JPH03160991A - Ｔ３―エキソヌクレアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、遺伝子操作等に有用なＴ３−エキソヌクレア
ーゼ、その塩基配列、及びその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

従来Ｔ３−エキソヌクレアーゼは、例えば大腸菌にＴ３
ファージを感染させ、その菌体の抽出物から精製するこ
とにより得られるものであった〔ジャーナル　オブ　ビ
ロロジ−（　Ｊ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、第１００巻、
第３８２頁（１９８０））。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、大腸菌にＴ３ファージを感染させて得ら
れるエキソヌクレアーゼの含量は少なく、また、操作も
煩雑であり、本酵素を大量に得ることは困難であった。

一方、この遺伝子の単離及び該遺伝子を種々のベクター
に結合して、クローニングする方法については、いまだ
明らかにされていない。

本発明の目的はＴ３−エキソヌクレ了一ゼの工業的規模
の製造に適した、Ｔ３−エキソヌクレアーゼ遺伝子を含
むプラスミドを導入した新規微生物、特に大腸菌の創製
及びそれを用いたＴ３−エキソヌクレアーゼの効果的製
造方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＴ３−エキ
ソヌクレアーゼに関する発明であって、下記式Ｉで表さ
れるアミノ酸配列を有することを特徴とする。

Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＶａｌＶａｌ　Ｔｒ
ｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＭｅｔＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ａｒｇ　ＧｌｕＡｓｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｕＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＬｅｕ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　ＧｌｎＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ
　ＡＳＩＩ　Ａ８＋１１Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｐ　ＴｒｐＭｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＧｌｕＴ
ｈｒ Ｇｌｎ ＾ｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＬｙＳ しｅｕ Ｐｈｅ ｒｌｅ Ｇ１ｙ ＾８ｐ ＾ｓｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ １１ｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉ１ｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ しｅｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｒｐ １１ｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＡｒｇＳｅｒ　　
Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　ＴｙｒＡｌａ　Ｔｒｐ　
　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　＾１ａＰｈｅ　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ
　　Ｓｅｒ　　ＶａｌＧｉｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｉ１ｅ Ｔｈｒ １１ｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ 八ｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＾１ａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ Ｇｌｙ　　Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ ｌｉｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇ１ｙ Ｇ１ｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｔｉｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ しｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇ１ｙ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｌａ ｌｉｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ　　Ｐｒｏ Ｖａｌ　　Ｉｌｅ Ｔｈｒ　　ｌｉｅ Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ Ｌｙｓ　　Ａｓｎ Ｖａｌ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｔｒｐ Ｌｙｓ　　Ａｌａ しｙｓ　　Ｇｉｎ Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ ｌｉｅ　　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　
Ａｒｇ　　ＬｙｓＩ１ｅ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ａｓ
ｐ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　ＰｈｅＰｒｏ　　Ａｓｎ　
　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＴｒｐＧ
ｌｙ　　Ａｓｎ　　ＩＩｅ　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌ
ｎ　　ＴｈｒＡｌａ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ
　Ｌｅｕ　ＬｅｕＬｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｍｅ
ｔ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ１１ｅ　　Ｐｒｏ　
　Ａｒｇ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｙ　　八ｓｐ　　ＴｈｒＰ
ｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐ
ｈｅ　　ｌｉｅＶａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ
　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　ＳｅｒＬｙｓ　　Ｇｌｙ　　
Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ八ｒｇ
　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ
　　ＧｌｕＡｓｐ　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ　　
Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　ＧｌｙＧａｙ　　Ｍｅｔ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　ＩｌｅＧｌｙ　
　Ｇｉｎ　　Ｍｅｔ　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　ｌｉｅ　　
ＬｅｕＧｌｕ　Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｉｃｅ
　Ａｓｐ　　ＬｙｓＬｅｕ　　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　　Ｐｒ
ｏ　　Ａｒｇ　Ｓｅｒ・・・　　〔Ｉ〕 の発明は、上記第１の発明 レアーゼをコードする塩基 また本発明の第２ のＴ３−エキソヌク 配列に関する。

更に、本発明の第３の発明は、第１の発明のＴ３−エキ
ソヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含有させた組換え
体プラスミドを導入させた形質転換体を培養し、該培養
物より本発明の第１の発明のＴ３−エキソヌクレアーゼ
を採取することを特徴とする製造方法に関する。

本発明者らは、Ｔ３バクテリオファージＤＮＡより、Ｔ
３−エキソヌクレアーゼ遺伝子全領域（　１０５３ｂｐ
）を含む２．１ｋｂｐＤＮＡをクローニングすることに
戒功し、更に、このＤＮＡ断片を含むプラスミドを導入
した微生物、特に大腸菌を培養することにより、菌体中
に著量のＴ３エキソヌクレアーゼが蓄積することを見出
し、本発明を完或した。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明に係る新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する
工程により得ることができる。

（１）ＤＮＡ供与体であるＴ３バクテリオファージから
ファージＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、ＤＮＡ断
片を回収する。

（２）　プラスミドベクターを制限酵素で開裂し、この
開裂部位に、（１）で得たＤＮＡ断片を結合させる。

（３）　　ファージＤＮＡ断片を結合させたプラスミド
を宿主に導入し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を
選択する。

（４）　　（３）で得た形質転換体からプラスミドを取
出し、目的のＤＮＡ断片を切出し、これを（２）と同様
の要領で発現ベクタープラスミドに結合させる。

（５）（４）で得たＴ３−エキソヌクレ了一ゼを含むＤ
ＮＡ断片を結合させた発現ベクタープラスミドを（３）
と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得る。

上記ＤＮＡ供与体であるＴ３バクテリオファージＤＮＡ
は大腸菌Ｂ株にＴ３バクテリオファージを感染させた溶
菌液よりファージ粒子を回収しそれより抽出する。

ファージＤＮＡの制限酵素による切断は次のように行う
。ファージＤＮＡに適当な制限酵素を加え、適当な反応
条件で反応を行うことにより種々のＤＮＡ断片に切断さ
れる。この切断に使用しうる酵素は、ファージＤＮＡを
切断し得るものであり、かつＴ３−エキソヌクレアーゼ
を産生ずる遺伝情報を担うＤＮＡ部分を切断しないもの
であることが望ましい。

また、ベクターとなるプラスミドを１カ所切断できるも
のであることが望ましい。

一方、プラスミドベクターの開裂も同様の方法で行うこ
とができる。プラスミドベクターとしては公知のものが
使用できるが、例えばｐＢＲ３２２、ｐ［１ｃ１８、ｐ
ｌｌｃ１９などが挙ケラレル。

次に、ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いてベクターＤＮＡの開裂
部位に上述のＤＮＡ断片を組込ませるが、その手段自体
は公知の方法によるものであり、ベクターＤＮＡの種類
及び制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が選択され
る。

次いで、ファージＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを宿
主大腸菌に導入させるが、宿主大腸菌としては、形質転
換能を有するものであれば、９ 野生株、変異株のいずれも使用できる。用いるベクター
プラスミドにより、用いる宿主大腸菌を適宜変えること
も可能である。

この様にして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入させ、プラ
スミドベクターの特性、例えばｐ０Ｃｌ８、Ｓａｕ３Ａ
　Ｉ部位にクローン化する場合には、アンピシリン耐性
コロニーを選択することにより、クローン化することが
できる。

クローン化されたＤＮＡの解析は、以下の方法を用いて
行う。すなわち、多数得られる形質転換株よりプラスミ
ドを調製し、適当な制限酵素で切断後、アガロース電気
泳動すればクローン化されたＤＮＡ断片の長さを知るこ
とができる。この様にして解析したところ２．　１　ｋ
ｂｐのクローン化ＤＮＡを有するプラスミドを得た。

更に、この全２．　１　ｋｂｌ）を解析し、この内部に
Ｔ３−エキソヌクレアーゼ遺伝子が存在すること、及び
その塩基配列を決定した。

プラスミドに組込まれたＴ３−エキソヌクレアーゼ遺伝
子を導入した大腸菌が上記エキソヌ１０ クレアーゼ蛋白を生産しているか否かを調べる手段とし
ては、菌体を破砕して得た抽出物を直接ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動し、分子量約４０，０００の
蛋白バンドの量を調べる方法がある。また、Ｔ３−エキ
ソヌクレアーゼ活性を測定すれば良い。

大腸菌からのＴ３−エキソヌクレアーゼの精製には、通
常のクロマトグラフィーの手法が用いられる。すなわち
、培養菌体をリゾチーム処理、次いで超音波処理して上
清を得る。次いで、ストレプトマイシン硫酸処理を行い
、上清を分画する。次いで、イオン交換、ゲルろ過等の
クロマトグラフィーによってＴ３−エキソヌクレアーゼ
を得ることができる。

以上述べてきたごとく、本発明によりＴ３エキソヌクレ
アーゼの一次構造が明らかとなり、その遺伝子を組込ん
だプラスミド、及びそれを導入した大腸菌を調製するこ
とができ、該大腸菌を用いるＴ３−エキソヌクレアーゼ
の遺伝子工学的製造方法を提供することが可能となった
。

１１ 〔実施例〕 以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。

実施例１ （１）Ｔ３バタテリオファージＤＮＡの調製ジャーナル
　オブ　ビロロジイー第１００巻、第３８２頁（１９８
０年）記載の方法に従ってＴ３バクテリオファージＤＮ
Ａを調製した。

（２）Ｔ７−エキソヌクレアーゼと類似性を有する領域
の解析 ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジ−（　Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ　）第１６６巻、第４７７頁（１９
８３年）にＴ７−エキソヌクレアーゼの遺伝子配列が記
載されている。

一方、Ｔ３バクテリオファージＤＮＡをＭｂｏ■で切断
すると、ジーン（　Ｇｅｎｅ　）第１２巻、第１６１頁
（１　９　８　０年）に記載の様なフラグメントに切断
される。これらのフラグメントの塩基配列をＭ１３ファ
ージを用いたジデオキシ法〔サイエンス（　Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　）第２１４巻、第１２０５１２ 〜１２１０頁（１　９　８　１）　］により決定したと
ころ、ＢフラグメントとＩフラグメントにわたってＴ３
−エキソヌクレアーゼ遺伝子と高い類似性を持つ配列が
認められた。

Ｔ７−エキソヌクレアーゼ遺伝子とＢフラグメント、■
フラグメントの関係を第１図に示す。

すなわち第１図はＴ７−エキソヌクレアーゼ遺伝子とＴ
３−エキソヌクレアーゼ遺伝子の関係を示す模式図であ
り、第１図で示す１０５３ｂｐがＴ３−エキソヌクレア
ーゼ遺伝子に相当する。Ｔ３−エキソヌクレアーゼの遺
伝子配列及びアミノ酸配列を第２図に示す。すなわち第
２図はＴ３−エキソヌクレアーゼの塩基配列及びアミノ
酸配列を示し、５′末端側のＡＴＧは開始コドンを示し
、Ｎｅｔをコードするが、発現時には除去される。また
３′末端側のＴＧＡは終止コドンを示す。

（３）Ｔ３−エキソヌクレアーゼ遺伝子を含む２，１ｋ
ｂｐＤＮＡ断片のクローニング上記（２）のＴ３バクテ
リオファージＤＮＡの■３ Ｍｂｏ　Ｉ　　Ｄ　Ｎ　Ａ断片のＢ７ラグメントをＢａ
ｍＨ　Ｉで開環後、アルカリホスファターゼ処理したｐ
ＢＲ３２２内に組込み（ＤＮＡライゲーションキット、
宝酒造社製を用いた）、このプラスミドＰＴ３−０を大
腸菌ＨＢＩＯＩに導入後、培養し常法に従ってプラスミ
ドｐＴ３−０を精製した。このプラスミドをＮａｅ　Ｉ
とＳａｕ３Ａ　Ｉで完全消化しＮａｅＩ，Ｓａｕ３Ａ　
Ｉサイトを両端に持つＢ２フラグメントを得た。

一方、ｐＵｃ１Ｂプラスミドを旧ｎｃＩ［と［ｌａｍＨ
　Ｉで消化したものと、Ｂ２フラグメントと■フラグメ
ントを混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて各フラグメントを結合させこの反応液を大
腸菌ＨＢ１０１株に導入後、常法に従ってアンピシリン
を含むシャーレ上に植菌後生育したコロニー４８株をア
ンピシリンを含むＬ培地で培養し、常法に従って各株の
プラスミドを精製した。精製したプラスミドをＨｉｎｄ
Ｉ［とＢＣＯＲ　Ｉで消化したところ、約２．　６　ｋ
ｂ（　ｐＵｃ１８）と約２．１ｋｂ（Ｉ＋８２７ラグメ
ント）１４ のフラグメントを生じるものが１株あった。このプラス
ミドのシークエンスを行ったところＢ２フラグメントと
１フラグメントはＴ３−エキソヌクレアーゼ遺伝子を完
戒させる方向に結合していた。このプラスミドをｐＴ３
−２と命名した。

（４）Ｔ３−エキソヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断
片とｐ［Ｉｃ１９との結合及び大腸菌への導入（３）で
得たプラスミドｐＴ３−２　Ｄ　Ｎ　ＡをＢＣＯＲ　Ｉ
、ｆｌｉｎｄｌｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動
により、前記１０５３ｂｐのＤＮＡを含むプラスミドｐ
Ｔ３１　　ＤＮＡを得た。またｐＵｃ１９　Ｄ　Ｎ　Ａ
もＢＣＯＲ　Ｉ、ｆｌｉｎｄＩＩＩで切断後アルカリン
ホスファターゼ処理を行いベクターＤＮＡを得た。

両ＤＮＡ断片を（３）に示す方法で結合後大腸菌ＪＭ１
０９株に形質導入した。（３）と同様の方法でプラスミ
ドを解析した結果、２．　１　ｋｂｐのＤＮＡ断片を含
むことが明らかとなりこのブラスミドをｐ’ｒ３−３と
命名した。

この大腸菌はエシエリヒアコリＪＭ１０９／　ｐＴ３−
３と命名し、Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ
１０９／　ｐＴ３−３とｌ５ 表示し、微工研菌寄第１１０８６号（　ＦＯＲＭ　Ｐ−
１１０８６　）として、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されている。

（５）　　プラスミドｐＴ３−３を導入した大腸菌（エ
シエリヒア・コリ　ＪＭ１０９／　ｐＴ３−３　）によ
るＴ３エキソヌクレアーゼの生産 上記大腸菌（　ＦＢＲＭ　Ｐ−１１０８６　）をアンビ
シリン５０μｇ／ｍｌ．を含む５０ｒｎｌ．のＬ培地に
接種し、３７℃、ｌ６時間前培養した。これを５００ｒ
ｄのＬ培地を含む２ｌ容フラスコに移し、３７℃１時間
（１２Ｏｒｐｍ）培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロビル
−１一チオーβ一Ｄ−ガラクトピラノシド）１００ｍｇ
／ｊ！を加えたのち、更に５時間培養した。集菌後緩衝
液［２５ｍＭ｝リスーＨＣＩ（ｐＨ　８．０）、５０ｍ
Ｍグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭ　　ＤＴＴＩ
　３６−に懸濁した。これに、１４４ｍｇのりゾチーム
を加え室温で約５分間かくはん後超音波処理、遠心分離
により無細胞抽出液を得た。

抽出液に５、２５一の５％ストレプトマイシン■６ 硫酸を添加し４℃で１５時間放置後遠心分離により上清
を得た。この上清を５０ｍＭ｝！Ｊスー１１ＣＩ緩衝液
（ｐＨ　７．５）、１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　，　
１　ｍＭ　　Ｄ　ＴＴで十分透析し、ＤＥＡＥ−セファ
ロースＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）による精製を行っ
た。ここで得られた活性画分を集めたところ３７４００
　ＵのＴ３−エキソヌクレアーゼが生産されていた。

Ｔ３−エキソヌクレアーゼの活性測定方法（１）基質Ｄ
ＮＡ溶液の調製 ３μｇの牛胸腺ＤＮＡをｌａｅＩＩＩで完全消化し、常
法に従いフェノール、クロロホルム処理後、エタノール
沈殿、乾燥後２００μｌの５０ｍＭ｝リスー｝ＩＣ＋緩
衝液ｐＨ７．５、１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａに溶解す
る。

（２）５倍濃縮緩衝液の組或 ２５０ｍＭ｝　　リス−１１ｃＩ　　（ｐｔｌ　　８．
１）、　２５ｍＭＭｇＣ１ａ、５ｍＭ　　ＤＴＴ，　１
　０　０ｍＭ　　ＫＣＩ（３）反応系 １７ 基質ＤＮＡ ５倍濃縮緩衝液 水 ７　μｌ ５０　μｌ １８６　　μｌ ３７℃　５分　反応　　　　２５０μＡ（４）活性の定
義 上記反応系において３０分間で１０ｎｍｏｌのヌクレオ
チドを生戒する酵素量をＩＵとする。

（５）活性のもとめ方 一Ｕ／μＬ Δ○Ｄ：５分間で増加する２６０ｎｍの吸光度６．　Ｏ
Ｘ　１０−’　：基質ＤＮＡからヌクレオチドが遊離し
、ヌクレオチド濃度が１ｏ ｎｍｏｌ／Ｌとなった時の２６０ｎｍ における吸光度の増加量 ２．５Ｘ　１０−’　：反応系の容量（Ｌ）３０／５：
反応時間５分に対する３０分の比７：　　酵素量（μＬ
） １８ 〔発明の効果〕 以上詳細に説明した通り、本発明によりＴ３バクテリオ
ファージエキソヌクレアーゼ遺伝子が単離された。該遺
伝子を含有するプラスミドで形質転換した微生物により
遺伝子工学において有用なＴ３−エキソヌクレアーゼを
効率よく製造することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴ７−エキソヌクレアーゼ遺伝子とＴ３−エキ
ソヌクレアーゼの関係を示す図、第２図はＴ３−エキソ
ヌクレアーゼをコードする塩基配列及びアミノ酸配列を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式 I ： 【遺伝子配列があります】 ・・・〔 I 〕 で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とするＴ３
   −エキソヌクレアーゼ。 ２、請求項１記載のＴ３−エキソヌクレアーゼをコード
   する塩基配列。 ３、請求項１記載のＴ３−エキソヌクレアーゼをコード
   するＤＮＡを含有させた組換え体プラスミドを導入した
   形質転換体を培養し、該培養物より、請求項１記載のＴ
   ３−エキソヌクレアーゼを採取することを特徴とするＴ
   ３−エキソヌクレアーゼの製造方法。