JPH0253484A

JPH0253484A - Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼおよびその製法

Info

Publication number: JPH0253484A
Application number: JP63202515A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Sakamoto; 拡之坂本; Toshiro Kikuchi; 俊郎菊地; Shigenori Aisui; 愛水　重典
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-08-12
Filing date: 1988-08-12
Publication date: 1990-02-22
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: JPH0817698B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は熱及びｐＨの変化に安定なり一ラクテートデヒ
ドロゲナーゼに関するものである。

本発明のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼは、血清、尿
中のピルビン酸の定量、グルタミン酸−ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ、ピルビン酸；トナー七等の酵素活性測定に
用いられる。

（従来の技術）従来から知られているＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼ
を生産する微生物は、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓ　ｔｏｃ）、ペデイオコッカス属（Ｐｅｄ　１ｏｃ
ｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ）などがある（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、ｖｏｌ、４４．１９８０）
。血清、尿中のピルビン酸の定量、グルタミン酸・ピル
ビン酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸・オキザロ酢
酸トランスアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼの酵素活性
測定に上記微生物から得られたＤ−ラクテートデヒドロ
ゲナーゼが用いられているが、これらの酵素は安定性が
充分でなく、また至適９１１がｐＨ４〜６と酸性側であ
った。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは上記の背景を踏まえ、従来のＤ−ラクテー
トデヒドロゲナーゼよりも熱安定性、ｐＨ安定性に優れ
、至適ｐＨが中性であるＤ−ラクテートデヒドロゲナー
ゼを見い出そうと試みた。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意研究を重ね
た結果、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ属）に属する微生物から熱安定性、ｐＨ安定性に優れ
、至適ｐＨが中性であるＤ−ラクテートデヒドロゲナー
ゼを見い出した。

すなわち本発明は下記性質を有するＤ−ラクテートデヒ
ドロゲナーゼである。

■　下記の反応を触媒する。

反応式；Ｄ−乳酸子ＮＡＤ”　＝ピルビン酸十ＮＡＤＩ
（＋Ｈ” ■　安定ｐＨが５．０〜１０．０付近である（２５°Ｃ
２４時間）。

■　ピルビン酸還元反応活性の至適ｐＨが７．０付近で
ある。

■　分子量が約１４０．０００である（ゲル濾過法）。

また本発明は上記性質を有するＤ−ラクテートデヒドロ
ゲナーφ懺生しうるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属菌を培養し、該培養物から０株ラクテートデヒドロゲナーゼを分取することを特徴とす
るＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼの製造法である。

本発明に用いる微生物は上記性質を有するＤラクテート
デヒドロゲナーゼを産生じつるラクトバチルス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌であって、好適な例として
は、ラクトバチルスフアーメンクム（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｌｌ）ＩＦＯ３９５６，
ＩＰｏ　３９５９などがあげられる。

本発明の酵素を製造するにあたっては、上記Ｄラクテー
トデヒドロゲナーゼ生産菌を酵素を生産する通常の方法
で培養する。使用する培地組成としては使用菌株が責化
しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を
適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれ
も使用できる。

培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行なう。培
養温度は３０°Ｃ〜４０’Ｃで行なうことが好ましい。

これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施
できる。通常１〜２日の培養期間で生育し、菌体内にＤ
−ラクテートデヒドロゲナーゼが生成蓄積される。

本発明酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いる
ことができる。例えば抽出法には超音波破砕、ガラスピ
ーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性
剤などいずれを用いてもよい。さらに抽出液については
、硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カ
ルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやエチレンイミ
ンポリマーなどの凝集法、さらにはイオン交換クロマト
グラフィーなどにより精製することができる。

次に本発明のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼの活性測
定法を示す。０．５０ｍＭピルビン酸、０．１１０ｆｆ
１還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（
ＮＡＤＨ）を含む６７１１−に−リン酸緩衝液（ｐｌ＋
７．４）を調整した後、３．０ｄを試験管に分取し、２
５°Ｃで予備加温する。酵素液０．０１ｄを添加し、ゆ
るやかに混和復水を対照に２５°Ｃで制御された分光光
度計で１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度変化を求める
。Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼの活性の表示は、上
記条件下で１分間あたり１マイクロモルのＮ　Ａ　Ｄ　
ＩＩを消去する酵素単位を１単位（Ｕ）とする。

次に本発明の酵素の理化学的な性質について述べる。

（１）　　作用及び基質特異性ピルビン酸を還元し、Ｄ（−）乳酸を生成する。

この際に等モルのＮＡＤＨを酸化し、等モルの酸化型ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ”）
を生成する。またこの逆の反応を触媒し、Ｄ（−）乳酸
とＮＡＤ”からピルビン酸とＮ　Ａ　Ｄ　ＩＩを生成す
る。なお、ピルビン酸の還元反応の際のピルビン酸に対
するＫｍは０．１０ｍＭＮＡＤＨ１６７ｎ＋Ｍ　Ｋ−リ
ン酸緩衝液（ｐｌ＋７．４）、測定温度２５°Ｃの条件
下で０．１６＋ｗＭであった。

（２）　　至適ｐＨ６７ｏ＋ＭＫ−’Ｊン酸緩衝液（ｐ　１１５　、０〜８
．０）、６７＋門Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０
〜９．０）中でのピルビン酸還元反応の活性の測定結果
は第１図に示す通りであって、至適ｐＨは７．０付近で
あった。

（３）　　安定ｐＨ本発明の酵素を１００＋ａＭジメチルグルタル酸ＮａＯ
Ｈ３ｌ衝液（ｐＨ４，０〜６．０）、１００ｍＭ　Ｋ−
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８．０）、１００ｉ＋Ｍ　
Ｔｒｉｓ４１ＣＩＷ衝液（ｐｌ＋８．０〜９．０）、１
００ｍＭグリシン−Ｎ　ａ　ＯＩｔ緩衝液（ｐ１１９．
０〜１０．０）中で２５℃、２４時間保温後、ピルビン
酸還元反応の残存活性を測定した。結果は第２図に示す
通りであって、安定ｐｌ（は５〜１０付近であった。

（４）　　至適温度６７ｍＭ　Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，４）中での各温
度におけるピルビン酸還元反応の活性を測定した。結果
は第３図に示す通りであって、至適温度は３５〜４０’
Ｃ付近であった。

（５）熱安定性本発明の酵素を５０ｍＭ　　Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）　中で３５〜５５°Ｃ１１５分間保温した後、ピ
ルビン酸還元反応の残存活性を測定した。

結果は第４図に示す通りであって、４５°Ｃまで安定で
あった。

（６）分子量ＨＰＬＣ用カラムＹＭＣ−ｐａｃｋ　Ａ−７１５５−５
−２０（山村化学研究所型）を用いたゲル濾過を行った
結果、分子量は約１４０，０００であった。

（７）等電点ヤンホライン（ＬＫＢ製）を用いた電気泳動の結果、等
電点はｐＨ４，０でった。

従来のラクトバチルス・ライヒマニ、ロイコノストック
・メセンテロイデス、スタフィロコッカス属の産生ずる
Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼと、に本発明の酵素を至適ｐＨ１熱安定性、ｐＨ安定性、ｋｖ
ａについて比較した。（至適ｐＨは２５°Ｃ、ピルビン
酸を基質とした反応について比較した。熱安定性はｐＨ
７，０，１５分処理の条件で比較した。　ｐＨ安定性は
２５°Ｃ２４８時間処理の条件下で比較した。Ｋｍは２
５°Ｃ１ρＩＩ　７　、０におけるピルビン酸に対する
反応について比較した。）ラクトバチルス・ライヒマニ
の産生ずる酵素は至適ｐＨが６付近であり、熱安定性が
４５°Ｃ以下で安定であり、ｐＨ安定性が−ｐＨ５〜ｌ
Ｏの範囲であり、ピルビン酸に対するＫｔｓが６．９Ｘ
１０−’Ｍであり、本発明の酵素とは至適ｐＨ，Ｋｍの
点で異なる。

また、ロイコノストック・メセンテロイデスの産生ずる
酵素は、至適ｐＨが６付近であり、熱安定性が４０°Ｃ
以下で安定であり、ｐＨ安定性がｐＨ６〜１０の範囲で
あり、ピルビン酸に対するＫｍが５．２　Ｘ　１０−’
門であり、本発明の酵素とは、至適ｐＨ２熱安定性、ｐ
ｌ＋安定性、Ｋ−の点で異なる。スタフィロコッカス属
の産生ずる酵素は至適ｐＨが４以下であり、熱安定性が
３５°Ｃ以下で安定であり、ｐＨ安定性がｐ）１５〜８
の範囲であり、ピルビン酸に対するに麟が１．９×１０
−’Ｍであり、本発明の酵素と至適ｐｉ（、熱安定性、
ｐＨ安定性の点で異なる。

（実施例）以下、実施例をあげ本発明を具体的に示す。

実施例１ポリペプトン１％、肉エキス１％、酵母エキス０．５％
、Ｋ２１１ＰＯ４０，２％、クエン酸臭アンモニウム０
．２％、グルコース２％、酢酸ナトリウム０．５％、Ｍ
ｇ５Ｏａ　’　７ＨｚＯＯ，０５８％、Ｍｎ５Ｏａ　’
　４１１ｚＯＯ，０２８％を含む培地（ｐＨ６，８＞　
１５−を３０滅容試験管に移し、１２１°Ｃ１１５分間
オートクレーブ殺菌を行なった。種菌としてラクトバチ
ルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆ
ｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＩＦＯ３９５６を１白金耳植菌し、
３７°Ｃで２４時間振盪培養し、種培養液とした。次に
同培地６００ｄを２１！、容坂ロフラスコに移し１２１
°Ｃ，１５分間オートクレーブを行なった。これに種培
養液５ｄを移し、３７°Ｃで２４時間振盪培養した。培
養終了時のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は６Ｕ
／Ｉｄであった。

培養液６００　ｄを遠心分離にて集菌し、ＩＩＩＩＭジ
チオスライトールを含む５０ｔ＊Ｍ　Ｋ−’Ｊン酸緩衝
液（ｐ１１７．０）　５５．０ｄにて懸濁した。超音波
破砕機（海上電気型、１９ＫＨｚ　）にて３０分間処理
し、遠心分離にてその上清液５０．Ｏａｄを得た。硫酸
アンモニウム２２．８　ｇを添加、溶解し、遠心分離に
て塩析沈澱物を得た。これを１ｍＭジチオスライトール
を含む５０ｍＭＫ−’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞　３
０．０ｄにて懸濁し、遠心分離にて上清液を得た。上清
液を１ｍＭジチオスライトールを含む５０ｍＭ　Ｋ−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて平衡化したセファデック
スＧ−２５（ファルマシア製）で脱塩を行なった。次に
同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂ　（ファルマシア製）カラムクロマトグラフィーに
供し、０〜０．４ｍＭ巳ＮａｋＨ８出画分にＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼ酵
素活性を得た。溶出液を５０ｍＭ　　Ｋ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にて平衡化したセファデックスＧ−２５
（ファルマシア製）で脱塩を行なった。その結果１５０
０　Ｕの酵素が得られた。得られた酵素の理化学的性質
は前述の通りであった。

比較例１従来のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼの理化学的性質
を第１表にまとめて記す。

表中（ａ）　　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　６２　：
　２４１−２５０（１９７０）（ｂ）門１ｃｒｏｂｉｏ
ｓ　　９　：　１９９−２１５（１９７４）（ｃ）　　
　Ｊ　、　Ｇ　ｅ　ｎ　、へｐｐ＋、旧ｃｒｏｂｉｏ１
．　１０　　：　　３３−４４（１９６４）（ｄ）　　
　Ｊ　、　Ｇ　ｅ　ｎ　、へｐｐ１．旧ｃｒｏｂｉｏ１
．　　８　　：　　１３０−１４１（１９６２）（ｅ）
　　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｅ　５５　：　１０４７−１０
５６（１９７３）（ｆ）　　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
　１２１　：　６００−６０７（１９７５）（ｇ）　　
Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１５７
　：　３６−４３（１９７３）（ｈ）　　Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　２３５　：　８１０−８１８（１９６０
）（ｉｌ　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４３　：　
２５８７−２５９６（１９６８）（発明の効果）本発明では熱安定性、ｐＨ安定性に優れ、至適ｐ■が中
性であるＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼの至
適ｐｏを示す。第２図は本発明のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼのｐ
ｉ安定性を示す。第３図は本発明のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼ゛の
至適温度を示す。第４図は本発明のＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼの熱
安定性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の性質を有するＤ−ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ。［１］下記の反応を触媒する。反応式：Ｄ−乳酸＋ＮＡＤ＾＋■ピルビン酸＋ＮＡＤＨ
＋Ｈ＾＋［２］安定ｐＨが５．０〜１０．０付近である（２５℃
、２４時間）。［３］ピルビン酸還元反応活性の至適ｐＨが７．０付近
である。［４］分子量が約１４０，０００である（ゲル濾過法）
。
（２）特許請求の範囲第１項記載の性質を有するＤ−ラ
クテートデヒドロゲナーゼを産生しうるラクトバチルス
属菌を培養し、該培養物からＤ−ラクテートデヒドロゲ
ナーゼを採取することを特徴とするＤ−ラクテートデヒ
ドロゲナーゼの製造法。