JPH03131743A - 微生物の生細胞，死細胞および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物細胞とその他の粒子とを含む試料に光を
照射し、上記試料中の全体の粒子から、微生物の生細胞
、死細胞および微生物以外の粒子の数を測定する方法に
関し、特に食品製造プラント、医薬品製造プラントにお
ける製品の品質管理や殺菌装置の性能把握等、半導体製
造に使用される超純水製造装置のチエツク等に有利に適
用される方法に関する。

〔従来の技術〕

食品、医薬品製造分野、発酵工業等においては、原料や
製品の品質管理、殺菌装置の性能確認のため微生物検査
、測定が不可欠である。また半導体製造に使用される超
純水では、微生物細胞も含め、無機粒子の検査も重要な
チエツク項目となっている。

従来の微生物検査・測定方法には、顕微鏡法、寒天培養
法、バイオルミネッセンス法などがあるが、いずれの方
法も微生物細胞の生死までは判別できず、殺菌されたか
どうかの評価はできないという欠点がある。すなわち、
寒天培養法は生細胞数の測定方法として最も広く用いら
れている方法であるが、結果を得るまでに数十時間以上
と長い時間を要するため、殺菌管理に支障をきたす場合
が多い。バイオルミネッセンス法中で最も代表的なＡＴ
Ｐ　（アデノシン三リン酸）法は寒天培養法に比較し、
測定時間がいくぶん短縮される利点はあるが、生細胞数
が１０３〜１０４個／ｒｎ１以上と比較的高濃度領域に
しか適用できないという欠点がある。また前述の三者の
方法では微生物細胞とそれ以外の粒子の識別はできない
。

従来、粒子計測方法としてはパーティクルカウンタが実
用化されている。この方法はセル中を通過する試料に光
を照射し、粒子の散乱光を計測することにより粒子数を
求める方法であるが、微生物細胞とそれ以外の粒子を識
別することはできないため、殺菌管理等には使用できな
い。

また、微生物細胞の生死を判別する方法として従来アク
リジンオレンジという蛍光色素を使用すると、生細胞は
緑色に、死細胞は橙赤色に蛍光発色することから、この
差でもって生死判別が試みられたことがあるが、試料の
状態や試験条件のわずかな差により判別が不十分になり
、信頼性に乏しいことから現在ではほとんど使われてい
ない。

以上のように従来技術には、試料中の微生物細胞の生−
死、微生物細胞以外の粒子の識別−計測を迅速かつ、同
時に、低濃度の試料に対しても行えるようなものはなか
った。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来技術では、■微生物細胞の生−死の識別ができない
。■生細胞を測定するには長時間必要（寒天培養法）。

■高濃度の微生物細胞しか測定できない（バイオルミネ
ッセンス法）。■微生物細胞とそれ以外の粒子との識別
はできない（パーティクルカウンター）　などの課題が
あり、原料や製品の品質管理、殺菌管理に支障をきたす
と共に使用範囲が限定されていた。

本発明はこれらの課題を解決し、微生物細胞きそれ以外
の粒子の識別、微生物細胞の生−死の識別を同時にかつ
短時間で、そして細胞濃度が１個／ｒｎ１以下の低濃度
でも高感度に測定できる方法を提供しようとするもので
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは生細胞、死細胞、微生物細胞以外の粒子を
短時間で高感度に識別、計測する方法について実験・検
討を重ねた結果、 ■　生細胞だけを識別する方法として、生細胞中に含ま
れる酵素又は補酵素と反応し蛍光を発する物質を作用さ
せ生細胞を光の点として計測する。

■　死細胞だけを識別する方法として、細胞内に存在す
る核酸に作用する蛍光物質を試料に作用させ、光の点と
して計測する。

■　微生物以外の粒子の計測は、微生物細胞を含む全粒
子数を散乱光で計測し、■、■で測定した生細胞数、死
細胞数を差し引いて求める。

という■、■、■を組み合せた手段を用いることにより
、生細胞数、死細胞数、微生物細胞以外の粒子が各々識
別・計測できることを確認した。

本発明は上記知見によって完成されたものであって、微
生物細胞とその他の粒子とを含む試料に光を照射し、上
記試料中の全体の粒子から生じる個々の散乱光を光の点
として検出して全体の粒子数を計測する工程と、上記試
料中の生きている微生物細胞の酵素あるいは補酵素と反
応して蛍光物質を生成する試薬を添加、し、生成する蛍
光物質を励起させる光を照射して微生物細胞から生じる
蛍光を光の点として検出して生きている微生物細胞の数
を計測する工程と、上記試料中の死んでいる微生物細胞
の核酸に作用する蛍光物質を添加し、該蛍光物質を励起
させる光を照射して微生物細胞から生じる蛍光を光の点
として検出して死んでいる微生物細胞の数を計測する工
程とを有するこ出を特徴とする特生物の生細胞、死細胞
および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法である。

本発明において、生細胞の識別に用いる物質は、細胞中
に含まれる酵素又は補酵素と反応して蛍光を発するもの
で、具体的にはフルオレセインニ酢酸、ホモバニリン酸
、０−フタルアルデヒド、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレチドなどが使用できるが、中でもスルオレセインニ
酢酸は生細胞に作用して特に強い蛍光を発するので特に
好ましい。

また死細胞の識別に用いた物質は、ＤＡＰ　Ｉ（４’　
　　６−ジアミジノ２−フェニルインドール）　ローダ
ミン、臭化エチジューム、臭化プロピジュームであり、
これらのいずれも死菌に対し、強い健康を発するので死
菌を高感度に検知・計測することができる。

〔作用〕

生細胞の識別に用いた例えばフルオレセンニ酢酸は生細
胞に作用させると細胞内に浸透して細胞内に存在する酵
素、エステラーゼの作用により加水分解されフルオレセ
インを生成する。

このフルオレセインは４５０〜４９０ｎｍの波長を有す
る励起光を照射してやることにより５１０〜５２０ｎｍ
をピーク波長とする蛍光を発するため、細胞が発光して
見える。

また、死細胞を識別する場合、例えばＤＡＰＩを作用さ
せると、死細胞は生細胞に比較して細胞壁、細胞幕が弱
くなって損傷を受けているため、ＤＡＰＩが細胞内に入
りやすくなって核酸と結びつきやすくなる。核酸と結び
ついたＤＡＰ　Ｉは３３０〜３８０　ｎｍの励起光を照
射することにより、４３０〜４４０ｎｍをピーク波長と
する蛍光を発するたぬ死細胞が明るく発色して見える。

また微生物細胞を含む全粒子数を計測する場合、例えば
生菌測定に用いた４５０〜４９０　ｎｍの励起光を利用
し、これを照射してやれば励起光と同一波長域の４５０
〜４９０ｎｍの散乱光が各粒子から発するので、これを
検知・計測すれば全粒子数が求まる。

〔実施例〕

本発明の一実施例を第１図によって説明する。

第１図において、１は試料に含まれる粒子に光を照射す
るための光源で、実施例では１００Ｗの水銀灯を用いて
いるが、蛍光色素を励起する波長を有するものであれば
キセノンランプ、レーザー光でも構わない。２はハーフ
ミラ−で光源１からの光を２軸方向に分割し、一方はセ
ル２４、他方は全反射ミラー３を介してセル２２に照射
する。

２２は生細胞と全粒子数の計数用セル、２４は死細胞計
測用セルである。４は死細胞に作用させた色素を励起す
るに必要な波長を通過させるフィルター　５は集光レン
ズである。また６は生細胞に作用させた色素を励起する
に必要な波長を通過させるフィルター　７は集光レンズ
である。

微生物の生細胞、死細胞、それ以外の粒子を含む試料は
ラインＰ１を経由して反応槽１９に入るが、その時ライ
ンＰ２より、生菌検知物質を所定濃度で注入してやる。

２０は温度ヒーター付きマグネチックスターラ、２１は
回転子で試料を所定温度で攪拌混合するためのものであ
る。

反応槽１９にて所定時間攪拌反応を行うことにより、生
細胞内では蛍光物質が生成するようになる。この試料を
ラインＰ３を経由して、セル２２内を通過させる。セル
２２には蛍光物質を励起するに必要な波長の光が照射さ
れており、試料が通過すると各粒子は散乱光を発する。

各粒子の中で生細胞は散乱光以外に蛍光も発する。

８は散乱光をカットするための蛍光フィルタで生細胞の
発する健康を通過させレンズ９を介して受光器１０に受
け、同受光器１０の出力をパルスカウンタ１１により生
細胞から発する蛍光を光の点としてパルスカウントする
ことにより生細胞数を計測する。

また、１２はセル内を通過する粒子に励起光を照射した
時、各粒子から発する散乱光を集光するレンズで、１３
は散乱光を受光するための受光器、１４はパルスカウン
タで、全粒子数を光の点として計測する。

セル２２を出た試料はラインＰ４を介して反応槽２３に
入るが、この時、ラインＰ５より死菌検知物質を所定濃
度で添加し反応槽２３で所定時間反応させた後、ライン
Ｐ６を介してセル２４に入る。セル２４には死細胞に作
用させた色素を励起するに必要な波長の光を照射してお
り、このセル内を通過する粒子は散乱光および死細胞は
散乱光以外に蛍光を発する。１５は散乱光をカットする
蛍光フィルタで死細胞の発する蛍光だけを通過させる。

レンズ１６を介して受光器１７により蛍光を受光し、パ
ルスカウンタ１８により死細胞の発する蛍光を光の点と
してパルスカウントし死細胞数を求める。

なお、生菌検知物質としてフルオレセインニ酢酸を用い
た場合、反応槽１９での反応時間は１０分以内でありま
た死菌検知物質としてＤＡＰＩを用いた場合、反応槽２
３での反応時間は１分以内であり、本発明方法では約１
０分という従。

来の寒天培養法の数十時間の測定時間に比較して格段に
短くてすみ、またセル内を通過する個々の粒子を１個、
１個、光の点のパルスとしてカウントする方式であるた
め、１個／艶以下という極めて低い細胞濃度でも測定を
可能とする。

本発明においては、生細胞および死細胞の発する蛍光量
の強さ、およびこの蛍光を検知するために必要な受光器
の選定が最も大きな技術的ポイントである。そこで本発
明者等はこれらの点について検討するため対象試料とし
て酵母を用い光学的、電気的に生細胞、死細胞からの蛍
光量の測定を行った結果、生細胞１個当りの蛍光発光量
はフルオレセインニ酢酸を５０μｇ／−作用させた時、
３０〜８０ｐＷ、そして死菌１個当りの蛍光発光量はＤ
ＡＰＩを１μｇ、／ｍ１作用させた時、約１００〜２０
０ｐＷという数値を得た。そこで、この光エネルギーを
検知する能力を有する受光器を選定し試験に使用した。

なお、この実施例では、セル２２により生菌と全粒子数
を、セル２３にて死菌数を計測する例を示したが、セル
２２で死菌数をセル２３にて生菌数を計測してもよいし
、散乱光の測定は２２．２３のどちらのセルで行っても
かまわない。

次に本装置を用いた試験実施例を示す。

（１）試料溶液 ４８時間培養したＢａｋｅｒ’ｓ　Ｙｅａｓｔ　　（酵
母）を遠心分離器により遠心ｍＷｉ　（３０００ｒρｍ
、５分間）して細胞を回収し、ｐ）１７．０．１／１５
Ｍリン酸バッファー液で洗浄したものを生細胞とした。

また死細胞はこれを１２１℃５分間加熱処理したものを
使用した。微生物細胞以外の粒子としてはポリスチレン
ラテックス標準粒子を使用し生細胞：死細胞：ポリスチ
レンラテックス標準粒子＝１：１０：１０の割合で混合
し、総粒子数として約１００個／ｒｄの濃度になるよう
に調整した。

（２）フルオレセインニ酢酸溶液 アセトンにフルオレセインニ酢酸を溶解して１　ｍｇ　
／　ｍＲの濃度に調整したものを試料に対し５０μｇ／
ｍｌの濃度になるように添加した。

（３）ＤＡＰＩ溶液 純水にＤＡＰＩを１００μｇ／ｄの濃度になるように調
整し試料に対し１μｇ／ｄの濃度で添加した。

（４）試料処理量、反応条件 試料を１０ｍｇ／ｍｉｎの処理速度で内径１　ｍｍφの
ガラス製セル内を通過させたが、この時、反応槽１９で
は３７℃、５分間、また反応（曹２３では室温で１分間
試料と色素との反応を行わせた。

（５）測定条件 照射光として１００Ｗ水銀ランプを使用し、励起フィル
タ６には４５０〜４９０ｎｍの波長域を通過するもの、
また蛍光フィルタ８は５１０ｎｍ以上の波長域を通過す
るものを使用した。また死菌を励起させるためのフィル
タ４には、３３０〜３８０　ｎｍの波長域を通過するも
の、蛍光フィルタ１５には４２０　ｎｍ以上の波長域を
通過するものを用いた。

（６）測定結果 パルスカウンタにてカウントされた各々の粒子機を第１
表に示す。この値は試料１０ｍ１！当りの粒子カウント
数である。この結果より生菌：死菌：微生物細胞以外の
粒子数（全粒子数−生菌数一死菌数）＝５２・５０８：
４８０となり初期設定値の１：１０：１０にほぼ近い数
値を得ることができた。

第１表 〔発明の効果〕 本発明の効果として （１）従来法では不可能であった生菌、死菌、微生物細
胞以外の粒子数をそれぞれ識別して計測できる。

（２）従来寒天培養法では数十時間必要であった微生物
細胞の計測が本発明方法により１０分以内で測定できる
。

（３）　　また、各細胞、粒子を光の点としてパルスカ
ウントすることにより低い細胞濃度の試料でも測定でき
る。

となり、殺菌装置の性能把握、原料、製品の品質管理が
高精度かつ迅速に行えるようになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の詳細な説明するだめの説明図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 微生物細胞とその他の粒子とを含む試料に光を照射し、
   上記試料中の全体の粒子から生じる個々の散乱光を光の
   点として検出して全体の粒子数を計測する工程と、上記
   試料中の生きている微生物細胞の酵素あるいは補酵素と
   反応して蛍光物質を生成する試薬を添加し、生成する蛍
   光物質を励起させる光を照射して微生物細胞から生じる
   蛍光を光の点として検出して生きている微生物細胞の数
   を計測する工程と、上記試料中の死んでいる微生物細胞
   の核酸に作用する蛍光物質を添加し、該蛍光物質を励起
   させる光を照射して微生物細胞から生じる蛍光を光の点
   として検出して死んでいる微生物細胞の数を計測する工
   程とを有することを特徴とする微生物の生細胞、死細胞
   および微生物細胞以外の粒子の数の測定方法。