JPH03210191A

JPH03210191A - プロスタグランジンの製造方法

Info

Publication number: JPH03210191A
Application number: JP525290A
Authority: JP
Inventors: Masahisa Tsuji; 辻　雅久; Kazuhiko Sunazaki; 砂崎　和彦; Ichiro Nakajima; 一郎中島
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1991-09-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はプロスタグランジンの製造方法に関し、特にア
シネトバクタ−属、アスペルギルス属またはモルティエ
レラ属に属する微生物を用いてプロスタグランジンを製
造する方法に関する。

〔従来技術〕

プロスタグランジンは、１９３０年に子宝に恵まれない
夫婦のために人工受精を試みていたアメリカのコロンビ
ア大学産婦人科医ＫｕｒｚｒｏｋとＬｉｅｂがヒト精液
中に子宮を収縮する物質が存在することを発見したこと
に端を発し、その後多くの研究者による精力的研究によ
りその化学構造が明らかにされ、さらに生理作用、薬理
作用について幅広い研究がなされてきた。

プロスタグランジンの医薬品への応用については、１９
７３〜１９７９年にかけてプロスタグランジンＥ、（以
後ＰＧＥ、と略記する）が慢性動脈閉塞症の治療薬、プ
ロスタグランジンＥ２（以後ＰＧＥ、と略記する）およ
びプロスタグランジンＦ１ａ（以後ＰＧＦ２αと略記す
る）が産婦人科領域において分娩誘発剤として認可され
た。さらに１９８２年にはＰＧＦ２αについて、開腹手
術後の腸管運動促進剤としての効能が追加された。こう
したプロスタグランジンの医薬品化に呼応して、プロス
タグランジン原体の工業的生産法がいろいろな角度から
検討されるようになった。

化学合成法については数多くの特徴ある合成法が発表さ
れており、シクロペンタジェンからＣｏｒｅｙラクトン
と呼ばれる中間体を経由するＣｏｒｅｙらの方法（Ｅ、
　Ｊ、Ｃｏｒｅｙ、　Ｎ、　Ｍ、　Ｗｅｉｎｓｈｅｎｋ
ｅｒ、　Ｔ、に、　５ｃｈａａｆ。

Ｗ、Ｈｕｂｅｒ、　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、５ｏｃ０．
９１．５６７５　（１９６９）　）が代表的な方法であ
る。しかしながら、このような化学合成法は合成工程が
多く収率が低いという欠点を有している。

また、サンゴ抽出物からの半合成法（Ｅ、　Ｊ、Ｃｏｒ
ｅｙ。

Ｈ，Ｅ、　Ｅｎｓｌｅｙ、　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ
、　、　３８．３１８７　（１９７３））も報告されて
いるが、サンゴからの不安定な物質の抽出や精製にかな
りのコストがかかることや、サンゴの生態系への悪影響
（刈とり後の再生に７年かかる）等問題が多い。

これらの方法に対して、生体反応を模倣あるいはヒント
にした生合成法も試みられている。例えば、アップジョ
ン社では７５ｋｇのヒツジ精嚢ホモジネートおよび３７
ｇのアラキドン酸から８〜１２ｇのプロスタグランジン
を生合成している（Ｂ、Ｇ。

Ｄａｎｉｅｌｓ、Ｊ、Ｅ、Ｐｉｋｅ、ＰＧ　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＷｏｒｃｅｓｔｅｒＦｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、ｐ３７９゜Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（１９６Ｂ））　ｏこれら生合成法
においては動物の臓器を用いる点で量産に限界がある。

また、酵素の不安定性や高価格である欠点を乗り越えよ
うとする努力はあるものの、実用段階には至っていない
。

一方、微生物がプロスタグランジンを発酵生産する事が
報告されている。イクスペリメンタル・バイオロジー社
では、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を１週間〜２週間培
養することにより、培地１ｍｌあたりＰＧＥ　：０、５
ｎｇＳＰＧＦ　：　１．６ｎｇ、　ＰＧＡ　：　２６．
８ｎｇを得ている（ｔｌｓ　ＰＡＴＥＮＴ　３８４３４
６７）。しかし、医薬として有用なＰＧＥ、ＰＧＦの生
産性が十分高いとは言えないばかりか、得られるプロス
タグランジンは構造上、側鎖二重結合により１から３の
３群に分けられ、薬理効果も各々によって異なるにも関
わらず、本報告では構造の区別が全く明らかにされてい
ない。

さらに、微生物を用いた変換反応としてＢｒａｇｉｎｔ
ｓｅｖａ　Ｌ、Ｍ、らはフサリウム・サンブシナム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ　ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）がアラキドン
酸から１８％の変換率でＰＧＥ、とＰＧＦ、α（量比２
：１）を生成すること（Ｂｒａｇｉｎｔｓｅｖａ　１９
Ｍ、ｅｔ　ａｔ、。

ＦＡＲＭＡＴＳＩＹＡ（Ｍｏｓｃｏｗ）、３３．４８（
１９８４））　、また、トリコセシーウム６０ゼウム（
Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）がアラキ
ドン酸から１８％の変換率でＰＧＦ２αを生成すること
（Ｂｒａｇｉｎｔｓｅｖａ　Ｌ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、
Ｐｒ１ｋｌ。

ＢｉｏｋｈｉｍｏＭｉｋｒｏｂｉｏｌ、　、　２２．２
２（１９８６））を報告している。

しかし、微生物による生産、変換ともにＰＧＥ。

についての報告は未だなされていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明はこれまでプロスタグランジンを産生ず
ることが知られていない微生物を用いてプロスタグラン
ジンを製造する方法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、微生物を用いたプロスタグランジンの生合成
法について鋭意研究を重ねた結果、アシネトバクタ−属
、アスペルギルス属またはモルティエレラ属に属する微
生物がプロスタグランジンを生産すること、及びこれら
の微生物が高度不飽和脂肪酸をプロスタグランジンに変
換することを見いだし、これらの知見にもとづいてなさ
れたものである。

すなわち、本発明は、アシネトバクタ−属、アスペルギ
ルス属またはモルティエレラ属に属する微生物を培養す
ることによりプロスタグランジンを生産することを特徴
とするプロスタグランジンの製造方法を提供する。また
、本発明は、これらの微生物を用いて高度不飽和脂肪酸
をプロスタグランジンに変換せし杓、これを採取するこ
とを特徴とするプロスタグランジンの製造方法をも提供
する。

本発明においては、アシネトバクタ−属、アスペルギル
ス属またはモルティエレラ属に属し、プロスタグランジ
ン生合成能を有する微生物であればすべて使用できる。

この様な微生物として、例えばアシネトバクタ−・カル
コアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌ
ｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ１７９０４、アスペ
ルギルス・カンディダス　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃ
ａｎｄｉｄｕｓ）　ＩＦＯ４３８９、アスペルギルス・
セルロサＩ　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃｅｌｌｕｌ
ｏｓａｅ）　ＩＦＯ４０４０、アスペルギルス・ニガー
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＪＡＭ　３
００１、モルテイエレラ・アルビナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅ
ｌｌａ　ａｌｐｉｎａ）ＡＴＣＣ３６９６５、ＩＦＯ８
５６８、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒ
ｅｌｌａ　ｅｌｏｎｇａｔａ）　ＩＦＯ８５７０、モル
ティエレラ０フミコーラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｈ
ｕｍｉｃｏｌａ）ＩＦｏ　８２８９等を挙げることがで
きる。これらの菌株はいずれも財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＤ　）　、米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴＣＣ）　、及び東京大学応用微生物研
究所（ＩＡＭ）からなんら制限なく入手することができ
る。

上記微生物の培養は、固体又は液体の培地を用いて、静
置培養、振盪培養、通気撹拌培養などにより行うことが
できる。ここで用いる培地は、液体培養の場合、炭素源
としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッ
カロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセ
ロール、マンニトール等の一般的に使用されているもの
が使用できるが、これらに限られるものではない。窒素
源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキ
ス、カザミノ酸、コーンステイープリカー等の天然窒素
源の他に、尿素等の有機窒素源、並びに硝酸ナトリウム
、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源
を用いることができる。

この他、必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸
鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源とし
て使用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害し
ない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に、炭素
源は０．１〜３０重量％（以下、％と略称する。）好ま
しくは１〜ｌＯ％、窒素源は０．０１〜５％、好ましく
は０．１〜２％とするのがよい。また、培養温度は５℃
〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃とし、培地のｐＨ
は４〜１０、好ましくは６〜９として、通常２日〜２０
日培養を行う。固体培養の場合、前屈液体培養培地に寒
天を加えたものの他、固形物重量に対して５０〜１００
％の水を加えたふすま、もみがら、米ぬか、ジャガイモ
、サトイモ、サツマイモ、キャラサバ、タロイモ、キク
イモ等を用い、さらに、必要に応じて培地中に窒素源、
無機栄養源、微量栄養源を加え、５〜４０℃、好ましく
は２０〜３０℃で２〜２０日間培養を行う。

上記のような好気的条件下で菌体が生合成したプロスタ
グランジンは、次のようにして抽出、精製することがで
きる。すなわち、菌体を機械的、または物理的に粉砕し
た後、ｐＨを酸性にし、常法により直接有機溶媒で抽出
処理する。有機溶媒としては、酢酸エチル、エチルエー
テル、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、四
塩化炭素、塩化メチレンおよびベンゼン等を用いること
ができる。また、アンバーライトＸＡＤ−２等を用いる
固相抽出も行うことができる。こうして得られたプロス
タグランジンはシリカゲル等の順相型カラムクロマトグ
ラフィーおよびＯＤＳ等の逆相型カラムクロマトグラフ
ィー等、常用されている方法で精製することができる。

さらに、菌体もしくは菌体の処理物を酵素源として用い
、基質である高度不飽和脂肪酸を添加しプロスタグラン
ジンに変換することもできる。この場合、培養液もしく
は培養液から分離した菌体、または菌体処理物の溶液に
前駆体として高度不飽和脂肪酸を加えた後、任意の時間
酵素反応を行うことができる。菌体処理物としては菌体
の破砕物のほか、固定化した菌体、菌体から得られる酵
素画分、あるいは固定化した酵素なども使用する事がで
きる。添加する高度不飽和脂肪酸としては炭素数１６〜
２２のものがあげられ、このうちアラキドン酸、ジホモ
−Ｔ−リルン酸、及びエイコサペンタエン酸が好ましい
。また、これら脂肪酸の塩やエステルを用いることもで
きる。これらのプロスタグランジン前駆体である高度不
飽和脂肪酸の添加量は任意とすることができるが、例え
ば培地あたり０．０００１〜１０ｇ／ｌ　００ｍｌ、好
ましくは０．００１〜１　ｇ／　１００ｍｌとするのが
よく、菌体乾燥重量当り０．００１〜１倍添加するのが
よい。こうして生成したプロスタグランジンは反応液を
酸性にした後、先に記したプロスタグランジンの菌体生
産の場合と同様の方法で抽出、精製することができる。

このように、高度不飽和脂肪酸を加えると高収率でプロ
スタグランジンを得ることができる。

〔発明の効果〕

本発明方法に従うと、アシネトバクタ−属、アスペルギ
ルス属またはモルティエレラ属に属する微生物からプロ
スタグランジンを高収量で得ることができる。しかも、
これらの微生物がＰＧＥ。

を生産することは全く新規な発見であり、微生物による
プロスタグランジンの工業的製法として極めて有用であ
る。

本発明により得られるプロスタグランジンは慢性動脈閉
塞症の治療薬、産婦人科領域における分娩誘発剤および
開腹手術後の腸管運動促進剤等の医薬分野で広く応用さ
れる。

次に、実施例により本発明を具体的に説明する。

〔実施例〕

実施例１市販のニュートリエンド・ブロス（ＤＩＦＣＯ社製）８
．３ｇに蒸留水を加えて１０１００Ｏとし、その１００
ｍ１を５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、アシネトバクタ
−・カルコアセティカス（ＡＴ［’［１７９０４）を白
金耳中接種した後、２６℃で７日間振盪培養した。一方
、市販のグルコース・ペプトン培地（日水製薬株式会社
製）２８．５ｇに蒸留水を加えて１０１００Ｏとし、そ
の１００ｍ１を５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、アスペ
ルギルス・カンディダス（ＩＦＯ４３８９）、アスペル
ギルス・セルロサエ（ＩＦＯ４０４０）　、アスペルギ
ルス・ニガー（ＩＡＭ　３００１）、モルティエレラ・
アルビナ（ＡＴＣＣ３６９６５、ＩＦＯ８５６８）　、
モルティエレラ・エロンガタ（ＩＰ（１８５７０）、及
びモルティエレラ・フミコーラ（ＩＦ［］　８２８９）
　ヲ個別に白金耳中接種した後、２６℃で１０日間振盪
培養した。得られた菌体は培養液中でホモジナイザー（
日本精機製作新製）により粉砕した後、塩酸にてｐＨを
３．０に調整した。そのうちの２０ｍ１を等量の酢酸エ
チルで２回抽出し、酢酸エチル層を水洗した後、減圧下
で溶媒を留去し、残渣をプロスタグランジン粗画分とし
た。この両分を逆相型充填剤を詰めた５ＥＰ−ＰＡＫＣ
、、カートリッジを用いて前処理を行った。即ち、プロ
スタグランジン画分を１５％エタノールに懸濁溶解し５
ＢＰ−ＰＡＫＣ、、カートリッジにチャージした後、１
５％エタノール１０ｍ１、ヘキサン１０ｍ１．及び酢酸
エチル１０ｍ１の順で順次溶出し、酢酸エチル画分をプ
ロスタグランジン画分とした。次にこの両分をＨＰＬＣ
で精製した。ＨＰＬＣ条件は、カラム：０ＤＳ−ＡＱ　
（６Ｘ　１５０ｍｍ、　ＹＭＣ社製）、移動相：０．０
１７Ｍリン酸ニアセトニトリル（６５：３５）、検出：
ＵＶ１９６ｎｍ、流速：　１．５　ｍｌ／ｍｉｎで行っ
た。

ＰＧＦ、α、ＰＧＥ２、ＰＧＥ、標品の溶出位置がそれ
ぞれ９．８分、１２．２分、１３．４分であるので、微
生物からのプロスタグランジン画分を同一条件で展開し
、ＰＧＦ２α、ＰＧＥ、　、ＰＧＥ。

画分を分取した。更に、これらの画分をマグヌス法によ
るバイオアッセイ及びラジオイムノアッセイにより定性
定量した。ラジオイムノアッセイによる定量の結果を表
−１に示す。

表１（ｎ３７ｍｌ培地）実施例２市販のニュートリエンド・ブロス（ＤＩＦＣＯ社製）８
．３ｇに蒸留水を加えて１０１００Ｏとし、そのＬＯＯ
ｍｌを５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、アシネトバクタ
−・カルコアセティカス（＾ＴＣＣ１７９０４）を白金
耳中接種した後、２６℃で７日間振盪培養した。また、
市販のグルコース・ペプトン培地（日水製薬株式会社製
）２８．５ｇに蒸留水を加えて１０１００Ｏとし、そ（
７）ＬＯＯｍｌを５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、アス
ペルギルス・ニガー（ＩＡＭ　３００１）　、ｌ’モル
ティエレラ・エロンガタ（ＩＦＯ８５７０）を個別に白
金耳中接種した後、２６℃で１０日間振盪培養した。そ
の後、それぞれの培養液に０，１ｍｌのエタノールに溶
解したアラキドン酸１　ｍｇを添加し、さらに４時間振
盪、反応させた。生成したプロスタグランジンを抽出す
るため、菌体を培養液中でホモジナイザー（日本精機製
作新製）により粉砕した後、実施例１と同様の方法でプ
ロスタグランジンを定性定量した。この結果をアラキド
ン酸無添加のコントロールと比較して表−２に示す。

表（ｎ３７ｍｌ培地）実施例３市販のグルコース・ペプトン培地（日水製薬株式会社製
）２８．５ｇに蒸留水を加えて１０１００Ｏとした。そ
の１００ｍ１を５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、モルテ
ィエレラ・フミコーラ（ＩＦｏ　８２８９）を白金耳中
接種し、２５℃で１４日間振盪培養した。その後、培地
と菌体を分離し、菌体に等量のガラスピーズと５０ｍ１
の水を加えホモジナイズした。そのホモジネートに０．
２ｍｌのエタノールに溶解したアラキドン酸２０ｍｇを
添加し、４℃にて一晩撹拌反応した。反応物を実施例１
と同様の方法で抽出し、プロスタグランジンを定性定量
した。

この結果を菌体未破砕、アラキドン酸無添加のコントロ
ールと比較して表−３に示す。

表−３（ｎ３７ｍｌ培地）表−３の結果から、破砕した菌体に高度不飽和脂肪酸を
添加すると、プロスタグランジンの生成量が著しく増加
することがわかる。

実施例４市販のグルコース・ペプトン培地（日水製薬株式会社製
）２８．５ｇに蒸留水を加えて１０１００Ｏとした。そ
の１００ｍ１を５００ｍ１坂ロフラスコに入れ、モルテ
ィエレラ・フミコーラ（ＩＦｏ　８２８９）を白金耳中
接種し、２５℃で１４日間振盪培養した。その後、培地
と菌体を分離し、菌体に２０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ！
Ｊン酸カリウム緩衝液、１０ｍＭＭｇＣＩ２．０．１％
Ｔｗｅｅｎ２０）と等量のガラスピーズを加えホモジナ
イズした。そのホモジネートにさらに３０ｍ１の緩衝液
と０，１ｍｌのエタノールに溶解したジホモ−Ｔ−リル
ン酸Ｌｏｍｇを添加し、５℃にて一晩攪拌反応した。反
応物を実施例１と同様の方法で抽出し、プロスタグラン
ジンを定性定量した。この結果をジホモ−ｒ−ＩＪルン
酸無添加のコントロールと比較して表−４に示す。

表−４（ｎｇ／ｍｌ培地）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アシネトバクター属、アスペルギルス属またはモ
ルティエレラ属に属する微生物を培養することによりプ
ロスタグランジンを生産することを特徴とするプロスタ
グランジンの製造方法。
（２）アシネトバクター属、アスペルギルス属またはモ
ルティエレラ属に属する微生物を用いて高度不飽和脂肪
酸をプロスタグランジンに変換せしめ、これを採取する
ことを特徴とするプロスタグランジンの製造方法。