JPH03504384A - エイズウイルスに対する合成ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エイズウィルスに対する合成ワクチン 本発明は、ヒト免疫不全性ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に対するワクチンの一般的な発 展に関するものである。更に特別には、本発明はＨＩＶ膜蛋白質を特定的に認識 するヘルパー１９２８球を刺激し、それにより抗体産生を高めるペプチド抗原並 びにエイズウィルスによる発病及びエイズウィルスにより引き起こされる感染症 を抑制する細胞毒性Ｔ細胞を提供することに関するものである。

発明の背景 ヒト免疫不全性ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に対するワクチンの発展は、広まった免疫 不全性症候群（Ａ　Ｉ　ＤＳ）の更なる拡散を妨げる決定的な方法である。安全 性の理由のために、全てのウィルスワクチンをＨＩＶの場合について適用するこ とはできない。しかしながら、如何なるサブユニットワクチンも、原抗原への暴 露に応答してヘルパーＴ細胞免疫性を引き出すことができる免疫優性ヘルパーＴ 細胞サイトを含むべきである。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞増殖及び抗体産生細胞 に対する差別化を起こすことによるＢ細胞の活性化のための、並びに細胞毒性Ｔ 細胞の誘導の両方のために必要である。ヘルパーＴ細胞は、入口の蛋白質抗原よ りもむしろ蛋白質分子内の固有サイトを認識するということを記載すべきである 。前記サイトのうち、２．３のものは通常応答の塊を引き出し、それ故、“免疫 優性”と呼ばれる。これより、有効な細胞毒性又は免疫性応答を引き出すために 、合成抗原は好ましくは分子内に免疫優性領域を含むべきである。更に、合成抗 原ペプチドは、合成フラグメントワクチンにおいてしばしば遭遇するＭＨＣ制限 の問題を克服すべきである。

発明の要約 したがって本発明の目的は、全ての又は大部分のＭＨＣ型のＴ細胞により認識さ れ、且つ少な（とも一部は、ＨＩＶ感染に対して高度のヘルパーＴ細胞応答性を 引き出す免疫優性サイトからなる合成ペプチド抗原を提供することである。

本発明の更なる目的は、実質的に多数組織適合性制限に起因する制約のないＨＩ Ｖ感染に対する合成又は組み換え型フラグメントワクチンを提供することである 。

本発明の別の目的は、ＡＩＤＳウィルスに対するＴ細胞免疫性の特定性及び／又 は水準を決定するための試薬を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、本発明に関する下記の詳細な記載から明らかにな るであろう。

図面の簡単な説明 本発明の前記及び他の目的、特長及び多くの注目すべき利点は、添付図面を参照 して考えた場合に下記の詳細な記載を読むことによりより良く理解されるであろ う。

図１は、ＨＩＶ膜蛋白質のアミノ酸残基を示す。４４種の重、複した合成ペプチ ドのアミノ酸連鎖部が表わされ特表千３−５０４３８４　（２） ている。ＨＦ２（Ｒ）において、アルギニンはカルボキシ末端リシンにより置換 されている。ペプチドＨＰ１７及び３３は、ＨＩＶ連鎖において存在しない外部 カルボキシ末端システィン残部を有する。

図２は、Ｔｉ（ＨＦ２）クラスターの重複したペプチドのアミノ酸残部を示す。

略記したアミノ酸符号が使用されている：Ａ＝Ａ１ａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ 、Ｅ＝Ｇ１ｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇ１ｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝１１　ｅ、に＝Ｌｅ ｕ、Ｍ＝Ｍｅ　ｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、ｐ＝ｐｒｏ＋　Ｑ＝Ｇ１ｎ、Ｒ＝Ａｒｇ＋　　 ５＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａ　１．Ｗ＝Ｔｒｐ、Ｙ＝Ｔｙｒ。

°図３は、免疫優性領域ＨＰ５２−５７における重複したペプチドのアミノ酸残 部を示す。

図４は、Ｂ　１０．　ＢＲ（Ｈ−２ｋ）マウスにおけるＨＦ２２−５７について の投与量応答曲線を示す。Ｂ１０゜ＢＲマウスは、ｇｐ１６０を用いて免疫化さ れ、そして３重のリンパ球結節増殖分析は本文記載の通りに行われた。ペプチド ＨＰ５２−５７に対する応答は、投与量応答検査により評価された。刺激指数は 、抗原のない背景計数を越える実験計数比を示す。

図５は、ＢＩＯ，Ｄ２　（Ｈ−２’）マウスにおけるＨＦ５２−５７についての 投与量応答曲線を示す。Ｂ１０゜Ｄ２マウスは、ｇｐ１６０を用いて免疫化され 、そして３重のリンパ球結節増殖分析は本文記載の通りに行われた。ペプチドＨ Ｐ５２−５７に対する応答は、投与量応答検査により評価された。刺激指数は、 抗原のない背景計数を越える実験計数比を示す。

図６は、Ｂｌ　Ｏ，Ｓ　（９Ｒ）（Ｈ−２１４）マウスにおけるＨＦ５２−５７ についての投与量応答曲線を示す。

Ｂｌ　Ｏ，Ｓ　（９Ｒ）マウスは、ｇｌ）１６０を用いて免疫化され、そして３ 重のリンパ球結節増殖分析は本文記載の通りに行われた。ペプチドＨＰ５２−５ ７に対する応答は、投与量応答検査により評価された。刺激指数は、抗原のない 背景計数を越える実験計数比を示す。

図７は、Ｂｌ　Ｏ，Ａ　（５Ｒ）（Ｈ−２”）マウスにおけるＨＦ５２−５７に ついての投与量応答曲線を示す。

Ｂ　１０．　Ａ　（５Ｒ）マウスは、ｇｐ１６０を用いて免疫化され、そして３ 重のリンパ球結節増殖分析は本文記載の通りに行われた。ペプチドＨＰ５２−５ ７に対する応答は、投与量応答検査により評価された。刺激指数は、抗原のない 背景計数を越える実験計数比を示す。

図８は、指示された範囲内に横たわる幾何学的手段による応答を用いて多数のペ プチドを示す棒グラフを表わす。前記範囲の下限は、Ｘ軸上に示されている（例 えば、“１．５″は１．５ないし２．０の範囲を示す）。

図９Ａ及び９Ｂは、リーサス猿を１）群１：完全フロイント助剤（ＣＦＡ）を用 いた乳剤中の３種のペプチドＨＰ５．ＨＰ２６及びＨＦ５３の各々の３９ナノモ ル；２）群２：ＣＦＡを用いて、Ｏ及び３９日目に処理した結果を示す。この猿 は、不完全フロイント助剤（ＩＦＡ）中で０．２ナノモルのｇｐｔｓｏを用いて ４７日目に免疫化された。抗−ｇｌ）４１抗体は、０．２７．５２，５５．５９ ，８２．６８及び８０日目に測定された。結果を“正味ｃｐｍｓ’　として表わ す：ウェスターンブロッ）　（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）のｇｐ４１バンド上 の抗体に結合した１２５−Ｉ＝蛋蛋白質線、背景から引（（予め採血した血清： ６４２±１８７ｃｐｍ）。

発明の詳細な説明 本発明の上記の及び種々の他の目的及び利点は、多数の異なったＭＨＣ型にわた る制限なしに、ＨＩＶ膜蛋白質を示す細胞を認識することが可能なＴ細胞の増殖 を刺激するペプチド抗原により達成される。

特記しない限りは、本文中で使用される全ての技術的及び科学的表現は、本発明 が属する技術分野において当業者により通常理解されるものと同一の意味を有す る。

本文中に記載した方法及び材料と同−又は等価な何れの方法及び材料も本発明の 実施例又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を下記 する。

下記本文中の全ての文献は、参考のために本文中に加えられている。特記しない 限りは、本文中で用いられた技術は前記技術分野において当業者に公知の標準的 な方法論である。

本文中で使用される表現“多数のＭＨＣ類又は型”は、少なくとも３種又はそれ より多くのＭＨＣ類又は型を意味する。

本文中で使用される表現“実質的に純粋”は、標準的な精製技術により得ること ができる可能なかぎり純粋であることを意味する。

本文中で使用される表現“合成”ペプチドは、何らかの適する手段例えば遺伝子 組み換え技術等により化学的に合成されたことを意味する。

材料及び方法 マウス Ｂ　１０．ＢＲ／５ｇＳｎ　（Ｈ−２ｋ）及びＢ１０．Ｄ２／ｎＳｎ　（Ｈ−２ ’）マウスは、ジャクソン実験室（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）　　（バー　ハーバ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ）　＋ＭＢ）から得た。Ｂ　１　 ｏ、　　Ｓ　（９Ｒ）　／Ｓｇ　（Ｈ−２１４）及びＢ　１０．　Ａ　（５Ｒ） 　／５ｇＳｎ　（Ｈ−２”）　マウスは、ディ、ジェイ、スティムブフリング（ Ｄ、Ｊ、Ｓｔｉｍｐｆｌｉｎｇ）〔グレート　フォールスＣＧｒｅａｔ　Ｆａｌ ｌｓ）　、　ＭＴ）から、及びジャクソン実験室から得た繁殖ペアからＮＩＨ繁 殖コロニーで繁殖させた。ＢＩＯ，Ｓ　（９Ｒ）及びＢＩＯ。

Ａ（５Ｒ）株からのマウスは、Ｈ−２”及びＨ−２にハブロタイブの１−八及び Ｉ−Ｅ分子の両方が前記組み換え株中に発現し、反対にＩ−Ｅは非組み換えＨ− ２１及びＨ−２６マウス中で発現しないので選んだ。

抗原 組み換えｇｐ１６０は、ラッチ、　（Ｒｕｓｃｈｅ）他、１９８７、ＰＮＡＳ、 アメリカ合衆国、８４：６９２４に記載された様なＨＩＶのＨＴＬＶＩ　１１Ｂ 単離体のｇｐ１６０に対して遺伝子を発現する組み換えバクロウィルスにより感 染させた細胞から調製した。それは、標準的なレンズ豆レクチンクロマトグラフ ィ及びゲル濾過技術により特に精製した。合成ペプチドは、多重ペプチド合成又 はホウテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）他、１９８６．生物技術（Ｂｉ。

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、　　４　：　５２２に記載された様な“ティーバッ グ（Ｔｅａ　Ｂａｇ）法”により作られた。ペプチドは、“低−高２弗化水素法 によりそれらの樹脂から分解された。

分解ペプチドは、セップーバック（Ｓｅ＋）−１１ａｋ）　　（ヲータース（Ｗ ａｔｅｒｓ）　＋　　ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）　、　ＭＡ）により脱塩 され、次いで純度及び濃度が分析的ＨＰＬＣにより決定された。ペプチドが充分 に純粋ではない場合は、それらは標準的な製造的ＨＰＬＣを用いて再精製された 。

リンパ結節子細胞精製分析 マウスは、尾を基準として完全フロイント助剤（ＣＦＡ）に対して１：１で組み 換えｇｐｉａｏを１１０−３０ｕ用いて皮下的に免疫化された。（この投与量は 、ｇｐ１８０調製の純度の基づいて決定された。）８ないし１０日後、大動脈周 囲の及び鼠径部のリンパ結節は、バーゴラ−（Ｂｅｒｋｏｗｅｒ）他、　　１９ ８４．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、’、　　１３２：１３７０の方法に従って完全Ｔ 細胞媒体中の単細胞懸濁液中で除去及び調製した。大当たり４Ｘ１０’細胞のリ ンパ結節細胞は、平底の９６−穴ミクロ滴定プレート〔コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ ）　、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）　＋ＭＡ）の各穴に加えられた。４ ４種のペプチドは、溶媒により最終容積０．２ｍｌとするように前記穴に加えら れた。培養４０日１に、〔１Ｈ〕チミジン１ｕＣｉ　（６，７Ｃｉ／ｍｍｏｌ； ニュー　イングランド　ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ ａｒ）　ｒ　ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）　、　ＭＡ）が各穴に加えられた。１８ 時間後、増殖の尺度として、ＤＮＡに対する〔３Ｈ〕チミジン配合比は、液体シ ンチレーション計数を使用して決定された。刺激指数は、抗原なしの背景計数に 対する実験計数の比を表わす。

実施例 Ｈ−２’、Ｈ−２嵯、Ｈ２”、及びＨ−２１４ハブロタイブのマウスは、マウス 当たり２２０−３０ｕの投与量でＣＦＡ中の組み換えｇＩ）１６０を用いて尾に 対して皮下的に免疫化された。８ないし１０日後、このマウスは犠牲にされ、大 動脈周囲の及び胤径部のリンパ結節が単離され、次いで抗原の存在下又は不存在 下でのリンパ結節細胞の増殖は、上記本文中に記載された様に決定された。

試験された４種のハブロタイブのマウスのＴ細胞増殖分析の結果を表工に要約す る。強い増殖応答が、予め同定された膜Ｔ、サイト（ＨＰ−５）（図２）を取り 囲んで構成されたペプチドＨＰ−４ないし８に対して、Ｈ−２にマウスで見られ た。最高の応答は、ペプチドＨＰ−５（残部１１２−１２４．ＨＥＤ　Ｉ　Ｉ　 ５ＬＷＤＱＳＬＫ）及びＨＰ−６（残部１１２−１２４．ＨＥＤＩＩＳＬＷＤＱ ＳＬＲ）（これは、リシンに対するアルギニンの置換のみが異なる）を用いて見 られた。漸減する応答は、ペプチドＨＰ−４（残部１１０−１２４．ＱＭＨＥＤ ＩＩＳＬＷＤＱＳＬＫ）　、ＨＰ−７０５８１１４−１２８゜Ｄ　Ｉ　Ｉ　５Ｌ ＷＤＱＳＬＫＰＣＶＫ）　、及びＨＰ−８（ｆｉ部１１９−１８４．ＷＤＱＳＬ ＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶ）について見られた。正の増殖応答は、ペプチドＨＰ− ２６（残部４２８−４４３．ＫＱ　Ｉ　ＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ）（これは 、ヘルパーＴ細胞外膜、膜Ｔと同一である）について観察された。この応答は、 １ｕＭの投与量において見られた。２ｕＭの投与量においては、増殖指数は２よ り大きかったが、しかし統計的に満足できるものではなかった。ペプチドＨＰ− ２９（残部４３７−４５１、ＶＧＫＡＭＹＡＰＰ　Ｉ　ＳＧＱ　ＩＲ）（、：れ は、６種のアミノ酸がペプチドＨＰ−２８と重複する）も正の応答を引き出した 。試験された４種のハブロタイブのマウスにおいて、正の増殖応答はｇ９４１分 子のＣ０ＯＨ基末端でペプチドＨＰ−５２ないし５７（図８）に重複する群中の ペプチドの１種又はそれより多くで認められた。Ｈ−２’マウスにおける前記ペ プチドに対する投与応答曲線（図４）は、ペプチドＨＰ−５２（残部８２８−８ ４２．ＡＶＡＥＧＴＤＲＶ　Ｉ　ＥＶＶＱＧ）及びＨＰ−５３（残部８３４−８ ４８．ＤＲＶＩＥＶＶＱＧＡＹＲＡ　ＩＲ）に対する好ましい応答を示す。

Ｈ−２す＼プロタイプのマウスにおける４４種のペプチドに対するＴ細胞増殖応 答を、表工の第２欄に示す。

膜Ｔ、領領域おけるペプチドＨＰ−３（残部１０９−１２３．ＥＱＭＨＥＤ　Ｉ 　Ｉ　５ＬＷＤＱＳＬ）に対する満足できる増殖応答が観察された。ペプチドＨ Ｐ−３はＨＰ−５（膜Ｔ、）に重複しているが、しかしその分子のアミノ末端方 向において３種のアミノ酸の分だけ長く、且つその分子のカルボキシ末端方向に おいて１種のアミノ酸の分だけ短い。正の応答は、ＨＰ−２６に対して認められ 且つ重複しているＨＰ−２９に対して認められた。

初期のスクリーニングにおいて、正の応答はＨＰ−５２ないし５７群のＨＰ−５ ５（残部８４１−８５５．ＱＧＡＹＲＡ　ＩＲＨＩ　ＰＲＲＩ　Ｒ）のみに対し て認められた。

投与量応答検査を用いたより詳細な研究により、正の且つ好ましい応答がＨＰ− ５５及びＨＰ−５６（残部８４６−８６０．ＡＩＲＨ−ＩＰＲＲＩＲＱＧＬＥＲ ）に対して認められた（図５）。Ｈ−２”ハブロタイブのマウス（Ａ”Ｅβ”Ｅ ｃＩｃｋ）　　（表工）は、膜Ｔ、領領域おいてペプチドＨＰ−３ないし８に対 して応答しなかった。この株のマウスは、Ｍｒ＋サイトペプチドＨＰ−２６、並 びに重複しているペプチドＨＰ−２８（残部４３２−４４６、ＮＭＷＱＥＶＧＫ ＡＭＹＡＰＰＩ）及びＨＰ−２９に対して応答した。初期のスクリーニングにお いて、正の応答は１μＭの投与量でペプチドＨＰ−５５及びＨＰ−５６に対して 見られた。投与量応答検査により、ＨＰ−５５及びＨＰ−５６に対する好ましい 応答（図６）を伴う前記見解が確証された。

表Ｉ 合成ペプチドに対するＨＩＶ膜−免疫性態Ｔ細胞の応答Ｓ−ニー（Ｐ’）　　　 Ｓ−１−（Ｐ’）　　　Ｓ−工Ｊ（Ｐ’）　　　Ｓ−ニーＣＰ’１）ＩＰ−１２ −３（，０５）　　　　−６，７２，２３（，０５）ＨＰ−２１，１８，８，７ ５１−７８ ＰＥＰ−３’　　２．１１１　　　　２．６５（−０２５）　　Ｌ６’７　　　 　２．４（，０００５）Ｉ４Ｌ５２　（，０１）　　　、９３　　　　　．９９ 　　　　１．５３　（−０２５））ＩＰ−５１１，２（，００５）　　１．５６ 　　　　　．８２　　　　１．６４ＨＰ−６１２，６（，００２５）　　１−０ ２　　　　１２６　　　　１．７Ｂ　（，０１２５）ＨＰ−７９，５９（，００ ５）　　　１−２６　　　　　　　　　１．５７　　　　　　　　１．５８々− ８Ｌ２４　（−０５）　　１．６８　　　　　Ｌ２３　　　　１．５ＬＨＰ−９ Ｌｉ２　　（，０００５）　　　１．７５　　（，０５）　　　　　　１．５６ 　　　　　　　　　　　２−６３）ＩＰ−１０３，５５（，０２５）　　Ｌ７８ 　　　　１．８Ｌ　　　　　Ｌ２Ｂ÷ｌｌ　　　Ｌ８　（，０５）　　　１−０ ７　　　　　１．６０　（，０５）　　　１．３６疫→２　　２−Ｏ８Ｌ５５　 　　　１．０５　　　　１．１９シ１４　　３＋２４　（＋０１）　　１５９　 　　　１１６　　　　１．２０ＨＰ−１５１，８９（，０２５）　　１．４９　 　　　２−７７　（，０５）　　　ＬＪｌｕ　（，０１２５）？−１７２，２８ （，０２５）　　　　１＋７５　　　　　　　　　　　２．０５　　　　　　　 　　　　３．３７Ｈｐ−１８Ｌ９Ｂ　（，０５）　　：Ｌ、２４　　　　　　Ｌ ９４　（，０５）　　　１．９４ＨＰ−１９３，３７（，０５）　　　　　３． ２２　　　　　　　　　　１−０５　　　　　　　　　　１．２０ＨＰ−２２２ ＝２５　（，０５）　　１．９９　（−□１）　　　１．４５　　　　１．５６ ＨＰ−２８２−ＯＸ　　　　　　　　　Ｌ、ｌＯ７，４３（，００５）　　　　 １．２３ＨＰ−２９２，１７（−０２５）　　　　２．６５　　（，０５）　　 　　　　７．０５　　（−（ｎ）　　　　　　３．３０　　（，０５j １４Ｐ−３０２，１９（，０２５）　　　　２．２５　　　　　　　　　　５． ４５　　（，０）−）　　　　　　　ＪフＢＰ−３３２，４１（，０１２５）　 　２．８６　（，０５）　　　２．６　（，０２５）　　　３．６１　（，００ ５）ＨＰ−３５４，５８（，０５）　　Ｌ２２　　　　５＋（ｕ　（，０１）　 　　１．０ＨＤ−３６ＬＪ２　（，０２５）　　１．０２　　　　　３．Ｂ３　 （，０Ｌ２５）　　２ｊ８　（，０５）ＨＰ−３７４，６４（，００５）　　　 　２．１１　　　　　　　　　　　２−３５　　　　　　　　　　　２−１７　 　（，０：Ｌ）酪３９　　　Ｌ９３　（，０５）　　　、９４　　　　３＋１８ 　（，０３５）　　Ｌ６６ＨＰ−４０Ｌ５３　（，０Ｌ２５）　　　１．２３　 　　　　　１．９２　　　　　　　　　Ｌ３２）！Ｐ−４１２，３４（，０２５ ）　　　　、６７　　　　　　ＬｌＢ　　　　　　　　１．５２　（，０５）Ｋ ｐ−４２１，７６（，０５）　　　　１．８１　　　　　　　１６９　　　　　 　　　１．５８ＨＰ−４３１，２４１−３２１，９３、２，０５Ｈｐ−４５２＋ ３７　（０＋０５）　　　　　２．１０　　　　　　　　　２−ＯＢ　　（，０ ５）　　　　　　ニー１８１１Ｐ−４７８，５８（，００２５）　　　２．６　 （，０５）　　　　５．２６　（，０１）　　　　　１．３６ＨＰ−５０３，０ ４（−ＯＸ）　　　　　２．０５　（，０５）　　　　２＋１６　　（，０５） 　　　　　　１７３ｐ値を用いた刺激指数（Ｓ、１．）　　（実施例ｃｐｍ／対 照ｃｐｍ） マウスの４種の株における各ペプチドに対する（対照と比較した研究者のｔ試験 実施例）が示されている。ペプチドは、特記しない限り２μＭの濃度で試験され た。ｐ値が統計的に満足される２よりも大きな刺激指数は、肉太活字型で示す。

１ペプチド濃度１．３μＭ 勤ペプチド濃度１μＭ ・ペプチド濃度０．３μＭ ’ｇｐｘｓｏ濃度０．１μＭ ”ｇｐｉａｏｇ度０．０２μＭ ’ＰＰＤａ１度２５ｕｇ／ｍ１ 表■ ３種の範哨のペプチドにより強く刺激された多数の株各株内で最も強い応答を有 する１０種のペプチドが同定された。前記ペプチドは、木表の目的のために、そ の株を強く刺激すると言われる（２５％最大刺激ペプチド）。

試験された４１種のペプチドの各々に対して、我々はそのペプチドが株のない場 合（０）或いは１，２，３．又は４種全ての株に対して２５％最大刺激ペプチド の中にあるかどうかを決定した。各範晴の多数のペプチドが与えられた多数の株 を強く刺激することが示されている。

Ｈ−２”（Ａ’Ｅβ’Ｅズｋ）ハブロタイブのマウスは、Ｈ−２’ハブロタイブ のマウスがするようにＨＰ−５よりもむしろ膜ＴｔＷ域においてペプチドＨＰ− ３に応答する。初期のスクリーニングにおいて、ＨＰ−５２ないし５７群中の全 てのペプチドは正の応答を引き出す。

しかしながら、投与量応答検査を用いた更なる研究（図７）により、最大応答が ペプチドＨＰ−５３及びＨＰ−５５において見られた。

Ｔ１又はＴ２サイト及びＨＰ−５２ないし５７群とはＺσの領域からのペプチド は、試験された株の幾つかに対して正であることが見出された。正の応答は、試 験された４１１の株のうちの３種に対して、ペプチドＨＰ−３０（残部４８３− ４９７．ＲＤＮＷＲ３ＥＬＹＫＹＫＶＶＫ）１．ＨＰ−３５（残部５６０−５８ １．　ＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫ）　、ＨＰ−４７（残部 ７８７−８０１．ＲＩＶＢＬＬＧＲＲＧＷＥＡＬＫ）、ＨＰ−５０（残部８０１ −８１５．ＫＹＷＷＮＬＬＱＹＷＳＱＥＬＫ）、及びＨＰ−５１（残部８０６− ８２０゜ＬＬＱＹＷＳＱＥＬＫＮＳＡＶＳ）について見られた。

ペプチドＨＰ−２９及びＨＰ−３０は、全ての株について正の応答を引き出す。

前記の免疫化ペプチドの幾つかは重複する。ペプチドＨＰ−３０及びＨＰ−３３ は、５種の残部において重複する。８２１ｇハブロタイブのマウスは、ＨＰ−３ ０に対して応答しなかったが、しかしペプチドＨＰ−３３（これは、その分子の カルボキシ末端方向において９種の残部の分だけ長い）に対して応答した。同様 に、ペプチドＨＰ−２６（膜Ｔ１サイト）に対する応答は、Ｈ２１１１マウスに おいては見られなかったが、しかし応答は重複しているペプチドＨＰ−２９（こ れは、その分子のカルボキシ末端方向において８種の残部の分だけ長い）に対し て見られた。全ての株についての重複しているペプチドに対する最も顕著な応答 は、群ＨＰ−５２ないし５７中のペプチドに対して見られた応答である。

ｇｐ１６０分子を用いて免疫化された４種のＭＨＣハブロタイブのマウス中のｇ ｐ　１６　（ｌ蛋白質の重複しているペプチドに対するＴ細胞増殖応答を反映し た前記の結果は、膜Ｔ１及びＴ、サイトは免疫化領域を表わすということを確証 させる。Ｈ−２’、Ｈ−２’、及びＨ−２１４ハブロタイブのマウスは、膜Ｔ、 サイトに応答する。Ｈ２１６マウスは、重複しているペプチドＨＰ−２９にたい して応答する。膜Ｔ、サイト、ペプチドＨＰ−５は、Ｈ−２”ハブロタイブのマ ウスにより認識され、一方Ｈ−２１及び）ｌ　−２１１マウスは、重複している ペプチドＨＰ−８を認識する。

それ故、５種のペプチド（ＨＰ−８０，８５，４７゜５０、及び５１）は、試験 された４１１の株のうちの３種によりＴｍｍ腹膜して認識されて同定され、そし て２種のペプチド（ＨＰ−２９及び８３）は、試験された全ての株により認識さ れた。ペプチド４７，５０．及び５１は、重複している外膜の群を形成する。更 に、ペプチドの群（ＨＰ−５２ないし５７）は、ｇｐ４１分子（これに、マウス の各株は応答する）のＣ０ＯＨ基領域中のヘルパーＴ細胞外膜として同定された 。この特徴は、２２１２０分子の多数の高度に変わり得る領域に比べて比較的維 持された領域であるｇｐ４１分子中に見出されたので、ワクチンの製造において は特に満足できるものである。試験された４種のハブロタイブのマウスは、この 群中の異なるペプチドに応答する。

Ｈ−２′ハブロタイブのマウスは、ペプチドＨＰ−５５及びＨＰ−５６に好まし く応答した。この結果は、連鎖部のＴ細胞外膜はアミノ酸連鎖部Ａ　Ｉ　ＲＨＩ 　ＰＲＲ１（ＨＰ−５５及びＨＰ−５６の重複しているアミノ酸を表わす）であ ってよいことを示唆している（図４）。反対に、２種の固有サイトが２種の重複 しているペプチド中に存在し得る。Ｈ−２′４ハブロタイブのマウスは、同様な 応答を示した；再び、ペプチドＨＰ−５５及びＨＰ−５６は好ましく認識された 。それ故、Ｈ−２”ハブロタイブのＴ細胞のための認識サイトは、同一の９種の アミノ酸連鎖部の地図形成をしてよい。対照的に、Ｈ−２’ハブロタイブのマウ スは、最初にペプチドＨＰ−５２及びＨＰ−５３に対して増殖応答を示し、次い でこのサイトを２種のペプチドにより造形された９種のアミノ酸（ＤＲＶ　Ｉ　 ＥＶＶＱＧ）ｉ、：対して地図形成スル。Ｈ−２目ハブロタイブのマウスは、ペ プチドＨＰ−５３及びＨＰ−５５に対して最高に応答する。前記ペプチドの重複 は、Ｔ細胞外膜は８種のアミノ酸連鎖部ＱＧＡＹＲＡＩＲであるが、しかし再び 、前記２種のペプチドは反対に２種の固有サイトを表わし得るということを示唆 する。

種の重複している外膜群（ペプチド３−８．２６−２９゜４７−５１．　及ヒ５ ２−５６）　ｆ）Ｒ見ハ、ＡＩＤＳ’フィルスに対するワクチンの発展のために 重要な意味を有する。単一ペプチドは試験された全てのマウス株において免疫化 されないけれども、幾つかのアミノ酸によるペプチド連鎖部の延長は、ＨＰ−５ ，２６，及び３０の場合のように、より多くのハブロタイブのマウスからの応答 を引き出す。それ故、前記の延長されたペプチドは、人間の様な異部族結婚をす る母集団に対しては更に適切である。ＡＩＤＳ膜の比較的観察された領域中に位 置するペプチドＨＰ−５２ないし５７の群の発見は、人間接種用ワクチンのため に特に満足できる。ペプチドのこの群はｇｐ４１の細胞内の部分上に存在するけ れども、抗体と異なり、Ｔ細胞は原蛋白質が供与又は目的細胞上に存在すること を必要としないので、Ｔ細胞認識は損なわれないであろう；それらはＭＭＣ分子 と結合した加工されたフラグメントを認識することができる。

明らかに、本発明の重要な特徴は大部分のＭＭＣハブロタイブにより認識される 外膜群の発見であり、そして２．３の残部により延長されているペプチド外膜は 試験された全てのハブロタイブの各々により認識される単一ペプチドを産生ずる という観察である。初期のこの発見は、特にＨＩＶ感染に関してＴ細胞免疫を引 き出すことを目的とするペプチド又はフラグメントワクチンにおけるＭＨＣ制限 及びＩｒ遺伝子の困難な問題を克服するための手段を提供する。

前記のペプチドが霊長類においても免疫化されたかどうか、及びそれらが試験管 内で原ＨＩＶ膜蛋白質に応答する第２抗体を助けるためのヘルパーＴ細胞を用意 することができるかどうかを評価するため、リーサス猿を前記群の３種の代表的 なもの、換言すればペプチドＨＰ−５、ＨＰ−２６，及びＨＰ−５３を用いて免 疫化した。

図９Ａ及び９Ｂに示される様に、グループＩの２匹の猿（これらは、厚膜蛋白質 ｇｐｉａｏを用いた免疫化の前に前記３種のペプチドの混合物を用いて免疫化さ れた）は、グループ２の猿（これらは、全ｇｐ　１６０の前にペプチドを受は取 らなかった）に比べて膜蛋白質（ｇｐ　４１部分）に応答する非常に増強された 抗体を産生ずる。

したがって前記ペプチドは、ＨＩＶウィルス膜に応答する非常に増強された抗体 を誘導するための最初のヘルパーＴ細胞に対して霊長類を免疫化するために使用 することができる。更に、グループ１の猿はＨＰ−２８及びＨＰ−５３の両方に 対して良好な末梢血液単核細胞増殖応答を示した。この結果は、前記ペプチドは 試験管内でＴ細胞ヘルプ並びに増殖を誘導することができ、そしてそれらはマウ スと同様に霊長類を免疫化するために使用することができるということを示す。

ＡＩＤＳのための生きているウィルスワクチン及び全て殺した又はサブユニット ウィルスワクチンは、潜在的な安全性に対する危険を有するということは、ここ で記載するのが適切であろう。対照的に、本文中に記載された様な合成ペプチド は、本来安全なものである。更に、全つイールス蛋白質に相当するがしかし組み 換えＤＮＡ技特表平３−５０４３８４　（５） 術により作られた分子は保護外膜に加えて免疫応答性の抑制を潜在的に引き出す 構造、及び抗体を引き出す構造を含み、保護的であるよりもむしろウィルスの摂 取を増強し且つそれ故有毒性であり得る。これより、適する免疫型を引き出し且 つ他の有毒な作用を有しない選択されたペプチドのみを含むワクチンは、勿論、 ＨＩＶの様な困難なウィルスのためにより望まれるべきである。本発明はその様 なワクチンを提供する。

シース（Ｃｅａｓｅ）他、　　１９８７．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｄａｄ、Ｓ ｃｉ。

８４　：　４２４９−４２５３による我々の研究は、ＡＩＤＳウィルスに対する ヘルパーＴ細胞免疫性を刺激する２種の合成ペプチドを定義する。しかしながら 、前記ペプチドは組織適合性型のほとんど全ての個々のウィルスにおいては見ら れない。全母集団を覆うためには、追加のペプチドを必要とするであろう。初期 におけろ本発明は、試験されたマウス並びに試験された数種類の猿の全てのＭＨ Ｃ型からＴ細胞により認識されるものを包含するその様な追加のペプチドを提供 する一０ 診断上の又は予後の使用としては、抗体は一般に測定される免疫性応答のみであ る。しかしながら、感染した個体は抗体を作らないであろうし、且つそれ放置と して検査されるであろうから、感染後退ないし月の範囲の間隔がある。この期間 中、前記の個体は他を感染させるか又は感染された血液を与える。ヘルパーＴ細 胞は、抗体よりも免疫性応答においてより早く発現すると信じられており、そし てそれ故ヘルパーＴ細胞を検出するための検査は一般に使用される抗体ベースの 検査よりも早く感染を検出することができる。限られた精製蛋白質のみをウィル スから得ることができ、そして組み換え分子には通常、誤った正の結果を与え得 るベクターからの他の物質により汚染されている。これに加えて、前記物質の多 くは有糸分裂誘発性であることが証明され、それ故誤った正の結果を与えるので あろう。対照的に、本文中に記載された様な合成ペプチドは、高度に精製され且 つ有糸分裂誘発性ではない。更に、本文中に記載された異なるペプチドを使用す ることにより、病気の進行によって変わり得るＴ細胞の異なる組を検出すること ができ、そしてこれは全蛋白質抗体を使用することを特徴としないであろう。そ れ故、本発明の合成ペプチドは、病気の進行を決定するために全く有効である。

これは、例えばこの分野の当業者に公知の末梢血液増殖芽細胞転換分析等の標準 的な免疫試験を行うことにより容易に成される。

要約すると、本発明は４種の異なった多数組織適合性型においてヘルパーＴ細胞 によりＡＩＤＳウィルス膜蛋白質内の多数の認識サイトであることが示された合 成ペプチドの組を提供する。前記ペプチドは、上記本文中に記載されている特定 のアミノ酸残基と共にラットナ−（Ｒａｔｎｅｒ）他によりＮａｔｕｒｅ３１３ ：２７７．１９８５に記載されたＡＩＤＳＩＤＳウィルス都連鎖部ＩＯ単離体） の残部８２８−８６０　（及びその中で重複しているペプチド）、１０９−１２ ４．４３２−４４６．４８７−４５１、４８３−４９７、４９２−５０６、５６ ０−５８１．７８７−８０１、及び８０６−８２ＯＮＩ相当する。

本発明は、前記サイトを含むために選択された全ての組み換え又は環ペプチド及 び、例えばＡＩＤＳウィルスの他の変性単離体上の同一サイトに相当する前記連 鎖部に重複しているか又は前記連鎖部の変形を含む全ての合成ペプチド；何らか の運搬体、助剤、施薬の道における、又はＴ細胞免疫性を引き出す他の物質と配 合した、免疫化のためのその用途；及びＡＩＤＳウィルスに対するＴ細胞免疫性 の性質及び程度を評価するための診断上の又は予後の試薬を包含する。勿論、前 記ペプチドは単独で又は本発明の１種より多くのペプチドとの配合物として使用 することができる。免疫応答性性を誘導するための方法は、ＨＩＶ膜蛋白質によ る感染を許容し得るホストに対して、ＨＩＶ感染に対するヘルパーＴ細胞免疫性 の増殖を誘導するための本発明の抗原の有効量を与えることから成る。ＨＩ　Ｖ ｊｌＥ蛋白質に対する暴露を決定するための検査は、血液試料からの末梢血液単 核細胞を本発明のペプチドと共に培養し、次いで増殖、芽細胞転換又はリンパ循 環産生の発生を慣用の免疫学的技術、例えば上記技術（正の反応は、ＨＩＶ膜蛋 白質に暴露された前記個体を示す）により決定することから成る。

本発明のＡＩＤＳのための診断上の又は予後のためのキットは、単独又は混合物 の何れかの本発明の抗原性ぺプチド、及び検査を行うための構造材料を含む容器 から成る。

本文中に記載された実施例及び態様は単に説明の目的のためのものであり、そし てその範囲内の種々の改良及び変化はこの技術分野の当業者に示唆されるであろ うし且つ本願の思想及び範囲及び添付された請求の範囲の範囲内に含まれている ということが理解される。

工 ＨＰ−３Ｅ　Ｑ　Ｍ　ＨＥ　Ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｓ　Ｌ　Ｗ　Ｄ　Ｑ　Ｓ　ＬＨＰ４　 　　Ｑ　Ｍ　ＨＥ　Ｄ　１１　Ｓ　Ｌ　Ｗ　Ｄ　Ｑ　Ｓ　Ｌ　ＫＨＰ−５ＨＥ　 Ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｓ　Ｌ　Ｗ　Ｄ　Ｑ　Ｓ　Ｌ　ＫＭＰ−６ＨＥ　Ｄ　Ｉ　Ｔ　Ｓ　 Ｌ　Ｗ　Ｄ　Ｑ　Ｓ　Ｌ　ＲＨＰ−７Ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｓ　Ｌ　Ｗ　Ｄ　Ｑ　Ｓ　Ｌ 　Ｋ　Ｐ　ＣＶ　ＫＨＰ−８Ｗ　Ｄ　Ｑ　Ｓ　Ｌ　Ｋ　Ｐ　ＣＶ　Ｋ　Ｌ　丁Ｐ 　Ｌ　ＣＶ図２ じ 刺激指数 ロ　　〜　　、−■　　ロ　　ロ　　〜　　・ト刺激指数 度数 グル−プ１ 図９Ａ 国際調査報告　　ｃｏ八へへ（ｒｌ；ｊ）隻Ａ／Ｌ１吻ＴＡ８１１１１１ａ・＾ 帥−・””””＠ｏｒ〒／ｎ＜ＲＱ１０１１７１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＰ−３及び４、ＨＰ−６ないし８、ＨＰ−２８及び２９、ＨＰ−４７ない し５１、ＨＰ−５２ないし５６、ＨＰ−３０、ＨＰ−３３及びＨＰ−３５からな る群から選択された、多数の異なった多数組織適合性型の個体、ＨＩＶ膜蛋白質 を発現する細胞を認識することができるＴ細胞の増殖を刺激する合成ペプチド抗 原。
2. ２．ＨＩＶ膜蛋白質に対するＴ細胞応答を引き出すための請求項１記載の抗原の 滿足できる量からなるワクチン。
3. ３．血液試料からの末梢血液単核細胞を請求項１記載のペプチドと共に培養し、 次いで増殖、芽細胞転換、又はリンパ循環産生の発生をいづれかの適用し得る慣 用の免疫学的技術（正の反応は、ＨＩＶ膜蛋白質に暴露された前記個体を示す） により決定することから成る検査。
4. ４．ＨＩＶ膜蛋白質によ感染を許容し得るホストに対して、ＨＩＶ感染に対する ヘルパーＴ細飽免疫性の増殖を誘導するための請求項１記載のペプチド抗原の有 効量を与えることから成る免疫応答性を誘導するための方法。
5. ５．単独又は混合物の何れかの多数の異なった多数組織適合性型の個体、ＨＩＶ 膜蛋白質を発現する細胞を認識することができるＴ細胞の増殖を刺激する異なる ペプチド抗原、及び前記ペプチド抗原を用いて検査を行うための構造材料を別々 に含む容器から成る、ＨＩＶ膜蛋白質に対する暴露を決定するためのキット。