JPH03224465A - 肉質改良剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は牛、豚、鶏等の肉の中で、硬くてスジの多い低
品質部位の肉質を調理前に改良し、付加価値を向上させ
る方法に関するものである。

〔従来の技術〕

牛、豚、鶏等の食肉中には、腿、すね等のようにスジが
多く、硬くて食べにくい部位が存在する。

肉の硬さは筋肉繊維表層を包む硬タンパク質、主として
エラスチンが関与しており、従来から機械的な破壊の他
に、パパイン、プロメライン、フィシンなど植物由来の
タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）が肉の軟化に用い
られてきた。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、これらの酵素は特殊な立体構造を持つエ
ラスチンにはほとんど作用せず、逆に筋肉タンパク質を
分解するため、軟かくはなるが弾力がなくなったり、べ
とつき感が生じて肉の本来有する食感がそこなわれてし
まう欠点があった。

また牛肉の輸入自由化（１９９１）に伴って大量に生じ
るスジの多い低品質部位の有効利用は大きな課題である
。したがってエラスチンを特異的に分解する酵素、エラ
スターゼの利用が待ち望まれているのが現状である。

（課題を解決するための手段〕 本発明者等は、上記問題点である低品質部位の肉質を改
良するべく鋭意研究を行ったところ、アルカリ性バチル
ス属細菌の生産するエラスターゼに注目することにより
、上記課題を解決し、本発明を完成に至らしめた。すな
わち、本発明は低品質の肉にアルカリ性バチルス属細菌
の生産する工ラスターゼを添加して、エラスチン分解反
応を行なわせることを特徴とする肉質改良法及びアルカ
リ性バチルス属の生産するエラスターゼを含有する肉質
改良剤に関するものである。

エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ　）は動脈壁や股、皮膚な
どの伸展性に冨んだ組織に存在している弾性線維を構成
する不溶性の硬タンパク質である。ペプチド鎖間に架橋
が多く　、Ｇｕｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ・・・・・
・というアミノ酸配列単位を豊富に含みコラーゲンと同
様にヒドロキシプロリンも含んでいる。一方、架橋構造
は４残基のＬｙｓの側鎖から導かれたピリジン環をもつ
デスモシン、イソデスモシンなどを含み、−Ｌｙｓ−八
１ａ−Ａｌａ−（Ａｌａ）−Ｌｙｓ−の配列がα−へワ
ックスに近い構造をとりながら多数存在し、Ａｌａをは
さんで対をなしているＬｙｓ残基の所に架橋構造が形成
されてくるのであろうと考えられた。アミノ酸組成は非
極性アミノ酸のＡｌａとＧｌｙが全体の約５５％を占め
ており、その他ではＶａｔ、　Ｌｅｕ。

Ｐｒｏなどが多く存在する。このような特殊構造のため
一般のプロテアーゼは作用しにくいが、もし、Ａｌａ−
Ａｌａ−（Ａｌａ）−という配列を選択的に切断できる
プロテアーゼであればエラスチンの架橋部分を切断して
分解することができると考えられる。こうしたエラスチ
ンを分解する酵素即ち、エラスターゼは動物の膵臓をは
じめ植物、カビ、放線菌、細菌から分離されている（Ｍ
ｏｒｉｈａｒａ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ。

（１９６５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　ハ［、
３２９５−３３０４；　Ｍａｎｄｌ。

１、　ｅｔ　ａｌ、　（１９６０）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、９１゜４７−５３；　
０ｚａｋｉ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　（１９７５）　Ｊ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

７７、１７１−１８０；　Ｍｏｒｉｈａｒａ、　Ｋ、　
ｅｔ　ａｌ、　（１９６７）　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、月２０　＋　６８
−７８；　Ｍａｎｄｌ、１．ｅｔ　ａｌ。

（１９６２）　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｍｅｄ、　１０９　、９２３−９２５）。

山崎らは、酵素分解を受けにくいエラスチンを高アルカ
リ域で変性の効果を加えつつ酵素分解する目的で、高ア
ルカリ域でよく作用するエラスターゼをアルカリ性バチ
ルス属細菌（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃＢａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐ、　）　Ｙ　ａ　−Ｂ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
０１７）の培養濾液より見出した（Ｔｓａｉ、Ｙ、Ｃ，
ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ
、　Ｌ、５７７−５８３）　、その後、本酵素の精製、
酵素学的性質の解析を行ない（Ｔｓａｉ、　Ｙ、Ｃ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ
ｈｐｙｓ、　Ａｃｔａ、　８８３，４３９４４７；　Ｔ
ｓａｉ、　Ｙ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、（１９８Ｂ）　Ａｐ
ｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４．３１５６−３１６１　）　
、最近、本酵素遺伝子のクローニング、塩基配列の決定
にも成功している（Ｋａｎｅｋｏ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、
　　（１９Ｂ’？）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

皿、　５２３２−５２３６　）。

本酵素のＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列は
枯草菌由来のアルカリ性セリンプロテアーゼ、サチライ
シンと約５０％の相同性があり、特に活性中心（Ａｓｐ
　３２．　Ｈｉｓ　６４．　Ｓｅｒ　２２１　）の近傍
は良く保存されている。したがって基質特異性の差異を
はじめ、両酵素の構造と機能の相関関係を解析すること
は極めて興味深い。さて、応用面であるが、現在のとこ
ろ、この酵素の利用例については報告されていない。

さて、食肉軟化に関しては、現在欧米ですでに市販され
ている食肉軟化剤（ａ＋ｅａｔ　ｔｅｎｄｅｒｉｚｅｒ
　）に含まれているパパイン、プロメラインなど植物由
来のプロテアーゼが知られているが、筋肉タンパク質を
分解するため軟かくはなるが、弾力がなくなりべとつく
感じで肉の食感がそこなわれてしまう。また国内の畜肉
メーカーにとっては１９９１年４月に控えた牛肉輸入自
由化に伴って、モモ、スネなどのスジの多い低品質部位
をどのように利用するかが大問題である。逆にこれら使
用しにくい部位を多く含む肩肉や老廃肉などを加工し、
付加価値を向上させることにより有効利用できれば大き
なビジネスにつながると考えられている。こうした背景
から本発明者らは従来知られているエラスターゼに比較
して活性が強いアルカリ性バチルス属細菌の生産するエ
ラスターゼに注目し、本発明の目的に使用することにし
た。本酵素の生産は以下の実施例で記載される方法に限
定されるわけではなく枯草菌や酵母などを宿主とする組
換えＤＮＡ法によってもまた変異した遺伝子を染色体に
相同組換えを利用して野生型遺伝子と入れかえてやるこ
とも可能であり、いずれの方法を用いて生産させた酵素
も同程度の効果が期待できる。

本発明の改良剤及び改良方法は、広範囲に適用可能であ
り、例えば、老廃中などその硬さのため食肉にはならず
、廃棄処分していた肩肉のようなものも通常の食肉に変
えることも考えられる。

さて、本発明に係る肉質改良剤中のアルカリ性バチルス
属細菌の生産するエラスターゼの含有量は特に制限はな
いが、通常、該肉質改良剤１ｇあたり１０〜１００，０
００ユニット程度、好ましくは１００〜１０，０００ユ
ニット程度含有させればよい。

この場合、精製されたエラスターゼを用いてもよく、ま
た粗精製品のエラスターゼを用いてもよい。

また、安定化剤、増量側として、塩化カルシウム、牛血
清アルブミン、グリセロール、デキストリン、クエン酸
ナトリウム等を単独又は２種類以上組み合せて含有させ
ても良い。

本発明に係る肉質改良剤は粉末の形でもよく、また、水
や緩衝液に溶解させた溶液の形態であっ−に分散させた
のち層殺し、通常の手順で処理する方法も採用しうる。

酵素処理した肉は冷蔵庫、室温などで反応を進めること
が可能であるが温度が高いほど反応が早（進行すること
となる。

また本発明に用いるアルカリ性バチルス属細菌が生産す
るエラスターゼの使用量は肉に存在するエラスチン量、
処理温度、処理時間、処理方法などによって異なるため
、一定に決めることはできないが、通常肉１ｋｇあたり
１万〜１ｏ万ユニツト、好ましくは肉１ｋｇあたり２万
〜８万ユニツトである。くり返し述べるが上記添加量に
制限されるものではない。以下、実施例をもって、本酵
素の調製方法、生産方法の改善、酵素化学的諸性質、さ
らには本酵素を用いた肉質改良法について示す。

〔実施例〕

〔実施例１〕 エラスチン含有寒天培地（グルコース１％、酵母エキス
０．５％、リン散水素二カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム０．０２％、炭酸ナトリウム１％、エラスチン０
．５％、寒天１．５％）で生育させたアルカリ性バチル
ス属細菌（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｐ、）Ｙａ−Ｂ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０１７）を
エラスターゼ生産培地（グルコース１％、ソイミール（
Ｓｏｙｍｅａｌ）１％、酵母エキス０．５％、リン散水
素二カリウム０、１％、硫酸マグネシウム０．０２％、
炭酸ナトリウム１％）に接種し、坂ロフラスコで３７”
Ｃ３２４時間の前培養を行なった。その後、本培養を２
゜ｒの消泡剤ＴＭＡ８１２０．００１％含有同エラスタ
ーゼ生産培地で２％シード、３７°Ｃ１等量通気、３０
０回転／分、２０時間の条件で実施した。培養後、迅速
に遠心分離により菌体を除去し、培養土清液を集めた。

本培養で得た培養上清液から本酵素を次のように精製し
た。

■硫安塩析：培養上清液のｐＨを酢酸で約７．０に調整
した後、硫安を最終７０％飽和になるように加え、溶解
後、４℃で一夜放置した。生じた沈殿（浮遊状態）を遠
心分離で集めて、適当量のエラスターゼ用緩衝液（５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ、　ｐＨ８，ｏ；　１ｍＭＣａ
Ｃ１ｇ）に溶解した。

■濃縮＝１尼の酵素溶液を限外濾過膜（Ｄｉａｆｌｏｗ
ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　
ＰＭＩｏ　７６ｍｍ、　Ａｍ１ｃｏｎグレースジヤパン
）で約５０ｍｆｆ１まで濃縮し、硫安を除くためにエラ
スターゼ用緩衝液に対して透析を行なった。

■ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５イオン交換：
エラスターゼ用緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ａ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に酵素溶液
をバッチ法（１０ｍｆ／ｇＤＥＡＥ）で処理し、濾液（
非吸着成分）を集めた。色素類はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘに吸着されるので、脱色された酵素溶液を得た。

■ＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０イオン交換：エラ
スターゼ用緩衝液で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
　Ｃ−５０（ＰＣ−５０（Ｐｈａｒカラム（２，５Ｘ２
０ｃｍ、８０ｍｊりに酵素溶液をかけ、同緩衝液で洗浄
した後、０，５Ｍ　ＮａＣｆｆ１を含む同緩衝液で酵素
を溶出した。この段階で、タンパク質の吸収曲線とエラ
スターゼ活性がほぼ一致するようになる。５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製度を確認後、精
製酵素として以後の実験に供した。また硫安沈殿物も粗
酵素として適宜使用した。本酵素の製造は上記方法に限
定されているわけではなく、例えば、培養液を限外濾過
膜などを用いて菌体を除去、濃縮後、アルコール沈殿し
たものを真空乾燥することによっても得られる。

エラスターゼの活性測定については多くの方法が考案さ
れたが、ここではｅｌａｓｔｉｎ−ｏｒｃｅｉｎを基質
とした比色法（Ｓａｃｈａｒ、　Ｌ、八、ｅｔ　ａｌ、
　（１９５５）　Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、９０３２３
−３２６）を用いた。スクリューキャップの付いたミニ
試験管に２０■のｅｌａｓｔｉｎ−ｏｒｃｅｉｎ（Ｅ１
５００．　Ｓｉｇｍａ）を取り、２ｍｌの５０　ｍＭ　
ＮａＨＣＯｚ−Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０，５＞　
と適当量の酵素溶液を添加して、３７℃で振動しながら
反応させ、１時間後、１ｍｆの反応停止液（０，７Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ６，０）を添加、遠心分離により基質
を除去して、上清の５９０　ｎｍでの吸光度を測定する
。

活性の表示は全量のｅｌａｓｔｉｎ−ｏｒｃｅｉｎの半
分を分解できる酵素の量を１０ユニツトとして用いた。

〔実施例２〕 本酵素生産菌であるアルカリ性バチルス属細菌Ｙａ−Ｂ
株（ＦＥＲＭ−ＢＰ　２０１？）の培地組成を検討し、
エラスターゼの生産性への効果を調べた。

従来のエラスターゼ生産培地に含まれるソイミールはエ
ラスターゼの生産に効果があると認められているが、不
溶性の粉末であり入手も困難であることから大量培養の
際には不適当である。そこで本発明者らはグルコース、
酵母エキス、無機塩、炭酸ナトリウムなどの基本成分の
他にグリセロース、ポリペプトン、油ｖａ（大豆のエタ
ノール抽出物）、さらに大豆の酸加水分解物である゛豆
濃”や“味液”、グルタミン酸生産菌の分解物である“
菌濃°゛などを表１のように組み合わせた各培地５０ｍ
１に２％シードで３７℃、２４時間の振とう培養を行な
った。各種培地による培養結果を表２に示す。

生育度に差はあるが、１ｍｆあたりのエラスターゼ活性
を比較すると従来の培地（Ｎａｌ）に比べて油糖をベー
スにしても（Ｎα６．７．９）エラスターゼ活性の上昇
は認められず、むしろ活性は低下した。

しかしながら、従来のソイミール（Ｎｏ、１）の代替物
として立瀬、味液、菌濃を全量・ノ素量約１４０ｒｎｇ
／ｄｌになるように添加した場合（Ｎα２．３゜４５）
にエラスターゼ活性が著しく増大することを見出した。

またグリセロールは生産量に影響を与えなかった。なお
各培地のｐＨは炭酸ナトリウムを添加する前に約６．４
に調整した（最終のｐＨは９．０〜９．５になった）。

以上の結果から本酵素の大量調製にはソイミールの代わ
りに立瀬や味液が有効であることが示された。

尚、立瀬、味液、菌濃はいずれも味の素株式会社製であ
り、それぞれ商品名「立瀬」、「味液」及び「菌濃Ｊで
市販されている。

さらに、以上の結果を踏まえて、立瀬（全量ッ素量約１
４０■／ｄ１）を含む生産培地でＹａ　−Ｂ株（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２０１７）を培養し、その経時変化を調べた
。

なお培養は、グルコース１％、酵母エキス０．５％、リ
ン散水素二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０，０
２％、炭酸ナトリウム１％、立瀬４％（全量ッ素量約１
４０■／ｄ１）を添加した培地（ｐＨ約９．３）６０ｍ
ｊ２に２％シードで３７°Ｃ１２４時間振とうして行な
った。図１に培養の経時変化を示す。

エラスターゼは対数増殖期の後期に入ってから生産量が
増加し、１６時間後に最大に達した。ｐＨは植菌時は９
，３であったが菌の生育とともに約８．０まで下がった
がｐＨの調整は行なわなかった。

これまで述べてきたように、本酵素の大量調製には従来
からチッ素源として用いてきたソイミールの代わりに立
瀬や味液などの大豆の酸加水分解物が適していることが
示された。そこで、本酵素生産菌を大量に培養しエラス
ターゼの生産性や収率について調べた。

エラスチン含有寒天培地（グルコース１％、酵母エキス
０．５％、リン散水素二カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム０．０２％、炭酸ナトリウム１％、エラスチン０
．５％、寒天１．５％）で生育させたアルカリ性バチル
ス属細菌（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｈｉｌｌ
ｕｓｓｐ、）Ｙａ−Ｂ株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２０１７）
をエラスターゼ生産培地（グルコース１％、立瀬４％（
全量ッ素量約１４０■／ｄｉｒ、酵母エキス０．５％、
リン散水素二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．
０２％、炭酸ナトリウム１％）に接種し、坂ロフラスコ
で３７°Ｃ１２４時間の前培養を行なった。

その後、本培養を２０１の消泡剤ＴＭＡ８１２ｏ、ｏｏ
ｉ％含有同エラスターゼ生産培地で２％シード、３７℃
、等量通気、３００回転／分、２０時間の条件で実施し
た。培養後、迅速に遠心分離により菌体を除去し、培養
上清液を集めた０本培養で得た培養上清液のｐＨを酢酸
で約７．０に調整した後、硫安を最終７０％飽和になる
ように加え、溶解後、４°Ｃで一晩放置した。生じた沈
殿を遠心分離で集めて、適当量の５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＥ１８．ｏ）に溶解した。表３に本実施
例（立瀬使用）と従来（ソイミール使用）の培養結果に
ついて示した。立瀬を用いることにより培養後の総活性
、硫安沈殿後の収率ともに著しく改善された。

表３　アルカリ性バチルス属細菌（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
０１７）のエラスターゼ生産性 豆　濃　　　　　　　ソイミール ステップ　比活性　　総活性　　　比活性　　総活性（
ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）　　（ｕｎｉｔｓ）　　（ｕｎｉｔ
ｓ／ｍｇ）　　（ｕｎｉｔｓ）硫安沈殿 ３１ ５０６Ｘ１０’ （６３Ｘ） ８７ ４１Ｘ１０’ （１７χ） 硫安塩析後の粗酵素は、実施例１で記載した操作により
、精製酵素として得られる。

本実施例で記載した方法により培養したアルカリ性バチ
ルス属細菌が生産するエラスターゼは従来用いていた培
地に比較してその生産性及び調製時の収率ともに著しく
向上した。したがって本実施例は本酵素の製造方法とし
て極めて有効な手段であることを確認した。また、実施
例１でも記載したように、本酵素の調製は上記方法に限
定されるわけではない。例えば、本実施例で記載した方
法により培養を行なったのちの培養液を限外濾過膜（Ｕ
Ｆ膜）やマイクロフィルタ膜（ＭＦ膜）を用いて菌体を
除去、濃縮後、アルコール沈殿したものを真空乾燥する
ことによっても得られるが、同様の効果が期待できる。

〔実施例３］ 本酵素の諸性質に関しては、既に詳細に調べられている
が（Ｔｓａｉ、　Ｙ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　
Ｂｉｏｃｈｉ１１＋。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　８８３４３９−４４７
）　、主な酵素化学的諸性質を以下に示した。

ａ）基質特異性：かなり広範囲のペプチド結合にｂ）至
適ｐＨ ｃ）　ｐＨ安定性 ｄ）至適温度 作用するが、特に、非極性の小 さなアミノ酸（Ａｌａ、　Ｇｌｙ）のカルボキシ末端側
を切断する活性 が強い。またエラスチンに対す る強い結合力から強いエラスチ ン分解活性を示す。

二基質により若干異・なるが弱〜中 アルカリ性である。エラスチン を基質とした場合の至適ｐｔｔは １１．７５であった。

：ｐｕｓ以下では不可逆的に変性失 活した。

：エラスチンを基質とした場合、 約６０℃であった。

ｆ）金属イオンの影響：　Ｃａ　１　＋の存在下で安定
性が一向上した。

ｇ）阻害剤の影響ニジイソプロピルフルオロリン酸（Ｄ
ＦＰ　）　、フェニルメタンス ルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、 放線菌由来サチライシン特異的 インヒビター（ｓｓｒ　）により阻 害された。

ｈ）等電点　　：１０．６ 本発明者らは今回調製した精製酵素、または硫安沈殿後
の粗酵素を用いて本酵素の肉質改良剤としての可能性を
多面的に評価した。即ち、以下に述べるようにエラスチ
ンやコラーゲンなどの硬タンパク質の分解活性、従来の
植物由来の酵素の欠点である筋原線維タンパク質の過剰
分解などを調べた。

まず、本酵素による硬タンパク質のエラスチンと一般タ
ンパク質のカゼインの分解活性を常法に従って測定した
。比較のためにブタ膵臓由来エラスターゼ、従来から食
肉軟化剤として使用されている植物由来の酵素パパイン
とプロメライン（シグマ社から購入）についても測定し
た。その結果を表４にまとめた。なお、カゼインを基質
とした場合のプロテアーゼ活性はアンソン萩原変法（Ｈ
ａｇｉｈａｒａ、　Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、（１９５８）　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４５゜１８５−１９４　）を
用いて測定した。また、測定は各酵素の至適条件に近い
緩衝液を用いた。具体的には、本エラスターゼは５０　
ｍＭ　ＮａＨＣＯ３−ＮａｔＣＯｓ　　緩衝液（ｐＨ１
０，５）、ブタ膵臓エラスターゼは５０ｍＭＴｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ８，５）、１ｍＭＣａＣｆ、、パパ
インおよびプロメラインは３００ｍＭ　ＮａＣｆ。

２ｍＭＥＤＴ＾、５ｍＭ　Ｃｙｓ、１０ｍＭβ−メルカ
プトエタノールを用いた。

本酵素はエラスターゼ活性及びプロテアーゼ活性ともに
他のプロテアーゼよりも強い。特にエラスターゼ活性は
従来の食肉軟化用酵素であるパパインやプロメラインに
比べて約６０〜２００倍の比活性を示した。

次に、別の方法により各酵素のエラスチン、コラーゲン
およびカゼインの分解活性を前述の緩衝液および水道水
で測定した。酵素は本エラスターゼ（精製酵素と硫安沈
殿後の粗酵素）、ブタ膵臓エラスターゼ、パパイン、プ
ロメラインおよびクロストリジウム属のコラゲナーゼ（
本エラスターゼ以外はシグマ社から購入）を用いた。コ
ラゲナーゼの緩衝液は５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　
（ｐＨ７，４）、１ｍＭＣａ（Ｊｔを用いた。方法は各
酵素の適当量を２０■の基質と共に１ｍｉの緩衝液に加
えて３７゛Ｃで１時間振とうしながら反応させた。反応
は２ｍｌのＴＣＡ溶液（０，１１Ｍｌ−リクロロ酢酸、
０、２２　Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３　Ｍ酢酸）を加
えて停止した。

タンパク変性剤のＴＣＡ溶液を加える為に、残存する基
質タンパク質及び使用した各種酵素は沈殿する。

この沈殿を遠心分離により除去し、上清を得た。

上清には酵素の作用で遊離してくるアミノ酸及びペプチ
ドが含有されている。

さて、 この上清の吸光度を２７５ｎｍで測定した。

その結果を表５に示した。

本酵素のエラスチン分解活性やカゼイン分解活性は他の
酵素に比べて強く、表４の結果と同じ傾向を示した。さ
らにエラスチンとカゼインの分解活性の相対比較では、
本酵素はブタ膵臓エラスターゼよりもエラスチン分解活
性が相対的に強く、またパパインやプロメラインの１０
倍以上もの値を示した。これらの結果から、本酵素は従
来のプロテアーゼに比べて選択的にエラスチンを切断分
解する活性が強いことが明らかになった。また実際の食
肉への利用を考慮して酵素反応を水道水で行なった場合
、本エラスターゼはカゼイン分解活性が著しく低下する
ため、エラスチンやコラーゲン分解活性の相対値が一段
と高まった。本酵素のこれらの性質は、食肉中の硬くて
スジの多い部位の主成分であるエラスチンやコラーゲン
を特異的に切断するのに好都合であり、従来から食肉の
軟化に使用されてきたパパインやプロメラインよりも効
果的である。

次に本酵素の筋原線維タンパク質への影響について調べ
た。前述したように従来から食肉軟化剤として用いられ
ている植物由来の酵素は基質特異性が低いために、肉の
主成分である筋原線維タンパク質を分解して肉特有のテ
クスチャーを失わせてしまうという欠点があった。した
がって本酵素を筋原線維タンパク質に作用させ、電気泳
動法により分解の程度を調べた。

市販の和牛の腿肉から常法に従って大きなスジを取り除
いたあとの筋原線維タンパク質を調製しく例えばＫｉｎ
＋ｕｒａ、　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。

９４、２０８３−２０８５など）、本酵素（精製品およ
び粗精製品）またはパパインを加えて３７°Ｃで１時間
、または４°Ｃで一晩反応させた。この時、基質タンパ
ク質と各酵素の重量比は１，０００：１または１０．０
００　：　１とした。その後、反応混合物をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。−例として、
１０，０００：　１での結果を第２図に示した。

酵素無処理区ではミオシン、アクチンを中心に幾つかの
タンパク質がバンドになって見えた。これにパパインを
作用させると、これらのタンパク質が著しく分解された
ためバンドが低分子側に移動したり、消失していた。特
に筋原線維タンパク質の中でその６０％を占めるミオシ
ンの分解が顕著であった。なお、パパイン以外の食肉軟
化剤であるブロメラインもパパインと類似の性質を有し
ていることから、パパインと同様に筋肉タンパク質を過
剰に分解すると思われる。一方、パパインとは対照的に
エラスターゼを添加しても泳動パターンはあまり変化し
ておらず、タンパク質の過剰な分解は生じていないこと
が明らかになった。この結果は本酵素の精製度、反応条
件にかかわらず得られた。

以上の結果から本酵素は従来の食肉軟化剤に比べて、著
しく強いエラスチン分解力を有し、かつ肉特有のテクス
チャーを失わせるような筋原線維タンパク質の過剰分解
をおこさない効果的な酵素であるといえる。

〔実施例４〕 これまでの結果を踏まえて本実施例では、本酵素（エラ
スターゼ）を用いた食肉の軟化を破断テストによる物性
測定、およびパネラ−による官能評価で調べた。

オーストラリア産輸入牛の腿肉５ｋｇを５００ｇずつｌ
Ｏグループに分けて下記に記載する処理を施した。その
あと４　ｃｒａ　Ｘ　４　ｃｍ　Ｘ　３　ｃｍに肉を切
り（約１００ｇ弱）、７０°Ｃｌ２Ｏ分間の加熱処理後
、レオメータ−（Ｆｕｄｏｈ社）による破断試験を行な
った。−例として５ｋｇの切断力で深さ３１での応力を
測定した。その結果を第３図に示す。残りの肉は１％の
塩をまぶして味付けし、それぞれを別のフライパン上で
同一火力のもとで同時に加熱調理し、ステーキを試作し
た。

処理区■　無処理 処理区■　市販のミートテンダライザー（Ａｄｏｌｐｈ
’ｓ社、パパイン含有）を説明書に準じ た方法であらかじめインジェクショ ン用の針を用いて表面を一定の深さ で突き刺した肉にまんべんなく振り かけた。

処理区■　市販のパパイン（シグマ社）５■を４５ｍｊ
！に溶解し、ランダムに肉に注射した。そのあと３７°
Ｃで１時間放 置した。

処理区■　市販のパパイン（シグマ社）５■を七５ｍｌ
に溶解し、ランダムに肉に注 射した。そのあと４°Ｃで１７時間放 置した。

硫安塩析のあと５０ｍＭリン酸緩衝 液（ｐＨ８，０）に溶解したエラスターゼ液１２．００
０ユニッＩ・分（精製酵素５■に相当）５ｍｌ！、をラ
ンダムに肉に注射した。そのあと３７°ＣＴ：１時間放
置した。

硫安塩析のあと５０ｍ、Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解したエラスターゼ液１２．０００ユニット分（
精製酵素５■に相当）５ｍｌをランダムに肉に 注射した。そのあと４°Ｃで１７時間 放置した。

硫安塩析のあと水に溶解したエラス ターゼ液１２，０００ユニット分（精製酵処理区■ 処理区■ 処理区■ 素５■に相当）５ｍｊ！をランダムに 肉に注射した。そのあと３７°Ｃで１ 時間放置した。

処理区■　硫安塩析のあと水に溶解したエラスターゼ液
１２．０００ユニット分（精製酵素５■に相当）５ｍｌ
をランダムに 肉に注射した。そのあと４°Ｃで１７ 時間放置した。

処理区■　硫安塩析のあと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）に溶解したエラスターゼ液１２，０００ユニッ
トを凍結乾燥後、増量剤デキストリン５ｇと混合して 肉質改良剤を調整した。次にこの改 良剤をインジェクション用の針を用 いて表面を一定の深さで突き刺した 肉にまんべんなく振りかけた。その あと４°Ｃで１７時間放置した。

レオメータ−による破断試験の結果から、市販のミート
テンダライザーやパパインと同じように、本酵素処理に
より肉を切断する力が小さくなり、肉の軟化が認められ
た。その効果は水や緩衝液に溶解させた溶液の形態でも
粉末の形態でもよかった。また処理を施した肉は冷蔵庫
や室温などで一定時間放置することにより効果が得られ
る。さらに、硫安塩析後の粗酵素のみならず、精製の最
終段階であるＣＭ−セファデックス処理後の酵素を用い
ても同じ効果が認められた。なお、対照として水や緩衝
液のみを注射したり、デキストリンのみを振りかけた肉
は処理区■とほとんど同じ値を示した。

次に肉がさめないうちに、パネラ−１０名で外観、風味
、食感、多汁性、結合組織の硬さ、味などの点から総合
評価を行った。その結果を表６に示した。市販ミートテ
ンダライザーやパパイン処理区では肉は軟化するが、ス
ジが残り、肉の弾力がなくなり、旨味、食感が著しくそ
こなわれていたが、エラスターゼ処理区ではパパイン同
様内の軟化が認められ、さらにスジが繊維状になり、肉
の弾力が残っていた。また肉本来の旨味、食感とも無処
理区、パパイン処理区に比べて増していた。

以上の結果より、食感、味ともエラスターゼ処理を処す
と著しく向上した。

また、本実験のスケールを大きくして、工業的スケール
で用いられるインジェクターにより食肉をエラスターゼ
処理しても同様の優れた効果が得られた。このことより
、本発明は十分、工業的に利用される技術であることが
裏づけられた。

表６　豪州輸入牛モモ肉の官能評価 〔効　果〕 従来のエラスターゼに比較して本出願に係る活性の高い
アルカリ性バチルス属細菌由来のエラスターゼを含有す
る肉質改良剤はエラスチン含量が高い為にあまり食品と
して利用されていないスジ等の肉の低品質部位の改良に
有効である。

また、本発明の肉質改良剤は、アルカリ領域でも中性領
域でも用いることができるので、極めて広い範囲で実施
できる有用なものである。

尚、このアルカリ性バチルス属細菌由来のエラスターゼ
は上記食品への応用以外にも、動脈硬化の治療などにも
広く応用できる可能性がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルカリ性バチルス属細菌Ｙａ−Ｂ株（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２０１７）の培養した時の経時変化を示す。 図中Ｏは菌の生育、△は培地のｐＨ変化、・はエラスタ
ーゼ活性をそれぞれ示す。 第２図は各種酵素処理した筋原線維タンパク質の５ＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動図である。 レーン１は無処理で４℃、１５時間放置した試レーン２
は精製エラスターゼ処理後、４℃、１５時間放置した試
料 レーン３は粗エラスターゼ処理後、４°Ｃ１１５時間放
置した試料 レーン４はパパイン処理後、４°Ｃ１１５時間放置した
試料 レーン５は無処理で３７°Ｃ，１時間放置した試料 レーン６は精製エラスターゼ処理後、３７°Ｃ１１時間
放置した試料 レーン７は粗エラスターゼ処理後、３７°Ｃ１１時間放
置した試料 レーン８はパパイン処理後、３７℃、１時間放置した試
料 第３図は豪州輸入牛モモ肉のレオメータ−による破断試
験を示す。図の番号１〜９は実施例４に記載した処理区
■〜■の試料である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルカリ性バチルス属細菌により生産されるエラ
   スターゼを含有してなる肉質改良剤。
2. （２）アルカリ性バチルス属細菌により生産されるエラ
   スターゼを鳥獣肉に作用させることを特徴とする肉質改
   良法。