JPH03199967A - 免疫学的測定方法およびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学的凝集反応を利用した測定方法および
測定用試薬に関する。特には、低分子化合物の免疫学的
測定方法および測定用試薬に関する。

［従来の技術］ 近年、医療分野において、治療経過の観察や疾病診断の
ために、血液や尿などの生体液体試料中に存在する微量
成分を迅速、簡便かつ高精度で測定することが、重要な
課題となっている。このような測定には、抗原抗体反応
による凝集を利用する方法が広く用いられている。例え
ば、抗原または抗体などの免疫学的活性物質で微粒子状
不溶性担体を感作し、この感作担体と検査対象物質含有
液体試料とを接触させ、感作担体と検査対象物質との抗
原抗体反応によって起きる凝集を目視的または光学的に
確認して、検査対象物質の存在（定性）および／または
濃度（定量）を分析することができる。

ここで、臨床検査の対象となる検査対象物質としては、
具体的には、タンパク質やポリペプチドなどの高分子化
合物から、薬物、ペプチド、糖類または核酸なとの低分
子化合物に至るまでの広範な化合物が存在する。

しかしながら、特に低分子化合物を免疫反応に由来する
凝集法で分析する場合には、その低分子化合物に特有の
困難な問題がある。

即ち、低分子化合物の場合には、それが含んでいる抗原
決定基の数が少ないので、高分子化合物についての分析
方法をそのまま利用することができない。例えば、抗体
で感作した不溶性担体に、多数の抗原決定基を含む高分
子化合物を接触させると凝集反応が起きるのに対して、
抗原決定基を１個しか含まない低分子化合物を接触させ
ても凝集反応は当然起こらない。また、その低分子化合
物が２個または３個程度の抗原決定基を有していても、
分子それ自体が小さいので、立体障害のために凝集が起
こらないかあるいは極めて困難になる。

特開昭６０−２０１４９号公報には、二種類の担体を用
いる技術が記載されている。即ち、検査対象物質である
ハプテン（低分子化合物）で感作した担体と、そのハプ
テンに対する抗体で感作した担体と、被検液体試料とを
接触させ、二種類の担体の凝集反応を、試料中の検査対
象物質が阻査。

する程度を測定することによって検査対象物質の存在ま
たは濃度を分析する技術が記載されている。

しかしながら、この特許公報に記載の技術にも、感度が
低いという問題があった。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明者は、従来技術における前記の問題点を、従来技
術の観点とは全く異なる手段によって解決することがで
きることを見いだした。即ち、凝集反応を直接的に起こ
すことが不可能または困難な検査対象化合物（ａ）（特
に低分子化合物）に対する抗体（ｂ）と、その検査対象
化合物（ａ）それ自体との抗原抗体反応複合体［（ａ）
　十（ｂ）］を作製し、続いてその複合体［（ａ＞＋　
（ｂ）］に対する第２の抗体（Ｃ）を作製し、そしてそ
の第２の抗体（Ｃ）を利用することによって前記の問題
を解決することができることを見い出した。

本発明は、この知見に基づくものである。

［課題を解決するための手段］ 従って、本発明は、 （ｉ）検査対象化合物（ａ）と、 この検査対象化合物（ａ）に対する第１次抗体（ｂ）と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体（ｃ）を担持
した不溶性担体（Ｘ）、 （ｉｉ）前記の第１次抗体（ｂ）、またはその第１次抗
体（ｂ）を担持した不溶性若しくは可溶性の担体（Ｙ）
および （ｉｉｉ）被検試料（ｄ） を接触させ、次いで、試料（ｄ）中の検査対象化合物（
ａ）と、不溶性担体（Ｘ）と、第１次抗体（ｂ）または
担体（Ｙ）とによる凝集反応を測定することを特徴とす
る、免疫学的測定方法に関する。

更に、本発明は、 （ｉ）検査対象化合物（ａ）と、 この検査対象化合物（ａ）に対する第１次抗体（ｂ）と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体（Ｃ）を担持
した不溶性担体くＸ）、および （ｉｉ）前記の第１次抗体くｂ）、またはその第１次抗
体（ｂ）を担持した不溶性若しくは可溶性の担体（Ｙ） を含むことを特徴とする、免疫学的測定用試薬にも関す
る。

以下、本発明の構成を詳細に説明する。

本発明において検査対象化合物（ａ）とは、抗原決定基
の数が少ないか、あるいは複数部位での抗原抗体反応を
妨げる立体障害が起きるために、その抗体で感作した担
体を用いては直接凝集反応を起こすことが不可能または
困難な化合物である。

例えば、分子量が数百程度の薬毒物の場合には、その基
本骨格を色々な方向から認識する抗体が数種類は存在す
ることが予想される。しかしながら、実際の抗原抗体反
応の場においては立体障害のために直接的に凝集反応を
起こすことは一般にできない。また、ペプチド抗原では
、分子量２．０００〜３，０００当たりに１個の抗原決
定基が存在するものと一般に考えられている。しかしな
がら、分子量が約５，０００以下のペプチドにおいては
、複数部位での抗原抗体反応を妨げる立体障害が起きる
可能性が高い。従って、本発明の検査対象化合物（ａ）
は、薬毒物の場合には、分子量が数百程度の化合物であ
り、ペプチドやタンパク質の場合には、分子量が約５．
０００以下の化合物である。

これらの低分子化合物の具体例としては、薬毒物（例え
ば、バルビッール系催眠剤）、ペプチド（例えば、キニ
ン類、カルシトニン）、低分子タンパク質（例えば、酵
素的分解産物）、糖類（例えば、グルコース、腫瘍関連
糖鎖抗原）、ステロイドハプテン（例えば、卵胞ホルモ
ン、黄体ホルモン、男性ホルモン、副腎皮質ホルモン、
ビタミンＤ類、コレステロール、胆汁酸、強心性ステロ
イド、サポニン）、生理活性アミン類（例えば、カテコ
ールアミン）を挙げることができる。

前記の検査対象化合物（ａ）に対する第１吹拭体（ｂ）
は、公知の方法で調製することができる。

検査対象化合物（ａ）それ自体が免疫原性を有する場合
には、その物質で動物（例えば、マウス、ラット、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ）す免疫し、免疫動物の
抗血清からポリクローナル抗体を調製するか、あるいは
好ましくはその牌臓細胞を用いる細胞融合により、モノ
クローナル抗体を調製することができる。

また、検査対象化合物（ａ）それ自体が免疫原性を有し
ない場合には、免疫原性を有する高分子キャリア化合物
と結合させて免疫原性を付与してから、動物に投与し、
前記と同様にして第１吹拭体（ａ）を調製する。

免疫原性を有する高分子キャリア化合物は、例えばタン
パク質（特にウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、ウ
シ免疫グロブリン、ＫＬＨ）である。

検査対象化合物（ａ）と高分子キャリア化合物との結合
には、例えば、グルタルアルデヒド法、カルボジイミド
法を用いることができる。

こうして得られた第１吹拭体（ｂ）は、不溶性若しくは
可溶性の担体（Ｙ）に担持させるか、または担体に担持
させず単独で、検査対象化合物（ａ）の測定に使用する
ことができる。第１吹拭体（ｂ）が多量体（主としてＩ
ｇＭ）である場合には、担体に担持させず単独で使用し
、第１吹拭体（ｂ）が単量体（主としてＩｇＧ）である
場合には、第２吹拭体の反応の場を多価に提供するため
に第１吹拭体（ｂ）を不溶性若しくは可溶性の担体（Ｙ
）に担持させて使用するのが好ましい。

不溶性担体（Ｙ）としては、例えば、ラテックス粒子、
または赤血球を用いることができる。担体（Ｙ）の感作
は、主として疎水結合による物理吸着法を用いて、ある
いは、カルボキシル基やアミノ基などによって修飾しな
担体（Ｙ）と抗体（ｂ）とを架橋剤（例えば、グルタル
アルデヒド、カルボジイミド）で化学的に結合する方法
を用いて実施することができる。

可溶性担体（Ｙ）としては、例えば、デキストランを用
いることができる。この場合の感作は、過ヨウ素酸によ
る化学結合法を用いて実施することができる。

検査対象化合物（ａ）と第１吹拭体（ｂ）との抗原抗体
反応複合体［（ａ）　十（ｂ）］の調製は、以下のとお
りに行うことができる。

即ち、第１吹拭体（ｂ）がポリクローナル抗体である場
合には、アフィニティークロマトグラフィーの手法を用
いて検査対象化合物（ａ）に特異的に反応する第１吹拭
体（ｂ）を得た後、検査対象化合物（ａ）の過剰量存在
下に第１吹拭体（ｂ）と反応させ、反応に関与しない検
査対象化合物（ａ）をゲル濾過法によって除去して、抗
原抗体反応複合体［（ａ）＋　（ｂ）］を得ることがで
きる。

更に、第１次抗体（ｂ）がモノクローナル抗体である場
合には、抗体を精製した後、前記のポリクローナル抗体
に関連して説明したのと同様の方法で、検査対象化合物
（ａ）の過剰量存在下に第１−吹拭体（ｂ）と反応させ
、ゲル濾過法によって処理して、抗原抗体反応複合体［
（ａ）＋（ｂ）］を得ることができる。

更に、抗原抗体反応複合体［（ａ＞＋　（ｂ）］に対す
る第２次抗体（ｃ）は、複合体［（ａ）＋（ｂ）］で動
物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、
ウマ、ブタ）を免疫し、免疫動物の抗血清からポリクロ
ーナル抗体を調製するか、あるいは好ましくはその牌臓
細胞を用いる細胞融合により、モノクローナル抗体を調
製することができる。

即ち、ポリクローナル抗体を得る場合には、始めに抗原
抗体反応複合体［（ａ）　＋（ｂ）］を固定化して得な
アフィニティーカラムに、抗血清を流して吸着画分を調
製し、続いて、検査対象化合物（ａ）の固定化カラムお
よび第１次抗体（ｂ）の固定化カラムに前記の吸着画分
を流して非吸着画分を採集し、第２次抗体（Ｃ）とする
ことができる。

モノクローナル抗体の場合には、ＥＬＩＳＡ法により、
検査対象化合物（ａ）および第１次抗体（ｂ）とは反応
せず、抗原抗体反応複合体［（ａ）十（ｂ）］とは反応
する抗体を選ぶことにより、第２次抗体（ｃ）とするこ
とができる。

こうして得られた第２次抗体（ｃ）で不溶性担体（Ｘ＞
を感作する。担体（Ｘ）の感作は、主として疎水結合に
よる物理吸着法を用いて、あるいは、カルボキシル基や
アミノ基などによって修飾した担体（Ｘ）と抗体（ｃ）
とを架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイ
ミド）で化学的に結合する方法を用いて実施することが
できる。

担体（Ｘ、）としては、前記の不溶性担体（Ｙ）と同様
のものを用いることができる。こうして本発明で用いる
第２次抗体感作不溶性担体（Ｘ）を得ることができる。

本発明で用いる被検試料（ｄ）は、検査対象化合物（ａ
）を含むおそれのある試料、例えば、水性液体、特に生
体試料（例えば、全血液、血清、尿）である。

第２次抗体（ｃ）感作不溶性担体（Ｘ）と、第１次抗体
（ｂ）またはその第１次抗体（ｂ）担持担体（Ｙ）とを
含む液体に、被検試料（ｄ）を加えると、その被検試料
（ｄ）中に検査対象化合物（ａ）が存在している場合に
は凝集反応が起きる。即ち、第１図に示すように、不溶
性担体１に担持された第２次抗体２が、検査対象物質３
と第１次抗体４との複合体５を介して相互に結合し、こ
の結果凝集が起きる。ここで、仮に、第１次抗体４で不
溶性担体１を感作し、その担体１と検査対象物質３とを
接触させても、検査対象物質３の抗原決定基の数が少な
いか、あるいは立体障害のために、相互の結合がまった
くあるいはほとんど起こらず、凝集が観察されない。

凝集反応は、被検試料中に含まれる検査対象物質の量に
依存するので、凝集の程度を、従来公知の方法で、目視
的（肉眼）または光学的（光学測定機器の使用）に測定
することによって検査対象物質の定量を、バッチ式にあ
るいは連続式に行うことができる。

本発明の試薬は、第２次抗体（Ｃ）を担持した不溶性担
体（Ｘ）からなる第１成分と、第１次組体（ｂ）または
その第１次抗体（ｂ）を担持した不溶性若しくは可溶性
の担体（Ｙ）からなる第２成分とからなる。第１成分と
第２成分は、懸濁液または溶液であり、好ましくは抗菌
剤（例えば、アジ化ナトリウム）の存在下に、低温下（
好ましくは１〜１０°Ｃ）で保存することができる。

被検試料（ｄ）中の検査対象化合物（ａ）の測定は、被
検試料（ｄ）と第１成分と第２成分とを同時に混和し、
任意の時間（例えば、１分間以上）反応させた後、目視
的（肉眼）または光学的（光学測定機器の使用）により
測定することができる。

また、被検試料（ｄ）と第２成分とを最初に混和して任
意の時間（例えば、１分間以上）反応させた後、更に第
１成分を加えて任意の時間（例えは、１分間以上）反応
させ、目視的（肉眼）または光学的（光学測定機器の使
用）により測定することができる。

［実施例］ 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

皿よ （１）ジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲート（複合体）の
調製 カルボジイミド法（Ｂ、Ｂ、Ａ、：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｒＡ　　８４２　、
９０−９９　）に準じ、ジゴキシン（分子量７８０）を
キャリアタンパク質である牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
に共有結合させた。即ち、ジゴキシン６ｍｇ、ＢＳＡ３
ｍｇおよび１−エチル−５−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド３０ｍｇを、０．９％塩化ナトリ
ウム溶液１ｍｌ中に溶解し、２０’Ｃで１６時間保温し
、０．９％塩化ナトリウム溶液（４°Ｃ）で透析した。

得られた透析液（１，Ｏｍｇ／ｍｌ、２５ｍ１）をジゴ
キシンに対するモノクローナル抗体作製用の免疫抗原と
して使用し、更に、抗ジゴキシンモノクローナル抗体産
生性ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原
として使用した。カップリング効率は約３０％であった
。

（２）免疫化牌細胞の調製 ジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲート免疫原溶液（１，０
ｍｇ／ｍｌ）を等量のフロイント氏完全アジュバントと
乳化するまで混合し、その混合液２００μｌをマウス腹
腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）
。３０日経過後、そのマウスに前記と同様の混合液２０
０μｍをマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２
回免疫から２１日経過後、ジゴキシン−ＢＳＡコンジュ
ゲート免疫原溶液（１、Ｏｍｇ／ｍｌ）を等量の生理食
塩水で希釈し、その希釈液２００μｍを、前記マウスの
静脈内に投与したく最終免疫）。最終免疫から３日経過
後、牌臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合
工程に使用した。

（３）細胞融合工程 無菌的に摘出した前記の牌臓を、１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地培地５奢ｌれたシャーレに入れた。次に
、牌臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍ
１で還流して牌臓細胞を流出させた後、この牌臓細胞懸
濁液をナイロンメツシュに通した。この牌臓細胞を５０
ｍ１遠心チユーブに集め、５００Ｘｇで１０分間遠心し
た。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５
５ｍＭＮＨ４ｃｌ、１０ｍＭＫＨＣＯ３，１ｍＭＮａ２
ＥＤＴＡ　　ｐＨ７，Ｏ＞４ｍｌを加え、懸濁させた。

０℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。

１５％ウシ胎児血清１０ｍ１を含むＤＭＥ培地を加えて
から遠心分離しな。こうして得た細胞ペレットをＤＭＦ
、培地で遠心法によって洗浄し、生きている牌臓細胞数
を測定した。

一方、予め培養しておいたマウスミエローマ細胞（骨髄
腫細胞）ＳＰ　　２１０−Ａｇ１４（理化学研究所シー
ンバンク細胞銀行）約２×１０７個に前記牌臓細胞１×
１０８個を加え、ＤＭＥ培地中で良く混合し、遠心分離
を行った（５００Ｘｇ、１０分間）。その上清を吸引し
、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチレングリ
コール４０００溶液（３８℃に保温）０゜５ｍｌを滴下
し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転することに
よってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混
合させた。次に、３８°Ｃに保温しておいたＤＭＥ培地
を３０秒毎に１ｍｌ加えて、チューブを穏やかに回転さ
せた。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児
血清２０ｍ１を含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５
００Ｘｇ、１０７分間）を行った。上清を除去した後、
細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（
ＤＭＥ培地にアミノプテリン４　Ｘ　１０−７Ｍ、チミ
ジン１．６Ｘ１０−５Ｍ、ヒボキサンチンｌＸｌ０−’
Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回
洗浄後、４０ｍ１の前記Ｈ，ＡＴ培地に懸濁した。この
細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウェルに
２００ｍ１ずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガスを含む炭
酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔
で各ウェルの培地を約１００μｌ除き、新たに前記のＨ
ＡＴ培地１００μｌを加えることにより、ＨＡＴ培地中
で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１５
％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジ
ン１．６Ｘ１０−５Ｍ、ヒポキサンチンｌＸ１０−４Ｍ
になるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマ
の増殖を観察するとともに、１００日目、後述するＥＬ
ＩＳＡ法によりジゴキシン抗体産生ハイブリドーマをス
クリーニングした。

（４）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ　　ＩＩ、日本ダイナチック株式会社
）の各ウェルに、前記のジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲ
ート免疫原溶液（５０μｇ／ｍｌ、生理食塩水で希釈）
５０μｌずつを分注し、２５°Ｃで２時間放置した（プ
レートＡ）。

同様に、別のプレートにＢＳＡ（５０μｇ／ｍ　１　）
を５０μｌずつ分注する（プレートＢ）。

次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で３回洗
浄した後、各ウェルに培養上清５０μｍを加え、２５℃
で１時間反応させた。

次に、Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　２０＝生理食塩水で２００倍に
希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、
デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後
、０．０５％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　２０生理食塩水で各ウェ
ルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０
ｍＭフェノールおよび０．００５％過酸化水素水を含む
溶液２５０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反
応させ、各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定し
た（プレートＡで反応し、プレートＢで反応しないウェ
ルの検索）。その結果、１９２ウエル中４ウエルに、抗
ジゴキシン抗体産生が認められた。そのウェル中のハイ
ブリドーマを２４ウエルプレートに移し、１５％ウシ胎
児血清を含むＨＴ培地で、４〜５日間培養した。その後
、再度ＥＬＩＳＡ法によって、キャリアタンパク質（Ｂ
ＳＡ）に反応しない抗ジゴキシン抗体の産生の有無を確
認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希
釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなる
ように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔細胞がウェルあたり２×１０４個分注しで
ある９６ウエルプレートの各ウェルに１００μｌずつ分
注した。１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗ジゴキシ
ン特異抗体を産生ずるハイブリドーマのクローンをスク
リーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、
２０〜４０個の抗体産生クローンの中から、増殖性が良
好で、抗体分泌能が高く、しかも、安定なりローンを選
び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、抗ジゴキ
シン特異的抗体産生ハイブリドーマＤＩＧ−１を樹立し
た。

（５）モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＤＩＧ−１を１５％ウシ胎児血清
を含むＤＭＥ培地中で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気中
において７２〜９６時間培養した。

培養物を遠心分離（１００００Ｘｇ、１０分）後、上滑
に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるよう
に徐々に加えた。混合物を水冷下で３０分間攪拌した後
、６０分間放置し、遠心分離（１００００Ｘｇ、１０分
）後、得られた沈殿物を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸
Ｍ街液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝
液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充
填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８，０）と０．２ＭＮａＣ１を含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）の間で濃度勾配法によって
行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で
濃縮し、０．１Ｍリン酸Ｍ街液（ｐＨ８，０）に対して
透析した。

ウシ血清１ｇＧを除くために、透析物をヤギ抗つシ血清
ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に、透
過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し
たプロティンＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した
。カラムをｐＨ３，５の緩衝液で溶出して、精製したジ
ゴキシン特異抗体ＤＩＧ−１の溶液を得た。

（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週令のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、１４〜２０日経過した後のマ
ウス腹腔内に、イン・ビトロで増殖させたハイブリドー
マＤＩＧ−１をマウス−回当なり２Ｘ１０６細胞となる
ように接種した。

各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５
ｍ１の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ
／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は
、前記のイン・ビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤギ
抗つシ血清ＩｇＧセファロース４Ｂのカラムを通す操作
を除く）行なった。

（６）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスおよ
び特異性の同定 抗ジゴキシン特異モノクローナル抗体ＤＩＧ１の免疫グ
ロブリンクラスおよび特異性の同定を、オフテロ二−免
疫拡散法およびエンザイムイムノアッセイ法により行っ
た結果、モノクローナル抗体ＤＩＧ−１の免疫グロブリ
ンクラスはＩｇＧ１であることがわかった。

（７）ジゴキシン−ＤＩＧ−１（抗ジゴキシンモノクロ
ーナル抗体）複合体の調製、免疫化した胛臓細胞の調製
、細胞融合およびハイブリドーマの樹立 精製抗体ＤＩＧ−１の１ｍｇ　（１ｍｇ／ｍ１　。

０．９％ＮａＣｌ　）とジゴキシン１ｍｇ　（１ｍｇ／
ｍｌ、０．９％ＮａＣ１）とを混合し、２０°Ｃで１時
間保温した。この混合液をセファデックスＧ−２５ゲル
濾過カラムにかけ、遊離のジゴキシンを除去し、ジゴキ
シン−ＤＩＧ−１複合体を得た。このジゴキシン−ＤＩ
Ｇ−１複合体く１．０ｍｇ／ｍ１．０．９％ＮａＣｌ　
）を当量のフロイント氏完全アジュバントと乳化するま
で混合し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与
することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経
過後、そのマウスに前記と同様の混合液２００μｌをマ
ウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。

第２回免疫から２１日経過後、ジゴキシン−ＤＩＧ−１
免疫原溶液（１，０ｍｇ／ｍ１　）を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液２００μｍを、前記マウスの静脈
内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、
肺臓を無菌的にマウスがら取り出し、抗ジゴキシン特異
性抗体ＤＩＧ−１の方法と同様の方法で細胞融合を行っ
た。細胞融合処理から１２日目にＥＬＩＳＡ法により、
ジゴキシン−ＤＩＧ−１複合体に対して特異的に反応す
る抗体を産生ずるハイブリドーマのスクリーニングを行
った。

即ち、９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕ　１
　ｏｎＩ　Ｉ、日本ダイナチック株式会社）の各ウェル
に前記のジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲート溶液５０μ
ｇ／ｍｌを５０μｌずっ分注し、２５℃で２時間放置し
た（プレートＣ）。

同様に、別々のプレートに、ＤＩＧ−１およびジゴキシ
ン−ＤＩＧ−１複合体をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度
で５０μｍずつ分注した。（プレートＤ、プレー）Ｅ）
、次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で３回
洗浄した後、各ウェルに培養上清５０μｌを加え、２５
℃で１時間反応させた。

次に、Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　２０−生理食塩水で２００倍に
希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、
デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後
、０．０５％Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０生理食塩水で各
ウェルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、
１０ｍＭフェノールおよび０．００５％過酸化水素水を
含む溶液２５０μｍ″′を各ウェルに加え、２５℃で３
０分間反応させ、各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度
を測是した。

その結果、プレートＥで反応し、プレートＣおよびプレ
ートＤで反応しないウェルは、２８８ウエル中で２ウエ
ルに認められた。そのウェル中のハイブリドーマを２４
ウエルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ
培地で、７日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法に
よって、ジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲートおよびＤＩ
Ｇｌには反応せず、ジゴキシン−ＤＩＧ−１複合体に反
応する抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によ
り、クローニングを行った。限界希釈法は、ＨＴ培地で
ハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞
浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞が
ウェルあたり２×１０’個分注しである９６ウエルプレ
ートの各ウェルに１００μｌずつ分注した。１２日後、
ＥＬＩＳＡ法によって、抗ジゴキシン＝ＤＩＧ−１−複
合体特異抗体を産生ずるハイブリドーマのクローンをス
クリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき
、２０〜４０個の抗体産生クローンの中から、増殖性が
良好で、抗体分泌能が高く、しかも、安定なりローンを
選び、前記と同様の方法で再クローン化を行い、抗ジゴ
キシンーＤＩＧ１複合体特異的抗体を産生ずるハイブリ
ドーマＤＩＧ−２を樹立した。

（８）モノクローナル抗体の製造と免疫グロブリンクラ
スの同定 モノクローナル抗体ＤＩＧ−２の製造とサブクラスの同
定は、前記と同様の操作を行った結果、モノクローナル
抗体ＤＩＧ−２の免疫グロブリンサブクラスはＩｇＧ１
であった。

前記のＥＬＩＳＡ法により調べたモノクローナル抗体Ｄ
ＩＧ−２の特異性を第２図に示す。第２図において、（
ａ）はジゴキシン−ＢＳＡコンジュゲートのプレート、
（ｂ）はモノクローナル抗体ＤＩＧ−１のプレート、そ
して［（ａ）＋（ｂ）］は］ジゴキシンーＤＩＧｌ１複
合のプレートを示す。

（９）抗体と不溶性担体との結合 ラテックス溶液（２％、Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社：
粒径０．４８２μｍ）２ｍｌと、ＤＩＧ−２抗体２．０
ｍｇ／ｍｌを含有する水溶液２ｍｌとを混合し、約１時
間攪拌しな。遠心後（２００００ｇ、１０分）、沈殿物
を０，１％ＢＳＡ溶液に懸濁し、約１時間攪拌した。再
び遠心（２００００ｇ、１０分）した後、沈殿を水に懸
濁し、約２時間攪拌した。こうして、ＤＩＧ−２抗体−
ラテックス複合体含有液を得た。

（１０）スライド凝集反応による定量 前項（９）で調製したＤＩＧ−２抗体−ラテックス複合
体含有液３０μＩと種々の濃度のジゴキシンを含有する
水溶液３０μｍと、一定量のＤＩＧ−１を含む水溶液３
０μＩとをスライドガラス状で混合、揺動して３分後に
凝集像を目視的に判定した。結果を以下の第１表に示す
。

４ 第１人 ジゴキシン濃度（ｎｇ／ｍ１） ３２　１６　　ｇ　　４　２　１　０．５　０，２５　
０．１２５十＋＋＋＋＋＋ ＋　：　凝集あり ：　凝集なし く１１）分光学的方法による測定 前項（９）で調製したＤＩＧ−２抗体−ラテックス複合
体を用い、自動分析器（ＬＰＩＡ：三菱化成）によって
凝集反応速度のジゴキシン濃度依存性を調べた。反応器
内に、一定量のＤＩＧｌと０．１２５〜３２ｎｇ／ｍｌ
の種々の濃度のジゴキシン溶液を分注し、そこにＤＩＧ
−２抗体ラテックス含有液を添加した。

対照実験として、ＤＩＧ−１を除いて同様の操作を行っ
た。得られた結果を第３図に示す。第３図において、○
はＤＩＧ−１が存在する本発明方法による実験の結果を
、そして、ΔはＤＩＧ−１を除いた対照実験の結果を、
更に、・はＤＩＧ１抗体を前記（９）の方法と同様の方
法でラテックスに感作して得たＤＩＧ−１抗体−ラテッ
クスを、ＤＩＧ−２抗体−ラテックスの非存在下で種′
々の濃度のジゴキシン溶液と反応させた結果を各々示す
。第３図から明らかなように、ジゴキシン濃度は凝集反
応速度（Ｖ値：単位時間当なりの透過度変１ヒ）と良好
な相関性を示している。

形 （１）カルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲート（
複合体）の調製 グルタルアルデヒド法（ＣＩｉｎ、　　Ｃｈｅｍ；３１
　：４３０，１９８５）に準じ、ヒトカルシトニン（分
子量３５００）をキャリアタンパク質である卵白アルブ
ミンに共有結合させた。即ち、ヒトカルシトニン（以下
、単にカルシトニンと称する）３ｍｇおよび卵白アルブ
ミン１０ｍｇを、０．９％塩化ナトリウム溶液２．０ｍ
ｌ中に溶解し、この溶液に１％（ｖ／ｖ）グルタルアル
デヒド０．２ｍｌを添加し、室温で２時間反応さぜな後
、０．９％塩化ナトリウム溶液（４℃）で透析した。得
られた透析液を０．９％塩化ナトリウム溶液で１．、Ｏ
ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、この希釈液をカルシトニン
に対するモノクローナル抗体作製用の免疫抗原として使
用し、更に、抗カルシトニンモノクローナル抗体産生性
ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原とし
て使用した。カップリング効率は約４０％であった。

（２）免疫化肺細胞の調製 カルシトニン−卵白アルブミンコンシュケート免疫原溶
液（１，０ｍｇ／ｍｌ）を等量のフロイント氏完全アジ
ュバントと乳化するまで混合し、その混合液２００μｍ
をマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第
１回免疫）。３０日経過後、そのマウスに前記と同様の
混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与した（第２回免
疫）。

第２回免疫から２１日経過後、カルシトニン−卵白アル
ブミンコンジュゲート免疫原溶液（１，０ｍｇ／ｍｌ）
を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液２００μｌを
、前記マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免
疫から３日経過後、肺臓を無菌的にマウスから取り出し
、次の細胞融合工程に使用した。

（３）細胞融合工程 無菌的に摘出した前記の肺臓を、１５％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地培地５奢ｌれたシャーレに入れた。次に
、肺臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍ
１で還流して牌臓細胞を流出させた後、この牌臓細胞懸
濁液をナイロンメツシュに通した。この牌臓細胞を５０
ｍ１遠心チユーブに集め、５００Ｘｇで１０分間遠心し
た。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５
５ｍＭＮＨ＋ＣＩ、１０ｍＭＫＨＣＯ３，１ｍＭＮａ２
ＥＤＴＡ　　ｐＨ７，０）４ｍｌを加え、懸濁させた。

０°Ｃで５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた
。１５％ウシ胎児血清１０ｍ１を含むＤＭＥ培地を加え
てから遠心分離した。こうして得た細胞ペレットをＤＭ
Ｅ培地で遠心法によって洗浄し、生きている牌臓細胞数
を測定した。

一方、予め培養しておいたマウスミエローマ細胞（骨髄
腫細胞）ＳＰ　　２１０−Ａｇ１４（理化学研究所シー
ンバンク細胞銀行）約２×１０７個に前記牌臓細胞１×
１０８個を加え、ＤＭＥ培地中で良く混合し、遠心分離
を行った（５００Ｘｇ、１０分間）。その上清を吸引し
、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチレングリ
コール４０００溶液（３８℃に保温）０．５ｍｌを滴下
し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転することに
よってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混
合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を
３０秒毎に１ｍｌ加えて、チューブを穏やかに回転させ
た。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血
清２０　ｍ　ｌを含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（
５００Ｘｇ、１０分間）を行った。上滑を除去した後、
細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（
ＤＭＥ培地にアミノプテリン４Ｘ１０”Ｍ、チミジン１
．６Ｘ１０−５Ｍ、ヒボキサンチンｌＸ１０’Ｍになる
ように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄後、
４０ｍ１の前記ＨＡＴ培地に懸濁した。この細胞懸濁液
を９６ウエル細胞培養プレートの各ウェルに２００ｍ１
ずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェル
の培地を約１００μｌ除き、新たに前記のＨＡＴ培地１
００μｌを加えることにより、ＨＡＴ培地中で増殖する
ハイブリドーマを選択した。７日目がら１５％ウシ胎児
血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６Ｘ
１０−５Ｍ、ヒボキサンチンｌＸ１０’Ｍになるように
添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察
するとともに、１１日目に、後述するＥＬＩＳＡ法によ
りジゴキシン抗体産生ハイブリドーマをスクリーニング
した。

（４）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート
（Ｉｍｍｕｌｏｎ　　ＩＩ、日本グイナテック株式会社
）の各ウェルに、前記のカルシトニン−卵白アルブミン
コンジュゲート免疫原溶液（５０μｇ／ｍｌ、生理食塩
水で希釈）５０μｍずつを分注し、２５°Ｃで２時間放
置した（プレートＦ）。

同様に、別のプレートに卵白アルブミン（５０μｇ／ｍ
１　＞を５０μｌずつ分注する（プレートＧ）。次に、
０．０５％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　２０−生理食塩水で３回洗
浄した後、各ウェルに培養上清５０μｍを加え、２５℃
で１時間反応させた。

次に、Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２００倍に希釈し
たペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマ
ーク）５０μｍを各ウェルに加えた。反応終了後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０生理食塩水で各ウェルを３回洗浄
し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０ｍＭフェノー
ルおよび０．００５％過酸化水素水を含む溶液２５０μ
ｍを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウ
ェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した（プレート
Ｆで反応し、プレートＧで反応しないウェルの検索）。

その結果、１９２ウエル中３ウエルに、抗カルシトニン
抗体産生が認められた。

そのウェル中のハイブリドーマを２４ウエルプレートに
移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で、４〜５日
間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって、キャ
リアタンパク質（卵白アルブミン）に反応しない抗カル
シトニン抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法に
よりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイ
ブリドーマか５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊
液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウェ
ルあなり２×１０４個分注しである９６ウエルプレート
の各ウェルに１００μｌずつ分注した。

８日後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗ジゴキシン特異抗体
を産生ずるハイブリドーマのクローンをスクリーニング
した。その結果、各ハイブリドーマにつき、３０〜５０
個の抗体産生クローンの中から、増殖性が良好で、抗体
分泌能が高く、しかも、安定なりローンを選び、前記と
同様の方法で再クローン化を行い、抗ジゴキシン特異的
抗体産生ハイブリドーマＣＡＬ−１を樹立した。

（５）モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＣＡＬ−１を１５％ウシ胎児血清
を含むＤＭＥ培地中で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気中
において７２〜９６時間培養した。

培養物を遠心分離（１００００Ｘｇ、１０分）後、上清
に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるよう
に徐々に加えた。混合物を水冷下で３０分間攪拌した後
、６０分間放置し、遠心分離（１００００Ｘｇ、１０分
）後、得られた沈殿物を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸
緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸ＭＷ
Ｉ液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに
充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）と０．２ＭＮａＣ１を含む１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）の間で濃度勾配法によっ
て行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法
で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対し
て透析した。

ウシ血清１ｇＧを除くために、透析物をヤギ抗つシ血清
ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に、透
過液をＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化し
たプロティンＡ−セファロｒス４Ｂのカラムに充填した
。カラムをｐＨ３，５の緩衝液で溶出して、精製したカ
ルシトニン特異抗体ＣＡＬ−１の溶液を得た。

（ｂ）イン・ビボ法 ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）０．５ｍｌを１０〜１２週令のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与し、１４〜２０日経過した後のマ
ウス腹腔内に、イン・ビトロで増殖させたハイブリドー
マＣＡＬ−１をマウス−回当なり２×１０６細胞となる
ように接種した。

各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５
ｍ１の腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ
／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は
、前記のイン・ビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤギ
抗つシ血清ＩｇＧセファロース４Ｂのカラムを通す操作
を除く）行なった。

（６）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスおよ
び特異性の同定 抗ジゴキシン特異モノクローナル抗体ＣＡ　Ｉ−１の免
疫グロブリンクラスおよび特異性の同定を、オフテロ二
−免疫拡散法およびエンザイムイムノアッセイ法により
行った結果、モノクローナル抗体ＣＡＬ−１の免疫グロ
ブリンクラスはＩ　ｇＧ２ａであることがわかった。

（７）カルシトニン−ＣＡＬ−１（抗カルシトニンモノ
クローナル抗体）複合体の調製、免疫化した牌臓細胞の
調製、細胞融合およびハイブリドーマの樹立 精製抗体ＣＡＬ−１の１ｍｇ　（１ｍｇ／ｍｌ。

０．９％ＮａＣ１）とカルシトニン１ｍｇ　（１ｍｇ／
ｍｌ　、０．９％ＮａＣ１）とを混合し、２０℃で１時
間保温した。この混合液をセファデックスＧ−５０ゲル
濾過カラムにかけ、遊離のカルシトニンを除去し、カル
シトニン−ＣＡＬ−１複合体を得た。このカルシトニン
−ＣＡＬ−１複合体（１，０ｍｇ／ｍｌ、０．９％Ｎａ
Ｃ１）を等量のフロイント氏完全アジュバントと乳化す
るまで混合し、その混合液２００μｍをマウス腹腔内に
投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０
日経過後、そのマウスに前記と同様の混合液２００μｌ
をマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫
から２１日経過後、カルシトニン−ＣＡＬ−１複合体免
疫原溶液（１、０ｍｇ／ｍ　ｌ　）を等量の生理食塩水
で希釈し、その希釈液２００μｍを、前記マウスの静脈
内に投与したく最終免疫）。最終免疫から３日経過後、
牌臓を無菌的にマウスから取り出し、抗カルシトニン特
異性抗体ＣＡＬ−１の方法と同様の方法で細胞融合を行
った。細胞融合処理から１４日目にＥＬＩＳＡ法により
、カルシトニン−ＣＡＬ−１複合体に対して特異的に反
応する抗体を産生ずるハイブリドーマのスクリーニング
を行った。

即ち、９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕ　１
　ｏｎＩ　Ｉ、日本ダイナチック株式会社）の各ウェル
に前記のカルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲート
溶液５０μｇ／ｍｌを５０μｌずつ分注し、２５℃で２
時間放置した（プレートＨ）。同様に、別々のプレート
に、ＣＡＬｌおよびカルシトニン−ＣＡＬ−１複合体を
それぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ分注した
。（プレートエ、プレートＪ）。次に、０．０５％Ｔｗ
ｅ　ｅ　ｎ　２０−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウ
ェルに培養上清５０μｍを加え、２５℃で１時間反応さ
せた。

次に、Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０−生理食塩水で２００
倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ
社、デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終
了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウェ
ルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０
ｍＭフェノールおよび０．００５％過酸化水素水を含む
溶液２５０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反
応させ、各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。

その結果、プレートＪで反応し、プレートＨおよびプレ
ート■で反応しないウェルは、３８４ウエル中で２ウエ
ルに認められた。そのウェル中のハイブリドーマを２４
ウエルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ
培地で、１１日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法
によって、カルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲー
トおよびＣＡＬ−１には反応せず、カルシトニン−ＣＡ
Ｌ−１複合体に反応する抗体の産生の有無を確認してか
ら限界希釈法により、クローニングを行った。限界希釈
法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるよ
うに希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マ
ウスの腹腔細胞がウェルあたり２Ｘ１０４個分注しであ
る９６ウエルプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注
した。

１２日後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗カルシトニンーＣ
ＡＬ−１複合体特異抗体を産生するハイブリドーマのク
ローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリド
ーマにつき、１０〜２０個の抗体産生クローンの中から
、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも、安定な
りローンを選び、前記と同様の方法で再クローン化を行
い、抗カルシトニンーＣＡＬ−１複合体特異的抗体を産
生ずるハイブリドーマＣＡＬ−２を樹立した。

（８）モノクローナル抗体の製造と免疫グロブリンクラ
スの同定 モノクローナル抗体ＣＡＬ−２の製造とサブクラスの同
定は、前記と同様の操作を行った結果、モノクローナル
抗体ＣＡＬ−２の免疫グロブリンサブクラスはＩｇＧ１
であった。

前記のＥＬＩＳＡ法により調べたモノクローナル抗体Ｃ
ＡＬ−２の特異性を第４図に示す。第４図において、（
ａ）はカルシトニン−卵白アルブミンコンジュゲートの
プレート、（ｂ）はモノクローナル抗体ＣＡＬ−１のプ
レート、そして［（ａ）　十（ｂ）］は］カルシトニン
ーＣＡＬ−１複合のプレートを示す。

（９）抗体と不溶性担体との結合 ラテックス溶液（２％、Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社二
粒径０．４８２μｍ）２ｍｌと、ＣＡＬ−２抗体２．０
ｍｇ／ｍｌを含有する水溶液２ｍｌとを混合し、約１時
間攪拌した。遠心後（２００００ｇ、１０分）、沈殿物
を０．１％ＢＳＡ溶液に懸濁し、約１時間攪拌した。再
び遠心（２００００ｇ、１０分）した後、沈殿を水に懸
濁し、約２時間攪拌した。こうして、ＣＡＬ−２抗体−
ラテックス複合体含有液を得た。

また、ラテックス溶液（２％、Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ
１社・粒径０．０９１μｍ）２ｍｌと、ＣＡＬ−１抗体
４．０ｍｇ／ｍｌを含有する水溶液２．０ｍｌとを混合
し、約１時間攪拌しな。遠心後 （２００００ｇ、１０分）、沈殿物を０．１％ＢＳＡ溶
液に懸濁し、約１時間攪拌した。再び遠心（２００００
ｇ、１０分）した後、沈殿を水に懸濁し、約２時間攪拌
した。・こうして、ＣＡＬ−１抗体−ラテックス複合体
含有液を得た。

（１０〉スライド凝集反応による定量 前項（９）で調製したＣＡＬ−２抗体−ラテックス複合
体含有液３０μｌと種々の濃度のカルシトニンを含有す
る水溶液３０μｌと、一定量のＣＡＬ−１抗体ラテック
スを含む水溶液３０μＩとをスライドガラス状で混合、
揺動して３分後に凝集像を目視的に判定した。結果を以
下の第２表に示す。

４ ＋ 第７人 カルシトニン濃度（ｎｇ／ｍ１） ３２　１６　　ｇ　　４　２　１　０．５　０．２５　
０．１２５＋＋＋＋十＋ ＋　：　凝集あり ：　凝集なし く１１）分光学的方法による測定 前項（９）で調製しなＣＡＬ−２抗体−ラテックス複合
体を用い、自動分析器（ＬＰＩＡ：三菱化成）によって
凝集反応速度のカルシトニン濃度依存性を調べた。反応
器内に、一定量のＣＡＬ−１抗体ラテックスと０．１２
５〜３２ｎｇ／ｍｌの種々の濃度のカルシトニン溶液を
分注し、そこにＣＡＬ−２抗体−ラテックス含有液を添
加した。

対照実験として、ＣＡＬ−１抗体ラテックスを除いて同
様の操作を行った。得られた結果を第５図に示す。第５
図において、○はＣＡＬ−１が存在する本発明方法によ
る実験の結果を、そして、△はＣＡＬ−１抗体ラテック
スを除いた対照実験の結果を、更に、・はＣＡＬ−２抗
体−ラテックスの非存在下でＣＡＬ−１抗体ラテックス
と種々の濃度のカルシトニン溶液と反応させた結果を各
々示す。第５図から明らかなように、カルシトニン濃度
は凝集反応速度（Ｖ値：単位時間当たりの透過度変化）
と良好な相関性を示している。

［発明の効果］ 本発明によれば、従来、抗原抗体反応により凝集を利用
することが不可能あるいは困難であった検査対照物質、
特に低分子化合物についても、凝集反応を行わせること
ができる。従って、従来、高分子化合物について開発さ
れてきた凝集反応を利用する臨床検査技術を、低分子化
合物に対しても、そのまま利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の原理を模式的に示す説明図であり、 第２図は、本発明の第２吹拭体ＤＩＧ−２の特異性を示
すグラフであり、 第３図は、本発明方法において、ジゴキシン濃度と凝集
反応速度とが良好な相関性を有していることを示すグラ
フであり、 第４図は、本発明の第２吹拭体ＣＡＬ−２の特異性を示
すグラフであり、そして 第５図は、本発明方法において、カルシトニン濃度と凝
集反応速度とが良好な相関性を有していることを示すグ
ラフである。 第 図 第２図 （ａ） （ｂ） （ａ）＋（ｂ） 第４図 （ａ） （ｂ）　（ａ）＋（ｂ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ）検査対象化合物と、 この検査対象化合物に対する第１次抗体との抗原抗体反
   応複合体に対する第２次抗体を担持した不溶性担体、 （ｉｉ）前記の第１次抗体、またはその第１次抗体を担
   持した不溶性若しくは可溶性の担体、および （ｉｉｉ）被検試料 を接触させ、次いで、被検試料中の検査対象化合物と、
   第２次抗体担持担体と、第１次抗体または第１次抗体担
   持担体とによる凝集反応を測定することを特徴とする、
   免疫学的測定方法。
2. （２）（ｉ）検査対象化合物と、 この検査対象化合物に対する第１次抗体と の抗原抗体反応複合体に対する第２次抗体を担持した不
   溶性担体、および （ｉｉ）前記の第１次抗体、またはその第１次抗体を担
   持した不溶性若しくは可溶性の担体 を含むことを特徴とする、免疫学的測定用試薬。