JPH0334586B2

JPH0334586B2 -

Info

Publication number: JPH0334586B2
Application number: JP9587783A
Authority: JP
Inventors: Burotsukeru Herumuuto; Furanku Ronarudo; Gurootoyaan Rutsutsu
Original assignee: BIOTEKUNOROGITSUSHE FUORUSHUNKU MBH G
Current assignee: BIOTEKUNOROGITSUSHE FUORUSHUNKU MBH G
Priority date: 1982-06-02
Filing date: 1983-06-01
Publication date: 1991-05-23
Also published as: JPS5926064A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はマススペクトロメトリーによる任意に
修飾されたオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデ
オキシリボヌクレオチドの配列分析方法に関す
る。合成オリゴヌクレオチドは現代の生命科学にお
いてますます重要になりつつある。特に、予め決
定されたヌクレオチド配列の化学合成は遺伝子工
学の発展を促進してきた。その結果、新規かつ迅
速な合成方法の発展が促進されてきた。例えば、
改良された連鎖方法（１，２）、高度に選択的な、
かつ温和な脱保護剤（３，４）の発展、及び適当
な固体支持体（５，６，７）の使用等である。こ
のような合成は今や数日の中に実施することがで
きる。したがつて、該作業の大部分は脱保護され
たオリゴヌクレオチドの注意深い分析に費やされ
る。配列分析は通常、化学的分解方法(8)又は放射
性標識によるワンダリング−スポツト
（wandering−spot）法(9)によつて行なわれる。十分に保護されたオリゴヌクレオチドのため
に、比較的複雑な分断反応が陰イオン²⁵²cfプラ
ズマ脱着マススペクトロメトリーに基づいて報告
された(12)。マツクニール（McNeal）らはさらに
次のように述べている。すなわち、自然に生じる
ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有するオ
リゴヌクレオチドはもつとさらに複雑な分断反応
を示し、そして分子イオンの収率は非常に減少す
ると(12)。このような先行技術にかんがみて、本発明によ
り任意に修飾されたオリゴヌクレオチド又はオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの配列分析を簡単な
方法でマススペクトロメトリーによつて行なうこ
とができることは驚くべきことである。この目的のために、本発明によれば、 (a) 任意に修飾されたヌクレオチドをマススペク
トロメトリーに付すること、但し前記の任意に
修飾されたヌクレオチドは測定条件下で少なく
とも１個のリン酸イオン基（リン酸電荷）を有
するヌクレオチド又はそのようなリン酸基を供
給するヌクレオチドであること、 (b) 陰イオンを記録すること、 (c₁) 質量差を重量に関して互いに続いている
5′−Ｐ−イオンの間で測定すること及び／又
は (c₂) 質量差を重量に関して互いに続いている
3′−Ｐ−イオンの間で測定すること、 (d) 連続する質量差を該塩基と関連させて決定す
ること、を特徴とする任意に修飾されたオリゴリボヌクレ
オチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配
列分析方法が提案される。適用可能なマススペクトロメトリー法の例は、
FABマススペクトロメトリー及びSIMSマススペ
クトロメトリー又はこれらの方法の組合せであ
る。FABマススペクトロメトリーに関しては例
えばバーバー（Barbcr）ら(10)並びにモーリス
（Morris）ら（13）が注目される。FABマススペ
クトロメトリーの本質的な特徴は、マトリツクス
上に単層の形で存在する被検材料を中性荷電粒
子、例えば5KV又はそれ以上の電場内で不活性
ガスで衝撃することである。本発明による方法はこうして未保護又は脱保護
されたオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキ
シリボヌクレオチドに適用される。分析すべきヌ
クレオチドの塩基数の上限は方法原理自体によつ
ては制限されるものではないが、しかし実際には
使用されるマススペクトログラフの分解能によつ
てある限界点を定めることができる。配列すべき材料の等質性に対する望ましい値は
95％、より好ましくは97％、特に99％である。し
かしながら、適当なレベルの等質性を決定するこ
とは当業者にゆだねられており、かつ当業者なら
ば適宜選択して決定することができる。場合しだ
いで異なる等質性が望ましいことがわかるかも知
れない。なぜなら、若干の不純物、例えばトリチ
ル基のような親油基を有するヌクレオチド材料は
スペクトル中で過大に表わされ得るからである。以下に本発明を添付の図面と共に詳細に説明す
る。第１ａ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド
ａ、すなわちｄ（Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｇ）（ｄ＝デオキシ）の陰イオンFABマススペク
トルを示し、第１ｂ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド
ｂ、すなわちｄ（Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ）の陰イオンFABマススペクトルを示し、第１ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド
ｃ、すなわちｄ（Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−
Ｔ−Ｔ−Ｃ）の陰イオンFABマススペクトルを
示し、第２ａ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドａ
の単純化した配列構造を示し、第２ｂ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドｂ
の単純化した配列構造を示し、第２ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドｃ
の単純化した配列構造を示す。第２ａ〜２ｃ図の単純化した配列構造におい
て、その切断によつて必須のフラグメントイオ
ンをもたらす結合は断続線で示されており、その
切断点において前記フラグメントイオンの質量
が示されており、断続線上の頂部に示された質量
は5′−Ｐ配列イオンに相当し、また断続線上の底
部に示された質量は3′−Ｐ配列イオンに相当す
る。純粋なオリゴヌクレオチドを本発明による方法
に使用した場合、実際には特異的5′−Ｐ配列イオ
ン及び3′−Ｐ配列イオンのみが得られる（第１ａ
〜１ｃ図参照）。このような特異的配列イオンの
特有の形成は、同じ型の連続する配列イオン間の
質量差を決定することによつて、迅速な配列分析
を簡単に可能にする。これらの二つの型の配列イ
オン間の識別は可能である。なぜなら、異なる型
の、しかし同一のヌクレオチド単位数を有するイ
オンはそれらのピーク強度によつて規則的にはつ
きり認めることができるからである。3′−Ｏ原子
を有する結合（これは砂糖部分の第２級炭素原子
に結合している）は5′−Ｏ原子を有する結合（こ
れは砂糖部分の第１級炭素原子に結合している。）
よりも不安定であるので、5′−Ｐ配列イオンは相
当する3′−Ｐ配列イオンよりも例外なくより強く
現われる。ヌクレオチド配列を決定するには、以下の方法
を採用する。（Ｍ−Ｈ）^-ピーク（Ｍ−Ｈ）^-＝分子マイナス陽
子）から出発して、全ての配列イオンを5′−Ｐイ
オンとして又は3′−Ｐイオンとしてのそれらの強
度に従つて分類する。第１ａ図及び第２ａ図に対
して次の結果が得られる。第１表5′−Ｐ配列イオン 3′−Ｐ配列イオン 2407／（Ｍ−Ｈ）^-イオン 2174 2158 1885 1854 1581 1541 1292 1212 963 923 650 619 346 330 次いで、同一の配列イオン型の隣設ピーク間の
正確な質量差を決定する。次の表において、それ
ぞれのヌクレオチドは確認された質量差と結びつ
けることができる。

【表】第２ａ〜２ｃ図から明らかなように、5′−Ｐ配
列イオン及び3′−Ｐ配列イオンに関して、5′末端
（図の左側）と3′末端（図の右側）との間の識別
（これはそれぞれのオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの反対側の末端と関連している）をすること
ができる。したがつて、本発明による方法に付さ
れたオリゴヌクレオチドの完全な塩基配列は、そ
の5′−末端又はその3′末端から出発することによ
つて、２回読み取ることができる。２つの異なる位置におけるオリゴヌクレオチド
の塩基配列を読み取ることのこのような可能性
は、各読取り位置において完全に塩基配列を読み
取ることが絶対に必要である訳ではなく、むしろ
重複領域に至るまで又は該領域からのみ読み取れ
ばよいことを意味している。たとえ（例えば調査
すべきオリゴヌクレオチドの汚染のために）配列
イオンの質量がやゝ正確性を欠いて決定され、質
量数がそれだけ大きく決定されることがあるとし
ても、上記の方法は有利である。このような場
合、完全な配列分析は、より小さい質量数に対し
て重複領域に至るまで又は該領域からのみの両方
の読取り位置において得られた結果を組み合わせ
ることによつて決定され得る。 5′−Ｐ配列イオン又は3′−Ｐ配列イオンが含有
されるか否かにかかわらず、同一組成物のすべて
のフラグメントが同一質量を有することは明らか
である。それゆえ、配列ｂのスペクトル（第１ｂ
図）は両方の末端位置ジヌクレオチドイオンに対
して唯一つのピークを示す。この事実にもかかわ
らず、その配列を決定するのに何ら困難性はな
い。全体のスペクトルからみて、唯一つのピーク
が広い質量範囲内に現われることは明らかであ
る。高分子オリゴヌクレオチドイオンの質量及び
ピーク強度は、（5′末端からから読み取れる）第
２位置Ｃ及び第７位置Ｇ並びに質量635の単一ピ
ークが両方のジヌクレオチドイオンを表わしてい
ることを明らかに立証している。 (イ) 実験的に調査されたオリゴデオキシリボヌク
レオチドの合成基本的に、その性能が証明されているホスホ
トリエステル法を用いる。複素環式塩基を保護
するために、ベンゾイル基、アニソイル基及び
イソブチリル基を、5′−OHを保護するために
４−メトキシトリチル基を、並びにリン酸基を
保護するために２−クロロフエニル基及び２，
２，２−トリブロモエチル基をそれぞれ使用す
る。縮合反応は縮合剤として２，４，６−トリ
イソプロピルベンゼン−スルホニル−３−ニト
ロ−１，２，４−トリアゾリドを含有する溶液
中で行なつた。最後に、未保護のオリゴマー
が、濃アンモニア中のピリジン（10％）で処理
した後酢酸（80％）で処理することによつて形
成された。栄養手段としてのイオン交換クロマ
トグラフイー（7m尿素存在下のセフアデツク
ス（Sephadex）Ａ−25）およびそれに続く脱
塩処理によつて99％以上の等質性が得られた。
等質性は逆相HPLC（逆相高圧液体クロマトグ
ラフイー）、鎖長標識存在下のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(11)、及び二次元指紋法によつ
て注意深く調べられた。尿素又はホルムアミド存在下のイオン交換ク
ロマトグラフイーに代えて、多逆相クロマトグ
ラフイー、変性条件下のゲル電気泳動又はこれ
らの方法のあり得る組合せを使用してもよい。 (ロ) 第１ａ〜１ｃ図のマススペクトログラムの作
成第１ａ〜１ｃ図は、グリセリンマトリツクス
を除いてａ＝ｄ（Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−
Ｇ）、ｂ＝ｄ（Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ）及びｃ＝ｄ（Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ）の（高速原子の衝撃下に行なわ
れた）マススペクトログラム（FAB）の陰イ
オンの適切な領域を示している。２個のマーク
間の質量差はそれぞれのヌクレオチドのしるし
である。該スペクトルより上方の質量差は5′リ
ン酸末端を有するフラグメントイオン（5′リン
酸配列イオン又は5′−Ｐ配列イオン）に関係が
あり、そして該スペクトルより下方の質量差は
3′リン酸末端を有するフラグメントイオン
（3′リン酸配列イオン又は3′−Ｐ配列イオン）
に関係がある。最も大きい質量は（Ｍ−Ｈ）^-イ
オンの質量である。相当する二重に荷電したイ
オンはその質量の1/2のところに確認された。
該スペクトルは高磁場磁石を有するクラトス
（Kratos）MS50S（8KVで約3000の質量範囲）
及びクラトスFAB源を用いて作成された。原
子ガン（gun）としてキセノンを使用し、８〜
9KeVで中性原子のビームを供給した。各オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドのトリエチルアン
モニウムの溶液（４〜5μ）で、１〜1.5oD₂₆₀
に相当する含量を有する；約10n mol）を
FAB銅試料支持体上のグリセリンマトリツク
ス（約2μ）に注入した。水をロツク（lock）
（直接挿入ロツク）によつて除去し、そのスペ
クトルを300秒／10年の磁気分解速度で記録し
た。オリゴリボヌクレオチドの配列分析のための本
発明による方法は第３表及び第３〜５図に明らか
にされている。

【表】１オリゴリボヌクレオチドのトリエチルアンモ
ニウム塩は相当するオリゴデオキシリボヌクレ
オチド（例：rA₆，rA₈）に類似した質量ピー
クを与える。２混合塩基リボ−３量体及び４量体の分析によ
つて、異なる型のイオンと同様に型は異なる
が、同じ数のヌクレオチド単位を有するオリゴ
リボヌクレオチドの場合にも、それらのピーク
強度によつて規則的にはつきり認めることがで
きる（例：ｄ（Ｇ−Ａ−Ｔ）及びｒ−（Ｇ−Ａ−
Ｕ））。なお、オリゴリボヌクレオチドは通常ヌ
クレオチドチミジン（Ｔ）の代りにヌクレオチ
ドウリジン（Ｕ）を含有していることを記憶し
て載きたい（第３図及び第６図参照）。本発明の方法はまた化学的に修飾されたオリゴ
マーにもほぼ同様に適用することができる。リン
酸電荷は調査すべき材料中に存在するにちがいな
い（第４表及び第５表参照）か、又はそのような
電荷は測定条件下に生じることができるにちがい
ない。後者は還元的に分離され得るリン酸保護基
（例：トリブロモメチル又はシアノエチル保護基）
の場合である。

【表】

【表】本発明による方法のこのような多様性の特に重
要な意義は、オリゴヌクレオチド合成のための中
間段階の正体を詳細に調査する可能性にある。今
日、ほとんど部分的に保護されたモノヌクレオチ
ド及びジヌクレオチドがオリゴヌクレオチド合成
に用いられている。今まで、後者はマススペクト
ロメトリーによる配列分析に付することができな
かつた。本発明による方法の結果は第４表に要約
されている。特徴的な一群のピークはジヌクレオ
チドに対する明確な配列情報の提供を可能にす
る。なお、上に番号で示した参照文献の文献名は次
のとおりである。文献名１ Berlin，Y.A.，Chakhmakhcheva，O.G.，
Efimov，V.A.，Kolosov，M.N.＆Korobko，
Y.G.，Tetrahedron Lett.1973，1353−1354 ２ Letsinger，R.L.，Finnan，J.L.，Heavner，
G.A.＆Lunsford，W.B.，J.Am.Chem.Soc.97，
3278−3279（1975）３ Reese，Ｃ，B.，Titmas，R.C.＆Yau，L.，
Tetrahedron Lett.1978，2727−2730 ４ Kohli，V.，Blo¨cker，H.＆Ko¨ster，H.，
Tetrahedron Lett.21，2683−2686（1980）５ Matteucci，M.D.＆Caruthers，M.H.
Tetrahedron Lett.1980，719−722 ６ Duckworth，M.L.，Gait，M.J.，Goelet，
P.，Hong，G.F.，Singh，M.＆Titmas，R.
C.，Nucl.Acids Res.９，1691−1706（1981）７ Ito，H.，Ike，Y.，Ikuta，S.＆Itakura，
K.，Nucl.Acids Res.10，1755−1769（1982）８ Maxam，A.M.＆Gildert，W.，Proc.natn.
Acad.Sci.U.S.A.74，560−564（1977）９ Brownlee，G.G.＆Sanger，F.，Eur.J.
Biochem.11，395−399（1969） 10 Barber，M.，Bordoli，R.S.，Sedgwick，
R.D.＆Tyler，A.N.，ネイチヤー293，270−
275（1981） 11 Frank，R.＆Ko¨ster，H.，Nucl.Acids Res.
６，2069−2087（1979） 12 McNeal，C.J.，Ogilvie，K.K.，Theriault，
N.Y.＆Nemer，M.J.，J.Am.Chem.Soc.104，
976−980（1982） 13 Morris，R.M.，Dell，A.＆McDowell，R.
A.，バイオメデイカル．マススペクトロメト
リー８，463−473（1981）

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はオリゴデオキシリボヌクレオチドａ
の陰イオンFABマススペクトル、第１ｂ図はオ
リゴデオキシリボヌクレオチドｂの陰イオン
FABマススペクトル、第１ｃ図はオリゴデオキ
シリボヌクレオチドｃの陰イオンFABマススペ
クトル、第２ａ図はオリゴデオキシリボヌクレオ
チドａの単純化した配列構造、第２ｂ図はオリゴ
デオキシリボヌクレオチドｂの単純化した配列構
造、第２ｃ図はオリゴデオキシリボヌクレオチド
ｃの単純化した配列構造、第３図はリボヌクレオ
チドGAUの陰イオンFABマススペクトル及び配
列構造、第４図はリボヌクレオチドAAAAAAの
陰イオンFABマススペクトル及び配列構造、第
５図はリボヌクレオチドAAAAAAAAの陰イオ
ンFABマススペクトル及び配列構造、第６図は
デオキシリボヌクレオチドGATの陰イオンFAB
マススペクトル及び配列構造をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a) 任意に修飾されたヌクレオチドをマスス
ペクトロメトリーに付すること、但し前記の任
意に修飾されたヌクレオチドは測定条件下で少
なくとも１個のリン酸イオン基（リン酸電荷）
を有するヌクレオチド又はそのようなリン酸基
を供給するヌクレオチドであること、 (b) 陰イオンを記録すること、 (c₁) 質量差を重量に関して互いに続いている
5′−Ｐイオンの間で測定すること及び／又は (c₂) 質量差を重量に関して互いに続いている
3′−Ｐイオンの間で測定すること、 (d) 連続する質量差を該塩基と関連させて決定す
ること、を特徴とする任意に修飾されたオリゴヌクレオチ
ド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドの配列分
析方法。２該ヌクレオチドをFABマススペクトロメト
リーに付することを特徴とする前項１記載の方
法。３ 95％、好ましくは97％、特に99％の等質性を
有するヌクレオチドを使用することを特徴とする
前項１又は２記載の方法。