JPH0343076A - 細胞培養担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞培養担体に関するものであり、特に動物
細胞を培養する際に使用される担体に関するものである
。詳しくは、動物細胞を本培養担体に付着させ、静置状
態、懸濁状態等で高密度培養するのに好適な細胞培養担
体に関するものである。

（従来の技術） 近年、動物細胞を培養するために種々の培養方法が開発
され、急速に発展しているが、その一つに培養担体な用
いるマイクロキャリア法がある。

現在、知られているマイクロキャリアの多くは、正に荷
電し得る化学的残基のみを導入したアニオン交換型のマ
イクロキャリアであり、列ア えば、サイトデヅクスー／（ファム９フ１社Ｍ）、スー
パーピーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ社製）、ドーマセル（
Ｐｆｅｉｆｅｒ＆Ｌａｎｇｅｎ社製）、ＤＥ−！、２、
ＤＥ−ｓ、ｙ（ワットマン社Ｍ）、ＭＣ−シリーズ（Ｗ
ａ　ｉ　ｔ　ａｌｃ　ｉ社製）等のマイクロキャリアは
、セファデックス、セルロース等のポリマー担体にジエ
チルアミノエチル基を化学結合させたものである。

また特開昭６．７−７／／り３号、特開昭６３−２２＆
２ｇ２号、特開昭６ダ一／θ９７９号において、（メタ
）アクリル酸エステルを構成単位とする水不溶性の重合
体粒子に正に荷電し得る化学的残基を導入して成るマイ
クロキャリアが記載されているをその他、ポリアクリル
アミドゲルにジエチルアミノエチル基を化学結合させた
バイオキャリア（バイオラド社製）も知られている。一
方、逆に、ポリスチレン表面に放電処理を施し、負電荷
を導入したバイオシロン（ヌンク社製）やサイトスフェ
ア（Ｌｕｘ社３８り等も知られている。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来の培養担体は、細胞の付着性や増殖
性が充分なものではなく、長期間の培養によっても細胞
が剥離しやすいという欠点を有していた。従って、細胞
の付着性や増殖性が良好で、長期培養においても剥離し
にくく、しかも容易に高密度培養が達成できる培養担体
が求められていた。

本発明の目的は、動物細胞とりわけ付着依存性動物細胞
を高密度かつ大量に培養できる細胞培養担体を提供しよ
うとするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の問題に鑑み鋭意検討を行った結果
、細胞剥離の原因は、担体が正電荷のみ又は負電荷のみ
を有することにあり、正に荷電し得る化学的残基と、更
に、負に荷電し得る化学的残基とを担体表面に併用する
ことにより細胞の付着性及び増殖性が向上するばかりで
はなく、特に長期培養においても細胞が剥離しにくいこ
とを見い出し、本発明に達した。

即ち、本発明の要旨は、支持体自身が重合性モノマーを
構成単位とする水不溶性高分子から成るか、もしくは支
持体表面が該水不溶性高分子によって被覆されて成り、
かっ該高分子は、正に荷電し得る化学的残基及び負に荷
電し得る化学的残基な有して成ることを特徴とする細胞
培養担体に存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の細胞培養担体、の製造に用いられる重合性モノ
マーとしては、重合して得られるポリマーが蛋白質等に
対して非特異的な吸着が少なく、動物細胞によって産生
される目的物のワクチン蛋白質を効率的に回収でき、か
つ、ポリマーの疎水性環境により細胞の伸展・増殖性が
抑えられることを防ぐ親水性ビニル七ツマ−（即ち、Ｃ
ＬＯＧＰ値が低いモノマー：ｃＬｏＧＰ値は、溶質の水
−／−オクタツール系におケルモノマーの分配係数の対
数値を計算により求めた値であり、その意義については
後述する。）が好適である。代表的には、（メタ）アク
リル酸エステルまたは（メタ）アクリルアミドが挙げら
れる。具体的には、ジエチレングリコール（メタ）アク
リレート、トリエチレングリコール（メタ）アクリレー
ト、テトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、
オクタエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリ
エチレングリコール（メタ）アクリレート、グリセロー
ル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレ
ート、（メタ）アクリルアミド、メチル（メタ）アクリ
ルアミド及び表−１１表−コに記載したモノマー等が挙
げられる。

荷電し得る化学的残基なもたないモノマーは、ポリマー
を親水性にするため、オキシエチレン類（（ＣＨｚ　Ｃ
Ｈｚ−０）ｎ　）においてｎが２以上であることが好ま
しい。

ここで重合して得られるポリマーが水不溶性であれば架
橋剤成分は必要ではないが、該ポリマー及び支持体から
の可溶成分の溶出、又は被覆した場合の該ポリマーの支
持体からの剥離を考慮し、架橋剤成分を添加することが
好ましい。

架橋剤成分としては、前述の七ツマー成分と共重合性を
有し、できる限り親水性の高い（ＣＬＯＧＰ値の低い）
多官能性のビニルモノマーが好適である。例えば、ジエ
チレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレ
ングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレン
グリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリ
コールジ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ
）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）
アクリレート、エチレンビス（メタ）アクリルアミド、
トリエチレンピス（メタ）アクリルアミド等が挙げられ
る。架橋剤成分は、支持体の構成成分の漏出を最小限に
抑えるために、使用することが好ましいが、架橋剤成分
の含有率が高すぎる場合には、血清中の蛋白質及び細胞
によって分泌された生理活性蛋白質を吸着し、効率的に
それらを回収できないという問題が生じる場合がある。

従って、架橋剤成分の含有率は、０．／〜ＳＯ重量％、
特に好ましくは７〜２０重量％であることが好ましい。

本発明において上記モノマーに対して、希釈剤を添加す
ることが好ましい。これにより支持体内部にまで含浸で
き、均一に被覆することができる。しかも得られる水不
溶性高分子に適度の可とう性をもたせることもできる。

本発明においては、培養液中における正に荷電し得る化
学的残基の含有量が水不溶性高分子７７当り０．５〜３
．０ミリ当量であり、かつ、負に荷電し得る化学的残基
の量が、水不溶性高分子／ｆ当りθ、θ／　−２，０ミ
リ当量であるとき、−層好ましい結果をもたらす。

正に荷電し得る化学的残基の量が、上記範囲以下の場合
には付着性が劣り、上記範囲以上の場合には電荷阻害が
観察される。また、負に荷電し得る化学的残基の量が、
上記範囲以下の場合には付着性が劣り、上記範囲以下の
場合には付着性増殖性ともに劣る。

細胞の付着性、増殖性に影響を与えるのは、化学的残基
の量ばかりではなく、ポリマー中の正に荷電し得る化学
的残基に相当するモノマー単位のＣＬＯＧＰ値も重要で
ある。支持体表面に細胞が付着し増殖するためには、ポ
リマー中の正に荷電し得る相当するモノマー単位のＣＬ
ＯＧＰ値が、−八Ｓ〜＋２．Ｏの範囲にあることが好ま
しい。本発明におけるＣＬＯＧＰシステムは、ボモナ大
学（カリフォルニア州）（Ｔ、　Ｎ１５ｈｉｏｋａ（京
都大学）によってＦＡＣＯＭ３．３３版に編集されたプ
ログラム〕によって開発されたもので、以下のように定
義される。

ＣＬＯＧＰ値は、溶質の水−／−オクタツール系におけ
る分配係数の対数値を計算により求めた値である。これ
により電荷的に中性な分子の疎水性を定量的に表現する
ことができるようになった。本発明における正に荷電し
得るモノマー単位のＣＬＯＧＰ値も、この方法により求
めたものである。正に荷電し得る化学的残基は、培養夜
中において、その一部は、解離状態にあると考えられる
が、Ｗ、　Ｓ、　Ｈｕ　（バイオテクノロジーアンドバ
イオエンジニアリング２９巻、／／メタ５−７ｌｂ３（
ｌｑり）〕らは、ｐＨ’７．２θにおける増殖速度に及
ぼす正味の荷電量の影響は少ない、又は全く規則性がな
いことを報告している。従って、ポリマー中の正に荷電
し得る相当するモノマー単位の疎水性度は、中性分子の
ＣＬＯＧＰ値を考慮すれば良いことになる。相当するモ
ノマー単位のＣＬＯＧＰ値が小さ過ぎると培養担体に対
する細胞の付着性は悪（なり、逆に、ＣＬＯＧＰ値う；
、大き過ぎる場合も細１泡の付着性や増殖性は悪くなる
。しかも、細胞によって分泌された生理活性蛋白質が、
培養担体に吸着されてしまう。更に、該モノマー単位の
ＣＬＯＧＰ値とその含有率との間には、規則性が観察さ
れた。即ち、培養担体上で細胞を付着増殖させるために
は、ＣＬＯＧＰ値が低い場合には含有率を高くし、ＣＬ
ＯＧＰ値が高い場合には、含有率を低くすることが好ま
しい事も判明した。正に荷電し得る化学的残基をもっモ
ノマー単位で、かつ、そのＣＬＯＧＰ値が一／、！〜＋
２．０の範囲にあるものとしては、表−／及び表−ユに
示したものを挙げることができる。

一方、支持体表面の水不溶性高分子に負電荷を導入する
方法として、重合体モノマー中に負に荷電し得る化学的
残基を有するモノマーを用いる場合と、重合後化学結合
により導入する方法の二通りがある。負に荷電し得る化
学的残基なもつモノマー単位で、かつ、そのＣＬ　ＯＧ
　Ｐ　（ｉが一へｓ〜＋コ、／の範囲にあるものの具体
的な例として、メタクリル酸、β−メタクリロイルオキ
シエテルハイドロジエンサクシネート、β−メタクリロ
イルオキシエチルハイドロジェンフタレート、メタクリ
ロキシエチルホスフェート、スルホプロピルメタクリレ
ート等が挙げられ、表−３に示した。

勿論、表−１ｇ表−２及び表−３に示していない重合性
モノマーでも、本発明の特許請求の範囲を越えない限り
、使用することができる。尚、表中において、Ｍｅはメ
チル基を、Ｅｔはエチル基を示す。

本発明における細胞培養担体の構造支持体として好適に
使用できるものとしては、例えば以下のような物が挙げ
られる。シャーレ類、Ｔ　−フラスコ、マルチトレイ類
、ローラー・ボトル類、紙（セルロース製濾紙、その他
）、布、発泡性ポリマー（ウレタン系、エーテル系、エ
ステル系）、多孔性セラミックス（シリカ系、アルミナ
系）、金属担体、金属箔、ガラスピーＩズ、発泡ガラス
、シート類、木材類、繊維類等が挙げられる。これらの
支持体の形状や大きさは、培養方法や培養規模によって
大きく異なる。支持体に付着した細胞を観察するために
は、光学的に透明な素材であることが好ましいが、これ
は培養のための必須条件ではない。

フィルム状及びフィルムのロール状、多孔性膜状、棒状
等が挙げられる。球状体としては、マイクロキャリアと
して特開昭６３−７／１ｇ．７号、特開昭／、３−２２
４２Ｓ２号及び特開昭６９−１０９７９号に記載された
方法により製造することができる。また、フィルム状の
担体は、特開昭Ａ＃−１Ｉ７３７２号に記載された方法
により製造することができる。団塊状の担体はモノマー
のバルク重合後、適切な方法により裁断することにより
得ることもできる。

一方、支持体の表面を水不溶性高分子で被覆する方法は
、例えば以下の手順に従って行うことができる。モノマ
ー、架橋剤、希釈剤を混合してなるモノマー溶液に重合
開始剤を添加する。

この溶液を支持体に含浸又は被覆し、過剰のモノマー溶
液は、圧縮し絞り出し又は、窒素を流し除去する。次い
で、窒素雰囲気下でモノマーを重合する。ここで、セラ
ミックスや発泡さポリウレタン等の固定床用担体な製造
する場合に１０ｃｍ以下に裁断することが好ましい。培
養器に合わせた固定床用担体な製造する場合には、裁断
し上記の操作を行った後に、遠心分離機で過剰の七ツマ
ー溶液を除去する。培養担体が小さい場合には、カラム
内に充填した後、含浸及び被覆することも可能である。

上記の製造工程において注意する点としては、過剰のモ
ノマー溶液を除去する際、担体内部に液溜りが生じない
ようにしなければならないことである。

モノマー成分に添加される希釈剤としては、モノマーを
溶解し、モノマー成分の官能基即ち、メタクリロイル基
、水酸基、グリシジル基、アミド基、アミノ基、カルボ
キシル基等及び支持体に不活性であればよい。それに好
適な希釈剤は、使用されるモノマ一種によって異なるが
、通常、ベンゼン、トルエン、シクロヘキサン、酢酸エ
チル、酢酸ブチル、エタノール、プロパツール、ブタノ
ール、／−ヘキサノール、シクロヘキサノール、オクタ
ツール、ヘプタツール、エチレングリコール、アセトン
、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、ジブチ
ルエーテル、テトラヒドロフラン、／、Ｆ−ジオキサン
、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、アセトニトリ
ル及び上記の水溶性有機溶媒と水との混合溶媒等が挙げ
られる。

上記希釈剤として、モノマーに対し良溶媒を添加した場
合には、被覆した水不溶性高分子は光学的に透明な高分
子となる。

全モノマーに対する希釈剤の添加量は、０〜７０倍量で
ある。希釈剤を過剰に添加した場合には、高分子膜が脆
弱になるばかりではなく、重合収率が低下する等の問題
が生じる。

使用される重合開始剤としては、以下のものをあげるこ
とができる。即ち、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイ
ル、過酸化アセチル等の過酸化系重合開始剤、コ、２′
−アゾビスーコーシクロプロビルブロピオニトリル等の
アゾ系重合開始剤、過酸化水素水−Ｆｅ’十塩等のレド
ックス系重合開始剤等により重合を開始させることがで
きる。

ここで重合開始剤の選択は、モノマー、架橋剤、希釈剤
等によって、大きく異なる。モノマー溶液が水溶性であ
る場合には、レドックス系重合開始剤、水溶性アゾ系重
合開始剤及び過酸化アンモニウム、過酸化カリウム−Ｎ
、Ｎ、Ｎ’。

Ｎ′−テトラアゾエチレンジアミン等が好ましく用いら
れる。

重合温度は、一般にレドックス系重合開始剤及び過酸化
物系重合開始剤は３０　’Ｃ〜／θＯ０Ｃで行うことが
好ましい。

また、重合性モノマー内に負に荷電し得る化学的残基が
存在する場合、得られた重合体は、それ自身、負に荷電
し得る化学的残基になり得、重合性モノマー内に、正に
荷電しうる化学的残基が存在する場合は、得られた重合
体はそのまま正に荷電しうる化学的残基になり得る。し
かし、重合体が前述の正又は負の官能基量な満足しｋい
場合には、更に化学反応によって正に荷電しうる官能基
を化学結合によって導入しなければならない。重合体が
グリシジル基を含有する場合は、アミンとの反応により
導入することができ、水酸基、コ、３−ジヒドロキシプ
ロピル基等の場合には、臭化シアンとの反応によりイミ
ドカルボネートを得た後、ジアミンとの反応により、導
入することができる。負に荷電しうる化学的残基を化学
結合によって導入する場合には、末端の水酸基を用いて
ハロゲン化酢酸と塩基性溶液中で反応させることにより
カルボキシル基を導入することができる。これらの結合
の方法に関しては、モスバック（メソッズ・イン・エン
ザイモロジ−ｔ３１Ｉ巻、／３ｒ巻、１３４巻）によっ
て詳細に記述されている。担体に導入された正及び負に
荷電しうる量は、支持体によっては、推定することが難
しい場合が多いをその場合、別にガラスシャーレ上でモ
ノマーを重合した後得られたポリマーを回収し、電荷量
を滴定によって推定することはできる。

尚、実施列に示した被覆させて得られる培養担体の電荷
量は、上記の方法によって求めた値である。

本発明の細胞培養担体を用いて培養する方法としては、
培養規模、培養の目的等によって異なるが、例えば以下
の方法が挙げられる。シャーレ、Ｔ−フラスコを用いた
場合には懸濁培養法が、固定床を用いた場合には固定床
培養法がその他エアーリフトを用いた場合には還流培養
法等が挙げられる。

培養方法により培養担体の投入量は異なり、一般に培養
液に対して３％〜１００％の範囲であることが好ましい
。

（実施例） 以下、実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明
は、その要旨を越えない限り以下の実施例により限定さ
れるものではない。

（実施例−７） 球状の細胞培養担体（マイクロキャリア）を、以下に述
べる方法により製造した。

３００　ｒｒｔｌの四ツロフラスコに温度計、冷却管、
窒素導入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カリウ
ム・三水塩３０ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液ｓ
　Ｏｍｌ　ｓイオン交換水ざ５　ｍｌを入れ攪拌した。

この中へｌ−ヘキサノール６θ２、シクロヘキサノール
３０２、ポリエチレングリコールメタクリレート（商品
名：ＰＥ−３Ｓθ、日本油脂社製）ｔ：１．ｌＩｔ、グ
リシジルメタクリレ−）　Ａ、Ｏｆ　、メタクリル酸０
．ｇｆ。

ポリエチレングリコールジメタクリレート（商品名：　
４ｔＱ新中村化学社製）　ｏ、ｇ　ｙ、重合開始剤とし
てコ、２′−アゾビス−（２，タージメチルバレロニト
リル）（商品名：Ｖ−Ａ、！ｔ　　和光紬薬社製）　ｏ
、ｏ　２ｔを溶解した有機溶媒をフラスコ内へ加えた。

徐々に昇温し、Ａｊ’Ｃで！時間、窒素雰囲気下で重合
反応を行った。反応終了後、該ポリマーをフッフナ−漏
斗上にあけ、タ０％メタノール水溶液で洗浄した。ポリ
マーを再度フラスコ内へ戻した。この操作を繰り返し、
ｌ−へキサノール及びシクロヘキサノール臭がしなくな
るまで、ダ回洗浄した。得られたポリマーは無色透明球
状体であった。重合収率はざり％であった。このポリマ
ーを標準篩を用い、／　２０ｐｍ−／　３０ｐｍに粒径
を揃えた。

該ポリマーを用いて更に以下の反応を行った。

３０ｒｔｔｌ（水中）のポリマーを／、４’−ジオキサ
ンで充分に洗浄し置換した。これを３００ｒｎｌのフラ
スコ内に入れ、更にジオキサンを３０ｍ１追加した。こ
の中へエタノールアミン！、θＶのジオキサン溶液／！
ｒａｇを滴下し、７０℃でｑ時間アミノ化反応を行った
。反応終了後、ポリマーを充分に洗浄した。

元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量はハゲ
６ミリ当量／２、カルボン酸の官能基量はＯ，２ｔ、　
ミリ当量／２であった。リン酸緩衝溶液（以下ＰＢＳと
略す）中における該ポリマーの膨潤度は／　７．ｑｒｎ
ｌ　／　？　、平均粒径は／ｌｉｅμｍ、比重は／、０
３　Ｐ　７ｍ（！であった。相当する正に荷電するモノ
マー単位は、メタクリル酸ヒドロキシエチルアミノー二
一ヒドロキシエチルでありそのＣＬＯＧＰ値は−０，１
，Ａ　９であり、相当する負に荷電するモノマー単位は
、メタクリル酸でありそのＣＬＯＧＰ値は０．’！−’
７０である。

（実施例−２） 球状の細胞培養担体（マイクロキャリア）を、以下に述
べる方法により製造した。

３００ｔｎｌの四ツロフラスコに温度計、冷却管。

窒素導入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシ
ウム・三水塩３０？、３％ポリビニルアルコール水溶液
！；０ｒｔｔｌ、イオン交換水ざｓ尻ｅを入れ攪拌した
。この中へｌ−ヘキサノール３゜２、シクロヘキサノー
ル３０Ｆ、／−オクタツール３０９．ポリエチレングリ
コールメタクリレート（商品名：ＰＥ−２０θ、日本油
脂社製）／コ、７？、グリシジルメタクリレ−）　ｊ、
ｌＩｆ、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジエ
ンサクシネート（商品名：ｓＡ、新中村化学社製）／、
／　ｙ、グリセロールジメタクリレート（商品名二ＮＫ
エステル７０／、新中村化学社製）０、ｇｆ、重合開始
剤として、２．．２’−アゾビス−（コ、４ｔ−ジメチ
ルバレロニトリル）（Ｖ−ｂｇ：前述）　０．０２　ｙ
を溶解した有機溶媒をフラスコ内へ加えた。徐々に昇温
し、４＆℃でＳ時間窒素雰囲気下で重合反応を行った。

重合終了後の後処理は、実施例−／と同様に行った。ア
ミノ化は、エタノールアミンの代わりに３−アミノ−７
−プロパツールを用いた以外は、実施例−／と同様に行
った。

元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量は／、
、？　７　ミリ当量１ｇ、カルボン酸の官能基量は０．
２２　ミ＋Ｊ当量／２であった。ＰＢＳ溶液中における
該ポリマーの膨潤度はｉｇ、ｇｒｎｌ／２、平均粒径は
１９２１１ｍ、比重はｔ、ｏ　、？　ｙ　／ａｔであっ
た。相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル
酸ヒドロキシプロビルアミノーコーヒドロキシプロビル
でありそのＣＬＯＧＰ値は一へ／２３であり、相当する
負に荷電するモノマー単位は、β−メタクリロイルオキ
シエチルハイドロジエンサクシネートでありそのＣＬＯ
ＧＰ値は０．ｇ　Ａ　Ａである。

（実施例−３） 球状の細胞培養担体（ マイクロキャリア）を、 以下に述べる方法により製造した。

３００ｍ１の四ツロフラスコに温度計、冷却管、窒素導
入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・
二水塩３θ２．３％ポリビニルアルコール水溶液ｓ　Ｏ
ｍｅ　ｓイオン交換水ｇｓｍｅを入れ攪拌した。この中
へ／−へキサノール３０２、シクロヘキサノール６０２
、ポリエチレングリコールメタクリレ−）（ＰＥ−３ｓ
ｏ：前述）　／　２．７　？、ジメチルアミノエチルメ
タクリレート←、ｌＩｔ、β−メタクリロイルオキシエ
テルハイドロジエンサクシネート（ＳＡ：前述）八／２
、ポリエチレングリコールジメタクリレート（商品名二
ＮＫエステル　９Ｑ、新中村化学社製）θ、ｇｆ、重合
開始剤とししコ、２′−アゾビス−（２，ｙ−ジメチル
バレロニトリル）（Ｖ−６よ：前述）　０．０コ２を溶
解した有機溶媒をフラスコ内へ加えた。徐々に昇温し、
Ａ５’（：、でＳ時間窒素雰囲気下で重合反応を行った
。重合終了後の後処理は、実施例−７と同様に行った。

実施例−３においては、アミノ化は行わなかつた。元素
分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量はへコ３ミ
リ当量／　ｆ　、カルボン酸の官能基量は０．２　！；
　ミＩＪ当量／１であった。ＰＢＳ廖液中におけるポリ
マーの膨潤度は１ｇ．Ｉｒｔｔｌ／２、平均粒径は／ｇ
／μｍ、比重は八〇３２７ｍｅであった。相当する正に
荷電するモノマー単位は、ジメチルアミノエチルメタク
リレートでありそのＣＬＯＧＰ値はθ、２９θであり、
相当する負に荷電するモノマー単位は、β−メタクリロ
イルオキシエチルハイドロジエンフタレートでありその
ＣＬＯＧＰ値は２．／である。

（実施例−１Ｉ） フィルム状の細胞培養担体を、以下に述べる方法により
製造した。

エチレングリコール３０２、ポリエチレングリコールメ
タクリレ−）（ＰＥ−３ｓｏ：前述）／リグ７、グリシ
ジルメタクリレート１．＋７、メタクリル酸ｏ、ｇｓｙ
、ポリエチレングリコールジメタクリレート（グＧ：前
述）　ｏ、ｇ　ｔ、重合開始剤として塩化メチレンｏ、
ｓ、Ｉｇに溶解したコ、２′−アゾビス−（ダーメトキ
シーコ、ｌＩ−バレロニトリル）（商品名：Ｖ−ｔＯ１
和光純薬社製）　０．０２　ｆモノマー溶液を調製した
。この溶液に窒素ガスを導入し、溶存酸素を除去した。

θ、！μｍのポリエステルフィルムのスペーサーを嫉ん
だ二枚のガラス板より成るセル中に、上記モノマー溶液
を流し込んだ。このガラス板を６θ°Ｃの水浴中にｌＯ
分間漬げ、窒素雰囲気下で重合反応を行った。重合終了
後、フィルムゲルを取り出し、ＳＯ％メタノール水溶液
で招浄した。該フィルムゲルは無色透明であった。

この表面積、ｔ、　ｔ、　ｏ　ｏ　ｃｒＡのフィルムゲ
ルをジオキサンで充分に洗浄しジオキサンで置換した。

これを１００ｔｔｔｌのフラスコ内に入れ、更にジオキ
サンを３０ｍ１追加した。この中へコーアミノエタンチ
オールハ０２のジオキサン酸液りｍｌを滴下し、７０℃
でグ時間アミノ化反応を行った。

反応終了後、ポリマーを充分に洗浄した。元素分析及び
酸塩基滴定より、アミンの官能基量は／、Ｓ３□り当量
／２、カルボン酸の官能基量は０．２９ミリ当量／２で
あった。比重は八〇３？／ＷＬｅでありた。膜厚は約へ
θμｍであった。

相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸メ
ルカプトエチルアミノーコーヒドロキシプロビルであり
そのＣＬＯＧＰ値は０．．３７！であり、相当する負に
、荷電するモノマー単位は、メタクリル酸でありそのＣ
ＬＯＧＰ値はθ、ｌＩｑ。

である。

（実施例−Ｓ） フィルム状の細胞培養担体な、以下に述べる方法により
製造した。へグージオキサン２６２、グリセロールメタ
クリレート（商品名：ブレンマー〇ＬＭ、日本油脂社製
）　９．７　Ｆ、アクリルアミドＪ、’ｌｔ、ジエチル
アミノエチルメタクリレ−）Ｌ／Ｓ’、　　β−メタク
リロイルオキシエテルハイドロジェンサクシネー）（Ｓ
Ａ：前述）０．９ｆ、グリセロールジメタクリレート（
りθ／：前述）ｏ、ｇｔ１重合開始剤として塩化メチレ
ンＯ，Ｓ−のコ、２′−アゾビス−（←−メトキシーコ
、ダーバレロニトリル）（Ｖ−７０：前述）０．０２　
ｔから成るモノマー溶液を調製した。この溶液に窒素ガ
スを導入し、溶存酸素を除去した。０１５μｍのポリエ
ステルフィルムのスペーサーを歓んだガラス板より成る
セル中に、上記モノマー溶液を流し込んだ。このガラス
板を６θ℃の水浴中に１０分間漬げ、窒素雰囲気下で重
合を行った。重合終了後、フィルムゲルな取り出し、５
０％メタノール水溶液で洗浄した。得られた該フィルム
ゲルは無色透明であった。

元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量はｉ、
！；　、７　ミリ当量／ｆ、カルボン酸の官能基量は０
．２　？　ミＵ当量／？であった。比重は八θＪ　ｔ　
／　ｒｔｔｌであった。膜厚は約へ〇ｐｍであった。相
当する正に荷電す、るモノマー単位は、ジエチルアミノ
エチルメタクリレートでありそのＣＬＯＧＰ値は／、？
　ｆｆ　／であり、相当する負に荷電するモノマー単位
は、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジエンサ
クシネートでありそのＣＬＯＧＰ値はθ、Ｓ６６である
。

（実施例−６） 発泡性ポリウレタンを支持体とする細胞培養担体な、以
下に述べる方法により製造した。

エチレングリコール３０？、ポリエチレングリコールメ
タクリレ−）（ＰＥ−３ｓｏ：前述）／２．’ｌｔ、グ
リシジルメタクリレート！；、’ｌｆ。

β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジエンサクシ
ネート八へよ？、ポリエチレングリコールジメタクリレ
ート（ダＧ：前述）ｏ、ｇｔ。

重合開始剤として塩化メチレンθ、！；ｍ１Ｋ２，１’
−アゾビス−（ターメトキシ−２，ｌｌ−バレロニトリ
ル）（Ｖ−７０：前述）　０．０２１を溶解したモノマ
ー溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを導入し、溶存
酸素を除去した。発泡性ポリウレタン（平均細孔径ざθ
μｍ、半連続性発泡体、ＭＤ化成社製）（ｌＯｃ！ＩＬ
ｘｌＯｃＩｒＬ×７α）に上記調製したモノマー溶液を
含浸し、過剰のモノマー溶液を圧縮し絞り出した。該ポ
リウレタン片をガラス容器内に入れ、窒素雰囲気下Ａ０
０Ｃに加温し、コ時間窒素雰囲気下で重合反応を行りた
。重合反応終了後残留モノマー及びジオキサンを除去す
るため、！θ℃に加温したアセトン溶液で洗浄し、最後
に蒸留水で洗浄した。

更に、該ポリウレタン片をジオキサンで置換した後、こ
の中へエタノールアミン溶液へＳ２のジオキサン溶液ｊ
　ｍｌを滴下し、７５℃で９時間アミノ化を行った。反
応終了後、ポリウレタン片を１０％メタノール水溶液で
充分洗浄した後、蒸留水で洗浄した。被覆されたポリマ
ーの量は、ｇ、７％であった。

推定される正に荷電し得る官能基量は約／、Ｆ　５ミリ
当量／ｌであり、負に荷電し得る官能基量は約θ、／　
９ミリ当量／ｌである。表面積はデθｃｒｔ？／　Ｈｌ
、空隙率は、約ｔ７％であった。相当する正に荷電する
モノマー単位は、メタクリル酸ヒドロキシエチルアミノ
ーコーヒドロキシプロビルでありそのＣＬＯＧＰ値は一
へ／２３であり、相当する負に荷電するモノマー単位は
、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジエンサク
シネートでありそのＣＬＯＧＰ値はＯＪ　Ａ　Ａである
。

（実施例−り） 多孔性セラミックスを支持体とする細胞培養担体を、以
下に述べる方法により製造した。／−ヘキサノール２２
２、ポリエチレングリコールメタクリレート（商品名：
ＰＥ−ｑｏ、日本油脂社製）　ｑ、ｏ　ｔ、グリシジル
メタクリレートｓ、ｔｉｅ、β−メタクリロイルオキシ
エチルノ・イドロジェンサクシネート／、θ！ｆＰ、グ
リセロールジメタクリレー）（ＮＫエステル７０／：前
述）ｏ、ｔｒ　ｙ、重合開始剤としてコ、２′−アゾビ
ス−（，２，ｔＩ−ジメトキシバレロニトリル）（Ｖ−
６５：前述）　０．０２　ｔから成るモノマー溶液を調
製した。この溶液に窒素ガスを導入し、溶存酸素を除去
した。多孔性セラミックス（プリジストン社製セラミッ
クスフオーム　４ＩｑＯ平均細孔径３０００ｐｒｎ）／
θｍｌに上記調製した七ツマー溶液を含浸し、過剰の七
ツマー溶液を窒素ガスを吹き付は除去した。該セラミッ
クスフオーム片をガラス容器内に入れ、窒素雰囲気下６
０℃に加温し、２時間窒素雰囲気下で重合反応を行った
。重合反応終了後残留モノマー及びｌ−ヘキサノールを
除去するため、！θ℃に加温したＳＯＸメタノール水溶
液で洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。

更に、該セラミックスなジオキサンで置換した後、この
中ヘジエチルアミン溶液へ夕２のジオキサン溶液Ｓｄを
滴下し、り！℃でｑ時間アミノ化を行った。反応終了後
、セラミックスフオーム片を！θ％メタノール水躊液で
充分洗浄した後、蒸留水で洗浄した。被覆されたポリマ
ーの量は、ｇ、７％であった。

推定される正に荷電し得る官能基量は約へｌＩｓミリ当
量／２であり、負に荷電し得る官能基量は約ｏ、ｉ　ｑ
　ミＩＪ当量／ｆである。表面積はデθｅｒａ　／　ｍ
ｌ　、空孔率は、約ｇ７％であった。相当する正に荷電
するモノマー単位は、メタクリル酸ジエチルアミノーコ
ーヒドロキシプロビルでありそのＣＬＯＧＰ値は八／／
６であり、相当する負に荷′電するモノマー単位は、β
−メタクリロイルオキシエチルノ〜イドロジエンサクシ
ネートでありそのＣＬＯＧＰ値は０１ｇ６６である。

（比較例−／） 比較例の球状の細胞培養担体は、以下に述べる方法によ
り製造された。３００　ｔｔｌの四ツロフラスコに温度
計、冷却管、窒素導入管、攪拌羽根を取り付け、この中
へ塩化カルシウム・三水塩３０？、３％ポリビニルアル
コール水醇液５ｏｔｒｔｌ、イオン交換水ｇ！ｒｒｔｔ
ｌを入れ、攪拌した。

重合反応は窒素雰囲気下で行った。この中へ、／−へキ
サノール６０２、シクロヘキサノ雫ル３０２、ポリエチ
レングリコールメタクリレ−１−（ＰＥ−，７りθ：前
述）／３．二２、グリシジルメタクリレート６、θ１、
ポリエチレングリコールジメタクリレート（ダＧ：前述
）　ｏ、ｇ　ｙ、重合開始剤としてコ、２′−アゾビス
−（ユ、クージメチルバレロニトリル）（Ｖ−ｇｒ：前
述）０．０２　ｒを溶解した有機溶媒をフラスコ内へ加
えた。徐々に昇温し、ｌ、！；°ＣでＳ時間重合反応を
行った。反応終了後、該ポリマーをフッフナ−漏斗上に
あげ、ＳＯＸメタノール水溶液で洗浄した。ポリマーを
再度フラスコ内へ戻した。

この操作を繰り返し、／−へキサノール及ヒシクロヘキ
サノール臭がしなく々るまでグ回洗浄した。得られたポ
リマーは無色透明球状体であった。重合収率はｇ７にで
あった。このポリマーを標準篩を用い、／２θμｍ〜１
３θμｍに粒径を揃えた。該ポリマーを用いて更に以下
の反応を行った。３ｏｒｎｌｃ水中）にポリマーを／、
ゲージオキサンで充分に洗浄し置換した。

これを３０θｍｌのフラスコ内に入れ、更にジオキサン
を３０ｍ１追加した。この中へエタノールアミン５．０
２のジオキサン溶液ｉｒ７を滴下し、７０℃でグ時間ア
ミノ化反応を行った。反応終了後、ポリマーを充分に洗
浄した。元素分析及び滴定より、アミンの官能基量は／
、’ｌ　ｔ、　ミリ当量／２であった。Ｐ’ＢＳ溶液中
における該ポリマーの膨潤度は１ｇ．９尻１／？、平均
粒径はｉｇｙ−μｍ、比重は八〇　３　？　／　ｙｔｌ
であった。

相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸ヒ
ドロキシエチルアミノーコーヒドロキシエチルでありそ
のＣＬＯＧＰ値は−０，４Ａ９である。

（細胞培養実験） 実施例／、２．３．６及び比較例−７で製造された各細
胞培養担体な用いて細胞培養実験を行った。上記の各細
胞培養担体な蒸留水で充分洗浄した後、ＰＢＳ溶液で洗
浄し、更にダルベツコイーグル変性培地で２回洗浄置換
した。

細胞培養には、ｌＯ％牛脂児血清（三菱化成■社製）を
含有するｅ　−ＲＤ　Ｆ培地（極東製薬■社製Ｏで培養
した。細胞培養に供した細胞は、ＣＨＯ−に／（チャイ
ニーズハムスター子宮卵巣）細胞、Ｖｅｒｏ　　（アフ
リカ□トリザル腎）細胞、ＭＤＣＫ（コツカスパニエル
腎）細胞である。マイクロキャリア培養は以下のように
行われた。実施例−／、２．３．６及び比較例−７で製
造したマイクロキャリアをダルベツコイーグル変性培地
で置換した。／ｌのスピンナーフラスコ内にこのマイク
ロキャリア／３−を入れ、／２１０Ｃで３０分間オート
クレーブ滅菌した。

この中へ牛胎児血清を、１０ｔｔｔｌ及びｅ　ＲＤＦ培
地を加え２９３ｍ１とした。更に、上記のＣＨＯ−に／
細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞を２．！；　Ｘ　／
　０’ｃｅｌｌｓ／ｍ／入れ、２　！；　ｒｐｍで連続
攪拌し培養を開始した。ｑ８目より５％血清で培地交換
をし６８目より２％血清で培地交換をし、更にｇ白目よ
り無血清培養を開始した。この状態で／θθ日間無血清
培養を行った。結果を表−ダに示す。

なお、表中の結果は、次の基準で評価結果を示したもの
である。

−Ｈ−）−：非常に良好 −Ｈ−：良好 ＋　：細胞の付着、培養が見られるが、あまり良くない
。

図−ｌに実施例−７の担体な用いてＶｅｒｏ細胞をざダ
日間培養したときの写真を示す。長期間培養したときも
細胞の伸展性は良好である。

図−コに実施例−７の担体な用いてＣＨＯ−に／細胞を
ｇｌＩ日間培養したときの写真を示す。

長期間培養したときもＣＨＯ−に／細胞の伸展性は良好
である。

図−３に比較例−ｌの担体な用いてＶｅｒｏ細胞を６９
日間培養したときの写真を示す。マイクロキャリア上で
剥離及び凝集した細胞が多く観察される。

（発明の効果） 本発明によれば、少なくとも支持体の表面に正に荷電し
うる化学的残基及び負に荷電しうる化学的残基が共存す
るための細胞の付着、増殖性が良好であるばかりではな
く、特に、長期間培養した場合にも細胞が剥離しにくい
ことを見い出した。

また、培養担体を構成する重合性七ツマ−が、透明な液
体であるため種々の形状の構造体に含ダ 浸し、被覆することができ、しかも光学的に透明である
ため細胞を観察しやすい等の特徴が挙げられる。また、
親水性ポリマーであるため蛋白質の非特異的吸着がほと
んど観察されない。

このことにより、各種用途に適した担体な製造すること
が可能となり、動物細胞の培養や、それによって分泌さ
れる生理活性蛋白質、モノクローナル抗体、ワクチン、
ウィルス等を効率的に生産できるようになった。

【図面の簡単な説明】

図−／及び図−２は、それぞれ実施例−／の担体を使用
し、ｇａ日間培養したＶｅｒｏ細胞及びＣＨＯ−に／細
胞の形態の顕微鏡写真（写真倍率×１０Ｏ）を表わした
図面である。 また、図−３は、比較例−７の担体を使用し、Ａ９日間
培養したＶｅｒｏ細胞の顕微鏡写真（写真倍率×１０Ｏ
）を表わした図面である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）支持体自身が重合性モノマーを構成単位とする水
   不溶性高分子から成るか、もしくは支持体表面が該水不
   溶性高分子によって被覆されて成り、かつ該高分子は、
   正に荷電し得る化学的残基及び負に荷電し得る化学的残
   基を含有して成ることを特徴とする細胞培養担体。
2. （２）重合性モノマーが、（メタ）アクリル酸エステル
   及び／又は、（メタ）アクリルアミドであることを特徴
   とする請求項１記載の細胞培養担体。
3. （３）正に荷電し得る化学的残基に相当するモノマー単
   位のＣＬＯＧＰ値が−１．５〜＋２．０をその含有量が
   水不溶性高分子１ｇ当り０．５〜３．０ミリ当量であり
   、かつ、負に荷電し得る化学的残基に相当するモノマー
   単位の ＣＬＯＧＰ値が−１．５〜＋２．１、その含有量が、水
   不溶性高分子１ｇ当り０．０１〜２．０ミリ当量である
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。