JPH03227941A - 急性循環不全およびそれに伴う臓器機能不全に対する治療用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、急性循環不全およびそれに伴う臓器機能不全
に対する治療用医薬組成物に関する。

〈従来の技術〉 急性循環不全は、熱傷、外傷、手術侵襲、出血、細菌感
染、アレルギー、神経的要因等に伴う血流障害のことで
あり、全身的な代謝不全や臓器機能不全を引き起こして
病態を悪化させ、さらには患者を死に至らしめるもので
ある。

従って、本病態に対しては、迅速に対処し、治療するこ
とが必要である。　しかしながら、現在の治療法では必
ずしも十分とはいえず、また、本病態は、生体内で種々
の要因が複雑に関与し合って引き起こされると考えられ
ることから、作用機作の異なる種々の薬剤が必要とされ
、その開発が期待されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明者らは、急性循環不全およびそれに伴う臓器機能
不全に対する薬剤の開発を目的どして鋭意研究を重ねて
きた。　その結果、驚くべきことに、ヒト由来の蛋白質
であるヒト膵分訛・性トリプシンインヒビターが、上記
の病態の改善に有効であることを見出した。

このヒト膵分泌性トリプシンインヒビターは、ヒト膵液
中に存在する蛋白質であり、膵液中のトリプシンと結合
して、それを不活性化することから、その生理作用は膵
液中の蛋白質分解酵素による膵臓の自己消化の防御にあ
ると考えられている（吉用信男、菊池典久、胆と膵、７
巻、９−１５頁、１９８６年）。

しかしながら、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターは
、α１−アンチトリプシンやインターａトリプシンイン
ヒビター、アブロヂニン、ウリナスタチン等の生体内に
存在する他のプロテアーゼインヒビターと比較すると、
トリプシン阻害活性が一過性であることを含め、その阻
害の形式や酵素阻害スペクトラムが大きく異なっている
（小川道雄、胆と膵、３巻、８４７−８５６頁、１９８
２年、参照）。　さらに、最近では、ヒト膵分泌性トリ
プシンインヒビターがｉｎ　ｖｊｔ、ｒｏで線維芽細胞
のＤＮＡ合成を促進すること（Ｍｉｃｈｉｏ　Ｏｇａｗ
ａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、Ｃｈｅｍ
、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、、５０巻
、１５５−１５８頁、１９８５年）、癌患者の血清中に
高い濃度で検出されること（小川道雄ら、癌と化学療法
、１３巻、７３１−７３９頁、１９８６年）等も報告さ
れ、その生理作用は、他の生体内のプロテアーゼインヒ
ビターとは異なることが予惣されている。　しかし、ヒ
ト膵分泌性トリプシンインヒビターが生理的もしくは全
身的にいかなる作用を示すのかについては未だ不明であ
る。

本発明は、上記の、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビタ
ーに見出された、急性循環不全およびそれに伴う臓器機
能不全を改善するという新規な作用を医療の分野で有効
に利用するため、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビター
および／またはヒト膵分泌性１−リブシンインヒビター
を含む蛋白質を有効成分とする、急性循環不全およびそ
れに伴う臓器機能不全に対する治療用医薬組成物の提供
を目的とするものである。

〈課題を解決するための手段〉 本発明は、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターおよび
／またはヒト膵分泌性トリプシンインヒビターを含む蛋
白質を有効成分として含有することを特徴とする急性循
環不全およびそれに伴う臓器機能不全に対する治療用医
薬組成物を提供するものである。

前記有効成分は、下記４種のアミノ酸配列のうちの１種
を少な（ともその一部に含む蛋白質のうちの１種以上で
あることが好ましい。

（ａ） ５１Ｏ Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ５２０ Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ５３０ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ５４０ Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌ
ｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ５ Ｇ］、ｎ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　ＧＬｙ　　Ｐｒｏ　
　Ｃｙｓ（ｂ） １　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　
　　　１０Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　
Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　ＡＬａ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　
Ｔｙｒ１５　　　　　　　　　　　　　　　２０Ａｓｎ
　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ
　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ２５　　　
　　　　　　　　　　　　　３０Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　
Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　　Ｇｌ
ｙ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ３５　　　　　　　　　　　　
　　　４０Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　
Ｃｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　　
Ｇｌｕ４５　　　　　　　　　　　　　　　　５０Ａｓ
ｎ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅｉｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ １ｙ Ｐｒ。

Ｃｙｓ （ｃ） １　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　
　　　　　１０Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ
　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ
　　Ｔｙｒ１５　　　　　　　　　　　　　　　　２０
Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　
Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ２５
　　　　　　　　　　　　　　　３０Ａｓｐ　　Ｐｒｏ
　　Ｖａｌ　　Ｃｙ、ｓ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ａｓ
ｐ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ３５　　　　　　　
　　　　　　　　　４０Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　
　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｌ、Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　
Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ５ Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　
Ｃｙｓｓｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ ５ｎ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　　Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　　Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ ０ Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ ０ Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ ０ Ｃｙｓ　Ｖａｌ ０ Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ５ Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ５ Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ５ Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｇ］、ｕ５ Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅＧｉｎ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓまた、前
記医薬組成物は、注射剤とすることが好ましい。

以下に、本発明を詳述する。

本明細書における記載において、ヌクレオチド、アミノ
酸、ペプチドその他に関して略号で表記する場合、当該
分野における慣用略号を使用するが、それらの例を以下
に列記する。

ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的ＤＮＡ ｍ　ＲＮ　Ａ　：伝令ＲＮＡ Ａ　　　：アデニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　・グアニン Ｃ：シトシン ＳＤ配列：シャインーダルガルノ配列 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫
酸ナトリウム ｌａ Ａｒｇ ｓｎ ｓｐ ｙｓ ｉｎ ｌｕ ｌｙ ｉｓ １ｅ ｅｕ Ｍ　　ｅ　　ｔ ｈｅ Ｐｒ。

ｅｒ ｈｒ ｒｐ ｙｒ ａｌ ｙｓ ：アラニン ：アルギニン ：アスパラギン ：アスパラギン酸 ニジスティン ：グルタミン ：グルタミン酸 ニゲリシン ：ヒスチジン ：イソロイシン ：ロイシン ：メチオニン ：フェニルアラニン ニゲリシン ：セリン ：スレオニン ：トリブトファン ：チロシン ：バリン ：リジン １ （Ａ）本発明の医薬組成物が有効成分として含有する蛋
白質 本発明の医薬組成物が有効成分として含有する蛋白質は
、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターもしくはヒト膵
分泌性トリプシンインヒビタ一部分をその分子中に含む
蛋白質である。

ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターには、少な（とも
４種の分子種が存在することが知られている。　それら
は、アミノ酸配列が微妙に異なっており、具体的には、
前記（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列で示されるものであ
る。

なお、前記（ｂ）は、前記（ａ）の第４５番目のアミノ
酸がグルタミンからグルタミン酸に置換されたものであ
り、前記（Ｃ）は、前記（ａ）の第５１番目のアミノ酸
がグルタミンからグルタミン酸に置換されたものであり
、また、前記（ｄ）は、前記（ａ）の第１番目〜第５番
目のアミノ酸が欠失したものである。

現在、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターのアミノ酸
配列については、（ａ）のアミノ酸配列が基本の形であ
り、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に示したアミノ酸配列
は、それぞれ基本のアミノ酸配列の一部に置換もしくは
欠失が生じた形であると考えられている（吉用信男、菊
池典久、胆と膵、７　（１）、９−１５頁、１９８６年
）。

しかしながら、上記のアミノ酸配列で示される４種の分
子種の他に、ヒスチジンを含む分子種が存在することも
報告されており（　Ｇ．　Ｆｅｉ　ｎｓｔｅｉｎ等、Ｂ
ａｙｅｒ−Ｓｙｍｐｏｓｊｕｍ　Ｖ、１９９２１２　頁
、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　出版、Ｂｅｒｌｉ
ｎ　９Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９
７４年）、また、ヒト各個体ごとに天然のアレル変異体
が存在しうることをも考慮すると、ヒト膵分泌性トリプ
シンインヒビターのアミノ酸配列を上記の４種に限定す
ることはできない。　さらに、上記の４種の分子種に対
し、天然のアミノ酸や誘導体アナログを導入して、その
アミノ酸配列の一部に置換、欠失、付加等を牛じさせた
誘導体を製造すること、および、上記４種の分子種やそ
の誘導体に糖を付加したり、アルキル化、酸化、還元、
氷解等で種々の化学修飾を施すこと、また、薬理学上許
容されつる酸、塩基との塩を形成させることは、近年の
技術の進歩から、当業者にとって極めて容易なことであ
る。　そ　して、このような誘導体等の中にも、急性循
環不全およびそれに伴う臓器機能不全を改善する作用を
示すものは多い。

従って、本発明の医薬組成物が有効成分として含有する
蛋白質は、主として、前記（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配
列のうちの１種によって示される、ヒト膵分泌性トリプ
シンインヒビターの４種の分子種を指すが、前記４種の
アミノ酸配列のうちの１種の配列中の１個以上のアミノ
酸が置換、欠失、付加したアミノ酸配列を少な（ともそ
の一部に含む蛋白質であって、急性循環不全およびそれ
に伴なう臓器機能不全を改善する作用を有する蛋白質を
も包含する。

そして、本発明の医薬組成物は、有効成分として、前記
４種の分子種をはじめとするこのような急性循環不全お
よびそれに伴う臓器機能不全を改善する蛋白質（以下、
ヒト膵分泌性トリプシンインヒビター等という）を、１
種以上含有する。

（Ｂ）本発明の医薬組成物が有効成分として含有する蛋
白質（ヒト膵分泌性トリプシンインヒビター等）の入手 本発明の医薬組成物が有効成分として含有する蛋白質と
しては、医薬組成物に供する事が可能な純度のものであ
ればすべて使用可能であるが、一般には、純度の高いも
のを使用することが好ましい。

本蛋白質を入手する方法としては、所望の純度の蛋白質
を得ることができるような方法であればいかなるものも
利用することが可能であるが、例えばヒト膵液な材料と
した公知の方法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９８巻、６８
７−６９４頁、１９８５年）、化学的に合成する方法、
本蛋白質を生産する細胞を培養してその培養上清から単
離する方法、組換えＤＮＡ技術を用いて生産する方法等
から適宜選択することができる。

しかしながら、一般に、蛋白質を含む医薬組成物の製造
には当該蛋白質が大量に必要となることを考慮すると、
本蛋白質の入手にあたって、特に組換えＤＮＡ技術を用
いた方法を利用することが好ましい。

（Ｃ）組換えＤＮＡ技術を用いた当該蛋白質の生産 組換えＤＮＡ技術を用いた当該蛋白質の生産は、現在一
般に行われている組換えＤＮＡ技術の工程に沿って実施
することができる。　すなわち、当該蛋白質をコードす
るＤＮＡを得、このＤＮＡを発現させる機能を持つ発現
用ベクターを作製し、次に、この発現用ベクターを適当
な宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換せしめ、得ら
れた形質転換体によって生産される当該蛋白質を形質転
換体もしくはその培養液から回収し、精製する方法であ
る。　以下に、各々の工程について、その詳細を述べる
。

当該蛋白質をコードするＤＮＡは、化学的に合成するか
、または天然物を材料として調製することができる。　
化学的に合成するには、全自動ＤＮＡ化学合成機（例え
ば３８０Ａ型、アプライド・バイオシステムズ社）等を
用いて所望のＤＮＡを合成した後、適当なベクターに組
み込んでクローン化する方法等がある。

一方、天然物を材料とする場合には、 公知の方法（例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｔ、
　Ｍａｎｉａｔｉｓ等編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２年）に準
じて、当該蛋白質に対するｍＲＮＡを有するヒト組織あ
るいはヒト細胞から当該蛋白質に対するｍＲＮＡを抽出
し、それを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる
。　また、公知の方法（Ｌａｖｎ、　Ｒ，ｌｉｔ等、Ｃ
ｅ１ｌ、１５巻、１１５７１１７４頁、１９７８年）に
したがってヒト染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、適
当なプローブを用いて当該蛋白質をコードするＤＮＡを
検出し、それを単離することもできる。

発現用ベクターについては、当該蛋白質をコードするＤ
ＮＡを発現させつるものであれば全て使用可能であるが
、好ましくは、当該蛋白質をコードするＤＮＡ、これを
発現させるためのプロモーターおよびＳＤ配列（もしく
は任意のリポソーム結合部位）、更に必要に応じてシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡを含有し、使用する宿
主内で複製可能なベクターを選択する。　また、使用す
るプロモーター、ＳＤ配列（もしくは任意のリポソーム
結合部位）およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
としては、使用する宿主内で機能するすべてのプロモー
ター、ＳＤ配列（もしくは任意のリポソーム結合部位）
およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡが使用可能
であり、これらは化学的に合成するか、あるいは使用す
る宿主、ウィルス、プラスミド、ファージから入手する
ことが可能である。

一方、使用可能な宿主細胞としては、発現用ベクター内
に組み込まれた当該蛋白質をコードするＤＮＡを発現さ
せる機能を有するものであれば全て使用可能であるが、
好ましくは、発現用ベクターを複製し、当該蛋白質を生
産する能力が高いものを使用する。　これらのプロモー
ター　ＳＤ配列（もしくは任意のリポソーム結合部位）
、およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡと発現用
ベクター、宿主は、それぞれ互いに機能しつる組み合わ
せで使用可能である。　例えば宿主とベクターとの組み
合わせの例としては、宿主として大腸菌に一１２株、ベ
クターとして、プラスミドｐＢＲ３２２由来のトリプト
ファンプロモーター、トリプトファンＳＤ配列、アルカ
リ性フォスファターゼのシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡを含有する発現用ベクターを使用する組み合わせ
があげられる。

また、動物細胞を使用する例としては、宿主としてＣＨ
Ｏ細胞、また、ベクターとしてシミアンウィルス４０　
（ＳＶ４０）の初期プロモーターを含有する発現用ベク
ターを使用する組み合わせがあげられる。

発現用ベクターで形質転換された宿主は、微生物あるい
は動物細胞を培養するのに用いられる一般的方法、例え
ば「生物化学工学」　（合葉修−等著、１９７６年、東
京大学出版会）、「組織培養」　（中井準之助等編、１
９７６年、朝食書店）等に記載された方法に準じて培養
することができる。　形質転換された宿主によって生産
される当該蛋白質は、最終的に、形質転換された宿主も
しくはその培養液から単離、精製して回収することがで
きる。　精製は、多くの文献や底置、例えば、「生化学
実験講座１：タンパク質の化学」　（日本生化学金線、
１９７６年、東京化学同人出版）に記載された方法を参
考にして実施することが可能であり、すなわち、透析、
塩析、ゲルろ過、酸沈殿、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー、電気泳動等を適宜組み合わせて行な゛
うことができる。

１　日 （Ｄ）本発明の医薬組成物中の補助成分および好ましい
投与用量 本発明の医薬組成物としては、前記ヒト膵分泌性トリプ
シンインヒビター等であって、凍結乾燥や除菌濾過等、
製剤学的に必要な工程で処理されたもの単独でも、充分
その効果を医療の分野に提供することができるが、一般
的には、有効成分である前記ヒト膵分泌性トリプシンイ
ンヒビター等に加えて、さらに、製剤学的に許容されつ
る補助成分を含むものを使用する。

この補助成分とは、具体的には賦形剤、結合剤、希釈剤
等の担体、および安定剤、保存剤、溶解補助剤等のこと
である。

担体には、例えば、炭酸カルシウム、乳糖、蔗糖、ソル
ビット、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セ
ルロース誘導体、ゼラチン、カカオ脂、２回蒸留水、塩
化ナトリウム水溶液、リンゲル溶液、グルコース溶液、
ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）等があるが、担体な含め
、安定剤、保存剤、溶解補助剤等の補助成分は、製剤学
的に許容されつるものであればすべて本発明の医薬組成
物の補助成分として使用することが可能であり、使用す
る物質の種類や量等は、製剤学的に許容されつる範囲よ
り、必要に応じて適宜選択することができる。

本発明の医薬組成物の投与量は、急性循環不全およびそ
れに伴なう臓器機能不全を改善することが可能な用量で
あればよく、治療を受ける患者の状態、年齢、性別、体
重等により異なるが、通常、成人に対し、有効成分で０
．１〜２００　ｍｇ／Ｋｇ　、好ましくは１〜１００　
ｍｇ７Ｋｇを用いる。

本発明の医薬組成物は、種々の剤型に調製されつる。　
従って、患者の状態に応じて、経口投与、筋肉内投与、
腹腔的投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等様々
な投与方法にて投与しつるが、特に注射剤として調製さ
れた本発明の医薬組成物を、静脈内に投与する方法にて
使用することが好ましい。

〈実施例〉 以下、実験例および実施例をもって本発明の詳細を示す
。

ここで示す実験例および実施例は、−例として示される
ものであり、従って、本発明は、これらの実験例、実施
例に限定されるものではない。

なお、各実験において、そのアミノ酸配列が前記（ａ）
、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）である蛋白質のいずれも
が同様の効果を示したので、以下の実施例および実験例
では、特に規定する場合を除き、医薬組成物の有効成分
として、そのアミノ酸配列が前記（ａ）である蛋白質を
用いた場合について述べた。

（実施例１）組換えＤＮＡ技術を用いたヒト膵分泌性ト
リプシンインヒビターの 入手方法 本発明の医薬組成物が有効成分として含有する蛋白質を
、特開昭６４−２７４７３号を参考として、大腸菌を宿
主とした組換えＤＮＡの技３ 術を用いて作製した。

（１）発現ベクターの作製 まず、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターのアミノ酸
配列に相当する塩基配列およびλファージｃ■のＳＤ配
列をコードする塩基配列を含む２０４ｂｐのＤＮＡ配列
を設計し、このＤＮＡ配列を、上下両鎖各々６本ずつの
８０１〜Ｓ１２の計１２本の一本鎖ＤＮＡ　（オリゴマ
ー）に分割した（第１図参照）。　ついで、この１２本
のオリゴマーを全自動ＤＮＡ合成機（モデル３８０、ア
プライド・バイオシステムズ社）にて化学合成し、逆相
カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（以後Ｈ
ＰＬＣと略す）にて精製した。　さらに、オリゴマーＳ
Ｏ１およびＳ１２をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを作
用させてリン酸化し、この２本のオリゴマーおよび残り
の１０本のオリゴマー（８０２〜５１１）を混合後、ア
ニーリングさせることによって連結し、２０４ｂｐの二
本鎖ＤＮＡ断片を構築した。

　４ 方、プラスミドｐＢＲ３２２の誘導体であり、大腸菌内
にて複製する機能、アンピシリン耐性遺伝子およびトリ
プトファンプロモーターを有するプラスミドｐ　Ｍ　３
２０　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　、　１７巻、１３
１１３４頁、１９８６年および第２図参照）を制限酵素
Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＢａｍｔ（Ｉにて二重消化
し、得られたＤＮＡ断片混合物を０．７％アガロースゲ
ル電気泳動後、約３．２ｋｂのＤＮＡ断片をジエチルア
ミノエチルセルロース紙（以後、ＤＥＡＥセルロース紙
と略す）に吸着させ、約０．６ｋｂのＤＮＡ断片と分離
した。　さ　らに、ＤＥＡＥセルロース紙を高濃度塩溶
液（２ＭＮａＣ１／１０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５）／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）にて洗浄し、約３．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片なりＥＡＥセルロース紙より回収した。

次に、このＤＮＡ断片と化学合成して得られた上述の２
０４ｂｐの二本鎖断片なＴ４　　ＤＮＡリガーゼを作用
させて連結し、連結後得られたＤＮＡにて大腸菌ＨＢ　
１０１株を形質転換させて、所望のアンピシリン耐性コ
ロニーを分離した。　得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＭ４５０と命名した（
第２図参照）。

次に、んファージｃ■のＳＤ配列をコードする塩基配列
（Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ　、　Ｒ，Ｗ、Ｈｅｎｄｒｉｘ編
著、１９８３年、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、アルカリ性フォスファ
ターゼのシグナルペプチドである２１個のアミノ酸をコ
ードする塩基配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ
、　、　９巻、５６７１−５６７８頁、１９８１年）、
およびヒト膵分泌性トリプシンインヒビターのアミノ酸
配列のアミノ末端側のアミノ酸をコードする塩基配列を
含む１０２ｂｐのＤＮＡ配列を設計した（第３図参照）
。　このＤＮＡ配列を、上下各々３本ずつの３１５〜Ｓ
２０の計６本のオリゴマーに分割し、前述の方法にて各
オリゴマーを化学合成した後、精製して回収した。　つ
いで、オリゴマー６１５およびＳ２０を前述の方法にて
リン酸化後、これら２本のオリボマーおよび残りの４本
のオリゴマーを混合してアニーリングさせ、１０２ｂｐ
の二本鎖ＤＮＡを構築した。

また、前述のｐＭ４５０（第２図参照）を制限酵素Ｈｉ
ｎｄ　ｍおよびＮｒｕ　Ｉにて二重消化して得たＤＮＡ
断片のうち、約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を前述のＤＥＡ
Ｅセルロース紙を用いた方法により単離した。　得られ
た３、４ｋｂのＤＮＡ断片と前述の化学合成によって得
られた１０２ｂｐのＤＮＡ断片とをＴ４　　ＤＮＡリガ
ーゼを作用させて連結後、このＤＮＡにて大腸菌Ｈ８１
０１株を形質転換させ、所望のアンピシリン耐性コロニ
ーを分離した。　得られた形質転換体よりプラスミドＤ
ＮＡを分離し、このプラスミドをｐＭ４６３とした（第
３図（Ａ）参照）。

（２）ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターを発現する
大腸菌株の作製 大腸菌株Ｊ　Ｅ　５５０５株（Ｍｏ１ｅｃ、　ｇｅｎ、
　Ｇｅｎｅｔ、、１６７巻、１−９頁、１９７８年）を
、公知の方法（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１巻、
ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、　　Ｄ、　
　Ｍ、　　Ｇｌｏｖｅｒ編、１０９−１３５頁、１９８
５年、Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）にてコンピテント細胞と
し、実施例１−（２）にて作製したプラスミドｐＭ４６
３にて形質転換した。　アンピシリン耐性を示すコロニ
ーを選択し、得られた形質転換体を９Ｍ４６３／Ｊ　Ｈ
５５０５株とした。

（３）ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターの分泌発現 ９Ｍ４６３／　Ｊ　Ｈ５５０５株をＬ培地にて一夜振ど
う培養し、その培養液を、５０倍量の１００μｇ／ｍＬ
アンピシリン含有し培地に植菌し、３７℃にて一夜振と
う培養した。　この培養液３００　ｍＬを、６０００回
転／分（以後ｒｐｍと略す）で５分間遠心分離（２０Ｒ
−５２遠心分離機およびＲＰＲ−２０−２０−ター使用
、日立工機■）して集菌後、１００μｇ／ｍＬアンピシ
リン含有し培地２Ｌに懸濁し、３７℃にて、対数増殖後
期まで、ジャーファーメンタ−（モデルＭＢ−Ｃ１■い
わし　７ や生物科学）にて培養した。　この培養液を６００Ｏｒ
ｐｍ　　で１０分間遠心分離して集菌後、ｉｏｏμｇ／
ｍＬアンピシリン含有Ｍ９ＣＡ培含有上９ＣＡ培地２Ｌ
　３７℃にて１時間培養後、インドールアクリル酸を終
濃度４０μｇ／ｍＬとなるように添加し、さらに−夜培
養した。

なお、通気量、撹拌速度およびｐＨは、それぞれ１．５
〜３Ｌ／分、約８０　Ｏｒｐｍおよび約７に制御した。

　得られた培養液を、４℃にて、６０００ｒｐｍ　　で
５分間遠心分離（ＲＰＲ−２０−２０−ター）して菌を
除いた後、培養上清をＲＩＡ　　（塩野義株式会社製、
ｒ　ＰＳＴＩテストジオツギ」）にて調べた結果、ヒト
膵分泌性トリプシンインヒビターが、培養上清１ｍＬあ
たり２８μｇ認められた。

（４）培養上清から得られたヒト膵分泌性トリプシンイ
ンヒビターの精製方法 まず、アフィニティー・クロマトグラフィー用に、ヒト
膵分泌性トリプシンインヒビターに対する単クローン性
抗体を作製した。　実施例　８ ｌ−（３）と同様の方法で、最終的に得られた９Ｍ４６
３／Ｊ　Ｅ５５０５株培養上清３００ｍＬを、分画分子
量３５００の透析膜（スペクトラム・メディカル・イン
ダストリーズ社）を使用して、０、ＩＮ酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ４，５）に対して透析後、濃縮機（グイ
アフロ−ＹＭ２）を用いて濃縮した。　この濃縮液をセ
ファデックスＧ−５０カラム（２，５ｃｍφｘ１００ｃ
ｍ）へ３０　ｍＬ／時間の速度で通じた後、ＲＩＡ（既
出）にて検知することにより、免疫学的活性を有する画
分を分取し、免疫用抗原とした。

次に、公知の方法（「単クローン性抗体ハイブリドーマ
とＥＬＩＳＡ　Ｊ　、岩崎辰夫等、１９８３年、講談社
サイエンティフィック）に従い、所望の単クローン性抗
体産生株を分離した。　すなわち、ヒト膵分泌性トリプ
シンインヒビター２０ＬＬｇを含む免疫用抗原５０μＬ
とフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製、以後
ＦＣＡと略す）５０μＬを混合し、これを乳化せしめた
後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下へ投与した。　さらに、
２週間間隔にて同量の免疫用抗原とＦＣＡとの乳化物を
３回繰り返し腹腔内へ投与し、最終投与の４日後、肺臓
を摘出した。　肺臓より分離した牌細胞とマウスミエロ
ーマ細胞Ｐ３Ｕｌ細胞株とをポリエチレングリコール１
５００を用いて細胞融合せしめ、ついで、融合せしめた
細胞集団を１１００ＬＬヒボキザンチン１０．４μＭア
ミノプテリン／１６μＭチミジン／１０％ウシ胎児血清
／ＲＰＭＩ　１６４０培地にて培養することにより、牌
細胞とＰ３Ｕ１細胞との融合細胞を選択した。

選択した細胞の培養上清中における所望の抗体の有無を
、免疫用抗原をウェル底面に固定した９６穴マイクロプ
レートを使用したＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　（以後、ＥＬＩＳＡ
と略す）にて判定した。　ついで、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ
にて陽性と判定された細胞を大量培養し、所望の単クロ
ーン性抗体を調製した。　すなわち、ＥＬＩＳＡ陽性細
胞株を約１０″細胞／ｍＬの濃度にて５μｇ／　ｍ　ｌ
−インシュリン１５μｇ／ｍＬ　ｌ−ランスフェリン１
０．１％ウシアルブミン／ＲＰＭＩ　１６４０培地２Ｌ
に分散せしめ、３７℃にて１０日間培養した。　培養液
を８００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清に終
濃度６０％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４
℃にて、スターラーにて２時間撹拌することによって塩
析した。　ついで、４℃にて、８０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離した後、沈殿な０，１Ｍリン酸緩衝液に溶解
した。　次に、本溶液をプロティンＡセファロース４Ｂ
カラムにアプライした後、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）にて溶出操作を行ない、所望の単クロー
ン性抗体４７ｍｇを得た。　この単クローン性抗体を、
平衡化状態のブロムシアン活性化セファロース４Ｂに約
１ｍｇ／ｍＬとなるように結合させ、単クローン性抗体
結合セファロース４Ｂとした。

以上のようにして得られた単クローン性抗体結合セファ
ロース４Ｂを用いて、以下の方法で、培養上清中からヒ
ト膵分泌性トリプシンイ１ ンヒビターを精製した。　すなわち、実施例１−（３）
で最終的に得られたｐＭ４６３／Ｊ　Ｅ　５５０５株の
培養上清８５０　ｍ　Ｌを分画分子量３５００の透析膜
（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社）で
０．ＩＮ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４，５）に対し
て透析後、濃縮機（ダイアフローＹＭ２　）を使用して
濃縮した。　この濃縮液をセファデックスＧ−５０カラ
ム（２，５ｃｍφＸ　１００　ｃｍ）ヘアブライし、Ｏ
，ＩＮ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４，５）で３０　
ｍＬ／時間の速度で溶出させ、ＲＩＡ　　（既出）にて
免疫学的活性が検出された画分を分取した。

分取した画分をダイアフローＹＭ２にて濃縮し、さらに
生理食塩水に対して透析後、前述の単クローン性抗体結
合セファロース４Ｂカラムヘアブライし、アフィニティ
ー・クロマトグラフィーを行なった。　溶出はＯ，１Ｍ
グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）にて行い、ＲＴＡ　
　（既出）にて免疫学的活性が検出できた画分な再びダ
イアフローＹＭ２にて濃縮後、分画分子量２ ３５００の透析膜（既出）を使用して生理食塩水に対し
て透析した。　透析後、逆相カラム（Ｃ１８）を使用し
たＨＰＬＣにアプライし、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ４，５）とアセトニトリルとの混合液を、
アセトリニトリルの濃度勾配が０〜３０％となるように
通じて展開させ、２８０ｎｍの吸光度を測定したところ
、アセトニトリル濃度２８％付近に蛋白質のシングルビ
ークが認められた。

精製されたヒト膵分泌性トリプシンインヒビターの比活
性値を、小川等の報告（胆と膵、１巻、１６３１〜１６
３８頁、１９８０年）に準じた方法で測定したところ、
約３０００７ＩＵ／ｍｇ蛋白質であった。　さらに、パ
イロザルトユニット（ザルトリウス株式会社）を用いて
リポポリサッカライドを除去し、最終的に一４０℃で凍
結を行ない、凍結乾燥機（Ｂｉｏ　Ｆｒｅｅｚｅ　ＢＦ
−２、ビーエム機器株式会社）を用いて凍結乾燥した。

なお、本実施例で使用しているＰ　ＲＭ　４６３／　Ｊ
　Ｅ　５５０５株は、工業技術院に寄託されている（受
託番号；微工研条寄第１９４９号）。

（実験例１）ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターの有
効性 体重８〜１６ｋｇのイヌを、ベンドパルビタール麻酔下
、右大腿動脈から２　ｍｌ／ｋｇ　／分の速度で脱血し
、平均動脈圧を４０　ｍｍＨｇまで低下せしめ、さらに
、必要に応じて脱血、環血を行ない、３０分間、平均動
脈圧を４０　ｍｍＨｇに維持した。　　１５分後、脱血
量の１／２を環血し、引き続き輸液を行ない、３時間後
の生存率を求めた。　なお、対照群のイヌには生理食塩
水を、実験群のイヌには実施例１で得たヒト膵分泌性ト
リプシンインヒビターを生理食塩水に溶解したものを、
それぞれ脱血終了時に１／４量急速静注し、残りの３／
４量を１時間かけて持続投与した。

結果は表１に示した。

表 （実験例２）ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターの毒
性に関する試験 実施例１で得たヒト膵分泌性トリプシンインヒビターを
生理食塩水に溶解し、１群１０匹の６週齢のＩＣＲ系マ
ウスおよびＷｉｓｔａｒ系ラットに静脈内投与し、２週
間観察した。　その結果、ヒト膵分泌性トリプシンイン
ヒビター１２００ｍｇ／ｋｇを投与しても、マウスおよ
びラットのいずれにも死亡例は認められなかった。

（実験例３）注射剤の調製 （１）実施例１で得たヒト膵分泌性トリプシンインヒビ
ターを、注射用蒸留水にて調製した０、１４Ｍ塩化ナト
リウム含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶
かして最終濃度を５　ｍｇ／ｍＬとした。　無菌の濾過
膜（０，２２μｍのマイレックスＧＶフィルター　ミリ
ボア社製）にて除菌濾過した後、２ＯｍＬずつガラス容
器に分注して密封し、水溶性注射剤とした。

（２）実施例１で得たヒト膵分泌性トリプシンインヒビ
ターを、注射用蒸留水にて調製した発熱性物質不含の０
．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含む１／１５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）に溶かして最終濃度を５　ｍｇ／ｍＬ
とした。　この溶液に、塩化ナトリウムを終濃度が７５
ｍＭとなるように加えた。　この溶液を無菌の濾過膜（
０，２２μｍのマイレックスＧＶフィルター、ミリボア
社製）にて除菌濾過した後、２ＯｍＬずつガラス容器に
充填して密封し、水溶性注射剤とした。

（３）実施例１で得たヒト膵分泌性トリブシシンインヒ
ビターを、注射用蒸留水にて調製した０、１４Ｍ塩化ナ
トリウム含有０．０ＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
に溶かして最終濃度を５　ｍｇ／ｍＬとした。　この溶
液にヒト血清アルブミンを最終濃度１％（ｗ／ｖ）とな
るように溶解し、無菌の濾過膜（０，２２μｍのマイレ
ックスＧＶフィルター、ミリボア社製）にて除菌濾過し
た後、５ｎ＋Ｌずつガラス容器に分注した。

次いで、−４０℃で１時間凍結を行ない、−１０℃で真
空度０．０４＋＋＋ｍＨｇで凍結乾燥機を用いて凍結乾
燥し、定法により無菌状態で密封し、注射用凍結乾燥粉
末剤とした。

〈発明の効果〉 ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターおよび／またはヒ
ト膵分泌性トリプシンインヒビターを含む蛋白質を有効
成分として含有する医薬組成物は、急性循環不全および
それに伴う臓器機能不全に対して有効である。　従って
、本病態の患者の治療に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、んファージｃＩＩのＳＤ領領域よびヒト膵分
泌性トリプシンインヒビターをコードする２０４ｂｐＤ
ＮＡ配列、ならびに該ＤＮＡによってコードされる翻訳
開始アミノ酸のメチオニンおよびヒト膵分泌性トリプシ
ンインヒビターのアミノ酸配列を示す図である。 第２図は、プラスミドｐＭ４５０の造成を示すフローチ
ャートである。 第３図（Ａ）は、プラスミドｐＭ４６３の造成の過程を
示すフローチャートであり、第３図（Ｂ）は、プラスミ
ドｐＭ４６３中に組み入れたアルカリ性フォスファター
ゼシグナルペプチドとヒト膵分泌性トリプシンインヒビ
ターを連結した蛋白質をコードするＤＮＡ配列ならびに
該ＤＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を
示す図である。 ９

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターおよび／ま
   たはヒト膵分泌性トリプシンインヒビターを含む蛋白質
   を有効成分として含有することを特徴とする急性循環不
   全およびそれに伴う臓器機能不全に対する治療用医薬組
   成物。
2. （２）前記有効成分が、下記４種のアミノ酸配列のうち
   の１種を少なくともその一部に含む蛋白質のうちの１種
   以上である請求項１に記載の急性循環不全およびそれに
   伴う臓器機能不全に対する治療用医薬組成物。 （ａ） 【遺伝子配列があります】 （ｂ） 【遺伝子配列があります】 （ｃ） 【遺伝子配列があります】 （ｄ） 【遺伝子配列があります】
3. （３）請求項１または２に記載の急性循環不全およびそ
   れに伴う臓器機能不全に対する治療用医薬組成物を含有
   する注射剤。