JPS5934885A - 耐熱性アルカリ金属プロテア−ゼ及びその製造法 - Google Patents
耐熱性アルカリ金属プロテア−ゼ及びその製造法Info
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- JPS5934885A JPS5934885A JP14556482A JP14556482A JPS5934885A JP S5934885 A JPS5934885 A JP S5934885A JP 14556482 A JP14556482 A JP 14556482A JP 14556482 A JP14556482 A JP 14556482A JP S5934885 A JPS5934885 A JP S5934885A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
Ａ・発１ｊ、ｌｌ ）−１：、食菌から得らノＬるアル
カリ金檎プロブアーゼ及びその製造法に関し、更に詳し
くは、真正旬子菌の一種で、サルノコシカケ科マイタケ
属に属゛するマイタケ［Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏ
ｓａ（Ｆｒ、 ）Ｓ、 Ｆ、 （Ｊｒａｙ 〕の子実体
又はその培養菌体から抽出して得られるアルカリ金属プ
ロテアーゼに関するものである。
カリ金檎プロブアーゼ及びその製造法に関し、更に詳し
くは、真正旬子菌の一種で、サルノコシカケ科マイタケ
属に属゛するマイタケ［Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏ
ｓａ（Ｆｒ、 ）Ｓ、 Ｆ、 （Ｊｒａｙ 〕の子実体
又はその培養菌体から抽出して得られるアルカリ金属プ
ロテアーゼに関するものである。
従来、触媒作用を発現するために亜鉛を必須成分とする
金属プロテアーゼとしては、微生物では、枯信菌、バチ
ルス・ズブチリス（ＢａｃｉｌＪｕｓ ５ｕｂ−を目ｉ
ｓ）、 バチルス・テルモブロテオリチヮス（Ｒａｃ
目ＪＬＩＳ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｅｕｓ
）などの培養液中の中性金属プロテアーゼ、コウジ菌
、アスペルの培地から得られる二種の中性金属プロテア
ーゼ、る低分子の中性金属プロプアーゼがあシ、捷た動
物では、ハブ、マムシ、ガラガラへビの蛇毒成分である
アルカリ金属プロテアーゼとウサギの腎臓やウシの下垂
体から得られる中性金属プロテアーゼが知られている。
金属プロテアーゼとしては、微生物では、枯信菌、バチ
ルス・ズブチリス（ＢａｃｉｌＪｕｓ ５ｕｂ−を目ｉ
ｓ）、 バチルス・テルモブロテオリチヮス（Ｒａｃ
目ＪＬＩＳ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｅｕｓ
）などの培養液中の中性金属プロテアーゼ、コウジ菌
、アスペルの培地から得られる二種の中性金属プロテア
ーゼ、る低分子の中性金属プロプアーゼがあシ、捷た動
物では、ハブ、マムシ、ガラガラへビの蛇毒成分である
アルカリ金属プロテアーゼとウサギの腎臓やウシの下垂
体から得られる中性金属プロテアーゼが知られている。
これら金属プロテアーゼには０子険１４．０（１０〜９
０，０００の範囲で多種類のものかあシ、亜鉛原子以外
にカルシウム原子を含むものもある。多くの中性金属プ
ロテアーゼは至適ｐ１４が６〜７め範囲間あるが、蛇毒
のアルカリ金属プロテアーゼにあっては、その至適ｐＨ
が８〜９の弱アルカリ側にある。また、とれらの中性及
びアルカリ金属プロテアーゼは、ナラタケ子実体の中性
金属プロテアーゼがＮ末端側にリジン残基を有するペプ
チド結合、−Ｘ −ＣＯ−ＮＨ−Ｌｙｓ−を優先的に分
解する特異性を示す以外に、Ｎ末端側のアミノ酸がロイ
シン、フェニルアラニンあるいはバＩＪ ｙであるペプ
チド結合、−Ｘ −ＣＯ−Ｎ）ｌ −Ｌｅｕ−１−Ｘ−
ＣＯ−ＮＨ−Ｐｈｅ−１−Ｘ−ＣＯ−ＮＪＩ−Ｖａｌ−
を主に分解する特異性もあることが知られている（Ｘは
アミノ酸残基を表わす）。
０，０００の範囲で多種類のものかあシ、亜鉛原子以外
にカルシウム原子を含むものもある。多くの中性金属プ
ロテアーゼは至適ｐ１４が６〜７め範囲間あるが、蛇毒
のアルカリ金属プロテアーゼにあっては、その至適ｐＨ
が８〜９の弱アルカリ側にある。また、とれらの中性及
びアルカリ金属プロテアーゼは、ナラタケ子実体の中性
金属プロテアーゼがＮ末端側にリジン残基を有するペプ
チド結合、−Ｘ −ＣＯ−ＮＨ−Ｌｙｓ−を優先的に分
解する特異性を示す以外に、Ｎ末端側のアミノ酸がロイ
シン、フェニルアラニンあるいはバＩＪ ｙであるペプ
チド結合、−Ｘ −ＣＯ−Ｎ）ｌ −Ｌｅｕ−１−Ｘ−
ＣＯ−ＮＨ−Ｐｈｅ−１−Ｘ−ＣＯ−ＮＪＩ−Ｖａｌ−
を主に分解する特異性もあることが知られている（Ｘは
アミノ酸残基を表わす）。
本発明の目的は、従来の研究によって明らかにされた細
菌、糸状菌、蛇毒又は晴乳動物の臓器由来の中性又はア
ルカリ金属フロテア〜ゼと比べて、その性質及び特異性
を異にする新規な耐熱性アルカリ金属プロテアーゼを提
供することである。
菌、糸状菌、蛇毒又は晴乳動物の臓器由来の中性又はア
ルカリ金属フロテア〜ゼと比べて、その性質及び特異性
を異にする新規な耐熱性アルカリ金属プロテアーゼを提
供することである。
本発明者らは、マイタケ子実体の抽出液に含号れるタン
パク分解酵素を総合的に研究した結果、分子所が２２，
０００で、タンパク１分子当りに１原子の亜鉛を含有し
、カゼイン又はアゾコールの分解に対する至適ｐＨが９
〜１０にあり、ロイシン、フェニルアラニン、バリン及
びリジン残基のＮ末端側のペプチド結合を特異的に加水
分解するエンドベグヂターゼ活性を示すアルカリ金屑プ
ロプアーゼを見出し、本発明を完成するに至った。
パク分解酵素を総合的に研究した結果、分子所が２２，
０００で、タンパク１分子当りに１原子の亜鉛を含有し
、カゼイン又はアゾコールの分解に対する至適ｐＨが９
〜１０にあり、ロイシン、フェニルアラニン、バリン及
びリジン残基のＮ末端側のペプチド結合を特異的に加水
分解するエンドベグヂターゼ活性を示すアルカリ金屑プ
ロプアーゼを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の耐熱性金属プロテアーゼは、次の酵素化
学的性質を有するものである。
学的性質を有するものである。
分子肴：約２２，０００（ゲルろ過性、８ ｉＪ Ｓゲ
ル電気泳動法） 約２１．．３０ （１（アミノ酸分析）安定なｐＨの範
囲＝３〜１ （１（４℃に２４時間保つたときの活性残
存率１００係の ｐＨ岬囲） 温度安定性＝６０℃（ｐＨ７，（１で６０分間熱処理し
た際の活性残存率１００チの温度） ７（Ｉｃ（ｐＨ７，０で６０分間熱処理した際の活性残
存率７０チのｆＡ度） 作用至適ｐ）Ｉ ： ９〜１（）（基）碓：カゼイン、
アゾコール、アルブミン） 作用至適温度： ７ （１℃（アゾカゼインを基質とし
て用い、ｐＨ９で１０分間反応した ときの温度） 等電点ニア、５ 含有金属：タンパク１分子当シ亜鉛１原子賦活剤二特に
必要とし寿い 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート（Ｆ）ＤＴ
Ａ）、１．１０−フェナントロリン、α、α′−ジピリ
ジル、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール
、グルタチオン（還元型）。
ル電気泳動法） 約２１．．３０ （１（アミノ酸分析）安定なｐＨの範
囲＝３〜１ （１（４℃に２４時間保つたときの活性残
存率１００係の ｐＨ岬囲） 温度安定性＝６０℃（ｐＨ７，（１で６０分間熱処理し
た際の活性残存率１００チの温度） ７（Ｉｃ（ｐＨ７，０で６０分間熱処理した際の活性残
存率７０チのｆＡ度） 作用至適ｐ）Ｉ ： ９〜１（）（基）碓：カゼイン、
アゾコール、アルブミン） 作用至適温度： ７ （１℃（アゾカゼインを基質とし
て用い、ｐＨ９で１０分間反応した ときの温度） 等電点ニア、５ 含有金属：タンパク１分子当シ亜鉛１原子賦活剤二特に
必要とし寿い 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート（Ｆ）ＤＴ
Ａ）、１．１０−フェナントロリン、α、α′−ジピリ
ジル、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール
、グルタチオン（還元型）。
ＥＤＴＡによる阻害は、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋ 又はＣＯ
２＋を添加すると活性が回復する。
２＋を添加すると活性が回復する。
ｘ 質ｔｐ、ｌｌ′異性：カゼイン、アゾカセイン、ア
ゾコール、コンゴーレッドエラスチン、ア ルブミン、インシュリン、ポリリジ ン々とのタンパク質又はペプチドに オケルロイシン、フェニルアラニン、 パーリン及びリジン残基のＮ末端側ペ プチド結合を特異的に加水分解す２・。
ゾコール、コンゴーレッドエラスチン、ア ルブミン、インシュリン、ポリリジ ン々とのタンパク質又はペプチドに オケルロイシン、フェニルアラニン、 パーリン及びリジン残基のＮ末端側ペ プチド結合を特異的に加水分解す２・。
捷な、イの製造法は、マイタケ子実体又はその菌体から
ｐＨ３〜１０の塩溶液を用いて抽出を省ない、得られた
抽出液を精製することを特徴とする。
ｐＨ３〜１０の塩溶液を用いて抽出を省ない、得られた
抽出液を精製することを特徴とする。
、＋、発明において用いるマイタケは自家て、酵母エキ
ス、麦芽エキス、ブドウ糖を含む通常の培地（ｐＨ４５
〜６）を用いて２０〜２５℃で培養したマイタケの菌体
を用いてもよいが、市販されている子実体を用いてもよ
い。
ス、麦芽エキス、ブドウ糖を含む通常の培地（ｐＨ４５
〜６）を用いて２０〜２５℃で培養したマイタケの菌体
を用いてもよいが、市販されている子実体を用いてもよ
い。
以下、詳細に本発明７０テアーゼの製造法について述べ
る。まず、マイタケ子実体を細断したもの、寸たけ培養
して得た菌体から中性塩溶液とともに１ブレンターで処
理した後、直ちに遠心分離して抽出液を得る。抽出に用
いる溶液のｐＨの範囲は３〜１０でよく、また塩濃度は
０．０５Ｍから０．５Ｍの範囲である。これらの処理及
び以後の処理は、４℃以下の低温で実施することか望ま
しい。
る。まず、マイタケ子実体を細断したもの、寸たけ培養
して得た菌体から中性塩溶液とともに１ブレンターで処
理した後、直ちに遠心分離して抽出液を得る。抽出に用
いる溶液のｐＨの範囲は３〜１０でよく、また塩濃度は
０．０５Ｍから０．５Ｍの範囲である。これらの処理及
び以後の処理は、４℃以下の低温で実施することか望ま
しい。
このようにして得られた抽出液に硫酸アンモニウムを加
え、３（）チ飽和で生じた沈殿を除去し、更に硫酸アン
モニウムを加えて、８０％飽和で生じた沈殿を分取する
。
え、３（）チ飽和で生じた沈殿を除去し、更に硫酸アン
モニウムを加えて、８０％飽和で生じた沈殿を分取する
。
次に、得られた沈殿を溶解し、透析あるいはセファデッ
クスＧ−２５（商品名）等のゲルろ過剤のカラムを用い
て、硫酸アンモニウムを除去するとともに、ｐＨを５に
調整した後、陽イオン交換体、例えばカルボキシメチル
セルロースのカラムに負荷し、カラムの緩衝化に用いた
ｐＨ５の溶離液（緩衝液）中の中性塩の濃度を直線的に
高めながら溶出を行々つで、溶出液へ中にアルカリ金属
プロテアーゼ画分を得る。この場合、中性塩の濃度を段
階的に高めて、特定の中性塩濃度で酵素を集中的に溶出
する方法も有効である。との両分の中性塩を除いた後、
再度、同様にしてＳＰ−セファデックス（商品名）をＪ
ｆｉいて処理する。溶離液（緩衝液）のｐＨは弱酸性で
あればよいが、その濃度は５０ｍＭ以下であることが望
ましい。添加して酵素の溶出に用いる中性塩は特に制約
されるものでｔｌＪないが、堪能ナトリウム又は塩化力
′リウムが適当である。
クスＧ−２５（商品名）等のゲルろ過剤のカラムを用い
て、硫酸アンモニウムを除去するとともに、ｐＨを５に
調整した後、陽イオン交換体、例えばカルボキシメチル
セルロースのカラムに負荷し、カラムの緩衝化に用いた
ｐＨ５の溶離液（緩衝液）中の中性塩の濃度を直線的に
高めながら溶出を行々つで、溶出液へ中にアルカリ金属
プロテアーゼ画分を得る。この場合、中性塩の濃度を段
階的に高めて、特定の中性塩濃度で酵素を集中的に溶出
する方法も有効である。との両分の中性塩を除いた後、
再度、同様にしてＳＰ−セファデックス（商品名）をＪ
ｆｉいて処理する。溶離液（緩衝液）のｐＨは弱酸性で
あればよいが、その濃度は５０ｍＭ以下であることが望
ましい。添加して酵素の溶出に用いる中性塩は特に制約
されるものでｔｌＪないが、堪能ナトリウム又は塩化力
′リウムが適当である。
溶出に際して、中性塩の濃度は０から１．０Ｍまで直線
的に高められるか、又は帆３Ｍ、０．５Ｍ更に０．７Ｍ
と段階的に高められる。
的に高められるか、又は帆３Ｍ、０．５Ｍ更に０．７Ｍ
と段階的に高められる。
次いで、イオン交換クロマトグラフィーで得られた両分
についてゲルろ過を行ない、虞に精製を進める。この精
製段階に用いるゲルろ過剤としては、セファデックスＧ
−１００（商品名）あるいはセルロファインＧＣ−２０
０−ｍ（ＦＥＢ品名）が適当である。ゲルろ過は５０ｍ
Ｍ以下の濃度で中性の溶離液を用いるが、０．５Ｍ以下
の中性塩が存在していることが望ましい。
についてゲルろ過を行ない、虞に精製を進める。この精
製段階に用いるゲルろ過剤としては、セファデックスＧ
−１００（商品名）あるいはセルロファインＧＣ−２０
０−ｍ（ＦＥＢ品名）が適当である。ゲルろ過は５０ｍ
Ｍ以下の濃度で中性の溶離液を用いるが、０．５Ｍ以下
の中性塩が存在していることが望ましい。
ゲルろ堝後、溶出したアルカリ金属プロテアーゼの両分
を集め、脱塩濃縮して精製標品を得る。
を集め、脱塩濃縮して精製標品を得る。
上記の精製過程で、マイタケのアルカリ金属プロテアー
ゼは６０係の高収計で２３０倍に精製することができる
。
ゼは６０係の高収計で２３０倍に精製することができる
。
以上のように、本発明のアルカリ金属プロテアーゼは、
マイタケ子実体又は菌糸に大量に存在し、容易に抽出す
ることが可能であり、硫酸アンモニウムによる分別、カ
ルボキシメチルセルロースやＳｒ−セファデックスなど
の陽イオン交換体によるカラムクロマトグラフィー及び
セファデックスｏ−ｔｏｏなどのゲルろ過剤によるゲル
ろ過にょシ畠い収量で純粋な酵素タンパク質Ｖｃ１で精
製することが可能である。
マイタケ子実体又は菌糸に大量に存在し、容易に抽出す
ることが可能であり、硫酸アンモニウムによる分別、カ
ルボキシメチルセルロースやＳｒ−セファデックスなど
の陽イオン交換体によるカラムクロマトグラフィー及び
セファデックスｏ−ｔｏｏなどのゲルろ過剤によるゲル
ろ過にょシ畠い収量で純粋な酵素タンパク質Ｖｃ１で精
製することが可能である。
マイタケのアルカリ金属プロテアーゼの動機及び従来報
告されている唾鉛含有金属プロテアーゼとの間の性質及
び特異性等における相違は、次の通シである。
告されている唾鉛含有金属プロテアーゼとの間の性質及
び特異性等における相違は、次の通シである。
１ マイタケのアルカリ金属プロテアーゼの分子ｉ・ｔ
よ約２２．０ （１０で、枯草菌の中性金属プロテアー
ゼ（分子１１ ： ４０，０００ ） 、コウジキンの
二種の細胞外中性金繞プロテアーゼ（分子量：１７，０
００及び４２．．０００）、ナラタケ子実体中性金属プ
ロテアーゼ（分子量：１３，５００）及び哺乳動物臓器
由来の中性金属プロテアーゼ（分子ｉｆ（：９Ｑ、００
０）とは明らかに異なっている。
よ約２２．０ （１０で、枯草菌の中性金属プロテアー
ゼ（分子１１ ： ４０，０００ ） 、コウジキンの
二種の細胞外中性金繞プロテアーゼ（分子量：１７，０
００及び４２．．０００）、ナラタケ子実体中性金属プ
ロテアーゼ（分子量：１３，５００）及び哺乳動物臓器
由来の中性金属プロテアーゼ（分子ｉｆ（：９Ｑ、００
０）とは明らかに異なっている。
２ マイタケのアルカリ金属プロテアーゼは、作用至適
ｐ＋１が９〜１０で、分子量が２３．０００〜２４．０
０（＋、作用至適ｐｎか８．５〜９．５である蛇毒超厚
の金属プロテアーゼと分子ＩＩ°、作用至適ｐ！（及び
基質特異性において類似しているが、 ｐＨ安定性（蛇
毒の酵素： ｐＨ５〜１．０ ）及び熱安定性（ｐＨ１
３，５，６０℃、５分間熱処理で完全に失活）で比べる
と、明らかに異なっている。
ｐ＋１が９〜１０で、分子量が２３．０００〜２４．０
０（＋、作用至適ｐｎか８．５〜９．５である蛇毒超厚
の金属プロテアーゼと分子ＩＩ°、作用至適ｐ！（及び
基質特異性において類似しているが、 ｐＨ安定性（蛇
毒の酵素： ｐＨ５〜１．０ ）及び熱安定性（ｐＨ１
３，５，６０℃、５分間熱処理で完全に失活）で比べる
と、明らかに異なっている。
３ マイタケ゛のアルカリ金属プロテアーゼが示す極め
て高い熱安定性は枯草菌、特にＢａｃｉＩｌｕｓｔｂｃ
ｒｍｎｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｅｕｓの中性金属プロテア
ーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｌｎ に匹敵するものてあ
シ、本酵素の顕將な性儒となっている。
て高い熱安定性は枯草菌、特にＢａｃｉＩｌｕｓｔｂｃ
ｒｍｎｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｅｕｓの中性金属プロテア
ーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｌｎ に匹敵するものてあ
シ、本酵素の顕將な性儒となっている。
マイタケの細胞内アルカリ金属プロテアーゼは、安定な
性質及び限定された特異性を利用して、７０℃までの種
々の温度及びｐＨ５〜１０寸での広い範囲のｐＨでタン
パク質やペプチドに作用させ、その構造の解析や修飾に
有用であるばかシでなく、生理活性を有−するタンパク
質又はペプチドなどの修飾や加工あるいは食品の処理や
安定性の増加に利用することが可能である。甘た、その
安定性を利用して不溶化した酵素を用いれば、種々の温
度及び−１でタンパク質を分解処理１°ることも可能で
ある。この際、反応はＪＯＩ） Ｔ Ａを加えて停止し
たシ・また適縦のＺｎ やＭｎ を添加することに
よシ再び開始できる利点がある。
性質及び限定された特異性を利用して、７０℃までの種
々の温度及びｐＨ５〜１０寸での広い範囲のｐＨでタン
パク質やペプチドに作用させ、その構造の解析や修飾に
有用であるばかシでなく、生理活性を有−するタンパク
質又はペプチドなどの修飾や加工あるいは食品の処理や
安定性の増加に利用することが可能である。甘た、その
安定性を利用して不溶化した酵素を用いれば、種々の温
度及び−１でタンパク質を分解処理１°ることも可能で
ある。この際、反応はＪＯＩ） Ｔ Ａを加えて停止し
たシ・また適縦のＺｎ やＭｎ を添加することに
よシ再び開始できる利点がある。
次に、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、
不発り１けその要旨を越え々い限り、これらによって限
定されるものではガい。
不発り１けその要旨を越え々い限り、これらによって限
定されるものではガい。
実施例
水洗した新鮮な市販のマイタケ子実体（生重歇、１５０
０り）を３倍重量の２０１ｎＭトＩＪス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）とともに、ブレンダーで破砕し、菌体からア
ルカリ金属プロテアーゼを抽出した。細胞壁等の不溶の
残渣し１．１３．（１００ｘｒ、３０分間、遠心外１’
ｌ１Ｍ して１余き上清を鳴めた。上清（約６７）に固
形硫酸アンモニウムの粉末をよく攪拌しながら除徐に加
え、３０チ飽和に１７た。４℃で３時間放置した後、生
じた沈殿を１３．（１（１０×ｆ１３０分間、遠心０離
して除いた。次いで、上清に固形のｆｌｎｅ酸アンモニ
ウムを添加し、８０チ飽和にした後、４℃で２０時間放
置した。沈殿は１３．０（ｌｏｘｆ、３０分＋１ＪＩ
、遠心分離して集め、少量の２０ｍＭ酢酸緩衝液（Ｐｉ
−１５，（１）に溶解してから、セファデックスＧ−２
５のカラム（５Ｘ３８ｃｍ）に通過させて硫酸アンモニ
ウムを除去した。プロテアーゼ活性を有する両分を集め
、予め２０ｍＭ酢酸緩衝ｉ’ｌ （ｐＩｌ ！１．０
） テ平衡化したカルボキシメチルセルロース（ワット
−ｒ７社、ＣＭ−３２）のカラム（３，５Ｘ ２５ｃ！
ｒＬ）に吸着させた。プロテアーゼの溶離は全量３１の
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ（５，０）中に溶解した塩化
カリウムの濃度をＯから１．０Ｍまで直線的に増加させ
る濃度勾配により行なった。プロテアーゼ活性画分は０
．７Ｍ〜０．８Ｍの塩化カリウムで溶出された。
０り）を３倍重量の２０１ｎＭトＩＪス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）とともに、ブレンダーで破砕し、菌体からア
ルカリ金属プロテアーゼを抽出した。細胞壁等の不溶の
残渣し１．１３．（１００ｘｒ、３０分間、遠心外１’
ｌ１Ｍ して１余き上清を鳴めた。上清（約６７）に固
形硫酸アンモニウムの粉末をよく攪拌しながら除徐に加
え、３０チ飽和に１７た。４℃で３時間放置した後、生
じた沈殿を１３．（１（１０×ｆ１３０分間、遠心０離
して除いた。次いで、上清に固形のｆｌｎｅ酸アンモニ
ウムを添加し、８０チ飽和にした後、４℃で２０時間放
置した。沈殿は１３．０（ｌｏｘｆ、３０分＋１ＪＩ
、遠心分離して集め、少量の２０ｍＭ酢酸緩衝液（Ｐｉ
−１５，（１）に溶解してから、セファデックスＧ−２
５のカラム（５Ｘ３８ｃｍ）に通過させて硫酸アンモニ
ウムを除去した。プロテアーゼ活性を有する両分を集め
、予め２０ｍＭ酢酸緩衝ｉ’ｌ （ｐＩｌ ！１．０
） テ平衡化したカルボキシメチルセルロース（ワット
−ｒ７社、ＣＭ−３２）のカラム（３，５Ｘ ２５ｃ！
ｒＬ）に吸着させた。プロテアーゼの溶離は全量３１の
２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐｌ（５，０）中に溶解した塩化
カリウムの濃度をＯから１．０Ｍまで直線的に増加させ
る濃度勾配により行なった。プロテアーゼ活性画分は０
．７Ｍ〜０．８Ｍの塩化カリウムで溶出された。
プロテアーゼ活性画分を集め、これを２ＱｒｎＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ！’ｉ、０ ）で平衡化させたセファデック
スＧ−２５のカラムを通過させて脱塩した。
衝液（ｐＨ！’ｉ、０ ）で平衡化させたセファデック
スＧ−２５のカラムを通過させて脱塩した。
なお、この段階で、カルボキシメチルセルロースのカラ
ムにアルカリ金属プロテアーゼを吸着させ、咬ず、５
（１０ｍｅの０．３Ｍ塩化カリウムを含む２０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＩｌ ５．０ ）てカラムを洗いタンパク質
を溶出させた後、０．３Ｍから１．０Ｍまでの塩化カリ
ウムの直線濃度勾配を用いてプロテアーゼを溶出する方
法、又は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＩｌ５．０）中の塩
化カリｒ７Ａ＋７）ｉ度を０．３Ｍ、０．６Ｍ。
ムにアルカリ金属プロテアーゼを吸着させ、咬ず、５
（１０ｍｅの０．３Ｍ塩化カリウムを含む２０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＩｌ ５．０ ）てカラムを洗いタンパク質
を溶出させた後、０．３Ｍから１．０Ｍまでの塩化カリ
ウムの直線濃度勾配を用いてプロテアーゼを溶出する方
法、又は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＩｌ５．０）中の塩
化カリｒ７Ａ＋７）ｉ度を０．３Ｍ、０．６Ｍ。
０．８Ｍと段階的に増加させ酵素を溶出させる方法がマ
イタケアルカリ金属プロテアーゼの分離精製に有効であ
る。
イタケアルカリ金属プロテアーゼの分離精製に有効であ
る。
次に、脱塩したプロテアーゼ画分は、２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０）で緩衝化したＳＰ−セファデックスの
カラム（２，ｏ ｘｉ ３ｃｍ ）に吸着させ、全容Ｉ
ｔ５００ｍ／の２（１ｍＭ酢酸緩衝液 （ｐｈｉ ５．
０ ）中の塩化カリウムの濃度をＯから０．８Ｍまで直
線的に増加させる濃度勾配溶出によって溶離した。プロ
テアーゼ活性は、０．４〜０．５Ｍの塩化カリウムで溶
出した。プロテアーゼ活性画分を集め、用ａｆｌｏｗメ
ンブレンＤＭ−１０を用いて限外濃縮した後、２０ｒｎ
Ｍ ト’Ｉス塩酸緩衝液（＋）Ｈ７，２）で平衡化した
セファデックスｏ−１ｏｏのカラム（２，４Ｘ１００α
）ヲ用いてゲルろ過した。このゲルろ過により、アゾカ
ゼインに対する活性溶出曲線とタンパク質の溶出曲線が
完全に一致したアルカリ金属プロテアーゼの溶出パター
ンが得られた。活性画分を集め、１］ａｆｌｏｗメンプ
レｙＤＭ−１０で限外濃縮後、凍結乾燥し、−８０℃で
凍結保存した。なお、集めた活性画分を１０ｍＭ炭酸水
素アンモニウムで平衡化したセファデックスＧ−２５カ
ラムを用いて脱塩した後、凍結乾燥してもよい。
液（ｐＨ５，０）で緩衝化したＳＰ−セファデックスの
カラム（２，ｏ ｘｉ ３ｃｍ ）に吸着させ、全容Ｉ
ｔ５００ｍ／の２（１ｍＭ酢酸緩衝液 （ｐｈｉ ５．
０ ）中の塩化カリウムの濃度をＯから０．８Ｍまで直
線的に増加させる濃度勾配溶出によって溶離した。プロ
テアーゼ活性は、０．４〜０．５Ｍの塩化カリウムで溶
出した。プロテアーゼ活性画分を集め、用ａｆｌｏｗメ
ンブレンＤＭ−１０を用いて限外濃縮した後、２０ｒｎ
Ｍ ト’Ｉス塩酸緩衝液（＋）Ｈ７，２）で平衡化した
セファデックスｏ−１ｏｏのカラム（２，４Ｘ１００α
）ヲ用いてゲルろ過した。このゲルろ過により、アゾカ
ゼインに対する活性溶出曲線とタンパク質の溶出曲線が
完全に一致したアルカリ金属プロテアーゼの溶出パター
ンが得られた。活性画分を集め、１］ａｆｌｏｗメンプ
レｙＤＭ−１０で限外濃縮後、凍結乾燥し、−８０℃で
凍結保存した。なお、集めた活性画分を１０ｍＭ炭酸水
素アンモニウムで平衡化したセファデックスＧ−２５カ
ラムを用いて脱塩した後、凍結乾燥してもよい。
上ＮＬＦの精製方法によシ、マイタケ子実体のアルカリ
金属プロテアーゼは粗抽出液から２３０倍に精製され、
イの収率け６０俤であった。
金属プロテアーゼは粗抽出液から２３０倍に精製され、
イの収率け６０俤であった。
精製した酵素の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（１０％ゲル、ｐＩ４４．３）及びＳ Ｊ） Ｓポリ
アクリルアミドスラブ電気泳動（Ｇｒａ旧ｅｎｔ Ｇｅ
１８〜１５％、又は１２．５チゲル）で精製したアルカ
リ金属プロテアーゼを検定した結果、Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅＨｒロロａｎｔ ＋３１ｕｅ染色でいずれの場合も単
一のクンバク染色バンドが検出できた。
動（１０％ゲル、ｐＩ４４．３）及びＳ Ｊ） Ｓポリ
アクリルアミドスラブ電気泳動（Ｇｒａ旧ｅｎｔ Ｇｅ
１８〜１５％、又は１２．５チゲル）で精製したアルカ
リ金属プロテアーゼを検定した結果、Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅＨｒロロａｎｔ ＋３１ｕｅ染色でいずれの場合も単
一のクンバク染色バンドが検出できた。
４６５−
Claims (2)
- （１） 次の酵素化学的性質を有する耐熱性アルカリ
金属グロテアーゼ 分子肴：約２２，０００（ゲルろ過失、Ｓ Ｉ） Ｓゲ
ルη〕、気泳動法） 約２１．．３００ （アミノ酸分析） 安定なｐＨの範１’Ｊ１１： ３〜１０（４℃に２４時
間保ったときの活性残存率１００係のｐＨ 範囲） 温度安定性二６０℃（ｐＨ７，０で６０分間熱処理した
際の活性残存率１００チの温度） ７０℃（ｐｉｆ ７．０で６０分間熱処理した際の活性
残存率７０チの温度） 作用至適ｐＨ： ９〜１０（基質：カゼイン、アゾコー
ル、アルブミン） 作ＪＴｌｆ′適温度ニア０℃（アゾカゼインを基質とし
て用い、ｐＨ９で１０分間 反応したときの温度） 等電点ニア、５ 含有金属：タンパク１分子当り亜鉛１原子賦活剤：特に
必要とし々い ｆｆ１Ｗ剤：エチレンジアミンテトラアセテ−）（ＥＤ
ＴＡ）、１．１０−フェナントロリン、α、α′−ジピ
リジル、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノー
ル、グルタチオン（還元型）。 ＥＤＴＡによる阻害は、Ｚｎ 、Ｍｎ 又はＣ０２
＋−を添加すると活性が回復する。 基質特異性：カゼイン、アゾカゼイン、アゾコール、コ
ンゴーレッドエラスチン、アルブミン、インシュリン、
ポリリジンなどのクンバク質又はペプチドにおけるロイ
シン、フェニルアラニン、バリン及ヒリシン残基のＮ末
端側ペプチド結合を特異的に加水分解する。 - （２） マイタケ子実体又はその菌体からｐａｌ ３
〜１０の塩溶液を用いて抽出を行ない、得られた抽出液
を循〜することを特徴とする耐熱性アルカリ金属プロプ
アーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14556482A JPH0244511B2 (ja) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | Tainetsuseiarukarikinzokupuroteaazeoyobisonoseizoho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14556482A JPH0244511B2 (ja) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | Tainetsuseiarukarikinzokupuroteaazeoyobisonoseizoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5934885A true JPS5934885A (ja) | 1984-02-25 |
| JPH0244511B2 JPH0244511B2 (ja) | 1990-10-04 |
Family
ID=15388047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14556482A Expired - Lifetime JPH0244511B2 (ja) | 1982-08-24 | 1982-08-24 | Tainetsuseiarukarikinzokupuroteaazeoyobisonoseizoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0244511B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63255713A (ja) * | 1987-04-13 | 1988-10-24 | Tlv Co Ltd | 減圧弁のピストン構造 |
| US20110143420A1 (en) * | 2004-11-15 | 2011-06-16 | University Of North Dakota | Kit for single oxygen atom incorporation into digested peptides |
-
1982
- 1982-08-24 JP JP14556482A patent/JPH0244511B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63255713A (ja) * | 1987-04-13 | 1988-10-24 | Tlv Co Ltd | 減圧弁のピストン構造 |
| US20110143420A1 (en) * | 2004-11-15 | 2011-06-16 | University Of North Dakota | Kit for single oxygen atom incorporation into digested peptides |
| US8669117B2 (en) | 2004-11-15 | 2014-03-11 | University Of North Dakota | Method for single oxygen atom incorporation into peptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0244511B2 (ja) | 1990-10-04 |
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