JPH03211462A - 小細胞気管支癌の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用公費 本発明はシナプトフィジンを測定することにより小細胞
気管支癌を検出する方法に関する。

従来の技術 癌では肺及び呼吸路範囲の悪性腫瘍が特に頻繁に発生し
、かつ侵襲的成長により局所的に並びに遠隔転移を介し
て拡がる。臨床的には４種の主要な腫瘍に区分され、つ
まり小細胞気管支癌（Ｓ　ＣＬ　Ｃ−ｓｍａｌｌ　ｃｅ
ｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌、
腺癌及び大細胞退形成癌に区分され、その際後者の３種
が一般に“非小細胞腫瘍“に含まれる。小細胞気管支癌
は一方では特に早期に転移しかつ更に著しく迅速な腫瘍
成長性を有するが、他方では非小細胞気管支癌とは反対
に放射線療法及び化学療法に対して高い感度を有するの
で、この腫瘍を早期に発見しかつ他の腫瘍と区別するこ
とがこの疾患の予後には決定的である。

発明が解決しようとする課題 本発明は、小Ｍｉ胞気管支癌の発生の検出を、患者から
組織試料を採取せずに可能にするという課題をベースと
する。

課題を解決するための手段 本発明により、この課題は体液中のシナプトフィジン、
そのオリゴマー及び／又はその砕片を測定することによ
り解決される。つまり、そうでない場合には膜に固定結
合している蛋白質のシナプトフィジン、そのオリゴマー
及び／又はその免疫学的に認識可能な砕片を、小細胞気
管支癌を持つ患者の場合体液中に検出することができる
ことが判明し驚異的であった。

神経伝達物質の貯蔵及び／又は遊離の調節に宜要な役割
を果すと思われるシナプトフィジンは既に集中的な検査
の目的であった。Ｒ，ロイベ（Ｌｅｕｂｅ）及びその他
共著“ＥＭＢＯジャーナル”、Ｖｏｌ、６．　３２６１
〜３２６８頁（１９８７年）から、種々のヒト小細胞肺
癌はシナプトフィジンｍＲＮＡの発生により特徴づける
ことができることが既に知られている。Ｎ−グリフシル
化蛋白質であるシナプトフィジンは、一般に神経分泌小
胞、特にシナプス前小胞並びに種々の神経内分泌細胞、
即ち神経表現型並びに上皮表現型の小胞中に存在する。

この蛋白質のアミノ酸配列及びそれに対応するｌｌｌＲ
ＮＡのヌクレオチド配列はヒト細胞についてもラット細
胞についても例えばＴ、ズードホ７　（５ｕｅｄｈｏｆ
）及びその他共著、′ニュークリーク・アシソズ・リサ
ース（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ
）　Ｖｏ１．　ｌ　５　、　Ｎｏ、　２２　、９６０７
頁（１９８７年）、Ｔ、ズードホフ及びその他共著、“
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　”　、　Ｖｏｌ、　２
３８　、　　ｌ　ｌ　４２〜＋１４４頁（１９８７年）
並びに既に記載したＲ、ロイベ（Ｌｅｕｂｅ）及びその
他共著の文献から知られている。それによればシナプト
フィジンとは、その全長にわたって小胞膜を４回縫い糸
状に突さ通っている、細胞膜中に組み込まれている蛋白
質である［“５ｃｉｅｎｃｅ　　、　２３８巻、１１４
２〜１１４４頁（１９８７年）。

５ｃｉｅｎｃｅ″、２４２巻、１０５０−１０５２頁（
１９８８年）１゜更に、８９個のカルボキシ末端アミノ
酸の配列（特にラットのシナプトフィジンの）に対して
作用するモノクロナール抗体も既に公知である。

本発明方法では体液として血清を使用すると有利である
。しかし、肺分泌物、リンパ液、唾液のような他の体液
も本発明方法を実施するのに使うことができる。体液中
のシナプトフィジンの測定は当業者に公知の方法で行な
う。しかしシナプトフィジンを免疫学的方法で検出する
と有利である。この際に、小胞膜から突出しているシナ
プトフィジンの配列に対して作用する抗体（抗血清、ポ
リクロナール又はモノクロナール抗体として）を使用す
ると有利であることが明らかになった。抗体の形成に、
アミノ酸配列がヒトシナプトフィジン又はラットシナプ
トフィジンから誘導されている抗原決定基を使用すると
有利である。本発明方法で使用される抗体の形成に好適
である特に有効な抗原決定基はンナプトフィジン分子の
カルボキシ末端に存在するアミノ酸配列により形成され
る。特に、ラットシナプトフィジンのカルボキシ末端の
８９個のアミノ酸（アミノ酸２１９〜３０７）及びヒト
シナプトフィジンの相応する９０個のアミノ酸配列（ア
ミノ酸２０７〜２９６）であるクローンフラグメントｐ
ＳＲ１又はその砕片の翻訳産生物に対して作用する抗体
も本発明方法に特に好適であることが明らかになった。

クローン７ラグメントｐＳＲ１の製造は公知であり、か
つ例えばＲ，Ｅ、ロイベ（Ｌｅｕｂｅ）及びその他共著
“ＥＭＢＯジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ）、Ｖｏｌ、６
．Ｎｏ、１１．３２６１〜３２６８頁（１９８７年）　
　［ｌ′５ｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ：　　　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＯｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　ｍ
ＲＮ　Ａ　−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｄｅｔｅｒｍ
ｉｎｅｄ　　ｆｒｏｍ　　ｃｌｏｎｅｄ　　ｃＤ　Ｎ　
Ａ“］に記載されている。

本発明方法を実施するにはモノクロナール抗体並びにポ
リクロナール抗体が好適であるが、モノクロナール抗体
が優れている。本発明方法を実施するに当り、ＥＣＡＣ
Ｃに８９１１２８０１で寄託した細胞系から得られるＭ
ＡＫｓＹ３８　［“Ｃｅ１ｌ”、４１巻、１０１７−１
０２８頁（１９８５年）フを使用すると特Ｊこ有利であ
ることが明らかになった。

本発明方法では抗体と並んで、超可変領域を含む抗体砕
片、例えばＦａｂ−又はＦ（ａｂ’　）２フラグメント
も使用される。これらの７ラグメントは殊に担体上に固
定化された形で結合して存在しかつ特に酵素イムノアッ
セイもしくは放射線イムノアッセイの実施に好適である
。

一般に、血清中のシナプトフィジンの測定は次のように
実施する： １、　　ＭＡＫであると有利であるシナプトフィジン抗
体を担体、一般に微小滴定板に結合させ２、引続いて試
料と一緒に恒温保持し、その際測定すべき抗原が抗体も
しくはその砕片に結合し、 ３、結合した抗原を一般に同一の、しかし標識したシナ
プトフィジン抗体により恒温保持し４、色原体基質によ
り検出反応を実施し、かつ ５、色原体基質の吸収を光度測定する。

第１方法工程を実施する際に、抗体を直接担体に結合さ
せるか又は当業者に公知の他の方法で、例えばストレプ
タビジン又はアビジンで塗布された板にビオチン接合体
として固定させると何利であることが明らかになった。

方法工程３を実施する際に、指示薬ＡＫとして、方法工
程ｌのＡＫとは別の、シナプトフィジン上の抗原決定基
を認識する抗体を使用することもできる。本発明では、
標識を放射性物質、蛍光物質又は化学発光物質により実
施することもできる。そのような標識に好適である酵素
は当業者に公知である。特に好適なのはペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ
であることが明らかになりＩ；。

実施例 次に本発明を実施例により詳説する。

例　　１ シナプトフィジンの検出 微小滴定板（Ｎｕｎｃ社）の凹部を重炭酸塩緩衝液ｐ　
Ｈ９，６中の２μｇ／肩Ｑ　　ＭＡＫ　　ＳＹ３８を用
いて室温で１時間塗布する。０．０５％ツイーン（Ｔｖ
ｅｅｎ）　２０／ＰＢＳ　（８ｇ／ＱＮａＣＱ　　、　
　　０．２９　　／Ｑ　　ＫＣＱ　　、　　１．４　４
ｇ　／ＱＮａ２ＨＰＯ４Ｘ　２Ｈ２０，０，２ｇ／（ｌ
　　ＫＨ２ＰＯ４）で３回洗いかつ２％卵アルブミン／
ＰＢＳ（リン酸塩緩衝させた生理食塩液）を用いて室温
で１時間後塗布する。引続いてＰＢＳ中の０゜０５％ツ
６−ン［Ｆ］で後塗布する。測定す−き試料をＰＢＳで
稀釈して添加する。室温で１．５時間恒温保持し、０．
０５％ツイーンで４回洗浄する。引続いて、ＭＡＫ　　
ＳＹ３８／ペルオキシダーゼ（ペルオキシダーゼ活性１
５０Ｕ／ｍｆｆ）−接合体の溶液を室温で１．５時間恒
温保持し、かつ０．０５％ツイーン／ＰＢＳで３回洗浄
する。

ペルオキシダーゼ活性を１．９ｍｍｏｌ／（２ＡＢＴＳ
′！Ｄ（２，２″−アジノージ［３−−チ・レーペンズ
チアゾリンースルホン酸（６）］　）−ジアンモニウム
塩、ｌ　００　＋ｍｍｏｌ／　Ｑリン酸塩／クエン酸塩
緩衝液、ｐＨ４，４，３、２ｍ＋ｅｏｌ／　Ｑ過硼素酸
ナトリウム）の溶液の添加後に調べかつ被分析物濃度の
尺度として４０５ｎ＋＊で吸光度を測定する。

例　　２ 例１により製造した微小滴定板を用いて５２人の患者の
血清を調べた。この試験結果は次の表１から明らかであ
る。

表　　１ 健康者 」１　　被験者 ７ 良性疾患 ■ ５ 癌 気管支癌： 非−３ＣＬＣ ＣＬＣ ３，２ 他の癌 ■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、体液中のシナプトフィジン、そのオリゴマー及び／
   又はその砕片を測定することを特徴とする小細胞気管支
   癌の検出法。 ２、体液として血清を使用する請求項１記載の方法。 ３、測定するに当り、細胞膜から突出しているシナプト
   フィジンの配列に対して作用する抗体を使用する請求項
   １又は２記載の方法。 ４、カルボキシ末端に対して作用する抗体を使用する請
   求項３記載の方法。 ５、クローンフラグメントｐＳＲ＾１の翻訳産生物又は
   その砕片に対して作用する抗体を使用する請求項１から
   ４までのいずれか１項記載の方法。 ６、ヒトシナプトフィジンのカルボキシ末端のアミノ酸
   配列２０７〜２９６に対して作用する抗体を使用する請
   求項１から５までのいずれか１項記載の方法。 ７、ラットシナプトフィジンのカルボキシ末端のアミノ
   酸配列２１９〜３０７に対して作用する抗体を使用する
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。 ８、ヒトシナプトフィジンのカルボキシ末端の最後の９
   ０アミノ酸配列に対して作用する抗体を使用する請求項
   １から７までのいずれか１項記載の方法。 ９、細胞系ＥＣＡＣＣ８９１１２８０１から得られるモ
   ノクロナール抗体ＳＹ３８を使用する請求項１から８ま
   でのいずれか１項記載の方法。