JPS5926064A - 任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析方法 - Google Patents
任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析方法Info
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- JPS5926064A JPS5926064A JP9587783A JP9587783A JPS5926064A JP S5926064 A JPS5926064 A JP S5926064A JP 9587783 A JP9587783 A JP 9587783A JP 9587783 A JP9587783 A JP 9587783A JP S5926064 A JPS5926064 A JP S5926064A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はマススイクトロメトリーによる任意に修飾され
たオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌク
レオチドの配列分析方法に関する。
たオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌク
レオチドの配列分析方法に関する。
合成オリゴヌクレオチドは現代の生命科学においてます
ます重要になりつつある。特に、予め決定されたヌクレ
オチド配列の化学合成は遺伝子工学の発展を促進してき
た。その結果、新規かつ迅速な合成方法の発展が促進さ
れてきた。例えば、改良された連鎖方法（１，２）、高
度に選択的な、かつ温和な脱保護剤（３，４）の発展、
及び適白な固体支持体（５，６，７）の使用等である。
ます重要になりつつある。特に、予め決定されたヌクレ
オチド配列の化学合成は遺伝子工学の発展を促進してき
た。その結果、新規かつ迅速な合成方法の発展が促進さ
れてきた。例えば、改良された連鎖方法（１，２）、高
度に選択的な、かつ温和な脱保護剤（３，４）の発展、
及び適白な固体支持体（５，６，７）の使用等である。
このような合成は今や数日の中に実施することができる
。
。
したがって、該作業の大部分は脱保護されたオリゴヌク
レオチドの注意深い分析に費やされる。配列分析は通常
、化学的分解方法（８）又は放射性標識によるワンダリ
ング−スポット（ｗａｎｃＬｅｒｉｒＬｇ−ｓｐｏｔ）
法（９）によって行なわれる。
レオチドの注意深い分析に費やされる。配列分析は通常
、化学的分解方法（８）又は放射性標識によるワンダリ
ング−スポット（ｗａｎｃＬｅｒｉｒＬｇ−ｓｐｏｔ）
法（９）によって行なわれる。
十分に保護されたオリゴヌクレオチドのために、比較的
複雑な分断反応が陰イオン２５２Ｃｆプラズマ脱着マス
スはクトロメトリーに基づいて報告されたαｚ０マツク
ニール（ＭｃＮｅａｌ）らはさらに次のように述べてい
る。すなわち、自然に生じるホスホジエステルヌクレオ
チド９聞納合を有するオリゴヌクレオチドはもつとさら
に複雑な分断反応を示し、そして分子イオンの収率は非
常に減少すると０２゜このような先行技術にかんがみて
、本発明により任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチ
ド７又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析を
簡単な方法でマススペクト四メトリーによって行なうこ
とができることは驚くべきことである。
複雑な分断反応が陰イオン２５２Ｃｆプラズマ脱着マス
スはクトロメトリーに基づいて報告されたαｚ０マツク
ニール（ＭｃＮｅａｌ）らはさらに次のように述べてい
る。すなわち、自然に生じるホスホジエステルヌクレオ
チド９聞納合を有するオリゴヌクレオチドはもつとさら
に複雑な分断反応を示し、そして分子イオンの収率は非
常に減少すると０２゜このような先行技術にかんがみて
、本発明により任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチ
ド７又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析を
簡単な方法でマススペクト四メトリーによって行なうこ
とができることは驚くべきことである。
この目的のために、本発明によれば、
（ａ） 任意に修飾されたヌクレオチドをマス７はク
トロメトリーに付すること、但し前記の任意に修飾され
たヌクレオチドは測定条件下で少フよくとも１個のリン
酸イオン基（リン酸油“、荷）を有するヌクレオチド又
はそのようなリン酸基を供給するヌクレオチドであるこ
と、 （ｈ） 陰イオンを記録すること、 （Ｃ１）質量差を重量に関して互いに続いている５′−
Ｐ−イオンの間で測定すること及び（又は）（Ｃ２）質
量差を重量に関して互いに続いている６′−Ｐ−イオン
の間で測定すること、 （ｄ、）連続する質量差を該塩基と関連させて決定する
こと−１ を％徴とする任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチド
９又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析方法
が提案される。
トロメトリーに付すること、但し前記の任意に修飾され
たヌクレオチドは測定条件下で少フよくとも１個のリン
酸イオン基（リン酸油“、荷）を有するヌクレオチド又
はそのようなリン酸基を供給するヌクレオチドであるこ
と、 （ｈ） 陰イオンを記録すること、 （Ｃ１）質量差を重量に関して互いに続いている５′−
Ｐ−イオンの間で測定すること及び（又は）（Ｃ２）質
量差を重量に関して互いに続いている６′−Ｐ−イオン
の間で測定すること、 （ｄ、）連続する質量差を該塩基と関連させて決定する
こと−１ を％徴とする任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチド
９又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析方法
が提案される。
適用可能なマススペクトロメトリー法の例は、ＦＡＢマ
ススはクトロメトリー及びＳＩＭＳマススＲクトロメト
リー又はこれらの方法の組合せである。ＦＡＢマススＲ
クトロメトリーに関しては例えばパーバー（ＢａｒｂＣ
ｒ）ら０ｅ並びにモーリス（Ｍｏｒｒｉｚ）らαＪが注
目される。ＦＡＢマススペクトロメトリーの本質的な特
徴は、マトリックス上に単層の形で存在する被検材料を
中性荷電粒子、例えば５ＫＶ又はそれ以上の電場内で不
活性ガスで衝撃することである。
ススはクトロメトリー及びＳＩＭＳマススＲクトロメト
リー又はこれらの方法の組合せである。ＦＡＢマススＲ
クトロメトリーに関しては例えばパーバー（ＢａｒｂＣ
ｒ）ら０ｅ並びにモーリス（Ｍｏｒｒｉｚ）らαＪが注
目される。ＦＡＢマススペクトロメトリーの本質的な特
徴は、マトリックス上に単層の形で存在する被検材料を
中性荷電粒子、例えば５ＫＶ又はそれ以上の電場内で不
活性ガスで衝撃することである。
本発明による方法はこうして未保護又は脱保護されたオ
リゴリボヌクレオチド又はオリボデオキ、シリボヌクレ
オチドに適用されろ。分析すべきヌクレオチドの塩基数
の上限は方法原理自体によっては制限されるものではな
いが、しかし実際には使用されるマス７はクトログラフ
の分解能によっである限界点を定めることができる。
リゴリボヌクレオチド又はオリボデオキ、シリボヌクレ
オチドに適用されろ。分析すべきヌクレオチドの塩基数
の上限は方法原理自体によっては制限されるものではな
いが、しかし実際には使用されるマス７はクトログラフ
の分解能によっである限界点を定めることができる。
配列すべき材料の等質性に対する望ましい値は９５％、
より好ましくは９７％、特に９９％である。しかしなが
ら、適当なレベルの等質性を決定することは当業者にゆ
だねられており、かつ当業者ならば適宜選択して決定す
ることができる。場合しだいで異なる等質性が望ましい
ことがわかるかも知れない。なぜなら、若干の不純物、
例えばトリチル基のような親油基を有するヌクレオチビ
材料はスはクトル中で過大に表わされ得るからである。
より好ましくは９７％、特に９９％である。しかしなが
ら、適当なレベルの等質性を決定することは当業者にゆ
だねられており、かつ当業者ならば適宜選択して決定す
ることができる。場合しだいで異なる等質性が望ましい
ことがわかるかも知れない。なぜなら、若干の不純物、
例えばトリチル基のような親油基を有するヌクレオチビ
材料はスはクトル中で過大に表わされ得るからである。
以下に本発明を添付の図面と共に詳細に説明する。
第１α図はオリゴデオキシリボヌクレオチド９α、すな
わちｄ（Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ）（ｄ＝ニブ
オキシの陰イオンＦＡＢマススはクトルを示し、 第１ｂ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド″ｂ。
わちｄ（Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ）（ｄ＝ニブ
オキシの陰イオンＦＡＢマススはクトルを示し、 第１ｂ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド″ｂ。
すなわちｄ（Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ） の陰
イオンＦＡＢマススはクトルを示し、 第１Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドＣ１すなわ
ちｄ（Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）の陰
イオンＦＡＢマススＲクトルを示し、第２α図はオリゴ
デオキシリボヌクレオチドαの単純化した配列構造を示
し、 第２ｈ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドｂの単純化
した配列構造を示し、 第２Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドＣの単純化
した配列構造を示す。
イオンＦＡＢマススはクトルを示し、 第１Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドＣ１すなわ
ちｄ（Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）の陰
イオンＦＡＢマススＲクトルを示し、第２α図はオリゴ
デオキシリボヌクレオチドαの単純化した配列構造を示
し、 第２ｈ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドｂの単純化
した配列構造を示し、 第２Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドＣの単純化
した配列構造を示す。
第２ｃＬ〜２Ｃ図の単純化した配列構造において、その
切断によって必須のフラグメント イオンをもたらす結
合は断続線で示されており、その切断点において前記フ
ラグメント イオンの質量が示されており、断続線上の
頂部に示された質量は５′−Ｐ配列イオンに相当し、ま
た断続線上の底部に示された質量は３／−Ｐ配列イオン
に相当する。
切断によって必須のフラグメント イオンをもたらす結
合は断続線で示されており、その切断点において前記フ
ラグメント イオンの質量が示されており、断続線上の
頂部に示された質量は５′−Ｐ配列イオンに相当し、ま
た断続線上の底部に示された質量は３／−Ｐ配列イオン
に相当する。
純粋なオリゴヌクレオチドを本発明による方法に使用し
た場合、実際には特異的５′−Ｐ配列イオン及び３／、
−ｐ配列イオンのみが得られる（第１α〜１Ｃ図参照）
。このような特異的配列イオンの〜特有の形成は、同じ
型の連続する配列イオン間の質量差を決定することによ
って、迅速な配列分析を簡単に可能にする。これらの二
つの型の配列イオン間の識別は可能である。なぜなら、
異なる型の、しかし同一のヌクレオチド単位数を有する
イオンはそれらのピーク強度によって規則的にはっきり
認めることができるからである。６／−０原子を有する
結合（これは砂糖部分の第２級炭素原子に結合している
。）は５′−〇原子を有する結合（これは砂糖部分の第
１級炭素原子に結合している。）よりも不安定であるの
で、５′−Ｐ配列イオンは相当する６′−Ｐ配列イオン
より憤例外なくより強く現われろ。
た場合、実際には特異的５′−Ｐ配列イオン及び３／、
−ｐ配列イオンのみが得られる（第１α〜１Ｃ図参照）
。このような特異的配列イオンの〜特有の形成は、同じ
型の連続する配列イオン間の質量差を決定することによ
って、迅速な配列分析を簡単に可能にする。これらの二
つの型の配列イオン間の識別は可能である。なぜなら、
異なる型の、しかし同一のヌクレオチド単位数を有する
イオンはそれらのピーク強度によって規則的にはっきり
認めることができるからである。６／−０原子を有する
結合（これは砂糖部分の第２級炭素原子に結合している
。）は５′−〇原子を有する結合（これは砂糖部分の第
１級炭素原子に結合している。）よりも不安定であるの
で、５′−Ｐ配列イオンは相当する６′−Ｐ配列イオン
より憤例外なくより強く現われろ。
ヌクレオチド配列を決定するには、以下の方法を採用す
る。
る。
（Ｍ−Ｈ）−ピーク（Ｍ−Ｈ）−＝分子マイナス陽子）
から出発して、全ての配列イオンを５’−ｐイオンとし
て又は６′−Ｐイオンとしてのそれらの強度に従って分
類する。第１α図及び第２ａ図に対して次の結果が得ら
れる。
から出発して、全ての配列イオンを５’−ｐイオンとし
て又は６′−Ｐイオンとしてのそれらの強度に従って分
類する。第１α図及び第２ａ図に対して次の結果が得ら
れる。
第１表
５′−Ｐ配列イオン ６′−Ｐ配列イオン２４
０７／（Ｍ−Ｈ）−イオン ２１７４ ２１５８ １８８５ １８５４ １５８１ １５４１ １２９２ １２１２ ９６３ ９２３ ６５０ ６１９ ３４（Ｓ ３３０次いで、同一の
配列イオン型の隣接ピーク間の正確な質量差を決定する
。次の表において、それぞれのヌクレオチドま確認され
た質量差と結びつけることができる。
０７／（Ｍ−Ｈ）−イオン ２１７４ ２１５８ １８８５ １８５４ １５８１ １５４１ １２９２ １２１２ ９６３ ９２３ ６５０ ６１９ ３４（Ｓ ３３０次いで、同一の
配列イオン型の隣接ピーク間の正確な質量差を決定する
。次の表において、それぞれのヌクレオチドま確認され
た質量差と結びつけることができる。
第２表
Ａ ３１３ ２３３ ３３０Ｃ２８９２０
９３０６ Ｇ ３２９ ２４９
ろ４６Ｔ ３０４ ２２４ ３２１第
２α〜２Ｃ図から明らかなように、５／−ｐ配列イオン
及び６′−Ｐ配列イオンに関して、５′末端（図の左側
）と６′末端（図の右側）との間の識別（これはそれぞ
れのオリゴデオキシリボヌクレオチドの反対側の末端と
関連している。）をすることができる。したがって、本
発明による方法に付されたオリゴヌクレオチドの完全な
塩基配列は、その５′−末端又はその６′末端から出発
することによって、２回読み取ることができる。
９３０６ Ｇ ３２９ ２４９
ろ４６Ｔ ３０４ ２２４ ３２１第
２α〜２Ｃ図から明らかなように、５／−ｐ配列イオン
及び６′−Ｐ配列イオンに関して、５′末端（図の左側
）と６′末端（図の右側）との間の識別（これはそれぞ
れのオリゴデオキシリボヌクレオチドの反対側の末端と
関連している。）をすることができる。したがって、本
発明による方法に付されたオリゴヌクレオチドの完全な
塩基配列は、その５′−末端又はその６′末端から出発
することによって、２回読み取ることができる。
２つの異なる位置におけろオリゴヌクレオチドの塩基配
列を読み取ることのこのような可能性は、各読取り位置
において完全に塩基配列を読み取ることが絶対に必要で
ある訳ではなく、むしろ重複領域に至るまで又は該領域
からのみ読み取ればよいことを意味している。たとえ（
例えば調査すべきオリゴヌクレオチドの汚染のために）
配列イオンの質量かやＮ正確性を欠いて決定され、質量
数かそれだけ太きく決定されることがあるとしても、上
記の方法は有利である。このような場合、完全な配列分
析は、より小さいｊＪｊ媚数に対して重複惟域に至るま
で又は該領域からのみの両方の読取り位置において得ら
れた結果を組み合わせろことによって決定され得る。
列を読み取ることのこのような可能性は、各読取り位置
において完全に塩基配列を読み取ることが絶対に必要で
ある訳ではなく、むしろ重複領域に至るまで又は該領域
からのみ読み取ればよいことを意味している。たとえ（
例えば調査すべきオリゴヌクレオチドの汚染のために）
配列イオンの質量かやＮ正確性を欠いて決定され、質量
数かそれだけ太きく決定されることがあるとしても、上
記の方法は有利である。このような場合、完全な配列分
析は、より小さいｊＪｊ媚数に対して重複惟域に至るま
で又は該領域からのみの両方の読取り位置において得ら
れた結果を組み合わせろことによって決定され得る。
５’−ｐ配列イオン又は６′−Ｐ配列イオンが含有され
るか否かにかかわらず、同一組成物のすべてのフラグメ
ントが同−質量を有することは明らかである。それゆえ
、配列すのスはクトル（第１ｂ図）は両方の末端位置ジ
ヌクレオチドイオンに対し℃唯一つのピークを示す。こ
の事実にもかかわらず、その配列を決定するのに伺ら困
難性はない。
るか否かにかかわらず、同一組成物のすべてのフラグメ
ントが同−質量を有することは明らかである。それゆえ
、配列すのスはクトル（第１ｂ図）は両方の末端位置ジ
ヌクレオチドイオンに対し℃唯一つのピークを示す。こ
の事実にもかかわらず、その配列を決定するのに伺ら困
難性はない。
全体のスはクトルからみて、唯一つのピークが広い質量
範囲内に現われることは明らかである。高分子オリゴヌ
クレオチドイオンの質量及びピーク強度は、（５′末端
から読み取られる）第２装置Ｃ及び第７装置Ｇ並びに質
量６６５の単一ピークが両方のジヌクレオチドイオンを
表わしていることを明らかに立証している。
範囲内に現われることは明らかである。高分子オリゴヌ
クレオチドイオンの質量及びピーク強度は、（５′末端
から読み取られる）第２装置Ｃ及び第７装置Ｇ並びに質
量６６５の単一ピークが両方のジヌクレオチドイオンを
表わしていることを明らかに立証している。
（イ）実験的に調査されたオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの合成 基本的に、その性能が証明されているホスホトリエステ
ル法を用いる。複素環式塩基を保４するためにばンゾイ
ル基、アニソイル基及びイソブチリル基を、５’−ＯＨ
を保護するために４−メトキシ） ＩＪチル基を、並び
にリン酸基を保護スるために２−クロロフェニル基及ヒ
２，２．２− ）リプロモエチル基をそれぞれ使用する
。縮合反応は縮合剤として２，４．／Ｓ−）リイソプロ
ピルベンゼンースルホニル−６−二トロ−１，２，４−
トリアゾリドを含有する溶液中で行なった。最後に、未
保護のオリゴマーが、濃アンモニア中のピリジン（１０
％）で処理した後酢酸（８０％）で処理することによっ
て形成された。栄養手段としてのイオン交換クロマトグ
ラフィー（７ｍ尿素存在下のセファデック、ｔ、 （Ｓ
ｅ、ｐｈａｄｅｘ） Ａ −２５）およびそれに栓く脱
塩処理によって９９％以上の等質性が得られた。
チドの合成 基本的に、その性能が証明されているホスホトリエステ
ル法を用いる。複素環式塩基を保４するためにばンゾイ
ル基、アニソイル基及びイソブチリル基を、５’−ＯＨ
を保護するために４−メトキシ） ＩＪチル基を、並び
にリン酸基を保護スるために２−クロロフェニル基及ヒ
２，２．２− ）リプロモエチル基をそれぞれ使用する
。縮合反応は縮合剤として２，４．／Ｓ−）リイソプロ
ピルベンゼンースルホニル−６−二トロ−１，２，４−
トリアゾリドを含有する溶液中で行なった。最後に、未
保護のオリゴマーが、濃アンモニア中のピリジン（１０
％）で処理した後酢酸（８０％）で処理することによっ
て形成された。栄養手段としてのイオン交換クロマトグ
ラフィー（７ｍ尿素存在下のセファデック、ｔ、 （Ｓ
ｅ、ｐｈａｄｅｘ） Ａ −２５）およびそれに栓く脱
塩処理によって９９％以上の等質性が得られた。
等質性は逆相ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィ
ー）、鎖長標識存在下のｙｆｅ ＋）アクリルアミドゲ
ル電気泳動（ｌＩ）、及び二次元指紋法によって注意深
（調べられた。
ー）、鎖長標識存在下のｙｆｅ ＋）アクリルアミドゲ
ル電気泳動（ｌＩ）、及び二次元指紋法によって注意深
（調べられた。
尿素又はホルムアミ）＋１存在下のイオン交換クロマト
グラフィーに代えて、多逆相クロマトグラフィー、変性
条件下のゲル電気泳動又はこれらの方法のあり得る組合
せを使用してもよい。
グラフィーに代えて、多逆相クロマトグラフィー、変性
条件下のゲル電気泳動又はこれらの方法のあり得る組合
せを使用してもよい。
（ロ）第１ａ〜１０図のマスク２クトログラムの作成
第１α〜１Ｃ図は、グリセリンマトリックスを除いてα
＝ｄ （Ａ−Ｃ−Ｔ−０４−Ａ−Ｇ）、ｈ＝ｄ（Ｇ−Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｔ−０４−Ｃ）及びｃ ＝ ｄ（Ｇ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）の（高速原子の衝撃下
に行なわれた）マススＲクトロダラム（ＦＡＢ） の
陰イオンの適切な領域を示している。２個のマーク間の
質量差はそれぞれのヌクレオチドのしるしである。該ス
はクトルより上方の質量差は５′リン酸末端を有するフ
ラグメントイオン（５′リン酸配列イオン又は５′−Ｐ
配列イオン）に関係があり、そして該スＲクトルより下
方の質量差は６′リン酸末端を有するフラグメントイオ
ン（６′リン酸配列イオン又は５／−ｐ配列イオン）に
関係がある。最も大きい質量は（Ｍ−Ｈ）−イオンの質
量である。相当する二重に荷電したイオンはその質量の
棒のところに確認された。該スにクトルは高磁場磁石を
有するクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）ＭＳ５０Ｓ （８ＫＶ
テ約３０００ ）質を範囲） 及ヒクラトスＦＡＢ源
を用いて作成された。原子ガン（、！７ＬＬｒＬ）とし
てキセノンを使用し、８〜９ＫｔＶで中性原子のビーム
を供給した。各オリゴチオキシリボヌクレオチドのトリ
エチルアンモニウムの溶液（４〜５μｌ）で、１〜１．
５０Ｄ２６ｏに相当する含量を有する；約１０ルｍｏｔ
）をＦＡＢ銅試料支持体上のグリセリンマトリックス（
約２μｌ）に注入した。水をロック（Ｌｏｃｋ） （直
接挿入ロック）によって除去し、そのス〆クトルを３０
０秒７１０年の磁気分解速度で記録した。
＝ｄ （Ａ−Ｃ−Ｔ−０４−Ａ−Ｇ）、ｈ＝ｄ（Ｇ−Ｃ
−Ｇ−Ａ−Ｔ−０４−Ｃ）及びｃ ＝ ｄ（Ｇ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）の（高速原子の衝撃下
に行なわれた）マススＲクトロダラム（ＦＡＢ） の
陰イオンの適切な領域を示している。２個のマーク間の
質量差はそれぞれのヌクレオチドのしるしである。該ス
はクトルより上方の質量差は５′リン酸末端を有するフ
ラグメントイオン（５′リン酸配列イオン又は５′−Ｐ
配列イオン）に関係があり、そして該スＲクトルより下
方の質量差は６′リン酸末端を有するフラグメントイオ
ン（６′リン酸配列イオン又は５／−ｐ配列イオン）に
関係がある。最も大きい質量は（Ｍ−Ｈ）−イオンの質
量である。相当する二重に荷電したイオンはその質量の
棒のところに確認された。該スにクトルは高磁場磁石を
有するクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）ＭＳ５０Ｓ （８ＫＶ
テ約３０００ ）質を範囲） 及ヒクラトスＦＡＢ源
を用いて作成された。原子ガン（、！７ＬＬｒＬ）とし
てキセノンを使用し、８〜９ＫｔＶで中性原子のビーム
を供給した。各オリゴチオキシリボヌクレオチドのトリ
エチルアンモニウムの溶液（４〜５μｌ）で、１〜１．
５０Ｄ２６ｏに相当する含量を有する；約１０ルｍｏｔ
）をＦＡＢ銅試料支持体上のグリセリンマトリックス（
約２μｌ）に注入した。水をロック（Ｌｏｃｋ） （直
接挿入ロック）によって除去し、そのス〆クトルを３０
０秒７１０年の磁気分解速度で記録した。
オリゴリボヌクレオチドの配列分析のための本発明によ
る方法は第６表及び第６〜５図に明らかにされている。
る方法は第６表及び第６〜５図に明らかにされている。
１、 オリゴリボヌクレオチドのトリエチルアンモニウ
ム塩は相半するオリゴチオキシリボヌクレオチド（例：
ｒＡ ６＋ ｒＡ ｓ ） に類似した質量ピーク
を与える。
ム塩は相半するオリゴチオキシリボヌクレオチド（例：
ｒＡ ６＋ ｒＡ ｓ ） に類似した質量ピーク
を与える。
２、混合塩基リポ−６量体及び４箪体の分析によって、
異なる型のイオンと同様に型は異なるが、同じ数のヌク
レオチド単位を有するオリゴリボヌクレオチドの場合に
も、それらのピーク強度によって規則的にはっきり認め
ることができる（例： ｄ（Ｇ−Ａ−Ｔ）及びｒ （Ｇ
−Ａ−Ｕ ） ）。
異なる型のイオンと同様に型は異なるが、同じ数のヌク
レオチド単位を有するオリゴリボヌクレオチドの場合に
も、それらのピーク強度によって規則的にはっきり認め
ることができる（例： ｄ（Ｇ−Ａ−Ｔ）及びｒ （Ｇ
−Ａ−Ｕ ） ）。
なお、オリゴリボヌクレオチドは通常ヌクレオチドチミ
ジンα）の代りにヌクレオチドウリジン（Ｕ）を含有し
ていることを記憶して載きたい（第３図及び第６図参照
）。
ジンα）の代りにヌクレオチドウリジン（Ｕ）を含有し
ていることを記憶して載きたい（第３図及び第６図参照
）。
本発明の方法はま−た化学的に修飾されたオリゴマーに
もほぼ同様に適用することができる。リン酸電荷は調査
すべき材料中に存在するにちがいない（第４表及び第５
表参照）か、又はそのような電荷は測定条件下に生じる
ことができるにちがいない。後者は還元的に分離され得
るリン酸保護基（例ニトリブロモメチル又はシアノエチ
ル保護基）の場合である。
もほぼ同様に適用することができる。リン酸電荷は調査
すべき材料中に存在するにちがいない（第４表及び第５
表参照）か、又はそのような電荷は測定条件下に生じる
ことができるにちがいない。後者は還元的に分離され得
るリン酸保護基（例ニトリブロモメチル又はシアノエチ
ル保護基）の場合である。
第５表５’−（ＭＭＴＲ）−オリゴデオキシリボヌクレ
オｆ）”（ＭＭＴＲ−モノメトキシトリチル）の配列イ
オン 本発明による方法のこのような多様性の特に重要な意義
は、オリゴヌクレオチド合成のための中間段階の正体を
詳細に調査する可能性にある。今日、はとんど部分的に
保護されたモノヌクレオチド及びジヌクレオチドがオリ
ゴヌクレオチド合成に用いられている。今まで、稜者は
マススペクトロメトリーによる配列分析に付することか
できなかった。本発明による方法の結果は第４表に要約
されている。特徴的な一群のピークはジヌクレオチドに
対する明確な配列情報の提供を可能にする。
オｆ）”（ＭＭＴＲ−モノメトキシトリチル）の配列イ
オン 本発明による方法のこのような多様性の特に重要な意義
は、オリゴヌクレオチド合成のための中間段階の正体を
詳細に調査する可能性にある。今日、はとんど部分的に
保護されたモノヌクレオチド及びジヌクレオチドがオリ
ゴヌクレオチド合成に用いられている。今まで、稜者は
マススペクトロメトリーによる配列分析に付することか
できなかった。本発明による方法の結果は第４表に要約
されている。特徴的な一群のピークはジヌクレオチドに
対する明確な配列情報の提供を可能にする。
なお、上に番号で示した参照文献の文献名は次のとおり
である。
である。
文献名
１、 Ｂｅｒｌｉｎ、 Ｙ、Ａ、、 Ｇｈａｋｈｍａ
ｋｈｃｈｅｖａ、 Ｏ，Ｃｒ、。
ｋｈｃｈｅｖａ、 Ｏ，Ｃｒ、。
Ｅｆｉｍｏｖ、 Ｖ、Ａ、、 Ｋｏｌｏ９ｏｖ、 Ｍ、
Ｎ、 ＆ Ｋｏｒｏｂｋｏ。
Ｎ、 ＆ Ｋｏｒｏｂｋｏ。
Ｙ、Ｇ、、 ＴｇｔｒａｈｔｄｒｏｒＬ Ｌｅｔｔ、
１９７ろ、 １ろ５６１３５４ ２、 Ｌｅｔｚｉｎ４μ？−、Ｒ，Ｌｌ、、 Ｆｊｎ
ｒＬｃＬｎ、 Ｊ、Ｌ、。
１９７ろ、 １ろ５６１３５４ ２、 Ｌｅｔｚｉｎ４μ？−、Ｒ，Ｌｌ、、 Ｆｊｎ
ｒＬｃＬｎ、 Ｊ、Ｌ、。
Ｈｔａｖｎｅｒ、 Ｇ、Ａ、 ＆ Ｌｕ、ｎ５ｆｏｒｃ
Ｌ、 Ｗ、Ｂ、、 Ｊ。
Ｌ、 Ｗ、Ｂ、、 Ｊ。
Ａ７７Ｌ、 Ｇｈｔｒｎ、Ｅ３ｏｃ、 ９７．３２７８
−３２７９（１９７５） ろ、 Ｒｔｅｓｅ、 Ｇ、Ｂ、、 Ｔｉｔｍａ
ｅ、 Ｒ，Ｇ、 ＆ Ｙａｕ、 Ｌ、。
−３２７９（１９７５） ろ、 Ｒｔｅｓｅ、 Ｇ、Ｂ、、 Ｔｉｔｍａ
ｅ、 Ｒ，Ｇ、 ＆ Ｙａｕ、 Ｌ、。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、１９７８．２７２
７−７３０ ４、 Ｋｏｈｌｉ、 Ｖ、、 Ｂ１１ｙ゛ｃｋｅｒ、
Ｈ，＆ Ｋ１５ｔｔｒ、 Ｈ，。
７−７３０ ４、 Ｋｏｈｌｉ、 Ｖ、、 Ｂ１１ｙ゛ｃｋｅｒ、
Ｈ，＆ Ｋ１５ｔｔｒ、 Ｈ，。
Ｔｔｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｔｔｔ、 ２１．２６８３
−２６８６（１９８０） ５、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、 Ｍ、Ｄ、 ＆ Ｇａｒ
ｔｂｔｈｅｒＳ、 Ｍ、Ｈ，。
−２６８６（１９８０） ５、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、 Ｍ、Ｄ、 ＆ Ｇａｒ
ｔｂｔｈｅｒＳ、 Ｍ、Ｈ，。
Ｔｅｔｒａｌｔｄｒｏｎ Ｌｌｌｌ！ｔ、 １９８０１
７１９−７２２６、 Ｄｔｔｃｋｗｏｒｔｈ、 Ｍ、
Ｌ、、 Ｃｒａｉｔ、 Ｍ、Ｊ、、 Ｃｒｏｅｔｅｔ。
７１９−７２２６、 Ｄｔｔｃｋｗｏｒｔｈ、 Ｍ、
Ｌ、、 Ｃｒａｉｔ、 Ｍ、Ｊ、、 Ｃｒｏｅｔｅｔ。
Ｐ、、Ｈｏｎｇ、Ｇ、Ｆ、、Ｓｉｎｇｈ、Ｍ、＆ Ｔｉ
ｔｍａｓ。
ｔｍａｓ。
Ｒ，Ｇ、、Ｎｗｃｌ、Ａｃ１ｃＬｓ Ｒｅｓ、９．１６
９１−１７０６（１９８１） ７、 Ｉｔｏ、 Ｈ，、Ｉｋｇ、 Ｙ、、 Ｘｌｗ
ｔａ、 Ｓ、 ＆ Ｉｔａｋｗｒａ。
９１−１７０６（１９８１） ７、 Ｉｔｏ、 Ｈ，、Ｉｋｇ、 Ｙ、、 Ｘｌｗ
ｔａ、 Ｓ、 ＆ Ｉｔａｋｗｒａ。
Ｋ、、Ｎｗｃｌ、ｋｃｉｄｔ Ｒｅｓ、１０．１７５５
−１７６９（１９８２） ３、 Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、＆Ｃｒ１Ｌｄｔｒｔ、Ｗ、
、Ｐｒｏｃ。
−１７６９（１９８２） ３、 Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、＆Ｃｒ１Ｌｄｔｒｔ、Ｗ、
、Ｐｒｏｃ。
ｎａｔｎ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４，５６
０−５６４（１９７７） ９、 ＢｒｏｗｎＬｅｔ、 Ｇ、Ｇ、 ＆ ＳＯＬｎ
ｇｅｒ、 Ｆ、、 Ｅｕｒ、Ｊ。
０−５６４（１９７７） ９、 ＢｒｏｗｎＬｅｔ、 Ｇ、Ｇ、 ＆ ＳＯＬｎ
ｇｅｒ、 Ｆ、、 Ｅｕｒ、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｇｍ、 １１．３９５−３９９ （１９６
９）１０、 Ｂａｒｂｅｒ、 Ｍ、、 ＢｏｒｔＬｏ
Ｌｉ、 Ｒ，Ｓ、、 Ｅ３ｅｔｉｙｗｉｃｋ。
９）１０、 Ｂａｒｂｅｒ、 Ｍ、、 ＢｏｒｔＬｏ
Ｌｉ、 Ｒ，Ｓ、、 Ｅ３ｅｔｉｙｗｉｃｋ。
Ｒ，Ｄ、＆ Ｔｙｌｅｒ、Ａ、Ｎ、、ネイチャー ２９
６゜２７０−２７５（１９８１） １１、 Ｆｒａｎｋ、 Ｒ，＆ Ｋ６ｚｔｇｒ、 Ｈ
，、ＮａＣＺ、 Ａｃ１ｄｓＲｔｔ、６．２０６９−２
０８７（１９７９）１２、ＭｃＮｔａＬ、 Ｃ，Ｊ、、
０ｇ１ｌｖｉｔ、 Ｋ、に、、 Ｔｈｔｒｉ −ａｔ
ＬＬｔ、 Ｎ、Ｙ、 ＆ Ｎｔｍｔｒ、 Ｍ、Ｊ、、
Ｊ、Ａｍ。
６゜２７０−２７５（１９８１） １１、 Ｆｒａｎｋ、 Ｒ，＆ Ｋ６ｚｔｇｒ、 Ｈ
，、ＮａＣＺ、 Ａｃ１ｄｓＲｔｔ、６．２０６９−２
０８７（１９７９）１２、ＭｃＮｔａＬ、 Ｃ，Ｊ、、
０ｇ１ｌｖｉｔ、 Ｋ、に、、 Ｔｈｔｒｉ −ａｔ
ＬＬｔ、 Ｎ、Ｙ、 ＆ Ｎｔｍｔｒ、 Ｍ、Ｊ、、
Ｊ、Ａｍ。
Ｃ五ａｍ、５ｏｃ−１０４，９７６−９８０（１９８２
）１３、Ｍｏｒｒｉｓ、 Ｒ，Ｍ、、 ＤｇＺＬ、 Ａ
、 ＆ ｋＡｃＤｏｗｇＬｌ。
）１３、Ｍｏｒｒｉｓ、 Ｒ，Ｍ、、 ＤｇＺＬ、 Ａ
、 ＆ ｋＡｃＤｏｗｇＬｌ。
Ｒ，Ａ、、バイオメディカル、マススペクトロメトリ−
８，４６３−４７６（１９８１）
８，４６３−４７６（１９８１）
第１α図はオリゴチオキシリボヌクレオチドαの陰イオ
ンＦＡＢマススはクトル、第１ｂ図はオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドｂの陰イオンＦ’ＡＢマススはクトル、
第１Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチｈｅ Ｃの陰
イオンＦＡＢマススＲクトル、第２α図はオリゴデオキ
シリボヌクレオチドαの単純化した配列構造、第２ｂ図
はオリゴデオキシリボヌクレオチドｂの単純化した配列
構造、第２Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド″Ｃ
の単純化した配列構造、第６図はりボヌクレオチ）”ｅ
ＡＵノ陰イオンＦＡＢマススはクトル及び配列構造、第
４図はりボヌクレオチドＡＡＡＡＡＡ の陰イオンＦ
ＡＢマススシクトル及び配列構造、第５図はりボヌクレ
オチト”ＡＡＡＡＡＡＡＡの陰イオンＦＡＢマススはク
トル及び配列構造、第６図はチオキシリボヌクレオチド
ＧＡＴの陰イオンＦＡＢマススペクトル及び配列構造を
それぞれ示す。 第１頁の続き 優先権主張 ３２１９８３年４月ｎ５３３西ドイツ（Ｄ
Ｅ）、３↓Ｐ ３３］、２９２９．０手続補正書（方剤 昭和５８年８月７２日 特許庁長官殿 （特許庁審査官 殿）１ 事件
の表示 昭和５８年特許願第 ０９５８７７ 号３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 昭和 年 月 日（発送口 昭和 年 月
日）６ 補正により増加する発明の数二〇 ７ 補正の対象
ンＦＡＢマススはクトル、第１ｂ図はオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドｂの陰イオンＦ’ＡＢマススはクトル、
第１Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチｈｅ Ｃの陰
イオンＦＡＢマススＲクトル、第２α図はオリゴデオキ
シリボヌクレオチドαの単純化した配列構造、第２ｂ図
はオリゴデオキシリボヌクレオチドｂの単純化した配列
構造、第２Ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド″Ｃ
の単純化した配列構造、第６図はりボヌクレオチ）”ｅ
ＡＵノ陰イオンＦＡＢマススはクトル及び配列構造、第
４図はりボヌクレオチドＡＡＡＡＡＡ の陰イオンＦ
ＡＢマススシクトル及び配列構造、第５図はりボヌクレ
オチト”ＡＡＡＡＡＡＡＡの陰イオンＦＡＢマススはク
トル及び配列構造、第６図はチオキシリボヌクレオチド
ＧＡＴの陰イオンＦＡＢマススペクトル及び配列構造を
それぞれ示す。 第１頁の続き 優先権主張 ３２１９８３年４月ｎ５３３西ドイツ（Ｄ
Ｅ）、３↓Ｐ ３３］、２９２９．０手続補正書（方剤 昭和５８年８月７２日 特許庁長官殿 （特許庁審査官 殿）１ 事件
の表示 昭和５８年特許願第 ０９５８７７ 号３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 昭和 年 月 日（発送口 昭和 年 月
日）６ 補正により増加する発明の数二〇 ７ 補正の対象
Claims (2)
- （１）（α）任意に修飾されたヌクレオチドをマススは
クトロメトリーに付すること、但し前記の任意に修飾さ
れたヌクレオチドま測定条件下で少なくとも１個のリン
酸イオン基（リン酸電荷）を有するヌクレオチド又はそ
のようなリン酸基を供給するヌクレオチドであること、 （ｈ） 陰イオンを記録すること、 （Ｃ１）質量差を重量に関して互いに続いている５’−
ｐイオンの間で測定すること及び（又は）（Ｃ２）質量
差を重量に関して互いに続いている６′−Ｐイオンの間
で測定すること、 （ｄ） 連続する質量差を該塩基と関連させて決定す
ること、 を特徴とする任意に修飾されたオリゴヌクレオチド又は
オリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析方法。 - （２）該ヌクレオチド９をＦＡＢマスス啄クトりメトリ
ーに付することを特徴とする前項（１）記載の方法。 Ｃ３）９５％、好ましくは９７％、特に９９％の等質性
を有するヌクレオチドを使用することを特徴とする前Ｊ
ｉｍ又は（２）記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE32207336 | 1982-06-02 | ||
| DE3220733 | 1982-06-02 | ||
| DE3312929.0 | 1983-04-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5926064A true JPS5926064A (ja) | 1984-02-10 |
| JPH0334586B2 JPH0334586B2 (ja) | 1991-05-23 |
Family
ID=6165080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9587783A Granted JPS5926064A (ja) | 1982-06-02 | 1983-06-01 | 任意に修飾されたオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5926064A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984003512A1 (en) * | 1983-03-02 | 1984-09-13 | Mitsui Toatsu Chemicals | Process and apparatus for scission treatment of deoxyribonucleic acid |
| JPH03502641A (ja) * | 1988-05-24 | 1991-06-20 | ゲゼルシャフト フュア バイオテクノロギッシェ フォーシュング エムベーハー（ゲーベーエフ） | オリゴヌクレオチドバンクを用いるｄｎａ塩基配列の決定法 |
| JP2005114515A (ja) * | 2003-10-07 | 2005-04-28 | Canon Inc | 質量分析可能な原子群を構成単位とする鎖状構造を有する分子に対して付加情報を付与して、情報記録コードとして利用する方法 |
-
1983
- 1983-06-01 JP JP9587783A patent/JPS5926064A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984003512A1 (en) * | 1983-03-02 | 1984-09-13 | Mitsui Toatsu Chemicals | Process and apparatus for scission treatment of deoxyribonucleic acid |
| JPH03502641A (ja) * | 1988-05-24 | 1991-06-20 | ゲゼルシャフト フュア バイオテクノロギッシェ フォーシュング エムベーハー（ゲーベーエフ） | オリゴヌクレオチドバンクを用いるｄｎａ塩基配列の決定法 |
| JP2005114515A (ja) * | 2003-10-07 | 2005-04-28 | Canon Inc | 質量分析可能な原子群を構成単位とする鎖状構造を有する分子に対して付加情報を付与して、情報記録コードとして利用する方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0334586B2 (ja) | 1991-05-23 |
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