JPH0327287A - 微生物による酸性ウレアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野−１ 本発明は酒類の品質改良やバイオ砒ンサなどに用いられ
る０平素としてイ゛ｆ用な酸性ウレアーゼの製造に関す
る。

「従来の技術１ ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）は、尿素を分解してアンモ
ニアと炭酸ガスを生ずる反応を触媒する酵素で、動物、
植物、微生物など広（自然界に分布ｌ７ている。

たとえばナタマメやバシルス屈細菌（　Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｐａｓｔ−ｅｕｒｉ−ｉ）Ｆｉｔ来の中１ｆ臥アルカ
リ性に至適ｐｉ＋をイｆするｎｊＩ素として一般的であ
る。また、近年一部のバクテリアの仲間に、酸性領域に
活性を示す醇素在７！｛することも明らかにされている
。これら酸性ウレアーゼは、乳酸菌（特許公開平成１−
５１０８３号公報）、人腸菌群（特許公開平成１−１０
４１６９号公報）およびアルスロバクター属（ＡｒＬｈ
ｒｏｂａｃｔ．ｅｒ：特許公開平成１−１３２３７９号
公報）など細菌に眼られる。

「発明が解決しようとする問題点−１ Ｌ記で知られる−股的なウレアーゼは、食品衛生の面で
は、その起源が問題とならないが、その触媒作用条件が
中性もしくはアルカリ性にあり、酸什領域での使用は困
難である（特許公告昭和５６−２０８０３号公報参照）
。また、酸性領域に至適ｐｉのある新しいウレアーゼは
、いずれ場合も微生物口体の食品衛生而で問題を抱える
範喘に属するもので、ややもすると食品衛生−Ｌの事故
にもつながる恐れをもち、食品加王副原料色してのイメ
ージも損なうものと冫１える。

１発明が解決するための千段１ 本発明者らは、一般に食品微生物とし゛Ｃ目常、衛生面
での問題もなく実用に供される範囲のカビにおける尿素
に対する挙動を細部にわたり検討し、酸性に至適ｐｌ＋
をイイするウレアーゼを製造する新１，い技術思想をも
って本発明を完成するにそった。

実用に耐え得るカビと１，ては、さほど広くは分布して
いないが、バンなどの表面に発生する、生酸性のカビと
して知られるリゾブス（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）属より選ば
れる菌株が酸性ウレアーゼ活性の高い。本発明は、かか
る新規な知見をもとに構成きれる。

これら、実用的なリゾブス属菌株は、実施例に示す菌株
（坦ｎ−ｊでｏｐ−ｕ；　ｏｒ−どＺ靭）に限定される
ことなく、尿素を含んだ含成培地に生育して《るカビの
中から、その培養物と尿素との反応で発生ずるアンモニ
アの定重で確認できる醇素活Ｐ１′．測定で選び出すこ
とも容易である。本発明における酸件ウレアーゼは、尿
素１分子からアンモニア２分ｒと炭酸ガスｌ分子を生成
し、その活性は、酸性領域、とりわけｐ．ｌＩ２〜６に
て触媒活性をイ１′する。

本発明の酸性ウ１／アーゼｌし産菌株は、野生株で充分
にその機能を発揮できるが、さらにこれら菌株に紫外線
、変異誘起剤処即をおこない、人為的に得られる菌株や
、当該酸性ウレアーせ活性の発現に必要な遺伝子断片を
組み入れた他の微生物菌株であっても使用できる。

これらの微生物菌株を好気的に培養して酸性ウレアーゼ
を生成きせるのであるが、通常に麹で知られる固体培養
が容舅であるここも、本発明の場合特徴ある技術として
採用出来る。勿論、本発明の閑は、いわゆる有機酸など
の生酸性閑の培養で知られる通気、撹拌よりなる深部培
養でも効果的な酸性ウレアーゼの生産はかのうである。

用いる培地は、使用する菌株の生育出来る通常のカビ類
の培地で充分であるが、窒素源として尿素を添加するこ
とは、醇素生成により効果を示す。

炭素源には、炭水化物、油脂、脂肪酸、有機酸あるいは
アルコール類などから資化するものを適宜選択し、単独
または混合使用される。窒素源とｌ７ては、安価な尿素
などがあれば充分であるが、必要に応じ硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、（ヘ）ブ１・ン、醇母エキス、
コーンスチープリカーなど．一般的な窒素栄養源を添加
する。さらに、必要に応じミネラル、アミノ酸あるいは
ビタミンなどの添加も、効果をもつ。培地への尿素、チ
オ尿素、カルバミン酸などの添加は、酸性ウレアーゼ生
成を効果的に誘導する為に効果的である。

固体培養も産業的に効果を持つものであり、本発明の菌
株で初めてｉｊＪ能となったものである。この場合、酒
造、味噌、鍔油など醸造技術として確立１，ている常法
に準ずる。固体培養の場含とくに、尿素溶液を噴霧する
ことは、ウレアーゼの誘導に効果を示す。

培養中のｐｌ＋は常時２〜６の範四、とくに微酸性に維
持するよう、培地の組成に応じて、酸性溶液、アルカリ
溶液にて制御することも必要で、発泡時には適宜、消泡
剤を滴下する。

培養の温度は、用いる菌株のｚＨ．育に適した温度条件
を満たせば良く、通常ｌ５〜４５°Ｃ１好ましくは２５
〜３７６Ｃで培養する。また、培養時間は、深部培養で
は、供試する菌株の生育およびウレアーゼ生成に充分な
［｝．Ｉｆ間が必要で、普通５〜１２０時間を要ずる。

固体培養においては、少々の時間が必要で、３口から１
週間で生育、ウレアーゼ生成が達成される。

深部培養の場含、菌体を回収し、これを連結乾燥ｉ（り
して直接ウレアーゼ酵素反応に供することも出来るが、
場合によって、培養物もしくは、菌体からの抽出も必要
である。培養した培養物もＬ＜は培養液全体にウレアー
ゼは生成、分布しており、固形分、培養閑体は、必要に
応じ凍結融解処理、磨砕処理、超音波処理、浸透ＩＥ処
即、細胞壁膜の溶解処理、界面活性剤処理などで酵素を
抽出する，　ｒｉＪ溶化された酵素は、さらにブロタミ
ン処裡、塩析、Ｙｆ機溶媒処Ｐ｛！、等電点沈澱、電気
泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフ
イニテイークロマトグラフィー、品出などの通常の酵素
の精製技術を適宜組み合わせることで比活性の高い１ｔ
醇素または精製醇素として得られる。

本発明で得られる酸性ウレアーゼは、尿素を分解除大す
る［１的で種々の用途に用いられるが、と＜ＥＬＪ本酒
、ワインなど酒類に３まれる尿素の分解には効果的な触
媒と（７てＩｔ１いることができる。

酒類中の尿素の除大は特許公告昭和５６−２０８３０号
公報記載の方法に嘲じて実施出来る。

以下に、実施例をもって本発明の実施の態様示すが、こ
れらは１１なる例示であって、本発明の範囲をなんら限
定するものではない。

なを、培養物の酸件ウレア・−ゼ活性は、培養液をから
遠心分離によ−｝て集菌［７、洗浄菌体を尿素を含む０
．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐ［ｌ　４．　０）に懸濁し、
３７°Ｃで３０分間反応ｌ７、生成したアンモニ゜γを
二１・ロブルシッド法で比色測定する。これらは特許公
開公報昭和６４＝５２０８３号公報記載の提案に明じて
、ｔ）１位Ｒ間当たりに１μＭの”γンモニアを生成す
るｒＩ夢素晴をｌユニッＢ＋．ｕ．）として表示ｌ７た
。

実施例Ｅ ボテトデキスｌ・ロース寒天培地に生育したりゾグルコ
ース５０ｇ，尿素２ｇ，Ｋｌｌ２ＰＯ＊　６００ｍｇ，
ＭｇＳＯ，”７１１ｐ０２５０ｍｇ，　ＺｎＳｏ４４１
５．０　４４ｍｇ，水１（２，ｐｌｌ　５、５よりなる
Ｍ地を１０Ｇ一分注１，た５０〇一容培養フラスコに接
種Ｌ、３７°Ｃ、４８時間２０Ｏｒｐｍ条件Ｆで回転振
とう培養した。得られた培養物の酸性ウレアーゼ活性は
２、８５Ｕ／＋ａｇであった。

実施例２． 実施例【に準じて得られた液体培養物５０ｍ＜２を、市
販パン粉１ｋｇニ１％尿素、０．６％Ｋ＋１，ＰＯ４，
　０．　１％ＭｇＳＯ．　’　７１１，０，　０．　０
５％ＺｎＳ（Ｌ　”　７１１＊０よりなる溶液（ｐｌ！
　５．　０）を１００ｄ噴霧、浸透させたのち殺閑した
培養基に接種し、５ｔ：｛　ｌ　Ｉ．ｉ　１回掻き交ぜ
ながら６口間静置培養した。得られたＪ？ｉ，ｌ物に等
容屓の水と混合し、ホモジナイザーにて撹拌した。乳化
状液の酸性ウｌ／アーゼ活性は０．　７９０／ｍＱであ
った。

実施例３． 酸性ウレアーゼ生産閑と（２てリゾブス・ミクロを用い
て実施例１に明じてｒＩ）ｆ．素製造をおこなー）た。

この場合、酵素活性は２．　４５Ｕ／ｌｌＩＱであ１た
。

発明の効果 これまで実用酔素酸件ウレアーゼ冑源とされていなかっ
たカビの中からニｉ該活性の高いことを見いだし、簡１
１１な培養操作で、低廉に、食品衛生而での安全性の高
い酸性ウレアーゼを工業的Ｙｒ利に製造する方法を提供
できる。

特．ｉ１：出願人 ベーガン通商株式会社 イイ眼会社生物科学産業研究所

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リゾプス属より選ばれる酸性ウレアーゼを産生する能力
   のある菌株を培養して、培養物中に酸性ウレアーゼを生
   成せしめることを特徴とする微生物による酸性ウレアー
   ゼの製造方法