JPH0249585A - 新規なプロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新規なプロテアーゼに関し、詳しくは塩基性
アミノ酸残基対特異的プロテアーゼに関する。
アミノ酸残基対特異的プロテアーゼに関する。
塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼは、プロホル
モンからのホルモンの生合成に関与していることが示唆
され、その酵素化学的性質、生理的機能などを明らかに
し、プロホルモンからのホルモンの合成やその高い特異
性を利用してタンパクやペプチドなどの限定分解などに
利用するため各種起源より精製が試みられてきた。
モンからのホルモンの生合成に関与していることが示唆
され、その酵素化学的性質、生理的機能などを明らかに
し、プロホルモンからのホルモンの合成やその高い特異
性を利用してタンパクやペプチドなどの限定分解などに
利用するため各種起源より精製が試みられてきた。
現在までに完全に精製され報告されているのは、豚脳下
垂体（ＩＲＣＭ−セリンプロテアーゼ−１：ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、）、２６１．１０８５０（１９８６））、
牛脳下垂体（ＰＯＭ［ニーコンバーティング・エンザイ
ムジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ −
（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６０． ７１９４
（１９８５）、 同２６１１４３９２ （１９
８６））、 酵母サツカロマイセス・セレビシｘ （Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
（フオルセシ７ Ｙ−１６ネイチヤー （Ｎａｔｕｒ
ｅ）； ３０９．５５８（１９８４））、 酵母スポ
ロボロマイセス・オドラス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃ
ｅｓ ｏｄｒｕｓ、特願昭６３−１６２８５）のみであ
りプロテアーゼの分類では、ＩＲＣＭ−セリンプロテア
ーゼ−１，フォルセシンＹ−１はセリン・プロテアーゼ
に、ＰＯＭＣ−コンバーティング・エンザイムはアスパ
ルティク・プロテアーゼに分類されている。スポロポロ
マイセス属由来の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼは、パラアミジノフェニルメタンスルフォニルフル
オリド（ｐＡＰＭＳＦ） 、パラクロロ水銀安息香酸（
ｐＣＭＢ） 、金属キレータ−１重金属などにより阻害
される。切断部位はＩＲＣＭ−セリンプロテアーゼ−Ｉ
ＰＯＭＣ−コンバーティング・エンザイム、スポロ
ポロマイセス属由来塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼは、連続する塩基性アミノ酸のＣ末端側を、フォ
ルセシンＹ−１は連続する塩基性アミノ酸の間を特異的
に加水分解することが知られている。また、酵母サツカ
ロマイセス・セレビシェよりα−接合因子（ａ −Ｍａ
ｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）のプロセシングに関与してい
る（ＫＢＸ２−プロテアーゼ）と思われる塩基性アミノ
酸残基対峙異的プロテアーゼが部分精製されており（バ
イオケミカル・バイオフィジカル畳すサーチ噂コミュニ
ケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
垂体（ＩＲＣＭ−セリンプロテアーゼ−１：ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、）、２６１．１０８５０（１９８６））、
牛脳下垂体（ＰＯＭ［ニーコンバーティング・エンザイ
ムジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ −
（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６０． ７１９４
（１９８５）、 同２６１１４３９２ （１９
８６））、 酵母サツカロマイセス・セレビシｘ （Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
（フオルセシ７ Ｙ−１６ネイチヤー （Ｎａｔｕｒ
ｅ）； ３０９．５５８（１９８４））、 酵母スポ
ロボロマイセス・オドラス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃ
ｅｓ ｏｄｒｕｓ、特願昭６３−１６２８５）のみであ
りプロテアーゼの分類では、ＩＲＣＭ−セリンプロテア
ーゼ−１，フォルセシンＹ−１はセリン・プロテアーゼ
に、ＰＯＭＣ−コンバーティング・エンザイムはアスパ
ルティク・プロテアーゼに分類されている。スポロポロ
マイセス属由来の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼは、パラアミジノフェニルメタンスルフォニルフル
オリド（ｐＡＰＭＳＦ） 、パラクロロ水銀安息香酸（
ｐＣＭＢ） 、金属キレータ−１重金属などにより阻害
される。切断部位はＩＲＣＭ−セリンプロテアーゼ−Ｉ
ＰＯＭＣ−コンバーティング・エンザイム、スポロ
ポロマイセス属由来塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼは、連続する塩基性アミノ酸のＣ末端側を、フォ
ルセシンＹ−１は連続する塩基性アミノ酸の間を特異的
に加水分解することが知られている。また、酵母サツカ
ロマイセス・セレビシェよりα−接合因子（ａ −Ｍａ
ｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）のプロセシングに関与してい
る（ＫＢＸ２−プロテアーゼ）と思われる塩基性アミノ
酸残基対峙異的プロテアーゼが部分精製されており（バ
イオケミカル・バイオフィジカル畳すサーチ噂コミュニ
ケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）、 １４
４． ８０７ （１９８７））、 ＫＥＸ２−プロテ
アーゼのクローニングも報告されている（昭和６３年度
農芸化学会大会ｐ２６４）。
４． ８０７ （１９８７））、 ＫＥＸ２−プロテ
アーゼのクローニングも報告されている（昭和６３年度
農芸化学会大会ｐ２６４）。
しかし、従来報告されているプロテアーゼは、活性の強
さ、安定性などの点で未だ満足できるものは得られてい
ない。
さ、安定性などの点で未だ満足できるものは得られてい
ない。
プロテアーゼをプロホルモンからのホルモンの合成に利
用するに際しては、特異性としては連続する塩基性アミ
ノ酸残基のＣ末端側を切断することが望ましく、この様
なプロテアーゼの探索が期待されている。
用するに際しては、特異性としては連続する塩基性アミ
ノ酸残基のＣ末端側を切断することが望ましく、この様
なプロテアーゼの探索が期待されている。
本発明者は、上記現状に鑑み大量に調製できることから
、その起源として酵母を選択し、酵母より上記性質を有
するプロテアーゼの探索を行い、クライベ０フイセス（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、フィロハジジウＡ
（Ｐｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ハンザこの様な性質
を有するプロテアーゼを生産することを発見し、本酵素
を精製しその理化学的性質を明らかにし本発明を完成し
た。
、その起源として酵母を選択し、酵母より上記性質を有
するプロテアーゼの探索を行い、クライベ０フイセス（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、フィロハジジウＡ
（Ｐｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ハンザこの様な性質
を有するプロテアーゼを生産することを発見し、本酵素
を精製しその理化学的性質を明らかにし本発明を完成し
た。
即ち、本発明は、次の１〜５に示す理化学的性質を有す
るプロテアーゼを提供するものである。
るプロテアーゼを提供するものである。
■作用及び基質特異性
Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有するあるい
は有しないＡｒｇ、 Ｌｙｓ又はＰｒｏ、 ＹはＡｒｇ
。
は有しないＡｒｇ、 Ｌｙｓ又はＰｒｏ、 ＹはＡｒｇ
。
はペプチド結合を示す。）で示される化合物のＹのＣ末
端側のペプチド結合を特によく加水分解する。
端側のペプチド結合を特によく加水分解する。
■至適ｐＨ：）リス−塩酸緩衝液 ｐＨ７，０付近■ｐ
ｌ（安定性：ｐ８６〜１０で最も安定。
ｌ（安定性：ｐ８６〜１０で最も安定。
■至適温度；６０℃付近（ｐＨ７，０）■熱安定性：５
５℃以下で安定（ｐＨ７，０，１０分間）本発明のプロ
テアーゼの上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質
は以下の通りである。
５℃以下で安定（ｐＨ７，０，１０分間）本発明のプロ
テアーゼの上記以外の理化学的性質、及び酵素学的性質
は以下の通りである。
■活性化剤：塩化カルシウム、ルブローノ叶Ｘ（Ｌｕｂ
ｒｏｌ ＰＸ）などの界面活性剤により活性化される。
ｒｏｌ ＰＸ）などの界面活性剤により活性化される。
■阻害剤：パラアミジノフェニルメタンスルフォニルフ
ルオリド（ｐＡＰＭＳＦ） 、パラクロロ水銀安息香酸
（ｐｃＭＢ） 、エチレンジアミン４酢酸（巳ＤＴＡ）
、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエー テル）４酢酸（ＥＧＴＡ）などの金属キレータ−や硫酸
銅、塩化亜鉛、塩化水銀 などの重金属により阻害される。
ルオリド（ｐＡＰＭＳＦ） 、パラクロロ水銀安息香酸
（ｐｃＭＢ） 、エチレンジアミン４酢酸（巳ＤＴＡ）
、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエー テル）４酢酸（ＥＧＴＡ）などの金属キレータ−や硫酸
銅、塩化亜鉛、塩化水銀 などの重金属により阻害される。
■分子量：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００５ＷｘＬによる
ゲル濾過で約１０万。
ゲル濾過で約１０万。
尚、本発明において、プロテアーゼの活性は以下に示す
方法により測定した。
方法により測定した。
活性測定法ニドリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０５０μｍｏ
ｌ。
ｌ。
ルブロールＰＸ １０ｍｇ、塩化カルシウム０，５μｍ
ｏｌ 、Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
（Ｂｏｃは、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基の略、ＭＣＡは４メ
チルクマリン−７−アミド（４ Ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ −７−ａｍｉｄｅ）の
略）０．１μｍｏｌ及び酵素を含有する１ｍ＆の反応液
中で３０℃で反応させ、生成する７−アミノ−４−メチ
ルクマリン（７ Ａｍｉｎｏ −４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ ；
以下ＡＭＣと略す）に由来する蛍光（励起波長３８０ｎ
ｍ、発光波長４６０ｎｍ）を経時的に測定した。ＩＵは
、１分間にｌｎｍｏｌのＡＭＣの遊離を触媒する酵素量
とした。また、 比活性はタンバフ１ｍｇ当たりのＵ数とし、タンパク量
は２８０１ｍにおける吸光度より６１％を１０として計
算した。
ｏｌ 、Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
（Ｂｏｃは、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基の略、ＭＣＡは４メ
チルクマリン−７−アミド（４ Ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ −７−ａｍｉｄｅ）の
略）０．１μｍｏｌ及び酵素を含有する１ｍ＆の反応液
中で３０℃で反応させ、生成する７−アミノ−４−メチ
ルクマリン（７ Ａｍｉｎｏ −４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ ；
以下ＡＭＣと略す）に由来する蛍光（励起波長３８０ｎ
ｍ、発光波長４６０ｎｍ）を経時的に測定した。ＩＵは
、１分間にｌｎｍｏｌのＡＭＣの遊離を触媒する酵素量
とした。また、 比活性はタンバフ１ｍｇ当たりのＵ数とし、タンパク量
は２８０１ｍにおける吸光度より６１％を１０として計
算した。
本発明において使用する塩基性アミノ酸残基対特異的プ
ロテアーゼ生産能を有する微生物は、塩基性アミノ酸残
基対特異的プロテアーゼを生産することができるクライ
ベロマイセス属、フィロバジジウム属、ハンゼヌラ属、
イサチェンキア属、ピキア属、ロドスボリジウム属、サ
ツカロミコプシス属に属する全ての菌株、突然変＝８ 異株、変種を含む。それらのうち好ましい菌株は、タラ
イベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３゜ＩＦ口１
２６７、フィロバジジウム・カジスリゲナムＩＦＯ１１
１９，ＩＦＯ１１８５、ハンセヌラ・ファビアニイＩＦ
Ｏ１２５３，ＩＦＯ１２５４、ハンセヌラ・ホルスティ
ＩＦＯ０９８０，ＩＰＯ０９８６、ハンセヌラ・ポリモ
ルファＡＴＣＣ２６０１２、イサチェンキア・スキニラ
レイク・バラエティ・スキニラレイク・ ＩＦＯ１００
６９、ＩＦｏ １００７０、ピキア・ヒープイーＩＦＤ
１００１９、１００２０、ピキア・オプンティエ・バラ
エティ・サーモトレランスＩＦＯ１００２４，ＩＰＯ１
００２５゜ＩＰＯ１００２６、ロドスボリジウム・ジオ
ボベイタムＩＦ０１８３０ 、ロドスポリジウム・トル
ロイデスＩＦＯ０４１３，［Ｆｏ ０８８０ 、サツカ
ロミコプシス・フィブリゲラＩＦＯ０１０３，ＩＦＯ０
１０５，ＩＦＯ０１０６である。
ロテアーゼ生産能を有する微生物は、塩基性アミノ酸残
基対特異的プロテアーゼを生産することができるクライ
ベロマイセス属、フィロバジジウム属、ハンゼヌラ属、
イサチェンキア属、ピキア属、ロドスボリジウム属、サ
ツカロミコプシス属に属する全ての菌株、突然変＝８ 異株、変種を含む。それらのうち好ましい菌株は、タラ
イベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３゜ＩＦ口１
２６７、フィロバジジウム・カジスリゲナムＩＦＯ１１
１９，ＩＦＯ１１８５、ハンセヌラ・ファビアニイＩＦ
Ｏ１２５３，ＩＦＯ１２５４、ハンセヌラ・ホルスティ
ＩＦＯ０９８０，ＩＰＯ０９８６、ハンセヌラ・ポリモ
ルファＡＴＣＣ２６０１２、イサチェンキア・スキニラ
レイク・バラエティ・スキニラレイク・ ＩＦＯ１００
６９、ＩＦｏ １００７０、ピキア・ヒープイーＩＦＤ
１００１９、１００２０、ピキア・オプンティエ・バラ
エティ・サーモトレランスＩＦＯ１００２４，ＩＰＯ１
００２５゜ＩＰＯ１００２６、ロドスボリジウム・ジオ
ボベイタムＩＦ０１８３０ 、ロドスポリジウム・トル
ロイデスＩＦＯ０４１３，［Ｆｏ ０８８０ 、サツカ
ロミコプシス・フィブリゲラＩＦＯ０１０３，ＩＦＯ０
１０５，ＩＦＯ０１０６である。
本発明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼは、
上記属に属する塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアー
ゼ生産能を有する菌株をＹＭ培地などの通常の培地に培
養し、培養物から塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼを取得する事を特徴とする方法により製造すること
ができる。培養液中に特に誘導物質は必要としない。ま
た、培養温度は２５〜３７℃が好ましく、培養時間は、
１日から３日程度が好ましい。生産された塩基性アミノ
酸残基対特異的プロテアーゼの精製は、通常の方法を組
み合わせることによって行われる。例えば、培養物を遠
心分離して菌体を回収し、グイノーミルなどにより菌体
を破砕し、破砕液を低速で遠心分離することにより菌体
残渣などを分離し、得られた上清を超遠心分離（例えば
１５０，０００ｇ、 ６０分）することにより膜画分を
調製する。この膜画分より界面活性剤によって酵素を可
溶化し、可溶化した酵素は、熱処理、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル濾過などによって精製される。
上記属に属する塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアー
ゼ生産能を有する菌株をＹＭ培地などの通常の培地に培
養し、培養物から塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼを取得する事を特徴とする方法により製造すること
ができる。培養液中に特に誘導物質は必要としない。ま
た、培養温度は２５〜３７℃が好ましく、培養時間は、
１日から３日程度が好ましい。生産された塩基性アミノ
酸残基対特異的プロテアーゼの精製は、通常の方法を組
み合わせることによって行われる。例えば、培養物を遠
心分離して菌体を回収し、グイノーミルなどにより菌体
を破砕し、破砕液を低速で遠心分離することにより菌体
残渣などを分離し、得られた上清を超遠心分離（例えば
１５０，０００ｇ、 ６０分）することにより膜画分を
調製する。この膜画分より界面活性剤によって酵素を可
溶化し、可溶化した酵素は、熱処理、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル濾過などによって精製される。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
（塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのスクリー
ニング） 各種酵母をＹＭ培地（グルコース１０ｇ、バクトペプト
ン５ｇ１酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ／β、ｐｆ１
６．０） ７５０１中で２日培養し、培養液を６、７０
０ｇ、１０分間遠心分離し湿菌体を調製した。
ニング） 各種酵母をＹＭ培地（グルコース１０ｇ、バクトペプト
ン５ｇ１酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ／β、ｐｆ１
６．０） ７５０１中で２日培養し、培養液を６、７０
０ｇ、１０分間遠心分離し湿菌体を調製した。
この湿菌体をアルミナ中で破砕し、更に１分間超音波破
砕した後、１，０００ｇ、 １０分間の遠心分離を行い
、得られた上清を更に８０，０００ｇ 、３０分の超遠
心分離を行い沈澱として膜画分を調製した。
砕した後、１，０００ｇ、 １０分間の遠心分離を行い
、得られた上清を更に８０，０００ｇ 、３０分の超遠
心分離を行い沈澱として膜画分を調製した。
得られた膜画分を抽出用緩衝液（１０ｍＭ ） ！Ｊス
ス−酸緩衝液ｐＨ７，０，１％ルブｏ −ルＰＸ、 Ｏ
，１Ｍ塩化ナトリウム）で懸濁し、４℃で１時間撹拌し
て膜タンパクを可溶化した。この懸濁液を８０．０００
ｇ 、 ３０分間超遠心分離して得られた上清を膜抽出
液とし、塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活
性を測定した。
ス−酸緩衝液ｐＨ７，０，１％ルブｏ −ルＰＸ、 Ｏ
，１Ｍ塩化ナトリウム）で懸濁し、４℃で１時間撹拌し
て膜タンパクを可溶化した。この懸濁液を８０．０００
ｇ 、 ３０分間超遠心分離して得られた上清を膜抽出
液とし、塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活
性を測定した。
更に、これらの膜抽出液を５０℃で１０分間熱処理し、
１５，０００ｇ 、 ３０分間の遠心分離の上清を熱処
理膜抽出液とし、塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼの活性を測定した。
１５，０００ｇ 、 ３０分間の遠心分離の上清を熱処
理膜抽出液とし、塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼの活性を測定した。
これらの活性測定の結果を第１表に示した。
表 塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのスク
リーニング実施例２ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのクライベ
ロマイセス・ラクティス ＩＦｏ １９０３からの精製
） クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ１９０３をＹ
Ｍ培地３０β中で２日培養し、培養液を遠心分離して３
１４ｇ （湿重量）の菌体を回収した。この菌体を３０
０ｍ１の緩衝液１ （１０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液
ｐｆ１７．ｏ、 ０．５ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁し
グイノーミルで菌体を破砕し、破砕液を１．７００ｇ１
０分間の遠心分離により菌体残渣を除去し、得られた上
清を１５０，０００ｇ、 ６０分の超遠心分離により沈
澱として膜画分を７９．４ｇ調製した。この膜画分を６
００−の抽出用緩衝液（１０ｍＭ ） ＩＪスス−酸緩
衝液ｐＨ７，０，３％ルブｏ −ノｂＰＸ、 ０．１Ｍ
塩化ナトリウム）に懸濁し一晩撹拌して酵素を抽出した
。上記条件で超遠心分離し上清として膜抽出液を得た。
リーニング実施例２ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのクライベ
ロマイセス・ラクティス ＩＦｏ １９０３からの精製
） クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ１９０３をＹ
Ｍ培地３０β中で２日培養し、培養液を遠心分離して３
１４ｇ （湿重量）の菌体を回収した。この菌体を３０
０ｍ１の緩衝液１ （１０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液
ｐｆ１７．ｏ、 ０．５ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁し
グイノーミルで菌体を破砕し、破砕液を１．７００ｇ１
０分間の遠心分離により菌体残渣を除去し、得られた上
清を１５０，０００ｇ、 ６０分の超遠心分離により沈
澱として膜画分を７９．４ｇ調製した。この膜画分を６
００−の抽出用緩衝液（１０ｍＭ ） ＩＪスス−酸緩
衝液ｐＨ７，０，３％ルブｏ −ノｂＰＸ、 ０．１Ｍ
塩化ナトリウム）に懸濁し一晩撹拌して酵素を抽出した
。上記条件で超遠心分離し上清として膜抽出液を得た。
この膜抽出液を５０℃で３０分間熱処理し、生成した沈
澱を３９，０００ｇ、 ２０分間の遠心分離により除去
し、限外濾過により濃縮した後、緩衝液２（ｌＱｍＭ
）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，５ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．２％ルブローノ叶Ｘ）に透析して得られた両
分を熱処理膜抽出液とした。
澱を３９，０００ｇ、 ２０分間の遠心分離により除去
し、限外濾過により濃縮した後、緩衝液２（ｌＱｍＭ
）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，５ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．２％ルブローノ叶Ｘ）に透析して得られた両
分を熱処理膜抽出液とした。
この両分を緩衝液２で予め平衡化したＤＥＡＲトヨパー
ル６５０Ｍ （２，５Ｘ ４０ｃｍ）に注入し、充分同
緩衝液で洗浄してからＯから０．６Ｍ塩化ナトリウムの
勾配溶出法により酵素を溶出し活性画分を得た。この時
の溶出パターンを第１図に示した。
ル６５０Ｍ （２，５Ｘ ４０ｃｍ）に注入し、充分同
緩衝液で洗浄してからＯから０．６Ｍ塩化ナトリウムの
勾配溶出法により酵素を溶出し活性画分を得た。この時
の溶出パターンを第１図に示した。
活性画分を限外濾過により濃縮した後、０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液２に予め平衡化したコンカナバリ
ンＡ （Ｃａｎ八）−セファロース（１，６Ｘ ２５ｃ
ｍ ）に注入し、同緩衝液で充分洗浄した後、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、 ０．６７Ｍ α−メチル−〇−マン
ノシドを含む緩衝液２で溶出した。
トリウムを含む緩衝液２に予め平衡化したコンカナバリ
ンＡ （Ｃａｎ八）−セファロース（１，６Ｘ ２５ｃ
ｍ ）に注入し、同緩衝液で充分洗浄した後、０．５Ｍ
塩化ナトリウム、 ０．６７Ｍ α−メチル−〇−マン
ノシドを含む緩衝液２で溶出した。
この溶出パターンを第２図に示した。活性画分を濃縮し
Ｃａｎ Ａ−セファロース画分とした。
Ｃａｎ Ａ−セファロース画分とした。
Ｃｏｎ Ａ−セファロース画分を緩衝液２に透析し、同
緩衝液で予め平衡化したアルギニン−セファロース（１
，６Ｘ ５０ｃｍ） に注入し充分に洗浄した後、０
から０．５Ｍ塩化す） ＩＪウムの勾配溶出法により溶
出した。この溶出パターンを第３図に示した。活性画分
を限外濾過により濃縮しアルギニン−セファロース画分
トシタ。
緩衝液で予め平衡化したアルギニン−セファロース（１
，６Ｘ ５０ｃｍ） に注入し充分に洗浄した後、０
から０．５Ｍ塩化す） ＩＪウムの勾配溶出法により溶
出した。この溶出パターンを第３図に示した。活性画分
を限外濾過により濃縮しアルギニン−セファロース画分
トシタ。
アルギニン−セファロース画分を緩衝液２に透析し同緩
衝液で予め平衡化したモノＱ （Ｍｏｎ。
衝液で予め平衡化したモノＱ （Ｍｏｎ。
Ｑ、 ０．５ Ｘ ５． Ｏｃｍ）に注入し、同緩衝液
で充分に洗浄した後Ｏから０．５Ｍ塩化す） ＩＪウム
の勾配溶出法により溶出した。この溶出パターンを第４
図に示すが、活性画分として２ピーク得られた。
で充分に洗浄した後Ｏから０．５Ｍ塩化す） ＩＪウム
の勾配溶出法により溶出した。この溶出パターンを第４
図に示すが、活性画分として２ピーク得られた。
これらの両分を別個に回収し濃縮しそれぞれＭｏｎｏ
Ｑ −Ｉ、 Ｍｏｎｏ Ｑ −Ｈ画分とした。
Ｑ −Ｉ、 Ｍｏｎｏ Ｑ −Ｈ画分とした。
これらの両分を別個に緩衝液２に透析し、予め同緩衝液
で平衡化したベンズアミジン−セファロース（１，６Ｘ
５．Ｏｃｍ＞ に注入し、同緩衝液で充分に洗浄した
後、Ｏから０．５Ｍ塩化す） ＩＪウムの勾配溶出法に
より酵素を溶出した。Ｍｏｎｏ Ｑ■及びＭｏｎｏ Ｑ
−ＩＩに対応するクロマトパターンをそれぞれ第５図
、第６図に示した。また、得られた活性画分をそれぞれ
Ｂｅｎｚ −Ｉ、 ＢｅｎｚＩ５ ■とじた。
で平衡化したベンズアミジン−セファロース（１，６Ｘ
５．Ｏｃｍ＞ に注入し、同緩衝液で充分に洗浄した
後、Ｏから０．５Ｍ塩化す） ＩＪウムの勾配溶出法に
より酵素を溶出した。Ｍｏｎｏ Ｑ■及びＭｏｎｏ Ｑ
−ＩＩに対応するクロマトパターンをそれぞれ第５図
、第６図に示した。また、得られた活性画分をそれぞれ
Ｂｅｎｚ −Ｉ、 ＢｅｎｚＩ５ ■とじた。
精製の要約を第２表に示した。
なお、Ｂｅｎｚ −Ｉ及びＢｅｎｚ −ＩＩは、後述す
る基質特異性、阻害剤に対する挙動、至適ｐ）ｌ （両
者のこれらの値はほぼ同一）、及び分子量（ＢｅｎｚＩ
は約６−１０万、８ｅｎｚ −ｍ ハ約１０万） （Ｄ
ａｌＪ定結果からみると、１３ｅｎｚ−ＩはＢｅｎｚ
−ＩＩの分解産物であるということがいえる。
る基質特異性、阻害剤に対する挙動、至適ｐ）ｌ （両
者のこれらの値はほぼ同一）、及び分子量（ＢｅｎｚＩ
は約６−１０万、８ｅｎｚ −ｍ ハ約１０万） （Ｄ
ａｌＪ定結果からみると、１３ｅｎｚ−ＩはＢｅｎｚ
−ＩＩの分解産物であるということがいえる。
また、第２表に示したとおり比活性はＢｅｎｚ■に比べ
、Ｂｅｎｚ −Ｉの方が高いので、以下ＢｅｎｚＩにつ
いてのみ説明する箇所もあるが、Ｂｅｎｚ■についても
同様である。
、Ｂｅｎｚ −Ｉの方が高いので、以下ＢｅｎｚＩにつ
いてのみ説明する箇所もあるが、Ｂｅｎｚ■についても
同様である。
実施例３
（クライベロマイセス・ラクティスＴＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの基質特異
性） 標準反応条件において螢光性基質をかえでＢｅｎｚ −
■及びＢｅｎｚ −ＩＩの活性を測定し、それぞれの基
質に対する活性をＢｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡに対する活性を１００とした相対活性で表し、第３
表に示した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの基質特異
性） 標準反応条件において螢光性基質をかえでＢｅｎｚ −
■及びＢｅｎｚ −ＩＩの活性を測定し、それぞれの基
質に対する活性をＢｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡに対する活性を１００とした相対活性で表し、第３
表に示した。
続いて、次の（１）〜（５）に示す各種ペプチドに対す
るＢｅｎｚ −Ｉの作用を測定した。測定に用いた反応
液組成、及び条件は次の通りである。
るＢｅｎｚ −Ｉの作用を測定した。測定に用いた反応
液組成、及び条件は次の通りである。
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，０） ２５ μ
ｍｏｌＣａＣ１２０，２５〃 ルブロールＰＸ ５ ｍｇＮ
ａＮ３１００ μｇ ペプチド 各 種Ｂｅｎｚ−■
／／ を含む５００μｌの反応液を３０℃で２０時間反応させ
た。
ｍｏｌＣａＣ１２０，２５〃 ルブロールＰＸ ５ ｍｇＮ
ａＮ３１００ μｇ ペプチド 各 種Ｂｅｎｚ−■
／／ を含む５００μｌの反応液を３０℃で２０時間反応させ
た。
反応０．２０時間に於いて５０μｌサンプリングし、５
０μｌの反応停止液（０，２％ＴＦＡ及び１０ｍＭＢＤ
ＴＡ）を添加したものをＨＰＬＣにより解析した。
０μｌの反応停止液（０，２％ＴＦＡ及び１０ｍＭＢＤ
ＴＡ）を添加したものをＨＰＬＣにより解析した。
１１ＰＬＣによる分離条件は、旧ｔｒｏｎ ＮＣ＋ｅ
（０，４５Ｘ１５Ｃｍ） もしくはＴＳＫｇｅｌ ０
ＤＳ−８０Ｔ！ （０，４６Ｘ２５ｃｍ）を用いて０．
１％ＴＦＡ存在下にＣＨ３ＣＮを勾配溶出法にて溶出し
た。
（０，４５Ｘ１５Ｃｍ） もしくはＴＳＫｇｅｌ ０
ＤＳ−８０Ｔ！ （０，４６Ｘ２５ｃｍ）を用いて０．
１％ＴＦＡ存在下にＣＨ３ＣＮを勾配溶出法にて溶出し
た。
新しく生成したピークの同定
分析時と同様な条件を用いて、残存する反応液のクロマ
トを行い、主なピークを分取した。
トを行い、主なピークを分取した。
分取した溶離液を遠心エバポレーターで乾固し、１１０
℃、２４時間の塩酸加水分解の後アミノ酸分析し、その
アミノ酸組成からフラグメントの推定を行った。
℃、２４時間の塩酸加水分解の後アミノ酸分析し、その
アミノ酸組成からフラグメントの推定を行った。
（１） ＢＡＭ−１２Ｐ
Ｂｅｎｚ −Ｉ ２００ｍＵを５ＱｎｍｏｌのＢＡＭ
−１２Ｐ （ＴｙｒＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）と
反応させた。反応時間２０時間のクロマトにおけるピー
クを分取し、アミノ酸分析を行った。その結果（Ｇｌｕ
、 １．２４ ； Ｇａｙ、 １．１８ ； Ｖａｔ。
−１２Ｐ （ＴｙｒＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）と
反応させた。反応時間２０時間のクロマトにおけるピー
クを分取し、アミノ酸分析を行った。その結果（Ｇｌｕ
、 １．２４ ； Ｇａｙ、 １．１８ ； Ｖａｔ。
１、０４ ； Ａｒｇ、 １．１０ ； Ｐｒｏ、 ０
．９１６ ）というアミノ酸組成、つまりＶａｌ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕと推定できるフラグメント
のピークが得られていることがわかった。
．９１６ ）というアミノ酸組成、つまりＶａｌ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕと推定できるフラグメント
のピークが得られていることがわかった。
これよりＢｅｎｚ −Ｉは下に示す１部を切断している
予想される。
予想される。
↓
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒ。
ｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒ。
１ｕ
（２） Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ Ａ （Ｌ −１３）
Ｂｅｎｚ −Ｉ ２００ｍＬＩをＤｙｎｏｒｐｈｉｎ
Ａ （１−１３）（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉ １ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒ
。
Ｂｅｎｚ −Ｉ ２００ｍＬＩをＤｙｎｏｒｐｈｉｎ
Ａ （１−１３）（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉ １ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒ
。
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ） ５０ｎｍｏｌと反応させた
。反応時間２０時間のクロマトグラムにおけるピークを
分取しアミノ酸分析を行った結果、（Ｉ Ｉｅ、 ０．
９２７ ；Ｌｅｕ、 １．１８ ；Ｌｙｓ、 １．９
１ ；Ａｒｇ １．０６ ；Ｐｒｏ。
。反応時間２０時間のクロマトグラムにおけるピークを
分取しアミノ酸分析を行った結果、（Ｉ Ｉｅ、 ０．
９２７ ；Ｌｅｕ、 １．１８ ；Ｌｙｓ、 １．９
１ ；Ａｒｇ １．０６ ；Ｐｒｏ。
０、９１９）のアミノ酸組成、つまりＩ Ｉｅ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅ叶しｙｓと推定できるフラグメ
ント、及び（Ｇｌｙ、２．３６ ；Ｌｅｕ、０．９９９
；Ｔｙｒ、０．７１５ ；Ｐｈｅ。
−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅ叶しｙｓと推定できるフラグメ
ント、及び（Ｇｌｙ、２．３６ ；Ｌｅｕ、０．９９９
；Ｔｙｒ、０．７１５ ；Ｐｈｅ。
１、１１ ； Ａｒｇ、 １．８２）のアミノ酸組成、
つまりＴｙｒＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｒｇと推定できるフラグメントのピークが得られて
いることがわかった。
つまりＴｙｒＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｒｇと推定できるフラグメントのピークが得られて
いることがわかった。
これより、Ｂｅｎｚ −Ｉは下に示す↓を切断している
と予想される。
と予想される。
↓
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒ。
ｒｇ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒ。
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
（３）プロティンキナーゼ関連ペプチドＢｅｎｚ Ｉ２
００ｍＵをプロティンキナーゼ関連ペプチド（Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）
５０ｎｍｏｌと反応させた。反応時間２０時間のクロマ
トグラムにおけるピークを分取し、アミノ酸分析を行っ
た結果、（Ｓｅｒ、 ０．９９０ ； Ｇｌｕ、 １
．０３ ；Ｌｙｓ、０．９５４ ；Ａｒｇ、１．０３
）’のアミノ酸組成つまりＳｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕと推定できるフラグメントが得られていることがわ
かった。これより、Ｂｅｎｚ −Ｉは下に示す１部を切
断していると予想される。
００ｍＵをプロティンキナーゼ関連ペプチド（Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）
５０ｎｍｏｌと反応させた。反応時間２０時間のクロマ
トグラムにおけるピークを分取し、アミノ酸分析を行っ
た結果、（Ｓｅｒ、 ０．９９０ ； Ｇｌｕ、 １
．０３ ；Ｌｙｓ、０．９５４ ；Ａｒｇ、１．０３
）’のアミノ酸組成つまりＳｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕと推定できるフラグメントが得られていることがわ
かった。これより、Ｂｅｎｚ −Ｉは下に示す１部を切
断していると予想される。
↓
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ
１ｕ（４） Ｘ ｅ ｎ ｏ ｐ ｓ ｉ ｎＢｅ
ｎｚ −１２００ｍＵとＸｅｎｏｐｓｉｎ （ｐＧＩｕ
−Ｇｌｙ−ＬｙｓＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｌ
ｅｕ） ５Ｑｎｍｏｌを反応させた。
１ｕ（４） Ｘ ｅ ｎ ｏ ｐ ｓ ｉ ｎＢｅ
ｎｚ −１２００ｍＵとＸｅｎｏｐｓｉｎ （ｐＧＩｕ
−Ｇｌｙ−ＬｙｓＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｌ
ｅｕ） ５Ｑｎｍｏｌを反応させた。
反応時間２０時間のクロマトグラムにおけるピークを分
取し、アミノ酸分析を行った結果、（Ｇｌｕ、 ０．９
９３ ； ｃｒｙ、 ｉ、 ２２ ； ｌｙｓ、 ｏ、
６７４ ； Ａｒｇ。
取し、アミノ酸分析を行った結果、（Ｇｌｕ、 ０．９
９３ ； ｃｒｙ、 ｉ、 ２２ ； ｌｙｓ、 ｏ、
６７４ ； Ａｒｇ。
１．１１）のアミノ酸組成、つまりｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−
ＬｙｓＡｒｇと推定できるフラグメントのピークが得ら
れていることがわかった。
ＬｙｓＡｒｇと推定できるフラグメントのピークが得ら
れていることがわかった。
これより、Ｂｅｎｚ −Ｉは下に示す１部を切断してい
ると予想される。
ると予想される。
↓
ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−
Ｉ Ｉｅ−しｅｕ（５） ３２００−ダルトン アド
レナールペプチドＥ（Ａｄｒｅｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｅ）Ｂｅｎｚ−Ｉ ２００ｍＬＩと３２００−ダルト
ン アドレナールペプチドＢ （Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＡｒｇＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
ＡｓｐＴｙｒ−Ｇｌｎ−しｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ） ２５ｎｍｏｌを反応
させた。反応時間２０時間におけるクロマトグラムのピ
ークはアミノ酸分析の結果（Ｇｌｙ、 ２．５３ ；
Ｍｅｔ、 ０．５４２ ： Ｔｙｒ、 ０．８９７
： Ｐｈｅ、 １．０３ ； Ａｒｇ、 ２．００）
のアミノ酸組成、つまり’Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−７Ａｒｇと推定できるフラグ
メント、（Ｇｌｙ、 ２．０３ ； Ｌｅｕ、 １．０
１ ； Ｔｙｒ。
Ｉ Ｉｅ−しｅｕ（５） ３２００−ダルトン アド
レナールペプチドＥ（Ａｄｒｅｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｅ）Ｂｅｎｚ−Ｉ ２００ｍＬＩと３２００−ダルト
ン アドレナールペプチドＢ （Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＡｒｇＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−
ＡｓｐＴｙｒ−Ｇｌｎ−しｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ） ２５ｎｍｏｌを反応
させた。反応時間２０時間におけるクロマトグラムのピ
ークはアミノ酸分析の結果（Ｇｌｙ、 ２．５３ ；
Ｍｅｔ、 ０．５４２ ： Ｔｙｒ、 ０．８９７
： Ｐｈｅ、 １．０３ ； Ａｒｇ、 ２．００）
のアミノ酸組成、つまり’Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−７Ａｒｇと推定できるフラグ
メント、（Ｇｌｙ、 ２．０３ ； Ｌｅｕ、 １．０
１ ； Ｔｙｒ。
０、９１３ ； Ｐｈｅ、 １．０４） のアミノ酸
組成、つまり２１Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−２
５Ｌｅｕと推定できるフラグメント及び（Ａｓｐ、 ０
．７６４ ； Ｇｌｕ、 １．７９ ； Ｇｌｙ。
組成、つまり２１Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−２
５Ｌｅｕと推定できるフラグメント及び（Ａｓｐ、 ０
．７６４ ； Ｇｌｕ、 １．７９ ； Ｇｌｙ。
３、２９ ； Ｖａｌ、 １．０１ ； Ｍｅｔ、 １
．２６ ； Ｔｒｙ、 ２．０７ ； Ｐｈｅ。
．２６ ； Ｔｒｙ、 ２．０７ ； Ｐｈｅ。
１、３２ ； Ｌｙｓ、 １．１７ ；八ｒｇ、 ４．
２９ ； Ｐｒｏ、 １．０３）のアミノ酸組成、つま
りＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＴｒｐＴ
ｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−”Ａ
ｒｇと推定できるフラグメントのピークが得られている
ことがわかった。
２９ ； Ｐｒｏ、 １．０３）のアミノ酸組成、つま
りＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＴｒｐＴ
ｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−”Ａ
ｒｇと推定できるフラグメントのピークが得られている
ことがわかった。
これより３ｅｎｚ −Ｉは下に示す１部を切断している
と予想される。
と予想される。
↓
Ｔｒｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ↓ Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−しｅｕ実施例４ （クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの至適ｐＨ
） 標準反応条件において緩衝液の種類及びｐＨを変化させ
てＢｅｎｚ Ｉ及びＢｅｎｚ ＩＩの活性を測定した。
ｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ↓ Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−ＡｒｇＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−しｅｕ実施例４ （クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの至適ｐＨ
） 標準反応条件において緩衝液の種類及びｐＨを変化させ
てＢｅｎｚ Ｉ及びＢｅｎｚ ＩＩの活性を測定した。
緩衝液としては、５０ｍＭ ） ！Ｊスス−酸緩衝液ｐ
Ｈ６〜９．７．１５ｍＭ フリットン・アンド・ロビ
ンソン緩衝液ｐｔ１４〜１０を用い、各条件における活
性をトリス−塩酸緩衝液ｐ１７．０における活性を１０
０とした相対活性で表し、第７図、第８図に示した。
Ｈ６〜９．７．１５ｍＭ フリットン・アンド・ロビ
ンソン緩衝液ｐｔ１４〜１０を用い、各条件における活
性をトリス−塩酸緩衝液ｐ１７．０における活性を１０
０とした相対活性で表し、第７図、第８図に示した。
実施例５
（クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのｐＨ安定
性） １０、７ｍＭブリットン・アンド・ロビンソン緩衝液ｐ
Ｈ３〜１２．０．２％ルブ０−ルｐ×、 ０．５ ｍＭ
塩化カルシウム中で酵素（３ｅｎｚ −Ｉ ）を３０℃
、３０分間インキュベートした後、当量の１００ｍＭ
） ’）ス塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，２％ルブｏ−
ルＰＸ、０．５ｍＭカルシウムを添加してｐＨを７に戻
してから標準反応条件で残存活性を測定した。各処理後
の残存活性を無処理の活性を１００とした相対活性で表
し第９図に示した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのｐＨ安定
性） １０、７ｍＭブリットン・アンド・ロビンソン緩衝液ｐ
Ｈ３〜１２．０．２％ルブ０−ルｐ×、 ０．５ ｍＭ
塩化カルシウム中で酵素（３ｅｎｚ −Ｉ ）を３０℃
、３０分間インキュベートした後、当量の１００ｍＭ
） ’）ス塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，２％ルブｏ−
ルＰＸ、０．５ｍＭカルシウムを添加してｐＨを７に戻
してから標準反応条件で残存活性を測定した。各処理後
の残存活性を無処理の活性を１００とした相対活性で表
し第９図に示した。
実施例６
（クライベロマイセス・ラクティスＩＰ０１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの至適温度
） 標準反応条件において反応温度のみを２５〜７５℃まで
変化させてＢｅｎｚ −Ｉの活性を測定した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの至適温度
） 標準反応条件において反応温度のみを２５〜７５℃まで
変化させてＢｅｎｚ −Ｉの活性を測定した。
各温度における活性を、６０℃における活性を１００と
した相対活性で表し、第１０図に示した。
した相対活性で表し、第１０図に示した。
実施例７
（クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの温度安定
性） 酵素（Ｂｅｎｚ −■）を各温度で１０分間インキュベ
ートした後氷水中で急冷し、残存活性を標準反応条件で
測定した。無処理の活性を１００とした相対活性で各温
度における残存活性を表し、第１１図に示した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの温度安定
性） 酵素（Ｂｅｎｚ −■）を各温度で１０分間インキュベ
ートした後氷水中で急冷し、残存活性を標準反応条件で
測定した。無処理の活性を１００とした相対活性で各温
度における残存活性を表し、第１１図に示した。
実施例８
（クライベロマイセス・ラクティスＩＰＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの各種阻害
剤に対する挙動） 基質不在下において各種阻害剤を含む標準反応液中にお
いて、酵素（３ｅｎｚ−Ｉ及びＢｅｎｚ −ＩＩ ）を
２５℃３０分間インキュベートし、基質を添加してから
残存する酵素活性を測定した。各阻害剤存在下における
残存活性を、無処理の活性を１００とした相対活性で表
し第４表に示した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの各種阻害
剤に対する挙動） 基質不在下において各種阻害剤を含む標準反応液中にお
いて、酵素（３ｅｎｚ−Ｉ及びＢｅｎｚ −ＩＩ ）を
２５℃３０分間インキュベートし、基質を添加してから
残存する酵素活性を測定した。各阻害剤存在下における
残存活性を、無処理の活性を１００とした相対活性で表
し第４表に示した。
第４表つづき
■
実施例９
（ＢＤＴＡ処理後のクライベロマイセス・ラクティスＩ
ＦＯ１９０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼの活性回復に及ぼす各種金属イオンの影響） ３ｅｎｚ −ＩをｌＱｍＭ ＢＤＴＡ存在下で４℃、１
時間インキニベートし、酵素が完全に失活してから１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，２％ルブロー
ノ叶Ｘに対して透析しＢＤＴＡを完全に除去した。この
透析した酵素液を用いて各種金属イオンを０．５ｍＭ含
有する反応液中で活性を測定し活性の回復を調べた。尚
、各活性を無処理の活性を１００とした相対活性で表し
第５表に示した。
ＦＯ１９０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼの活性回復に及ぼす各種金属イオンの影響） ３ｅｎｚ −ＩをｌＱｍＭ ＢＤＴＡ存在下で４℃、１
時間インキニベートし、酵素が完全に失活してから１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，２％ルブロー
ノ叶Ｘに対して透析しＢＤＴＡを完全に除去した。この
透析した酵素液を用いて各種金属イオンを０．５ｍＭ含
有する反応液中で活性を測定し活性の回復を調べた。尚
、各活性を無処理の活性を１００とした相対活性で表し
第５表に示した。
実施例１０
（クライベロマイセス・ラクティスＩＦＤ−１９０３か
らの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活性に
及ぼすカルシウムイオン濃度の影響）０、１ｍＭ ＢＤ
ＴＡを含む標準反応液において塩化力３ｅｎｚ −Ｉ及
びＢｅｎｚ −ＩＩの分子量を界面活性剤を含まない条
件下でＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ ３０００５ＷＸＬ（０，７
８Ｘ３Ｑｃｍ）を用いたゲル濾過で測定した結果、Ｂｅ
ｎｚ −■は約６〜１０万、Ｂｅｎｚ−ＩＩは約１０万
であった。
らの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活性に
及ぼすカルシウムイオン濃度の影響）０、１ｍＭ ＢＤ
ＴＡを含む標準反応液において塩化力３ｅｎｚ −Ｉ及
びＢｅｎｚ −ＩＩの分子量を界面活性剤を含まない条
件下でＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ ３０００５ＷＸＬ（０，７
８Ｘ３Ｑｃｍ）を用いたゲル濾過で測定した結果、Ｂｅ
ｎｚ −■は約６〜１０万、Ｂｅｎｚ−ＩＩは約１０万
であった。
実施例１３
（実施例１で得られた膜抽出液の塩基性アミノ酸残基対
特異的プロテアーゼの部分精製）ロドスポリジウム・ト
ルロイデスＩＦＯ０４１３及びハンセヌラ・ホルスティ
ＩＦＯ０９８０の菌体より実施例１において調製した膜
抽出液の一部に緩衝液１ （１０ｍＭ ）リス−塩酸
緩衝液ｐｆｌ？、０．０．５ｍＭ塩化カルシウム０．２
％ルブローノ叶Ｘ）に透析し予め同緩衝液で平衡化した
モノＱ （ＭｏｎｏＱ、 ０．５Ｘ’５．Ｑｃｍ 、
ファルマシア社製）に注入し、同緩衝液で充分に洗浄し
た後、０から１．０Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により
酵素を溶出した。ロドスポリジウム・トルロイデスＩＦ
００４１３及びハンセヌラ・ホルスティＩＦ００９８０
の各クロマトグラムをそれぞれ第１４図、第１５図に示
した。得られルシウムの濃度を変化させて３ｅｎｚ −
Ｉ及びＢｅｎｚ■の活性を測定した。遊離の塩化カルシ
ウム濃度をＢＤＴＡの塩化カルシウムに対する見かけの
解離定数に、をＬｏｇ Ｋ、 ＝７．３より計算により
求め、各カルシウム濃度における活性を１ｍＭにおける
活性を１００とした相対活性で表し第１２図に示した。
特異的プロテアーゼの部分精製）ロドスポリジウム・ト
ルロイデスＩＦＯ０４１３及びハンセヌラ・ホルスティ
ＩＦＯ０９８０の菌体より実施例１において調製した膜
抽出液の一部に緩衝液１ （１０ｍＭ ）リス−塩酸
緩衝液ｐｆｌ？、０．０．５ｍＭ塩化カルシウム０．２
％ルブローノ叶Ｘ）に透析し予め同緩衝液で平衡化した
モノＱ （ＭｏｎｏＱ、 ０．５Ｘ’５．Ｑｃｍ 、
ファルマシア社製）に注入し、同緩衝液で充分に洗浄し
た後、０から１．０Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により
酵素を溶出した。ロドスポリジウム・トルロイデスＩＦ
００４１３及びハンセヌラ・ホルスティＩＦ００９８０
の各クロマトグラムをそれぞれ第１４図、第１５図に示
した。得られルシウムの濃度を変化させて３ｅｎｚ −
Ｉ及びＢｅｎｚ■の活性を測定した。遊離の塩化カルシ
ウム濃度をＢＤＴＡの塩化カルシウムに対する見かけの
解離定数に、をＬｏｇ Ｋ、 ＝７．３より計算により
求め、各カルシウム濃度における活性を１ｍＭにおける
活性を１００とした相対活性で表し第１２図に示した。
実施例１１
（クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活性に及
ぼすルブロールＰＸの影響）標準反応条件においてルブ
ローノ叶Ｘ濃度のみを変化させてＢｅｎｚ −Ｉ及びＢ
ｅｎｚ −ＩＩの活性を測定した。最大活性を１００と
した相対活性で各ルブロール濃度における活性を表し第
１３図に示した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活性に及
ぼすルブロールＰＸの影響）標準反応条件においてルブ
ローノ叶Ｘ濃度のみを変化させてＢｅｎｚ −Ｉ及びＢ
ｅｎｚ −ＩＩの活性を測定した。最大活性を１００と
した相対活性で各ルブロール濃度における活性を表し第
１３図に示した。
実施例１２
（クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９０３から
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの分子量） ３ま た活性画分を回収し、その比活性を測定しクロマト前の
比活性とともに第６表に示した。
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの分子量） ３ま た活性画分を回収し、その比活性を測定しクロマト前の
比活性とともに第６表に示した。
実施例１４
（部分精製した酵素の基質特異性）
実施例１３において精製した酵素を用いて、ＢｏｃＧｉ
ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、 Ｂｏｃ−１１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ。
ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、 Ｂｏｃ−１１ｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ。
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−ＭＣＡに対する相対活性を測
定し、第７表に示した。尚、活性の測定は、各基質を１
００μＭ含有する標準反応条件を用いて行い、ＢｏｃＧ
ｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する活性を１００
とした相対活性で表した。
定し、第７表に示した。尚、活性の測定は、各基質を１
００μＭ含有する標準反応条件を用いて行い、ＢｏｃＧ
ｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する活性を１００
とした相対活性で表した。
第
表
部分精製酵素の基質特異性
ＡはＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを、Ｂは
Ｂｏｃ−Ｉ Ｉｅ−ＧｌｕＧｌｙ−八ｒｇ−ＭＣＡをＣ
はＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを表している。
Ｂｏｃ−Ｉ Ｉｅ−ＧｌｕＧｌｙ−八ｒｇ−ＭＣＡをＣ
はＰｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを表している。
第１図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＰＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＤＥＡＥ−）ヨパールのクロマトグラム
である。 第２図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＣｏｎ Ａ−セファロースクロマトグラ
ムである。 第３図は、クライベロマイセス・ラクティスブリットン
・アンド・ロビンソン緩衝液における至適ｐ＋を表した
図である。 第９図はＢｅｎｚ −ＩのｐＨ安定性を表した図である
。 第１０図は［１ｅｎｚ−Ｉの至適温度を表した図である
。 第１１図はＢｅｎｚ −Ｉの熱安定性を表した図である
。 第１２図はＢｅｎｚ −Ｉ及びＢｅｎｚ −ＩＩの遊離
の塩化カルシウム濃度の活性に対する影響を表した図で
ある。 第１３図はＢｅｎｚ −Ｉ及び３ｅｎｚ −ｎの活性に
及ぼすルブロールＰＸ濃度の影響を表した図である。 第１４図はロドスボリジウム、トルロイデスＩＦＯ０４
１３の膜抽出液のモノ０におけるクロマトグラムである
。 第１５図は、バンゼヌラ・ホルスティＩＦ００９８０の
膜抽出液のモノＱにおけるクロマトグラムである。 出願人代理人 古 谷 馨 ＩＦＯ１９０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロ
テアーゼの精製時におけるアルギニン−セファロースの
クロマトグラムである。 第４図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＭｏｎｏ Ｑのクロマトグラムである。 第５図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＭｏｎｏΩ−１のベンズアミジン−セフ
ァロースのクロマトグラムである。 第６図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＭｏｎｏ Ｑ −■のベンズアミジン−
セファロースのクロマトグラムである。 第７図はＢｅｎｚ −工及びＢｅｎｚ −Ｉ［のトリス
−塩酸緩衝液における至適ｐＨを表した図である。 第８図はＢｅｎｚ −Ｉのトリス−塩酸緩衝液及び第 図 ６．０ ８．０ １０．０ Ｈ 第 図 ４．０ ６．０ ８．０ １０．０ Ｈ 第 図 温 度（℃） 第 図 工Ｅ−９ ＩＥ−７ＩＥ−５工Ｅ−３ 遊離の塩化カルシウム濃度
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＤＥＡＥ−）ヨパールのクロマトグラム
である。 第２図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＣｏｎ Ａ−セファロースクロマトグラ
ムである。 第３図は、クライベロマイセス・ラクティスブリットン
・アンド・ロビンソン緩衝液における至適ｐ＋を表した
図である。 第９図はＢｅｎｚ −ＩのｐＨ安定性を表した図である
。 第１０図は［１ｅｎｚ−Ｉの至適温度を表した図である
。 第１１図はＢｅｎｚ −Ｉの熱安定性を表した図である
。 第１２図はＢｅｎｚ −Ｉ及びＢｅｎｚ −ＩＩの遊離
の塩化カルシウム濃度の活性に対する影響を表した図で
ある。 第１３図はＢｅｎｚ −Ｉ及び３ｅｎｚ −ｎの活性に
及ぼすルブロールＰＸ濃度の影響を表した図である。 第１４図はロドスボリジウム、トルロイデスＩＦＯ０４
１３の膜抽出液のモノ０におけるクロマトグラムである
。 第１５図は、バンゼヌラ・ホルスティＩＦ００９８０の
膜抽出液のモノＱにおけるクロマトグラムである。 出願人代理人 古 谷 馨 ＩＦＯ１９０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロ
テアーゼの精製時におけるアルギニン−セファロースの
クロマトグラムである。 第４図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＭｏｎｏ Ｑのクロマトグラムである。 第５図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＭｏｎｏΩ−１のベンズアミジン−セフ
ァロースのクロマトグラムである。 第６図は、クライベロマイセス・ラクティスＩＦＯ１９
０３からの塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
精製時におけるＭｏｎｏ Ｑ −■のベンズアミジン−
セファロースのクロマトグラムである。 第７図はＢｅｎｚ −工及びＢｅｎｚ −Ｉ［のトリス
−塩酸緩衝液における至適ｐＨを表した図である。 第８図はＢｅｎｚ −Ｉのトリス−塩酸緩衝液及び第 図 ６．０ ８．０ １０．０ Ｈ 第 図 ４．０ ６．０ ８．０ １０．０ Ｈ 第 図 温 度（℃） 第 図 工Ｅ−９ ＩＥ−７ＩＥ−５工Ｅ−３ 遊離の塩化カルシウム濃度
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の１〜５に示す理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。 ［１］作用及び基質特異性 Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有するあるい
は有しないＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＰｒｏ、ＹはＡｒｇ、−
はペプチド結合を示す。）で示される化合物のＹのＣ末
端側のペプチド結合 を特によく加水分解する。 ［２］至適ｐＨ：トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．０付近 ［３］ｐＨ安定性：ｐＨ６〜１０で最も安定。 ［４］至適温度：６０℃付近（ｐＨ７．０）［５］熱安
定性：５５℃以下で安定（ｐＨ７．０、１０分間） ２ クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
）属、フィロバジジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）
属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、イサチエン
キア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃ
ｈｉａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉ
ｄｉｕｍ）属、又はサッカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属に属する酵母を培養し、その
培養物から得られる下記［１］に示す性質を有するプロ
テアーゼ。 ［１］作用及び基質特異性 Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有するあるい
は有しないＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＰｒｏ、ＹはＡｒｇ、−
はペプチド結合を示す。）で示される化合物のＹのＣ末
端側のペプチド結合 を特によく加水分解する。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63201285A JPH0249585A (ja) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | 新規なプロテアーゼ |
| EP89101200A EP0336056B1 (en) | 1988-01-27 | 1989-01-24 | Protease |
| DE68922014T DE68922014T2 (de) | 1988-01-27 | 1989-01-24 | Protease. |
| US07/301,988 US5053333A (en) | 1988-01-27 | 1989-01-26 | Protease |
| CA000589189A CA1318872C (en) | 1988-01-27 | 1989-01-26 | Protease |
| KR1019890000900A KR930005454B1 (ko) | 1988-01-27 | 1989-01-27 | 포로테아제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63201285A JPH0249585A (ja) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | 新規なプロテアーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0249585A true JPH0249585A (ja) | 1990-02-19 |
| JPH0578306B2 JPH0578306B2 (ja) | 1993-10-28 |
Family
ID=16438439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63201285A Granted JPH0249585A (ja) | 1988-01-27 | 1988-08-12 | 新規なプロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0249585A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04148694A (ja) * | 1990-10-09 | 1992-05-21 | M D Res Kk | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
-
1988
- 1988-08-12 JP JP63201285A patent/JPH0249585A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04148694A (ja) * | 1990-10-09 | 1992-05-21 | M D Res Kk | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0578306B2 (ja) | 1993-10-28 |
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