JPH03204821A

JPH03204821A - モノクローナル抗体含有水溶液の加熱処理方法

Info

Publication number: JPH03204821A
Application number: JP34469689A
Authority: JP
Inventors: Setsu Goto; 後藤　節; Yoshiaki Kano; 加納　義明; Yatsuhiro Kamimura; 上村　八尋
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1989-12-28
Filing date: 1989-12-28
Publication date: 1991-09-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はモノクローナル抗体、特にキメラ抗体含有水溶
液の加熱処理方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕従来より、
アルブミンなどの血漿蛋白について、そこに混入してく
る懸念のあるウィルスを不活化する最も確実な方法とし
て、水溶液状態での加熱処理法（以下、液状加熱法と称
す）が、マレイ（Ｍｕｒｒｙ）ら〔ザ　ニューヨーク　
アカデミ−オブ　メデスン（Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３１（
５）　、３４１〜３５８（１９５５）　）の報告に基づ
いてとられており、以来今日に至るまで長年にわたり汎
用され、疫学的にも液状加熱法のウィルス不活化効果が
立証されている。

しかしながら、アルブミンのように液状加熱に耐えるも
のは血漿蛋白の中でも極く限られており、特に生理活性
または生物活性を有する血漿蛋白は熱に対し非常に敏感
で、熱変性をおこし易く、活性の低下、消失を招きやす
い。

モノクローナル抗体は、細胞融合体（ハイブリドーマ）
、形質転換体、遺伝子組み換えで得られた宿主などを培
養することにより産生される。その培養時に夾雑ウィル
スなどの外来性感染物質の混在を１００％否定すること
はできない。そのため、夾雑ウィルスの不活化方法とし
て加熱殺菌を施すことは充分意義のあることである。

しかし、通常の生理的食塩溶液などの水溶液中でこれを
行うと短時間で白濁し、大部分の活性を失い、蛋白分子
が変性してしまうという問題点がある。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明者らは、かかる問題点を解決するために種々検討
を重ね、モノクローナル抗体を含存する水／８液に対し
て、夾雑ウィルスなどの外来性感染物質などを不活化す
るための加熱処理を行うに際して、ソルビトールを添加
すれば加熱処理に対するモノクローナル抗体の熱安定性
が著しく高まることを見出した。

本発明は、上記の知見に基づいて完成されたものであり
、その要旨はモノクローナル抗体含有水溶液を、ソルビ
トールの存在下に加熱処理をすることを特徴とするモノ
クローナル抗体含有水溶液の加熱処理方法である。

本発明のモノクローナル抗体とは特定の抗原決定基に対
してのみ反応する単一の抗体である。

モノクローナル抗体の調製方法は公知の手法を用いれば
よく、例えばＮａｔｕｒｅ、　２５６．　ｐ４９５−、
１９７５年に記載の方法が例示される。

具体的には、例えば次の如き方法が例示される。

■増殖性細胞（例えば骨髄腫細胞）と抗体産生細胞とを
ポリエチレングリコールなどの存在下で細胞融合して得
られた細胞融合体（ハイブリトーマ）を培養することに
よりモノクローナル抗体を産生させる方法。

■抗体産生細胞を向リンパ性ウィルス（例えばＥＢウィ
ルス）により形質転換して得られた形質転換体を培養す
ることによりモノクローナル抗体を産生させる方法。

■抗体遺伝子を、組換技術により適当な宿主に導入して
得られた組み換え宿主を培養することによりモノクロー
ナル抗体を産生させる方法。

細胞融合法は上述した通り、抗体産生細胞と増殖性細胞
を融合させてハイブリドーマを調製することにより行わ
れる。

抗体産生細胞は各種ウィルス（サイトメガロウィルス、
ヘルペスウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザなど）その
もの、ウィルス由来蛋白（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、
破傷風毒素など）、腫瘍関連抗原（癌胎児性抗原、α−
フェトプロティンなど）等に対する抗体を産生ずる細胞
である。

抗体産生細胞はヒト、マウス、ラット等に由来するもの
が挙げられるが、好ましくはヒト由来のものが用いられ
る。

抗体産生細胞としては肺細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ
球等が例示される。

増殖性細胞としては骨髄腫細胞等が挙げられる。

骨髄腫細胞としては、例えばマウス、ラット、ヒトなど
由来のものが使用される。例えば、マウスミニｏ−７Ｐ
３Ｕ１、Ｘ　６３−Ａ　ｇ　８−６．５．３．などが挙
げられる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来
のものであることが好ましい。

細胞融合は、たとえば、ジー、ガルファー（Ｇ。

Ｇａ１ｆｒｅ）　　Ｃネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　
　２６６　、　５５０（］９７７））に記載の方法又は
これに準する方法によって行われる。この際、ポリエチ
レングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用
いて反応させることによって行われる。

また、モノクローナル抗体は公知の手段により断片化し
たもの、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ　　、Ｆ（ａｂ’）ｚ
であってもよい。

こうして得られるモノクローナル抗体としては、各種ウ
ィルス（サイトメガロウィルス、ヘルペスウィルス、Ｈ
ＩＶ、インフルエンザウィルスなど）に対するもの、ウ
ィルス由来蛋白（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、破傷風毒
素など）に対するもの、腫瘍関連抗原（癌胎児性抗原、
α−フェトプロティンなど）に対するものなどが挙げら
れる。

モノクローナル抗体の回収方法としては、抗体の精製法
として従来より既知の硫安分画法、ポリエチレングリコ
ール分画法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマト
などが適用できる。

本発明のモノクローナル抗体としては、ヒト、ウマ、マ
ウスなどに由来するものが例示され、その抗体タイプも
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどが挙げられる。

本発明においては、モノクローナル抗体としてキメラ抗
体をも包含する。キメラ抗体とは非ヒト・モノクローナ
ル抗体の可変領域（抗原認識部位）とヒト抗体の定常領
域を組み合わせたモノクローナル抗体であり、これには
Ｆａ　ｂ’　、Ｆ　（ａ　ｂ’ＬもしくはＦａｂ、また
は他の抗原認識キメラグロブリンフラグメントなどのフ
ラグメントをも包含する。

上記キメラ抗体は遺伝子操作を経て、キメラ抗体を発現
した細胞からキメラ抗体を抽出、要すれば精製したもの
であれば特に限定されない。キメラ抗体産生細胞は特に
限定されるものではなく、例えば、大腸菌、酵母菌、動
物細胞などが例示される（特開昭６０−１５５１３２号
公報、同６１−４７５００号公報、同６１−１１９１９
６号公報、同６１−１３４３２５号公報、特表昭６２−
５００３５２号公報）。

キメラ抗体を得るためには、遺伝子操作によってキメラ
抗体産生細胞を調製する方法、キメラ抗体を産生させる
方法、抽出法、さらには精製法は既知の方法またはそれ
に準する方法に従えばよい。

本発明におけるモノクローナル抗体含有水溶液としては
、モノクローナル抗体を含む未精製な水溶液から高度精
製された水溶液までいかなる段階のモノクローナル抗体
水溶液であってもよいが、有利には部分精製または精製
段階の水溶液が加熱処理の対象とされる。その蛋白質（
モノクローナル抗体）の含量は０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ
）のものが好ましいが、特に限定されない。また、当該
水溶液のｐＨは一般にｐＨ４，５〜６．５であり、特に
適当な緩衝液によってｐＨ５〜６に調製されていること
が好ましい。

ソルビトールの添加量は、モノクローナル抗体水溶液１
００　ｍｌ当たり、１０〜７０ｇ、好ましくは３０〜７
０ｇ、より好ましくは４０〜６０ｇである。

加熱処理時のイオン強度は、低イオン強度であることが
好ましく、特に０．０１以下、さらに好ましくは０．０
０１以下である。

加熱処理は、夾雑ウィルスを不活化するに十分な温度お
よび時間行えばよく、具体的には５０°Ｃ〜７０°Ｃ１
好ましくは約６０°Ｃにて、１０分〜２０時間、好まし
くは１０時間行われる。

本発明の加熱処理による効果を検討するため、モノクロ
ーナル抗体製剤に含まれる可能性が危惧される各種ウィ
ルスの感染性について、安定化剤の添加による加熱効果
、安定化剤の無添加による加熱効果を実験した。この実
験は、モノクローナル抗体試料に痘疹ウィルス、おたふ
くかぜウィルス、はしかウィルス、水泡性口内炎ウィル
ス、チクングニアウイルス、ポリオウィルス、コタサツ
キーウイルス、エコーウィルスを加え、６０°Ｃで１０
時間の加熱処理を行い、経時的に残存するウィルス感染
性を測定したが、１０時間後には安定化剤の添加、無添
加にかかわらず、感染性を完全に失っていた。この結果
は、用いたウィルス以外のウィルスについても本発明の
加熱処理が施されるならば感染性は失活させうろことを
示唆するものであり、また、数分間の加熱処理で感染性
は十分減少させうるものであることを示している。

上記加熱処理を行った後、外観、性状はもとより、重合
体の定量、抗補体価の測定、麻疹抗体価の測定および急
性毒性実験を行った。かくして、本発明方法を経たもの
はモノクローナル抗体製剤として医療上極めて安全性の
高い、また、存効性の高いものであることが確認された
。

本発明の処理を受けた製剤は溶液状であり、粗製品を用
いた場合は公知の精製法に準してさらに処理を行った後
、必要ならば、透析、除菌濾過を行った後、包装単位に
従って５００〜１００００■のモノクローナル抗体を含
むように分注される。

当該製剤の貯蔵に際しては、高温を避ければ特に問題で
はない。望ましくは、３０°Ｃ以下にて保存される。ま
た、当該製剤は所望により凍結乾燥製剤としてもよい。

当該処理を経たモノクローナル抗体は、そのまま、また
は自体公知の製剤化処理を行って、例えば注射用暴留水
で希釈または溶解して投与される。

投与量は、通常、成人に対しては、１回にモノクローナ
ル抗体として２５００〜５０００■量、小児に対しては
、１回にモノクローナル抗体として１００〜１５０■／
ｋｇ体重が使用される。

〔効果］本発明の加熱処理を経たモノクローナル抗体は、夾雑ウ
ィルス等の外来性感染物質が実質的に不活化されており
、かつモノクローナル抗体は高活性で存在するので、本
発明の処理を経たモノクローナル抗体の使用によってウ
ィルス等による感染の可能性が極めて少ない。

また、本発明の処理を経たモノクローナル抗体は、水に
対する溶解性に優れており、水熔解物の溶状が良好に保
たれ、さらに高分子型の生成が抑制され、かつ抗補体価
の上昇が抑制されており、静脈投与製剤用の処理法とし
て好適である。

［実施例］以下の実施例において、試験は次の方法によって行った
。

（試験方法）外観性状としては、濁りが問題となることから０、　　
Ｄ、　ｂｏｏｎｎの吸光度を測定した。

重合体の定量は高速液体クロマトグラフィーで分析した
。

抗補体価の測定は、カバソトとマイヤーの方法［Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｆ＋ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　２２５（１９６１）　）および百聞、聞出の方法〔
免疫の生化学、１０３、昭４６（井守出版）〕に準じた
。即ち、１００単位の補体が試料を加えることによって
何単位に減少するかを測定し、その減少単位を抗補体価
として表わした。

麻疹抗体価は、血球凝集阻止試験（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔ
ｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｔｅ５ｔ）法
により測定し、国際単位（１０／１５０■）で表わした
。

実施例１ヒト由来抗サイトメガロウィルスモノクローナル抗体（
ｉ８７１０３６０２に準じて調製）を５％（ｗ／ｖ）溶
液液となるように調製し、安定化剤としてソルビトール
をモノクローナル抗体溶液１００ａｉ！に対して５０ｇ
添加した。この際、溶液のＰＨは５，５、イオン強度は
０．００１以下となるように調製した。

６０゛Ｃで１０時間の加熱処理を行った。

その結果、加熱処理の前後で、溶液の外観、抗体の重合
体の含量、抗補体価、抗体価等に重大な変化は認められ
なかった。

実施例２癌モノクローナル抗体（特開昭６１−１６７６９９号公
報に準じて調製）を用いて、実施例１と同様に処理した
。

実施例３特表昭６２−５００３５２号公報により得たキメラ抗体
を５％（ｗ／ｖ）溶液となるように調製し、安定化剤と
してソルビトールをキメラ抗体溶液１００ｄに対して５
０ｇ添加した。この際、ｐＨは５．５、イオン強度は０
．０１以下となるように調製した。６０°Ｃで１０時間
の加熱処理を行った。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）モノクローナル抗体含有水溶液を、ソルビトール
の存在下に加熱処理することを特徴とするモノクローナ
ル抗体含有水溶液の加熱処理方法。
（２）モノクローナル抗体がキメラ抗体である請求項（
１）記載の加熱処理方法