JPH03236773A - 細胞培養用基材および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は細胞培養用基材およびその基材を用いた細胞培
養方法に関するものである。さらに詳細には、動物細胞
培養用基材および動物細胞培養方法に関するものである
。

［従来の技術］ 従来、動物細胞の細胞培養用基材および培養方法として
オリゴ糖を多孔質高分子基材表面上に担持させた細胞培
養用基材（例えば特開昭６３−１９８２７４号公報）や
、一種類の動物細胞を立体網目状多孔質構造を有する担
体中に保持した状態で培養する方法がある（例えば特開
昭Ｅｉ４−８Ｅ３８７０公報）。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、前記技術では細胞の付着性、増殖性は改善され
、細胞を一定期間生育、生存させることはできる様にな
ったものの、機能の発現程度が低いか、あるいは培養期
間中の早期の機能欠落等、高機能発現を長期間維持した
培養が行つことができないという課題を有している。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、培養細胞の高機能発現を長期間維持した
培養ができる細胞培養用基材および細胞培養方法につき
鋭意検討した結果本発明に到達した。すなわち本発明は
、表面が糖質、蛋白質、脂質、合成高分子およびそれら
の複合化合物のいずれか一種類以上からなる多孔質構造
体であり、その孔径が、同時に培養を行う２種類以上の
細胞のうち最も大きな平均直径を有する細胞の１．５〜
１０倍であることを特徴とする２８１１類以上の細胞を
培養するための細胞培養用基材、および該基材を用いた
２ｔｉｉ類以上の細胞を同時に培養することを特徴とす
る細胞培養方法である。

以下この発明の詳細な説明する。本発明における多孔質
構造体としては細胞に対する毒性がなく、しかも２８１
類以上の細胞導入、培養液供給、老廃物除去を行うため
連通孔を有する構造体があげられる。また孔径が均一で
、孔の方向性がある方が好ましいが、ランダムな編目状
構造でも良い。具体的には多孔質構造体として発泡体、
線維不織布、織布なと、連通孔を有する構造体であれば
特に限定されない。多孔質構造体を構成する材料として
は、例えば合成高分子材料、天然高分子材料および無機
材料があげられる。合成高分子材料とじては、ポリウレ
タン：ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂な
どのビニル（共）　ｌｉ＆体：ナイロン、ポリカーボネ
ート、ポリエステルなどの縮合系重合体：　ブタジェン
またはイソプレンなどのジエン系重合体：　さらにフッ
素樹脂：シリコン樹脂：尿素フォルムアルデヒド樹脂：
エポキシ樹脂などが例示できる。天然高分子材料として
はセルロース、セルロース誘導体などの多糖類誘導体、
タンパク質およびその誘導体などが挙げられる。無機材
料としてはガラス、セラミックスなどがあげられる。

多孔質構造体の表面を形成する糖質としては、グルコー
ス、ガラクトース、ガラクトサミン、アラビノースなど
の単糖類：セレブロシド、ラクトース、メリビオース、
ラフィノース、スタキオースなどのオリゴ糖：アガロー
ス、アガロペクチン、ガラクトマンナン、アラビアゴム
、アラビノガラクタンなどの多糖類があげられる。蛋白
質および蛋白質−糖質複合化合物としては、培養する細
胞の細胞膜表面のレセプターに対するモノクローナル抗
体、アルブミン、インシュリン・ＥＧＦ等の増殖因子、
コラーゲン、コンドロネクチン、ビトロネクチン、フィ
ブロネクチン、ラミニン等があげられる。合成高分子と
してはスルホン酸基を有するポリスチレンスルホン酸な
どがあげられる。

脂質複合体としては、リン脂質、糖脂質などがあげられ
る。表面形成物質は培養する細胞の種類により種々変え
ることができる。好ましくは、肝細胞を培養する場合ガ
ラクトースが良い。血管内皮細胞を培養する場合はコラ
ーゲンが良い。

これら物質により基材表面を形成する方法としては、こ
れらの物質の溶液中に多孔質構造体を浸漬したのち乾燥
させる方法あるいは多孔質構造体に塗布し乾燥する方法
により行うことができる。

また基材表面を形成する物質に安定性を持たせるため多
孔質構造体を放射線処理、オゾン処理、イオン処理、化
学処理、レーザーによる物理的処理等により処理後、浸
漬または塗布もしくは必要に応じて活性エステル、カル
ボジイミド、ゲルタールアルデヒド、インシアネート等
により化学的に表面に結合させることもできる。

本発明における細胞培養用基材は多孔質構造体（三次元
構造体）でなければならない。シャーレのような二次元
形態の基材に比較して、二次元形態の基材の方が高機能
発現を長期間維持するために最も重要な同種細胞及び異
種細胞同士の細胞接触点が多くなるためである。孔径は
培養する細胞の大きさ等により最適な孔径が決められる
が、基材中に保持された同種細胞および異種細胞同士が
三次元的に接触しあい細胞同士の相互作用を高めること
が出来るような孔径であることが必要であり、同時に培
養を行う２種類以上の細胞のうち最も大きな平均直径を
有する細胞の通常１．５〜１０倍、好ましくは３〜７倍
である。孔径が１．５倍未満であれば細胞が基材内部に
導入できないか、もしくは細胞導入ができても細胞同士
の三次元的な接触が少ないため相互作用を高めることが
できない。また孔径が１０倍より大きい場合は細胞が導
入できても基材中からの細胞の脱落が多いため細胞密度
が高められず、同種細胞および異種細胞同士の三次元的
接触による相互作用を高めることが出来ないため高機能
発現を長期間維持した培養を行うことができない。また
、細胞密度を高くするという観点から、該多孔質構造体
の見かけの単位体積当りの表面積は、多孔質構造体が基
材としての物理的強度を保持できる限り大きい方が好ま
しい。

本発明において培養される細胞の種類は動物細胞であれ
ば特に限定されず、正常細胞、ガン細胞、人為的に変性
された細胞等が挙げられる。例えば肝実質細胞、膵うン
ケ°ルハンス島細胞、神経細胞、血管内皮細胞、腎細胞
、ダリア細胞、チャイニーズハムスター肺由来細胞Ｖ−
７９・卵巣由来ＣＨＯ細胞、ヒト肺由来ＭＲＣ−５細胞
・ＩＭＲ−９０細胞・ＷＩ−’３８細胞、ヒトリンパ球
由来ナマルバ細胞、ヒト肝癌由来ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細
胞・ＨｅｐＧｔ細胞・ｈｕＨ−２細胞等が例示される。

これら細胞の内、２種類以上を同時（−緒に）に培養し
なければいけない。同時に培養することにより、細胞が
お互いに影響しあい相互作用により高機能発現を長期間
維持できる。例えば肝実質細胞と血管内皮細胞：肝実質
細胞と繊維芽細胞：肝実質細胞と各種肝由来株化細胞の
組合せが例示できる。好ましくは、同じ組織内にある細
胞より選択した２種類以上の細胞を同時に培養する。例
えば肝実質細胞と肝臓組織を構成する胆管上皮細胞の組
合せ等が例示出来る。

本発明における培養方法は、例えば、本発明の培養用基
材に細胞懸濁液を吸収させて細胞を基材に導入した後、
培養液の入ったシャーレ、培養ビン内に置いて培養する
方法、さらに大規模には細胞を導入した基材をランダム
に培養槽内に充填する方法、基材を培養槽内に積層する
方法、中空糸あるいはチューブの表面を本発明の基材で
形成する方法などが挙げられる。これらのうち好ましく
は中空糸が中空部もしくは外側に培養液を潅流させ、必
要に応じて炭酸ガス、酸素等を上記中空糸の中空部に送
ることにより、中空糸表面を覆う基材内部で細胞を増殖
、高機能発現を長期間維持させることかできる方法であ
る。培養液としては通常１０％牛脂児血清入り培養液を
使用するが、培養を行う細胞の種類に応じて各種培養液
が使用できる。培養温度は通常３５〜３９°Ｃの範囲で
ある。

培養液の水素イオン濃度は、通常１０−４〜１０−・ｍ
　ｏ　ｌ　／　ｌの範囲である。

この培養方法により培養される細胞は、従来の用途、例
えば生体内の微量な有用物質の大量生産、人工臓器の構
築等に利用できる。

［実施例コ 以下本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ ポリエーテル系ウレタン樹脂プレポリマーを１５重量％
（固型分）ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）溶液とし
て該溶液をガラス板上に厚さ１■となるようにキャステ
ィングした。その後、２５℃の凝固洛中（水／ＤＭＦ）
で湿式処理することにより多孔質ウレタン樹脂を作製し
た。次に多孔質ウレタン樹脂をコラーゲン（高研社１１
　　Ｔｙｐｅ　Ｉ−ＰＣ）溶液に浸漬・乾燥させたのち
、リン酸緩衝液によりり３回洗浄することによりコラー
ゲンを固定化し、厚さＩ　ＩＩＩ、　　直径３４　＋ｎ
、　　平均孔径２３〜８０μの円形の細胞培養用基材を
得た。

培養する細胞のうちの一種類はラット肝実質細胞であり
、１ｉｓｔｅｒ　Ｒａｔ　（ｍａｌｅ、Ｇ退会）よりＩ
ｎ　５ｉｔｅコラゲナーゼ潅流法により得られた生存率
９８％以上のものであり、その平均直径は約１５μであ
った。肝実質細胞と共に培養するもう１種類の細胞とし
てラット肝細胞より株化したＲ−２細胞（７１ブミン産
生能（−）、平均直径約１０μ、上皮様）を用いた。こ
の２種類の細胞を１０：　１の細胞数比で培養液（１０
％牛脂児血清含有ダルベツコ変性イーグル培地）に４ｘ
ｌＯ・ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁した。上記の基材
を直径３５ｍｍのシャーレ底面に敷き、細胞懸濁液１．
０■ｌを基材上に均一に滴下し細胞を基材内部に吸収さ
せた。細胞導入後、基材を別のシャーレに写し換え、培
養液を２■ｌ入れてＣＯ雪インキュベーター（５％炭酸
ガス、９５％空気雰囲気、　　１００％湿度、３７℃）
内で培養し、２日毎に培養液を交換した。細胞導入割合
は、未導入細胞数をカウントすることにより滴下した細
胞当りの基材内部に保持された細胞数の割合を算出した
。その結果９５％であった。

機能発現の指標として２日毎に培養液を全交換し、得ら
れた培養上清から肝細胞特異的機能であるアルブミン産
生量をＥＬＩＳＡにより定量し、ｌＸｌ０’ｃｅｌｌｓ
当りのアルブミン産生量を用いた。結果は第１図に示す
（基材孔径と機能発現・維持の関係）実施例２ 実施例１においてウレタン樹脂の凝固浴の温度を４０℃
にすること以外は同様の方法で作製した孔径８０〜１５
０μの多孔質ウレタン樹脂を用いて同様に培養した。細
胞導入割合８５％であった。結果を第１図に示す（基材
孔径と機能発現・維持の関係）比較例１ 実施例１においてウレタン樹脂の凝固浴の温度を１０℃
にすること以外は同様の方法で作製した孔径５〜２０μ
の多孔質ウレタン樹脂を用いて同様に培養した。細胞導
入割合は３０％であった。結果を第１図に示す（基材孔
径と機能発現・維持の関係）比較例２ 実施例１においてウレタン樹脂の凝固浴の温度を６０℃
にすること以外は同様の方法で作製した孔径１８０〜２
５０μの多孔質ウレタン樹脂を用いて同様に培養した。

細胞導入割合は５０％であった。結果を第１図に示す（
基材孔径と機能発現・維持の関係）。

実施例３ 実施例１において、Ｒ−２細胞の代わりにラット繊維芽
細胞を用いること以外は同様の培養基材・培養方法で培
養した。細胞導入割合は９５９Ａであった。結果を第２
図に示す。

比較例３ 実施例１において、Ｒ−２細胞を使用しないで肝実質細
胞のみを用いること以外は同様の培養基材・培養方法で
培養した。結果を第２図に示す。

比較例４ 実施例３において、培養基材にコラーゲン処理を行わな
いこと以外は同様の基材を用いて、同様の培養方法で培
養した。結果を第２図に示す。

比較例５ 実施例３において、培養基材としてコラーゲンをコート
した直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレを用いたこ
と以外は同様の培養方法で培養した。

結果を第２図に示す。

［発明の効果］ 水基材および培養方法は、長期間細胞の高機能発現を維
持した培養が行えるという効果を有する。

この発見の細胞培養用基材および方法は、動物細胞の培
養によるホルモン等の有用物の生産に利用出来る他、た
とえば肝細胞を基材内部表面に接着、培養することによ
りハイブリット人工肝臓や肝細胞移植を行うための基材
に利用できるほか、機能細胞培養用キット等にも利用で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は培養日数とアルブミン産生量の関係を示すグラ
フである。第２図は培養日数とアルブミン産生量の関係
を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表面が糖質、蛋白質、脂質、合成高分子およびそれ
   らの複合化合物のいずれか一種類以上からなる多孔質構
   造体であり、その孔径が、同時に培養を行う２種類以上
   の細胞のうち最も大きな平均直径を有する細胞の１．５
   〜１０倍であることを特徴とする２種類以上の細胞を培
   養するための細胞培養用基材。 ２、請求項１記載の細胞培養用基材を用いて２種類以上
   の細胞を同時に培養することを特徴とする細胞培養方法
   。