JPH03130230A

JPH03130230A - 記憶障害の改善・治療剤

Info

Publication number: JPH03130230A
Application number: JP2202266A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Hisano; 壽野　正廣; Mitsuru Kakihana; 垣花　満; Hiroaki Fukumoto; 宏明福元
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-07-31
Filing date: 1990-07-30
Publication date: 1991-06-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】意！ｆ、１７）４射■分齋本発明は、線維芽細胞成長因子（本明細書において、Ｆ
ＧＦと略称することもある。）蛋白質を含有するアルツ
ハイマー型記憶障害の改善・治療剤に関する。

従来の技術塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦ　Ｇ　Ｆ　）はペプチ
ド性因子で、その全アミノ酸配列が明らかにされている
［Ｔｈｏａ＋ａｓら；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

旦λ：　６４０９　（１９８５）］。

ｂＦＧＦは、１９７４年にＧｏｓｐｈｏｄａｒａｏｗｉ
ｃｚにより線維芽細胞増殖因子として発見された。その
後、中胚葉由来の全ての細胞に対して、増殖促進作用を
示し、その作用は多岐にわたっている。ｂＦＧＦは脳組
織に多量に存在することから、中枢神経系において何ら
かの機能を果たしていると考えられているが、その機能
の詳細は殆ど明らかにされていない。最近、ｂＦＧＦが
ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、神経細胞の生存延長作用を
有することが明らかにされた［ＭｏｒｒｉｓｏｎらＰｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ、旦３　、７５３７　（１９８Ｂ）］。また、
ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、脳損傷時の神経細胞死を抑制
する作用が明らかにされている［Ａｎｄｅｒｓｏｎら、
Ｎａｔｕｒｅ、　３２２　、　３６０　（１９８８）］
。しかし何れもその作用の詳細は不明である。

天然に存在するヒ）ｂＦＧＦは極めて微量であり、また
、これをヒトの組織から得る試みは種々の制約によって
極めて困難である。しかし、最近ヒ）　ｂＦ　Ｇ　Ｆは
、遺伝子工学的手法を駆使して、高純度のものが多量に
、且つ、比較的安価に生産されるようになった（ヨーロ
ッパ特許出願公開第２３７９６６号公報参照）。

一方、神経成長因子（ＮＧＦ）は１９５１年にＬｅｖｉ
−ＭｏｎｔａｌｃｈｉｎｉとＦｌｕｍｂｕｒｇｅｒによ
って神経細胞の神経突起伸長因子作用を有する因子とし
て発見された。当初、ＮＧＦの作用は末梢交換神経、感
覚神経に限られ、中枢神経には作用しないと考えられて
いたＯＨｏｇｇｅｒとＬｅｎｉｏｒは、ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ細胞培養系において、ＮＧＦがラット胎児の終脳神経
細胞に対して、コリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）の活性を上昇させることを明らかにした［Ｄｅｖ
ｅｌｏｐ、　　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、　　３．　２２
９　（１９８２）］。

その後、種々のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験系でＮＧＦの中枢
神経系における作用が検討され、神経細胞の生存の維持
、神経突起伸長作用、ＣＡＴの活性の上昇とアセチルコ
リン量の上昇等の作用が明らかにされている。

また、最近、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ラットの前脳基
底部のコリン作動性神経細胞を人為的に破壊した後、Ｎ
ＧＦを脳室内に注入すると、ＣＡＴ活性が上昇し、神経
細胞の生存数が著明に増加することが見出されたｒｔｌ
ｅｒｔｉ、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　、　　６　＋
　　２１５５　（１９８６）　：　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　
ら、Ｐｒａｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ＩＪｓＡ、　　８３．　９２３１　（１９
８Ｂ）　；　　Ｋｏｒｍｅｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５　＋　（１９８６）］。更に
、老齢ラットニＮＧＦを４週間、脳室内に注入すると記
憶障害が改善されることが明らかにされた［　Ｆｉｓｈ
ｅｒらＮａｔｕｒｅ、　　３２９　、　６５　（１９８
７）］。

近年、高齢化社会に伴い、老人性疾患が急増している。

とりわけ、老人性痴呆（アルツハイマー型痴呆症（記憶
障害））は有効な治療法がなく、社会問題となりつつあ
る。アルツハイマー型痴呆症のような中枢退行性疾患に
おいては、前脳基底部（中隔野、ブロッカ一対角帯、お
よびマイ不ルト基底核）のコリン作動性神経細胞の変性
・脱落がおこり、そこで産生される神経伝達物質、アセ
チルコリン（ＡＣｈ）の著明な低下が惹起される。この
Ａｃｈ量の低下が、本疾病の記憶・学習障害の原因であ
るとされている［　ＷｈｉＬｅａｈｏｕｓｅら、５ｃｉ
ｅｎｃｅ、　２１５．　１２３７　（１９８２）　ＨＣ
ｏｙｌｅ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１９　、　１１８
４　（１９８３）］。実験的には、う７１−の前脳基底
部のコリン作動性神経細胞を破壊すると、記憶障害が惹
起され、ＡＣｈｆｆｉの低下が起こる［Ｈｅ１ｐｅｒら
、Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、　５．　８６６（１９８
５）］。前述したように、ＮＧＦは前脳基底部のコリン
作動性神経細胞に作用して、ＣＡＴ活性を上昇させ、Ａ
Ｃｈ含量を上昇させることから、Ｎ　Ｇ　Ｆはアルツハ
イマー型痴呆症のような中枢退行性疾病に対して予防・
治療の作用を有することが示唆されている。

このようにＮＧＦは、その作用機序が明確な唯一の神経
栄養因子である。ＮＧＦは１１６−１１８個のアミノ酸
からなるポリペプチドが２個結合した二重体で、マウス
顎下線、モルモット前立腺、ヘビ毒液などに多く含まれ
ている。これらの材料、特にマウス顎下線からＮＧＦは
容易に精製できる。

最近、マウス、ウシ、ヒトなどのＮＧＦ遺伝子がクロー
ニングされ、それらの構造が明らかにされたＣ５ｃｏｔ
ｔ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３０２　、　５３８　（１９
１１１３）　；υＨｒｉｃｈ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３
０３　、　８２１　（１９８３）　；Ｍｅｉｅｒ　ら、
ＥＭＢＯＪ、　、　５　、　　ｌ　４８９　（１９８５
）］。

発明が解決しようとする課題上記の状況において、アルツハイマー型記憶障害が改善
・治療される薬剤が望まれていた。

課題を解決するための手段本発明者等は、ＦＧＦによる脳損傷の治療薬の応用開発
を行っている途上、ＦＧＦか脳アスログリア細胞に作用
して、Ｎ　Ｃ，Ｆの分泌を誘導する作用のあること、ま
た、ＦＧＦが脳神経細胞に作用して、アセチルコリン量
を著明に上昇させる作用のあることを見出し、これに基
づいてさらに鋭意研究を行い本発明を完成した。

本発明は、ＦＧＦ蛋白質を含有するアルツハイマー型記
憶障害の改善・治療剤である。

上記ＦＧＦ蛋白質は、ＦＧＦ活性、すなわち線維芽細胞
成長促進作用を有する物質であればいずれでもよい。Ｆ
ＧＦ蛋白質としては、天然由来のものでもよく、また遺
伝子工学的手法によって製造されたものでもよい。また
、これ等の関連物質やムティンでもよい。

ＦＧＦ蛋白質としては、酸性のものく以下、ａＦＧＦと
略称することもある。）、塩基性のもの（以下、ｂＦＧ
Ｆと略称することがある。）が挙げられる。特にｂＦ　
Ｇ　Ｆが好ましい。該哺乳動物のａＦＧＦの例としては
、例えば、牛のａＦＧＦ［Ｋ、Ａ。

Ｔｈｏｍａｓ　ら、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　＾ｃ
ａｄ、　Ｓｅｔ、　　ＵＳＡ＋　　８１：　３５７　（
１９１１４）’ｌ、ヒトのａＦ　Ｇ　Ｆ　［Ｇ、　Ｇｉ
ｍｅｎｅｚＧａｌｌｅｇｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

１３８　：　６１１　（１９８６）］などが挙げられる
。該哺乳動物のｂＦＧＦの例としては、例えば、ウシの
ｂＦ　Ｇ　Ｆ　［Ｅ、　　Ｆｅｄｅｒｉｃｋ　　ら、　
Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　入ｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、：８２＋　　６５０７（１９８５）］、ヒトの
ｂＦＧＦ［ヨーロッパ特許公開公報（以下、ＥＰと略称
することもある。）第２３７，９６６号公報、ＥＭＢＯ
Ｊ。

：　５．　２５２３（１９ｇ＆）、フエブス・レターズ
　第２１３巻、１８９−１９４頁（１９８７年）］など
が挙げられる。由来が、脳損傷の治療される動物の同じ
由来のものを用いるのが好ましい。

本明細書においては、リコンビナントヒト塩基性ＦＧＦ
をｒｒｈｂＦＧＦＪ、と略称することもある。

本発明で用いられるＦＧＦ蛋白質としては、さらに、Ｆ
ＧＦムティンが挙げられる。

該ＦＧＦのムティンとしては、たとえばバイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミｘ−１−
ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄＢｉ
ｏｐｈｙｓｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉ
ｃａｔｉｏｎｓ　）第１５１巻第７０１〜７０８頁（１
９８８年）、ＥＰ第２８１．８２２Ａ２公報９日本特許
出願平成１年第１５６６２号明細書に記載のムティンが
挙げられる。

上記ＦＧＦのムティンは、ちとのペプチドあるいは蛋白
質のアミノ酸配列が変異したものであり、従って該変異
としては、アミノ酸の付加、構成アミノ酸の欠損、他の
アミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個（７
）ＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸に置換されている
ものが挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおけるアミノ酸としては、ペプチドを発現する際
に用いられる開始コドンに基因するメチオニンやシグナ
ルペプチドは含まれないものとする。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

好ましくは、ＦＧＦと相同性が認められて、且つ、同様
の活性を示す蛋白質のアミノ酸配列の一部、あるいは全
てが挙げられる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損アミノ酸の数としては、Ｆ
ＧＦの有する特徴を失わない限り何個でもよい。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおける、置換される
前の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸としては、Ｆ
ＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としては、システィン以外のものとしては、アスパラ
ギン酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられ
る。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換された後のアミノ酸としては、中性アミノ酸が
好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば
、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、インロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプ
トファン、セリン、スレオニン、メチオニンなどが挙；
ずられる。

特にセリン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された後のアミノ酸としては、たと
えば、該アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で
、置換される前のアミノ酸と異なる性質と持つものを選
ぶ。具体的には、置換される前のアミノ酸がアスパラギ
ン酸である場合には、置換された後のアミノ酸としては
アスパラギン、スレオニン、バリン、フェニルアラニン
、アルギニンなどが挙げられる。特に、アスパラギン、
アルギニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がアルギニンの場合には、
置換された後のアミノ酸としては、グルタミン、スレオ
ニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸な
どが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換された後のアミノ酸としては、スレオニン、ロイ
シン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、アル
ギニンなどが挙げられる。特にスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換された後のアミノ酸としては、メチオニン、アラニ
ン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン、
アスパラギン酸などが挙げられる。特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換された後のアミノ酸としては、セリン、ロイシン、
プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが挙
げられる。特にセリンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンなどが好
ましい。また、置換された後の構成アミノ酸としては、
アスパラギン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、
メチオニン、セリン、ロイシンなどが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたもので
ある。

上記の置換においては、２個以上の置換を同時に行って
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
たものが好ましい。

本発明のムティンは、上記した付加、欠損、置換のうち
、２または３つが組合わさったものでもよい。

該ムティンとしては、少なくとも１個のヒト塩基性ＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムティ
ンが好ましい。特にヒトｂＦＧＦの７０位および８８位
のＣｙｓがそれぞれＳｅｔに置換されたｒｈｂＦ　Ｇ　
Ｆムティンｃｓ２３が好ましい。

該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術が採用される。該技術は周知であり、たとえば、
Ｒ，Ｆ、　Ｌａｔｈｅｒ　　ａｎｄ　　Ｌ、　Ｐ、　Ｌ
ｅｃｏｑ：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ社）。

ｐｐ３１−５０　（１９８３）に示されている。また、
オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はＭ、　Ｓｍ
１ｔｈａｎｄ　　Ｓ、　Ｇｉｌｌａｍ、　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　：原理と方法（プレナ
ムプレス社）、　ｐｐ　１−３２　（１９８１）に示さ
れている。

該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、（ａ）先ず、ＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなるＤＮ
Ａを突然変異株オリゴヌクレオチド・プライマーと雑種
形成させる（この１本鎖ＤＮＡ内の代替えすべきシステ
ィン用コドン、または、場合によりこのコドンと対合を
作るアンチセンス・トリプレットを包含する領域に対し
て上記プライマーは相捕的なものである。ただし、当該
コドンの他のアミノ酸暗号用コドン、または場合により
アンチセンス・トリプレットとの不一致はこの限りでは
ない。）、（ｂ）Ｉ）ＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長さ
せ、突然変異性へテロ二１体を形成させる、および（ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。

本発明におけるＦＧＦ蛋白質を含有する記憶障害の改善
・治療剤（以下、本発明の製剤と略称することもある。

）は低毒性であるので、安全に使用することができる。

上記した如く、本発明の製剤は神経栄養因子としてその
作用が明確なＮＧＦの分泌を促進する作用を有し、また
、中枢神経細胞に作用して、アセチルコリン量を上昇さ
せる作用を有する。すなわち、本発明の製剤は、脳アス
トログリア細胞に作用して、ＮＧＦを分泌誘導させる。

このようにして分泌誘導されたＮＧＦは、該細胞中のア
セチルコリン含量を上昇させ、アルツハイマー型記憶障
害の改善・治療を行なうものである［Ｔｒｅｎｄｓ　　
１ｎＮｅｕｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｔ　Ｉ　Ｎ　Ｓ　）
、旦、５７０−５７３　（１９８６）　；　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　３２９　、　６５−６８　（１９ｇ？）］。

また、本発明の製剤は、脳の神経細胞に作用して該細胞
中のアセチルコリン含量を上昇させる。

このようにして脳の神経細胞中のアセチルコリン含量を
上昇させることによって、アルツハイマー型記憶障害の
改善・治療を行なうものである［５ｃｉｅｎｃｅ、　２
１５．１２３７−１２３９（１９８２）；５ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２１７．　４０８　４１７　（１９８２）］。し
たがって、本発明の製剤はアルツハイマー型記憶障害の
改善・治療剤として用いることができる。

本発明の記憶障害の改善・治療剤は動物脳組織に投与す
ることによりアルツハイマー型記憶障害の改善・治療を
促進させる。該投与法としては、非経口的に行われ、た
とえば本発明のＦＧＦを静脈内注射、あるいは脳組織内
に直接注入することによって行われる。

該動物としては、温血哺乳動物が挙げられ、その例とし
てはたとえばマウス、ネコ、犬、牛、羊。

ヤギ、ブタ、ウサギ、ヒトなどが挙げられる。

本発明の製剤の使用量は、注射投与として用いる場合に
は、たとえば、ＦＧＦのタンパク質量として、−日量約
０，０２μｓ　／　ｋｇ〜０．０２＋ｌ１ｇ／ｋｇ、さ
らに好ましくは約０．２μｇ　／　ｋｇ〜０．０２ｍｇ
／ｋｇとなる量を投与する。

本発明の製剤は、公知の製剤学的製造法に準じ、所望に
より製剤学的に許容される担体（希釈剤、賦形剤を含む
）などを用いて製造することができる。

本発明の製剤を注射用とする場合には、該製剤は、水溶
性剤（例、蒸留水）、水溶性溶剤　（例、生理的食塩水
、リンゲル液）、油性溶剤（例、ゴマ油、オリーブ油）
等の溶剤、または所望により溶解補助剤（例、サリチル
剤ナトリウム、酢酸ナトリウム）、緩衝剤（例、ぶどう
糖、転化糖）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリ
エチレングリコール）、保存剤（例、ベンジルアルコー
ル、フエ／−ル）、ｍ癌化剤（例、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロ力イン）等の添加剤を用いて、通常の手段
により製造される。

該水溶液の液性は、ｐＨ３〜ｐＨ８に、好ましくはｐＨ
５〜ｐＨ７に調整される。上記ｐＨ範囲に液性を調整す
るためには、たとえば稀塩酸や稀アルカリ（例、種水酸
化ナトリウム、稀炭酸水素ナトリウム）等を添加するこ
とにより行われる。

ＦＧＦ蛋白質の製剤化にあたって、ＦＧＦを含有する水
溶液に、さらにヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）を配合し
、液性をｐＨ３〜ｐＨ８になるように調整すると、保存
中のＦＧＦの活性の低下が少、な（好都合である。

ＨＳ　Ａとしては、いかなるものでもよいが、本組成物
を臨床に適用するためには、非経口投与に用いられる程
度の品質のものが好ましい。たとえば、健康人血漿を材
料としてＣｏｈｎのエタノール分画第６法によって分画
精製したものが用いられる。

また、安定化剤として、アセチルトリプトファン・ナト
リウム、カプリル酸ナトリウムを含有するものであって
もよい。

ＩＳＡは、水溶液とした場合、水溶液１ｄ当たり約０．
１ｍｇ”−５０ｍｇ、とりわけ０．５ｍｇ　〜２０ａ＋
ｇ含有させることが好ましい。

本発明の脳損傷治療剤の製剤化にあたっては、上記Ｈ３
Ａに加えるに、さらにグリシン、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸、アラニン、プロリンなどのアミノ酸、特にモ
ノアミノ脂肪族アミノ酸、もしくは環状アミノ酸、ブド
ウ糖、マンノースなどの単糖類、ソルビット、マンニッ
ト等の糖アルコール類、およびこれらの生理学的に許容
される配合できる塩もしくは誘導体の１種、または２種
以上を配合してもよい。

上記配合剤は、各成分を水溶液とした場合、水溶液１ｄ
当たり、単糖類または糖アルコール類に関しては約１０
＝ｌｏｏｍｇ、アミノ酸に関しては約５〜５０ｎ＋ｇ配
合することが好ましい。

本発明の脳損傷治療剤を製剤化したもの（Ｈ３Ａを配合
したもの）を溶液状態でｐＨ５〜７になるように調整す
るために、グルタミン酸などの酸性アミノ酸を配合する
場合には、該物質を上記所定置棚えることにより所定の
液性に調整でき、また、所望により、上記酸性アミノ酸
を配合しない場合には、塩酸、りん酸等の鉱酸、もしく
はコハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤で所定の液性
に調整する。

上記の本発明の製剤を製造するに当たっては、通常の製
剤法が採用される。

後述の実施例において用いられたりコンビナンドヒト塩
基性ＦＧＦ（以下、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆと略称することも
ある。）は、ＥＰ第２３７，９６６号公報に記載の方法
で製造される。すなわち、該ｒｈｂＦ　ＧＦは、形質転
換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ１２　　　
ＭＭ２９４／ｐＴＢ６６９（ＩＦＯ１４５３２，ＦＥＲ
Ｍ　　　ＢＰ−１２８１）を用いて、ＥＰ公開第２３７
，９６６号公報の実施例１．３および６または８に記載
された方法で製造、精製されたものである。

また、後述の実施例において用いられたりコンビナンド
ヒト塩基性ＦＧＦムティンＣ３２３（以下、ｒｈｂＦ　
Ｇ　ＦムティンＣ３２３と略称することもある。）は、
日本特許出願第６３−５０２４９号明細書、ＥＰ第２８
１，８２２Ａ２号公報、バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ第１５
１巻第７０１〜７０８頁（１９８８年）に記載の方法で
製造される。

すなわち、該ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ３２３は、形
質軸ｍ　体エシェリヒア・コリ　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７
６２（ＩＦＯ１４６１３，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６４５
）を用いて、ＥＰ−２８１，８２２Ａ２の実施例１，６
．７および２４に記載の方法で製造。

精製されたものである。

上述の形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＭＭ２
９４／ｐＴＢ６６９およびＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＭ　２９
４　／　ｐＴ　Ｂ４Ｃ３は、財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）および通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（ＦＲｌ）に寄託されている。それらの受託番号および
受託臼を次の表１に示す。なお、ＦＲＩへの寄託につい
ては、当初国内寄託がなされＦＥＲＭＰ番号で示される
受託番号が付され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄
託に切換えられて、ＦＥＲＭ　　ＢＰ層番号示される受
託番号が付され、同研究所（ＦＲＩ）に保管されている
。

（以　下　余　白）聚皇桝以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１　　（ｂＦＧＦによる前脳基底部および海馬神
経細胞におけるアセチルコリン量の上昇）妊娠ラッ）（ＳＤ系ラット）を断頭、開腹後、胎仔脳を
とりだし、実体顕微鏡下で目的とする部位を採取した。

中隔野および前脳基底部の神経細胞は胎生１７７日目、
また、海馬神経細胞は１９９日目妊娠ラットより採取し
た。脳組織を細断後、０．２５％のトリプシンで処理し
て細胞を分散し、細胞浮遊液を得た。無血清完全合成培
養液（ＤＭＥ／Ｆ１２／Ｎ２）に浮遊させた神経細胞（
約１０６細胞／ｃｍりを、ポリーＬ−オルニチン（１０
０μｇ／ｊ１１２）であらかじめコートしたプレートに
まき、炭酸ガス−培養器（５％炭酸ガス−９５％空気）
で３７°Ｃで培養した。培養開始後、４時間目に緩衝液
（０，１％ｏｖａ１ｍｉｎ／　Ｐ　Ｂ　Ｓ　）で希釈し
たＦＧＦを添加し、更に４日間培養した。培養液を吸引
除去後、０．３Ｎ過塩素酸０．５ｄを添加してアセチル
コリンを抽出し、内標のエチルホモコリン（２０ｐｓｏ
１ｇ／　２０μｇ）を添加の後、高速液体クロマトグラ
フィーにより、アセチルコリンを定量した。

同時に、抽出液の蛋白質量を測定し、ミリグラム蛋白質
量たりにアセチルコリン量を算出した。統計処理は５ｔ
ｕｄｅｎｔのｔ検定により行った。結果を第２表に示す
。

第２表第２表から明らかなように、中隔野−前脳基底部神経細
胞および海馬神経細胞、いずれに於いても、ｒｈｂＦ　
Ｇ　Ｆはアセチルコリン量を上昇させた。

実施例２　　（ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆによるアストログリア
細胞におけるＮＧＦの分泌誘導作用）生後２日目の新生ラット（ＳＤ系ラット）を断頭後、実
体顕微鏡下に於いて大脳皮質を採取した。

脳組織を細断後、０．１２５％トリプシンで処理して細
胞浮遊液を得た。１０％の血清を含む培養液（ＤＭＥ／
Ｆ　１２）に浮遊させた細胞（５ＸＩＯ’細胞／ｃｍり
を培養瓶にまき、１０日間培養した（この培養によりア
ストログリア細胞のみが生き残り、神経細胞は死滅する
）。０．２５％トリプシン処理により、同アストログリ
ア細胞をはがし、先と同様に細胞浮遊液を作成した。ポ
リーＬ−オルニチン（１００μｓ／ｄ）であらかじめコ
ートしたプレートに細胞（５Ｘ１０’細胞／皿）をまい
た後、炭酸ガス−培養器（５％炭酸ガス−９５％空気）
で、３７℃で３日間培養した。培養液を除去し、無血清
培地（０，５％ＢＳＡを含む、ＤＭＥ／Ｆ　ｌ　２培地
）で洗浄の後、同培地で溶解した種々の濃度の「ｈｂＦ
ＧＦ（５００μｅ）またはｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
８２３（５００μＱ）（以下、ｃｓ２３と略称すること
もある。）を添加した。更に２４時間培養の後、培養上
清を採取し、同培養土清中に含有するＮＧＦを酵素免疫
測定法により測定した。蛋白質量はＩＮのＮａＯＨを添
加して細胞を可溶化したのちに定量した。ＮＧＦ量は、
ミリグラム蛋白質あたりで表現した。結果を第３表に示
す。

第３表第３表に見られるように、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆまたはｒｈ
ｂＦＧＦムティンＣ３２３をアストログリア細胞に添加
すると、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦまたはｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムテ
ィンＣ３２３の濃度に依存して、培養土清中にＮＧＦ量
の増加が認められた。即ち、ｒｈｂＦ　ＧＦまたは「ｈ
ｂｉ？ＧＦムティンＣ３２３はアストログリア細胞に作
用して、ＮＧＦの分泌を促進した。

実施例３　（中隔野−海馬間・神経線維切断ラットにお
けるアセチルコリン（Δｃｈ）神経細胞の減少に対する
Ｃ３２３およびＮＧＦの作用）Ｋｆｆｉ２５０〜３００ｇの雄性ウィスターラットをベ
ンドパルビタール麻酔下（５５ｍｇ／　ｋｇ　ｉｐ）ニ
脳定位固定装置に固定し、頭蓋骨に長方形の穴を開けた
（ブレグマより尾側へ０．５　５ｍｌ１１、正中線より
外側へ０．３−３ｍｍ）。大脳皮質部分を吸引除去後、
海馬吻側部を含む中隔野−海馬・神経線維を吸引除去し
た。この吸引除去部分に、Ｃ３２３またはＮＧＦを染み
込ませたスポンジゲル（３×５　Ｘ　５　ｍｍ）を封入
した。表皮を瞬合し、２週間、個別ケージにて飼育した
。Ｃ３２３およびＮＧＦは、０．１％オバルブミン／Ｐ
ＢＳ溶液に溶解し、その３０μＱをスポンジゲルに染み
込ませて投与した。２週間後、生理食塩水に溶解したメ
チルアトロビン（５ｎ＋ｇ／　ｋｇ）を腹腔的投与し、
１５分後にピーナツオイルに溶解したジイソプロピルフ
ルオロホスフェイト（ＤＦ　Ｐ、　１．４ｍｇ／ｋｇ：
不可逆的なアセチルコリンエステラーゼ阻害剤）を左後
肢筋肉内に投与した。Ｄ　ＦＰ投与後、３−４時間目に
ラットをベンドパルビタール麻酔下に開腹、開胸し、左
心室から頭部方向の大動脈にカニユーレを挿入した。両
総頚動脈を切断して放血させると同時にカニユーレを通
して冷生理食塩水（５０，ｄ）を注入して脱血させ、続
いて固定液（４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液
、約５０ｄ）を注入して脳組織を固定した。話頭後、脳
組織を取り出し、−２０°Ｃで凍結し、ミクロトームで
３０μｍの脳組織切片を作製した（第１図参照）。第１
図は、脳組織切片についての脳組織の断面図を示し、Ａ
は中隔野を、Ｂはブロー力の対角帯垂直部を、Ｃはブロ
ー力の対角帯水平部をそれぞれ示す。

脳組織切片は、脳の吻側部（はぼブロー力対角帯垂直部
のアセチルコリン神経細胞が出現する部位）から尾側部
方向に６０μｍおきに計２４枚を切り出し、アセチルコ
リン神経細胞をアセチルコリンエステラーゼ活性を利用
して染色した。結果は、神経線維を切断していない側（
対側の非損傷側）のアセチルコリン神経細胞の数をｌＯ
Ｏとした時の切断側の細胞数の割合で表現し、第１図に
示すように、Ａ（中隔野）、Ｂ（ブロー力の対角帯垂直
部）、Ｃ（ブロー力の対角帯水平部）の３領域に分けそ
れぞれ非損傷側と比較した。結果を第２図に示す。

第２図において、■■■はＣ８２３（３μｇ）投与の、
函ニーはＮＧＦ（３０μｇ）投与の、ロニコは無処理の
結果をそれぞれ示す。

＊また、第２図において、＊および＊は、＊ｐ＜　Ｑ　。

＊０５、＊　ｐ＜０．０１をそれぞれ示し、無処理群と比
較した（ｎ＝　７　）を示す。

第２図に示す結果から明らかなように、Δ領域において
は、神経線維切断側のアセチルコリン神経細胞数は、非
切断側（非損傷側）の２０％に低下した。Ｃ５２３投与
群ではこの減少を有意に回復させた。ＮＧＦも回復傾向
を示した。Ｂ領域、Ｃ領域においても同様の回復が認め
られた。

発明の効果本発明の製剤は、アルツハイマー型記憶障害の改善・治
療作用を有するので、アルツハイマー型記憶障害の改善
・治療剤として有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２で得られた、脳組織切片についての
脳組織の断面図を示す。第２図は、実施例２で得られた、中隔野−海馬間の神経
線維切断ラットにおける神経細胞減少に及ぼすＣ３２３
およびＮＧＦの影響を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）、ＦＧＦ蛋白質を含有するアルツハイマー型記憶
障害の改善・治療剤。
（２）、ＦＧＦ蛋白質がヒト塩基性ＦＧＦ蛋白である請
求項１記載の改善・治療剤。