JPH0578305B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規なプロテアーゼに関し、詳しく
は、スポロボロマイセス属に属する酵母により産
生される塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアー
ゼに関するものである。 〔従来の技術〕 塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼは、
プロホルモンからのホルモンの生合成に関与して
いることが示唆され、その酵素化学的性質、生理
的機能などを明らかにし、融合蛋白質からの蛋白
質の切り出しなどに利用するための各種起源より
精製が試みられてきた。現在までに完全に精製さ
れ報告されているのは、豚脳下垂体からのプロテ
アーゼ（IRCM−Serine Protease １；J.Biol.
Chem.，261，10850（1986））、牛脳下垂体からの
プロテアーゼ（POMC−変換酵素；J.Biol.
Chem.，260，7194（1985）、J.Biol.Chem.，261，
14392（1986））、酵母からのプロテアーゼ
（PhorcesinY−１；Nature，309，558（1984））
のみであり、プロテアーゼの分類では、IRCM−
Serine Protease，Phorcesinはセリン・プロテ
アーゼに、POMC−変換酵素は、アスパルテイ
ク・プロテアーゼに分類されている。切断部位は
IRCM−Serine Protease １，POMC−変換酵素
は、連続する塩基性アミノ酸のＣ末端側を、
Phorcesin Ｙ−１は、連続する塩基性アミノ酸
残基の間を特異的に加水分解する。また、部分精
製ではあるが、サツカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）より連続する塩基
性アミノ酸残基対のＣ末端側を選択的に加水分解
するCa2+−依存性Thiol Proteaseも報告されて
いる（Biochem.Biophys.Res.Commun.，144，
807（1987））。 〔発明が解決しようとする課題〕 プロテアーゼを融合蛋白質からの蛋白質の合成
に利用する場合、該プロテアーゼは連続する塩基
性アミノ酸残基のＣ末端側を特異的に切断するも
のであることが望ましく、この様なプロテアーゼ
の探索が期待されている。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者は、上記現状に鑑み、大量に調製でき
ることから、その起源として酵母を選択し、酵母
より上記性質を有するプロテアーゼの探索を行
い、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属
に属する酵母がこの様な性質を有するプロテアー
ゼを生産することを見出し、このプロテアーゼを
精製しその理化学的性質を明らかにし本発明を完
成した。 即ち、本発明は次の〜に示す理化学的性質
を有するプロテアーゼを提供するものである。 作用および基質特異性 Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有す
るあるいは有しないArg，Lys又はPro，Ｙは
Arg，−はペプチド結合を示す。）で示される化合
物のＹのＣ末端側のペプチド結合を特によく加水
分解する。 至適PH：トリス−塩酸緩衝液PH7.0付近。 PH安定性： PH6.0〜8.0で最も安定（PH６〜８で30℃，30分
の処理後にも80％以上の残存活性を有する）。 至適温度：40〜47℃付近（PH7.0）。 熱安定性： 38℃以下で安定（PH7.0，10分間の熱処理で活
性の低下がない）。 本発明のプロテアーゼの上記以外の理化学的性
質、および酵素学的性質は以下の通りである。 活性化剤： 塩化カルシウムにより活性化される。特に低濃
度の塩化カルシウムにより最も活性化される。ま
た、ルブロールPX（Lubrol PX）やトリトンＸ
−100（TritonX−100）などの界面活性剤により
活性化される。 阻害剤： エチレンジアミン４酢酸（以下EDTAと略
す）、エチレングルコールビス（２−アミノエチ
ルエーテル）４酢酸（以下EGTAと略す）など
の金属キレーターや、硫酸銅、塩化亜鉛、塩化水
銀などの重金属により阻害される。また、パラク
ロロ水銀安息香酸（以下ｐ−CMBと略す）やパ
ラアミジノフエニルメタンスルフオニルフルオリ
ド（以下ｐ−APMSFと略す）によつても阻害さ
れる。 分子量： TSK gel G3000 SWXLによるゲル濾過で約5.6
万、またSDS−PAGEで約4.7万 等電点：等電点電気泳動により4.5 尚、本発明において、プロテアーゼの活性は以
下に示す方法により行つた。 活性測定法： トリス−塩酸緩衝液PH7.0 50μmol、ルブロー
ルPX 10mg、塩化カルシウム0.5μmol、Boc−
Gln−Arg−Arg−MCA｛Bocは、ｔ−ブトキシ
カルボニル（ｔ−Butoxycarbonyl）基の略、
MCAは４−メチルクマリン−７−アミド（４−
Methy1−coumarin−７−amide）の略｝
0.1μmolおよび酵素を含有する反応液中で30℃で
反応させ、生成する７−アミノ−４−メチルクマ
リン（７−Amino−４−methylcoumarin；以下
AMCと略す）に由来する螢光（励起波長380nm，
発光波長460nm）を経時的に測定した。1Uは１
分間に1nomlのAMCの遊離を触媒する酵素量と
した。以下、この測定条件を標準反応条件とす
る。 本発明において使用する微生物は、塩基性アミ
ノ酸残基対特異的プロテアーゼを生産することが
できるスポロボロマイセス属に属する全ての菌
株、突然変異株、変種を含む。それらのうち好ま
しい菌株は、スポロボロマイセス・オドラス
（Sporobolomyces odrus）IFO 1597である。 本発明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼは、例えば、スポロボロマイセス属に属する
塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼ生産能
を有する菌株をYM培地などの通常の培地で培養
することにより、培養物から取得することができ
る。培養液中に特に誘導物質は必要としない。ま
た、培養温度は25〜30℃が好ましく、培養時間
は、１日から３日程度が好ましい。 生産された塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼの精製は、通常の方法を組み合わせること
によつて行われる。例えば、培養物を遠心分離し
て菌体を回収し、ダイノーミルなどにより菌体を
破砕し、破砕液を低速で遠心分離することにより
菌体残渣などを分離し、得られた上清を超遠心分
離（例えば105000g，60分）することにより膜画
分を調製する。この膜画分より界面活性剤によつ
て酵素を可溶化し、可溶化した酵素は、硫安分
画、熱処理、イオン交換クロマトグラフイー、ア
フイニテイークロマトグラフイー、ゲル濾過など
によつて精製される。 〔実施例〕 以下、実施例により本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
スポロボロマイセス・オドラスIFO 1597からの
精製） スポロボロマイセス・オドラスIFO 1597を
YM培地（グルコース10g、バクト−ペプトン5g、
酵母エキス3g、麦芽エキス3g／）33中で２
日培養し、培養液を遠心分離して265g（湿重量）
の菌体を回収した。この菌体を300mlの緩衝液１
（10mMトリス−塩酸PH7.0，0.5mM CaCl2）に懸
濁しダイノーミルで菌体を破砕し、破砕液を
1000g、10分間の遠心分離により菌体残渣を除去
し、得られた上清を105000g、60分の超遠心分離
により沈殿として膜画分を調製した。この膜画分
を60mlの抽出用緩衝液（10mM トリス−塩酸PH
7.0，0.5mM CaCl2，１％ルブロールPX，0.1M
NaCl）に懸濁し一晩攪拌して酵素を抽出した。
上記条件で超遠心分離し上清として膜抽出液を得
た。 この膜抽出液に硫安を30％飽和になるまで添加
し、6000g、20分の遠心分離により上清を得、こ
の上清に更に硫安を70％飽和になるまで添加し、
6000g、20分の遠心分離により沈殿画分を30％−
70％硫安画分として回収した。 この沈殿を少量の緩衝液２（10mMトリス−塩
酸，0.5mM CaCl2，0.2％ルブロールPX）PH8.0
に溶解し、同緩衝液に透析したあと50℃10分間の
熱処理を行つた。生じた沈殿を39000g、20分の
遠心分離により除去した熱処理画分とした。 この画分を緩衝液２（PH8.0）で予め平衡化した
DEAE−Toyopearl 650M （東ソー(株)製）（2.5
×45cm）に注入し、充分同緩衝液で洗浄してから
０から1M NaClの勾配溶出法により酵素を溶出
し活性画分を得た。この時の溶出パターンを第１
図に示した。 活性画分を限外濾過により濃縮した後、緩衝液
２（PH7.0）に透析し同緩衝液で予め平衡化した
Arginine−Sepharose（フアルマシア社製）（2.5
×10cm）に注入した。カラムを同緩衝液で充分に
洗浄した後、０から0.5M NaClの勾配溶出法で
溶出した。この溶出パターンを第２図に示した。
活性画分を濃縮しArg−Sepharose画分とした。 Arg−Sepharose画分を0.5M NaClを含む緩衝
液２（PH7.0）で平衡化したCon Ａ−Sepharose
（フアルマシア社製）（1.6×25cm）に注入した。
充分に同緩衝液で洗浄した後、0.5M NaCl，
0.5Mα−、メチル−Ｄ−マンノサイド（α−
Methyl−Ｄ−mannoside）を含む緩衝液２（PH
7.0）で溶出した。活性画分を濃縮しCon Ａ−
Sepharose画分とした。 Con Ａ−Sepharose画分を緩衝液１（PH7.0）に
透析し、同緩衝液で平衡化したMono Ｑ（フアル
マシア社製）に注入し、０から0.6M NaClの勾
配溶出法で溶出した。活性画分を濃縮しMono
Ｑ画分とした。 Mono Ｑ画分を緩衝液１（PH7.0）で平衡化した
Superose 12（フアルマシア社製）でゲル濾過し
活性画分を得、これを濃縮しSuperose 12画分と
した。この精製酵素は、ゲル濾過およびSDS−
PAGEでともに均一であつた。 精製の要約を第１表に示した。
は、スポロボロマイセス属に属する酵母により産
生される塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアー
ゼに関するものである。 〔従来の技術〕 塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼは、
プロホルモンからのホルモンの生合成に関与して
いることが示唆され、その酵素化学的性質、生理
的機能などを明らかにし、融合蛋白質からの蛋白
質の切り出しなどに利用するための各種起源より
精製が試みられてきた。現在までに完全に精製さ
れ報告されているのは、豚脳下垂体からのプロテ
アーゼ（IRCM−Serine Protease １；J.Biol.
Chem.，261，10850（1986））、牛脳下垂体からの
プロテアーゼ（POMC−変換酵素；J.Biol.
Chem.，260，7194（1985）、J.Biol.Chem.，261，
14392（1986））、酵母からのプロテアーゼ
（PhorcesinY−１；Nature，309，558（1984））
のみであり、プロテアーゼの分類では、IRCM−
Serine Protease，Phorcesinはセリン・プロテ
アーゼに、POMC−変換酵素は、アスパルテイ
ク・プロテアーゼに分類されている。切断部位は
IRCM−Serine Protease １，POMC−変換酵素
は、連続する塩基性アミノ酸のＣ末端側を、
Phorcesin Ｙ−１は、連続する塩基性アミノ酸
残基の間を特異的に加水分解する。また、部分精
製ではあるが、サツカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）より連続する塩基
性アミノ酸残基対のＣ末端側を選択的に加水分解
するCa2+−依存性Thiol Proteaseも報告されて
いる（Biochem.Biophys.Res.Commun.，144，
807（1987））。 〔発明が解決しようとする課題〕 プロテアーゼを融合蛋白質からの蛋白質の合成
に利用する場合、該プロテアーゼは連続する塩基
性アミノ酸残基のＣ末端側を特異的に切断するも
のであることが望ましく、この様なプロテアーゼ
の探索が期待されている。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者は、上記現状に鑑み、大量に調製でき
ることから、その起源として酵母を選択し、酵母
より上記性質を有するプロテアーゼの探索を行
い、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属
に属する酵母がこの様な性質を有するプロテアー
ゼを生産することを見出し、このプロテアーゼを
精製しその理化学的性質を明らかにし本発明を完
成した。 即ち、本発明は次の〜に示す理化学的性質
を有するプロテアーゼを提供するものである。 作用および基質特異性 Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有す
るあるいは有しないArg，Lys又はPro，Ｙは
Arg，−はペプチド結合を示す。）で示される化合
物のＹのＣ末端側のペプチド結合を特によく加水
分解する。 至適PH：トリス−塩酸緩衝液PH7.0付近。 PH安定性： PH6.0〜8.0で最も安定（PH６〜８で30℃，30分
の処理後にも80％以上の残存活性を有する）。 至適温度：40〜47℃付近（PH7.0）。 熱安定性： 38℃以下で安定（PH7.0，10分間の熱処理で活
性の低下がない）。 本発明のプロテアーゼの上記以外の理化学的性
質、および酵素学的性質は以下の通りである。 活性化剤： 塩化カルシウムにより活性化される。特に低濃
度の塩化カルシウムにより最も活性化される。ま
た、ルブロールPX（Lubrol PX）やトリトンＸ
−100（TritonX−100）などの界面活性剤により
活性化される。 阻害剤： エチレンジアミン４酢酸（以下EDTAと略
す）、エチレングルコールビス（２−アミノエチ
ルエーテル）４酢酸（以下EGTAと略す）など
の金属キレーターや、硫酸銅、塩化亜鉛、塩化水
銀などの重金属により阻害される。また、パラク
ロロ水銀安息香酸（以下ｐ−CMBと略す）やパ
ラアミジノフエニルメタンスルフオニルフルオリ
ド（以下ｐ−APMSFと略す）によつても阻害さ
れる。 分子量： TSK gel G3000 SWXLによるゲル濾過で約5.6
万、またSDS−PAGEで約4.7万 等電点：等電点電気泳動により4.5 尚、本発明において、プロテアーゼの活性は以
下に示す方法により行つた。 活性測定法： トリス−塩酸緩衝液PH7.0 50μmol、ルブロー
ルPX 10mg、塩化カルシウム0.5μmol、Boc−
Gln−Arg−Arg−MCA｛Bocは、ｔ−ブトキシ
カルボニル（ｔ−Butoxycarbonyl）基の略、
MCAは４−メチルクマリン−７−アミド（４−
Methy1−coumarin−７−amide）の略｝
0.1μmolおよび酵素を含有する反応液中で30℃で
反応させ、生成する７−アミノ−４−メチルクマ
リン（７−Amino−４−methylcoumarin；以下
AMCと略す）に由来する螢光（励起波長380nm，
発光波長460nm）を経時的に測定した。1Uは１
分間に1nomlのAMCの遊離を触媒する酵素量と
した。以下、この測定条件を標準反応条件とす
る。 本発明において使用する微生物は、塩基性アミ
ノ酸残基対特異的プロテアーゼを生産することが
できるスポロボロマイセス属に属する全ての菌
株、突然変異株、変種を含む。それらのうち好ま
しい菌株は、スポロボロマイセス・オドラス
（Sporobolomyces odrus）IFO 1597である。 本発明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテア
ーゼは、例えば、スポロボロマイセス属に属する
塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼ生産能
を有する菌株をYM培地などの通常の培地で培養
することにより、培養物から取得することができ
る。培養液中に特に誘導物質は必要としない。ま
た、培養温度は25〜30℃が好ましく、培養時間
は、１日から３日程度が好ましい。 生産された塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼの精製は、通常の方法を組み合わせること
によつて行われる。例えば、培養物を遠心分離し
て菌体を回収し、ダイノーミルなどにより菌体を
破砕し、破砕液を低速で遠心分離することにより
菌体残渣などを分離し、得られた上清を超遠心分
離（例えば105000g，60分）することにより膜画
分を調製する。この膜画分より界面活性剤によつ
て酵素を可溶化し、可溶化した酵素は、硫安分
画、熱処理、イオン交換クロマトグラフイー、ア
フイニテイークロマトグラフイー、ゲル濾過など
によつて精製される。 〔実施例〕 以下、実施例により本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
スポロボロマイセス・オドラスIFO 1597からの
精製） スポロボロマイセス・オドラスIFO 1597を
YM培地（グルコース10g、バクト−ペプトン5g、
酵母エキス3g、麦芽エキス3g／）33中で２
日培養し、培養液を遠心分離して265g（湿重量）
の菌体を回収した。この菌体を300mlの緩衝液１
（10mMトリス−塩酸PH7.0，0.5mM CaCl2）に懸
濁しダイノーミルで菌体を破砕し、破砕液を
1000g、10分間の遠心分離により菌体残渣を除去
し、得られた上清を105000g、60分の超遠心分離
により沈殿として膜画分を調製した。この膜画分
を60mlの抽出用緩衝液（10mM トリス−塩酸PH
7.0，0.5mM CaCl2，１％ルブロールPX，0.1M
NaCl）に懸濁し一晩攪拌して酵素を抽出した。
上記条件で超遠心分離し上清として膜抽出液を得
た。 この膜抽出液に硫安を30％飽和になるまで添加
し、6000g、20分の遠心分離により上清を得、こ
の上清に更に硫安を70％飽和になるまで添加し、
6000g、20分の遠心分離により沈殿画分を30％−
70％硫安画分として回収した。 この沈殿を少量の緩衝液２（10mMトリス−塩
酸，0.5mM CaCl2，0.2％ルブロールPX）PH8.0
に溶解し、同緩衝液に透析したあと50℃10分間の
熱処理を行つた。生じた沈殿を39000g、20分の
遠心分離により除去した熱処理画分とした。 この画分を緩衝液２（PH8.0）で予め平衡化した
DEAE−Toyopearl 650M （東ソー(株)製）（2.5
×45cm）に注入し、充分同緩衝液で洗浄してから
０から1M NaClの勾配溶出法により酵素を溶出
し活性画分を得た。この時の溶出パターンを第１
図に示した。 活性画分を限外濾過により濃縮した後、緩衝液
２（PH7.0）に透析し同緩衝液で予め平衡化した
Arginine−Sepharose（フアルマシア社製）（2.5
×10cm）に注入した。カラムを同緩衝液で充分に
洗浄した後、０から0.5M NaClの勾配溶出法で
溶出した。この溶出パターンを第２図に示した。
活性画分を濃縮しArg−Sepharose画分とした。 Arg−Sepharose画分を0.5M NaClを含む緩衝
液２（PH7.0）で平衡化したCon Ａ−Sepharose
（フアルマシア社製）（1.6×25cm）に注入した。
充分に同緩衝液で洗浄した後、0.5M NaCl，
0.5Mα−、メチル−Ｄ−マンノサイド（α−
Methyl−Ｄ−mannoside）を含む緩衝液２（PH
7.0）で溶出した。活性画分を濃縮しCon Ａ−
Sepharose画分とした。 Con Ａ−Sepharose画分を緩衝液１（PH7.0）に
透析し、同緩衝液で平衡化したMono Ｑ（フアル
マシア社製）に注入し、０から0.6M NaClの勾
配溶出法で溶出した。活性画分を濃縮しMono
Ｑ画分とした。 Mono Ｑ画分を緩衝液１（PH7.0）で平衡化した
Superose 12（フアルマシア社製）でゲル濾過し
活性画分を得、これを濃縮しSuperose 12画分と
した。この精製酵素は、ゲル濾過およびSDS−
PAGEでともに均一であつた。 精製の要約を第１表に示した。
【表】
実施例 ２
（塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
基質特異性） 標準反応条件において螢光性基質をかえて活性
を測定し、それぞれの基質に対する活性をBoc−
Gln−Arg−Arg−MCAに対する活性を100とし
た相対活性で表し、第２表に示した。
基質特異性） 標準反応条件において螢光性基質をかえて活性
を測定し、それぞれの基質に対する活性をBoc−
Gln−Arg−Arg−MCAに対する活性を100とし
た相対活性で表し、第２表に示した。
【表】
【表】
実施例 ３
（塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
至適PH） 標準反応条件において緩衝液の種類およびPHを
変化させて活性を測定した。緩衝液としては、
50mM トリス−塩酸緩衝液 PH6.0〜9.0、
7.15mM Britton and Robinson緩衝液PH4.5〜
10.0を用い、各条件における活性をトリス−塩酸
緩衝液PH7.0における活性を100とした相対活性で
表し、第３図に示した。 実施例 ４ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
PH安定性） 11.9mM Britton and Robinson緩衝液PH４〜
11，0.2％ルブロールPX，0.5mM CaCl2中で酵
素を30℃、30分間インキユベートした後、当量の
100mMトリス−塩酸PH7.0を添加してPHを７に戻
してから標準反応条件で残存活性を測定した。各
処理後の残存活性を無処理の活性を100とした相
対活性で表し、第４図に示した。 実施例 ５ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
至適温度） 標準反応条件において反応温度のみを25〜60℃
まで変化させて活性を測定した。各温度における
活性を45℃における活性を100とした相対活性で
表し、第５図に示した。 実施例 ６ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
熱安定性） 酵素を各温度で10分間インキユベートした後、
氷水中で急冷し、残存活性を標準反応条件で測定
した。無処理の活性を100とした相対活性で各温
度における残存活性を表し、第６図に示した。 実施例 ７ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
各種阻害剤に対する挙動） 基質不在下において各種阻害剤を含む反応条件
液中で、酵素を25℃、30分間インキユベートし、
その後基質を添加して反応させた。阻害剤不在下
において同様な処理をしたあとの酵素活性を100
とした相対活性で残存活性を表し、第３表に示し
た。
至適PH） 標準反応条件において緩衝液の種類およびPHを
変化させて活性を測定した。緩衝液としては、
50mM トリス−塩酸緩衝液 PH6.0〜9.0、
7.15mM Britton and Robinson緩衝液PH4.5〜
10.0を用い、各条件における活性をトリス−塩酸
緩衝液PH7.0における活性を100とした相対活性で
表し、第３図に示した。 実施例 ４ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
PH安定性） 11.9mM Britton and Robinson緩衝液PH４〜
11，0.2％ルブロールPX，0.5mM CaCl2中で酵
素を30℃、30分間インキユベートした後、当量の
100mMトリス−塩酸PH7.0を添加してPHを７に戻
してから標準反応条件で残存活性を測定した。各
処理後の残存活性を無処理の活性を100とした相
対活性で表し、第４図に示した。 実施例 ５ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
至適温度） 標準反応条件において反応温度のみを25〜60℃
まで変化させて活性を測定した。各温度における
活性を45℃における活性を100とした相対活性で
表し、第５図に示した。 実施例 ６ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
熱安定性） 酵素を各温度で10分間インキユベートした後、
氷水中で急冷し、残存活性を標準反応条件で測定
した。無処理の活性を100とした相対活性で各温
度における残存活性を表し、第６図に示した。 実施例 ７ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
各種阻害剤に対する挙動） 基質不在下において各種阻害剤を含む反応条件
液中で、酵素を25℃、30分間インキユベートし、
その後基質を添加して反応させた。阻害剤不在下
において同様な処理をしたあとの酵素活性を100
とした相対活性で残存活性を表し、第３表に示し
た。
【表】
【表】
【表】
実施例 ８
（塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
活性に及ぼす界面活性剤の影響） 標準反応液において界面活性剤の種類および濃
度を変えて反応を行い、３％ルブロールPX存在
下における活性を100とした相対活性で表し、第
７図に示した。 実施例 ９ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
活性に及ぼすCaCl2の影響） 0.1％EDTA存在下にCaCl2濃度を変化させて活
性を測定した。0.5mM CaCl2存在下における活
性を100とした相対活性で表し、第８図に示した。
尚、遊離のCaCl2濃度は、EDTAのCaCl2に対す
る見かけの解離定数K1をlogK1＝7.3として計算
により求めた。 実施例 10 （EDTA処理後の塩基性アミノ酸残基対特異
的プロテアーゼの活性の回復に及ぼす各種金属イ
オンの影響） 基質非存在下1mM EDTAを含む標準反応液中
で酵素を25℃、30分間処理し、各種金属イオンを
1.5mMになるように添加して30℃、５分間イン
キユベートしてから活性を測定した。各条件にお
ける活性を無処理における活性を100とした相対
活性で表し、第４表に示した。
活性に及ぼす界面活性剤の影響） 標準反応液において界面活性剤の種類および濃
度を変えて反応を行い、３％ルブロールPX存在
下における活性を100とした相対活性で表し、第
７図に示した。 実施例 ９ （塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
活性に及ぼすCaCl2の影響） 0.1％EDTA存在下にCaCl2濃度を変化させて活
性を測定した。0.5mM CaCl2存在下における活
性を100とした相対活性で表し、第８図に示した。
尚、遊離のCaCl2濃度は、EDTAのCaCl2に対す
る見かけの解離定数K1をlogK1＝7.3として計算
により求めた。 実施例 10 （EDTA処理後の塩基性アミノ酸残基対特異
的プロテアーゼの活性の回復に及ぼす各種金属イ
オンの影響） 基質非存在下1mM EDTAを含む標準反応液中
で酵素を25℃、30分間処理し、各種金属イオンを
1.5mMになるように添加して30℃、５分間イン
キユベートしてから活性を測定した。各条件にお
ける活性を無処理における活性を100とした相対
活性で表し、第４表に示した。
【表】
【表】
実施例 11
（塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
分子量及び等電点） 12.5％ゲルを用いたSDS−PAGEにより見かけ
の分子量は約4.7万であつた（第９図）。また、ル
ブロールPXを含まない条件下でのTSK gel
G3000 SWXLを用いたゲル濾過では約5.6万であつ
た（第１０図）。 IEF gel ３−９を用いた等電点電気泳動によ
り本酵素のpIは4.5であつた（第１１図）。
分子量及び等電点） 12.5％ゲルを用いたSDS−PAGEにより見かけ
の分子量は約4.7万であつた（第９図）。また、ル
ブロールPXを含まない条件下でのTSK gel
G3000 SWXLを用いたゲル濾過では約5.6万であつ
た（第１０図）。 IEF gel ３−９を用いた等電点電気泳動によ
り本酵素のpIは4.5であつた（第１１図）。
第１図はスポロボロマイセス・オドラス
IFO1597由来塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼの精製時におけるDEAE Toyopearl
650M クロマトグラムである。第２図はスポロ
ボロマイセス・オドラスIFO1597由来塩基性アミ
ノ酸残基対特異的プロテアーゼのArg−
Sepharoseクロマトグラムである。第３図は本発
明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
至適PHを表した図である。第４図は本発明の塩基
性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのPH安定性
を表した図である。第５図は本発明の塩基性アミ
ノ酸残基対特異的プロテアーゼの至適温度を表し
た図である。第６図は本発明の塩基性アミノ酸残
基対特異的プロテアーゼの温度安定性を表した図
である。第７図は本発明の塩基性アミノ酸残基対
特異的プロテアーゼの活性に及ぼす界面活性剤の
影響を表した図である。第８図は本発明の塩基性
アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活性に及ぼ
すCaCl2の影響を表した図である。第９図は本発
明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
7.5％ゲルを用いた電気泳動における分子量測定
の結果を表した図である。第１０図は本発明の塩
基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのTSK
gel G3000 SWXLを用いたゲル濾過による分子量
測定の結果を表した図である。第１１図は本発明
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
IEF gel ３−９を用いた等電点電気泳動の結果
を表した図である。
IFO1597由来塩基性アミノ酸残基対特異的プロテ
アーゼの精製時におけるDEAE Toyopearl
650M クロマトグラムである。第２図はスポロ
ボロマイセス・オドラスIFO1597由来塩基性アミ
ノ酸残基対特異的プロテアーゼのArg−
Sepharoseクロマトグラムである。第３図は本発
明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
至適PHを表した図である。第４図は本発明の塩基
性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのPH安定性
を表した図である。第５図は本発明の塩基性アミ
ノ酸残基対特異的プロテアーゼの至適温度を表し
た図である。第６図は本発明の塩基性アミノ酸残
基対特異的プロテアーゼの温度安定性を表した図
である。第７図は本発明の塩基性アミノ酸残基対
特異的プロテアーゼの活性に及ぼす界面活性剤の
影響を表した図である。第８図は本発明の塩基性
アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの活性に及ぼ
すCaCl2の影響を表した図である。第９図は本発
明の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
7.5％ゲルを用いた電気泳動における分子量測定
の結果を表した図である。第１０図は本発明の塩
基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼのTSK
gel G3000 SWXLを用いたゲル濾過による分子量
測定の結果を表した図である。第１１図は本発明
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの
IEF gel ３−９を用いた等電点電気泳動の結果
を表した図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の〜に示す理化学的性質を有するプロ
テアーゼ。 作用および基質特異性： Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有す
るあるいは有しないArg，Lys又はPro，Ｙは
Arg，−はペプチド結合を示す。）で示される化合
物のＹのＣ末端側のペプチド結合を特によく加水
分解する。 至適PH：トリス−塩酸緩衝液PH7.0付近。 PH安定性：PH6.0〜8.0で最も安定。 至適温度：40〜47℃付近（PH7.0）。 熱安定性：38℃以下で安定（PH7.0，10分
間）。 ２ スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属
に属する酵母を培養し、その培養物から得られ
る、下記のに示す性質を有するプロテアーゼ。 作用および基質特異性： Ｘ−Ｙ−（ＸはＮ末端側にペプチド結合を有す
るあるいは有しないArg，Lys又はPro，Ｙは
Arg，−はペプチド結合を示す。）で示される化合
物のＹのＣ末端側のペプチド結合を特によく加水
分解する。 ３ スポロボロマイセス属に属する酵母がスポロ
ボロマイセス・オドラス（Sporobolomyces・
odrus）IFO1597である請求項２記載のプロテア
ーゼ。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63016285A JPH01191683A (ja) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | 新規なプロテアーゼ |
| DE68922014T DE68922014T2 (de) | 1988-01-27 | 1989-01-24 | Protease. |
| EP89101200A EP0336056B1 (en) | 1988-01-27 | 1989-01-24 | Protease |
| CA000589189A CA1318872C (en) | 1988-01-27 | 1989-01-26 | Protease |
| US07/301,988 US5053333A (en) | 1988-01-27 | 1989-01-26 | Protease |
| KR1019890000900A KR930005454B1 (ko) | 1988-01-27 | 1989-01-27 | 포로테아제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63016285A JPH01191683A (ja) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | 新規なプロテアーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01191683A JPH01191683A (ja) | 1989-08-01 |
| JPH0578305B2 true JPH0578305B2 (ja) | 1993-10-28 |
Family
ID=11912279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63016285A Granted JPH01191683A (ja) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | 新規なプロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01191683A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07108232B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1995-11-22 | エム・ディ・リサーチ株式会社 | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
-
1988
- 1988-01-27 JP JP63016285A patent/JPH01191683A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01191683A (ja) | 1989-08-01 |
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