．前記分画の段階が前記水性抽出物の逆相ＨＰＬＣ及びゲル濾過の段階を含ん で成る、請求項７に記載の方法。
9. ９．次の性質； ３６〜１８０塩基対である；及び 請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドをコードしている； を有する、単離されたＤＮＡ配列。
10. １０．請求項１〜２のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ配列に使用 可能に連結された転写プロモーターを含んで成る発現ベクターによりトランスフ ェクトされ又はトランスフォームされた宿主細胞。
11. １１．前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
12. １２．骨芽細胞及び前骨芽細胞における細胞分裂を刺激するペプチドの製造方法 であって、 請求項１０又は１２に記載の宿主細胞を培養し；そして該宿主細胞から該ペプチ ドを単離する；ことを含んで成る方法。
13. １３．請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドを生理的に許容されるキャリヤ ー又は希釈剤と組合わせて含んで成る療法組成物。
14. １４．骨芽細胞及び前骨芽細胞におけるＤＮＡ合成を更に増加せしめるのに十分 な量において成長因子をさらに含んで成り、該成長因子がインシュリン、インシ ュリン様成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子α、形質転換成長因 子β及び表皮成長因子から成る群から選択されたものである、請求項１３に記載 の療法組成物。
15. １５．骨芽細胞及び前骨芽細胞におけるＤＮＡ合成をさらに増加せしめるのに十 分な量でインシュリン様成長因子Ｉをさらに含んで成る、請求項１３に記載の療 法組成物。