JPH03502641A - オリゴヌクレオチドバンクを用いるｄｎａ塩基配列の決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドバンク及びＤＮＡ塩基配列の決定方法 核酸フラグメント、特にＤＮＡの配列決定分析は現代の生物科学と現代のバイオ テクノロジーにおけるキープロセス（Ｓｃｈ−Ｉｕｅｓｓｅｌｖｅｒｆａｈｒｅ ｎ）として位置づけられるかも知れない。最近の配列決定技術の絶え間のない進 歩に伴って、複雑なゲノム全体であっても分析の可能性が現実的なものとなって きた。

あまり一般的でない２，３の方法を除（と、現時点において、２つの基礎的に異 なった方法が配列決定のために特によく用いられる。つまり、 一化学修飾と分解とによる配列決定分析（マキシム／ギルバート）ならびに、 一異種のヌクレオチドのコントロールされた条件下でのポリメラーゼ添加による 配列決定分析（サンガー法）：例えば、Ｇａ５５ｅｎ　　及び５ｃｈａｅｆｅｒ 、　Ｓｅｑｕｅｎｚｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ　ｖａｎＮｕｃｌｅｉｎｓａｅｕｒｅ ｎ　　ｕｎｄ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎ。

ｔｎ：　Ｇａ５５ｅｎ　ｅｔ　ａｔ、　Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｋ、２．　Ａｕｆｌ ａｇｅ、　Ｇｕｓｔａｖ−Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　１９８７．５ｅｉ ｔｅ　２４１　ｆｆ、参照。

サンガー法は、配列決定用に特に調製された一本鎖ＤＮＡを用いて行なわれるか 、又はここ数年のケースとして充分に純粋な２本鎖ＤＮＡを用いて行なわれる。

しかしながら、サンガー法の一般的特徴として用いられる酵素（ＤＮＡポリメラ ラーゼ）に依存するという問題点を残している。この酵素は鋳型（Ｍａ−ｔｒｉ ｚｅ）　（鋳型−配列決定されるべきＤＮＡ）と短い鎖長の分子（ブライマー） の両方に用いられるものである。

このブライマーは、一般に、短くて化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであ って、且つ配列決定をするためのＤＮＡセクションの全長の中でより３′末端側 に位置づけられた部位と塩基対が相補的な関係にあるものである。

まず、明瞭な配列決定の結果を得るために、実験条件下で、ブライマーが望んで いる接合部位のみを見出し、いかなる他の接合部位にも見出されないように、ブ ライマーの接合部位（ハイブリダイズされる部位）を選択しなければならない。

ブライマーの特異性は実験に用いられたＤＮＡの複雑さとその長さに直接依存す る。統計的な考察と実際の経験から２４塩基対（Ｂａｓｅｎ）までの鎖長を持っ たブライマーが全ての考えられるケースに対して充分であることが見出されてい る。

非常に長いＤＮＡの配列決定分析の場合（例えば、ゲノムの配列決定）には、現 在、本質的に２つの異なったストラテジ（Ｓｔｒａｔｅｇ）が用いられる。

ストラテジ１：　　シングル−ブライマー法この方法において配列決定されるＤ ＮＡはより大きな或いはより小さなランダムな断片に分断されるか、もしくは部 分的に組織的な断片（方法の若干の違いに依存して）に分断される。次にこの断 片は同じ種類のベクター内に挿入される。細胞のトランスフォーメーション後、 個々のクローンのＤＮＡ調製物を調製し、配列決定分析を行なう。全そのＤＮＡ 調製物は最大挿入されたＤＮＡによって異なっているので、例えば、ベクターＤ ＮＡ上の挿入部位に直接に隣接してハイブリダイズしたシングルブライマーは、 原理的に、すべて要求さる配列決定分析のために用いることができる。しかしな がら、この利点と対比される顕著な欠点がある。

−第１に、クローンはランダムに捜さねばならないので、オリジナルＤＮＡの個 々の断片は、しばしば、必要であるよりもはるかに多くの配列決定がなされる。

そして、第２に、適当なコンピュータープログラムを用いて配列決定した部分配 列結果のパターン分析において、大きなギャップをしばしば見出す、これは、例 えば、分析されるべきオリジナルＤＮＡのある断片が容易にクローンを作らない （“ＳｃｈｗｅｒＫｌｏｎｉｅｒｂａｒ”）ためである。

ストラテン２；マルチーブライマー法 この場合に、配列決定用ＤＮＡはストラテジ１におけるように、ショットガン法 によって分析されない、制御された処理方法によってなされる。

最初の実験において確実に分解された（ＤＮＡ）配列の断片は次の実験等のため プライマー接合部位の選択に用いられる。

この方法の利点は、ストラテジ１におけるように不必要な多くの回数の配列決定 分析がさけられていると言う事実にある。

この方法が、なぜ「比較的長いＤＮＡ断片の分析のために用いられる唯一のもの でないか？」という本質的理由は、たぶん現在利用されている化学的ＤＮＡ合成 の方法に横たわっている技術的限界に起因していると思われる。

上述した方法の欠点を、たとえば、ストラテジ１における複式配列決定法じＭｕ ｌｔｉｐｌｅｘ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”）の手段と、ストラテジ２において異 なった部位からの自動進行型配列決定による方法の欠点を軽減するための試みは これまで無かった。

ストランジ２の本質的欠点を取り除（ひとつの方法は理論的には全ての可能なブ ライマーのバンクを準備することである。

しかしながら、そのためには２４の鎖長をもっている４１４通りの異なったブラ イマーを用意しなければならないので、直接の化学的合成では実際上不可能であ る。

それゆえ比較的短い化学合成されたオリゴヌクレオチドの使用が本発明によって 提案される。比較的長い配列は原理として、２あるいはそれ以上の比較的短い配 列から作られるので、望んでいるブライマーの代わりに、望んでいるブライマー に一致した短いオリゴヌクレオチドを配列決定されるＤＮＡに加えて、そして適 当な操作によって、たとえばＴ４−ＤＮＡライゲースを用いて、望んでいるブラ イマーを形成するように結合させる０次に、配列決定反応は一般的な標準の条件 下で実際に実施される。

発明が基礎としている課題はクレームされている手段によって解決される。

実施例１ 典型的な実験において、プラスミドｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ ）の約２．５ｐ　ｍｏｌ　ＤＮＡをＮａＯＨで変成処理した。次にエタノールで 沈澱させ、乾燥後、水に溶解した。おのおの２種の異なったオリゴヌクレオチド 溶液それぞれ２．５１）　ｔｏｏｌをこのＤＮＡ溶液に加えた。これらのオリゴ ヌクレオチドとして鎖長８個（オクタマー）から成るものを選択した。これらの オリゴヌクレオチドはプラスミドＤＮＡ上の既知のヌクレオチド配列のセクショ ン上でそれぞれ隣接して直接にハイブリダイズされた。公知の通常の方法に従っ て、ハイブリダイズされた状態において、オクタマーの５′末端は、前もってＴ ４−ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰによりリン酸化されていた。なお、オク タマーの５′末端は、他のもう一方のオリゴヌクレオチドの３′末端に隣接した 位置にあった。

次に、Ｔ４−ＤＮＡライゲースによるライゲーションのため、公知の通常のとお りに緩衝液の条件を調整し、Ｔ４−ＤＮＡライゲースの１ユニツトを加え、反応 溶液（溶液の実験時における体積は１０μｍ）を１５°Ｃで４時間インキュベー トした。

こうして得られたライゲーション溶液は配列決定操作の前に３７°Ｃで５分間保 温された。ライゲージジンによってもたらされる１６−マーの数を増やし、ハイ ブリダイズされうるオクタマーをできるだけ少なくするためである。

続いて、配列決定を選択したベクターの配列を試験するためにおこなった。米国 バイオケミカルコーポレーション社（Ｆｉｒ＋＊ａ　ＩＪｎｉｔｅｄ　５ｔａｔ ｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＵＳＢ））の標準プ ロトコールに従って配列決定反応を行うために、ライゲーション溶液の８μｍが 用いられた。上のプロトコールからは離れるので、鋳型とブライマーのアニーリ ング（“Ａｎｎｅａｌｉｎｇ”）はオミットされた。

上記で使われたリン酸化は（ｒ　−”Ｐ）　ＡＴＰを用いて行ない、〔α−”Ｐ ）　ｄＡＴＰの後での使用はオミットされた。

この発明はマルチ−プライマー法によってＤＮＡの配列を決定するためのオリゴ ヌクレオチドバンク及びＤＮＡ配列決定法に関するものである。

国際ｙ４査報告 一一ユ噂−＾・−ｕ加＾−ＰＣＴ／ＥＰ８９１５７９ＬＮ際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）可能な全ての４６通りの異なったメキサメリックオリゴヌクレオチド（ｈ ｅｘａｍｅｒｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むオリゴヌクレオチドバ ンク （２）可能な全ての４７通りの異なったヘプタメリックオリゴヌクレオチド（ｈ ｅｘａｍｅｒｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むオリゴヌクレオチドバ ンク （３）可能な全ての４８通りの異なったオクタメリックオリゴヌクレオチド（Ｏ ｃｔａｍｅｒｅＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むオリゴヌクレオチドバ ンク （４）可能な全ての４９通りの異なったオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃ ｌｅｏｔｉｄｅ）を含むオリゴヌクレオチドバンク（５）（ａ）配列を決定しよ うとするＤＮＡにおいて、公知の配列からなる一本鎖のプライマー接合部位を選 択する工程、（ｂ）このプライマー接合部位に、直接隣接して、２種のヘキサメ リック、ヘプタメリックまたはオクタメリックオリゴヌクレオチド（例えば、前 記請求項（１）〜（４）のいずれかのひとつに従ったオリゴヌクレオチドバンク から）をハイブリダイズする工程、そして （ｃ）工程（ｂ）とほぼ同時または工程（ｂ）の後、さらにヘキサメリック、ヘ プタメリックまたは、オクタメリックオリゴヌクレオチド（例えば、前記請求項 （１）〜（４）のいずれかひとつに従ったオリゴヌクレオチドバンクから）をプ ライマー接合部位で他の２種のオリゴヌクレオチドの一方の端に直接隣接させて ハイブリダイズさせる工程、（ｄ）これらオリゴヌクレオチドにライゲーション 処理を行ってプライマーを形成させる工程、 を行うことを特徴とするマルチープライマー法によるＤＮＡ塩基配列決定方法 （６）プライマー接合部位において、２種のオリゴヌクレオチドをハイブリダイ ズし、この２種のオリゴヌクレオチドを互いにライゲーションしてプレープライ マーを形成し、その後初めて、第３のオリゴマーをプライマー接合部位でハイブ リダイズし、プレープライマーとライゲーションすることを特徴とする請求項（ ５）による方法（７）ヘキサメリック、ヘプタメリック及び／又はオクタメリッ クオリゴヌクレオチドをプライマー形成のために使用することを特徴とする請求 項（５）または（６）による方法（８）５′末端が、その末端を隣接するオリゴ マヌクレオチドＴ４−ＤＮＡ−ライゲースを用いて接合させる場合に、リン酸化 されているオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする前記請求項のいずれか による方法 （９）ライゲーションの後であって配列決定の前に、望まれるプライマーにライ ゲーションされなかったオリゴヌクレオチドを熱処理によって除去することを特 徴とする前記請求項のいずれかによる方法