KR930005454B1 - 포로테아제 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) IFO 1903(ATCC 8651, NRRL Y-1205)의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제에 있어서 형성된 DEAE/토요피얼 크로마토그램.
제2도는 클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651, NRRL Y-1205)의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제에 있어서 형성된 Con A/세파로제 크로마토그램.
제3도는 클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651, NRRL Y-1205)의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제에 있어서 형성된 아르기닌/세파로제 크로마토그램.
제4도는 클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651, NRRL Y-1205)의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제에 있어서 형성된 모노Q 크로마토그램.
제5도는 클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651, NRRL Y-1205)의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제시에 형성된 모노Q-Ⅰ의 벤즈아미딘/세파로제 크로마토그램.
제6도는 클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651, NRRL Y-1205)의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제시에 형성된 모노Q-Ⅱ의 벤즈아미딘/세파로제 크로마토그램.
제7도는 Benz-Ⅰ 및 Benz-Ⅱ의 트리스염산완충액내의 최적 pH 값을 보여준다.
제8도는 Benz-Ⅰ의 트리스염산완충액 및 브리튼 및 로빈슨 완충액내의 최적 pH를 보여준다.
제9도는 Benz-Ⅰ의 pH 안정성을 보여준다.
제10도는 Benz-Ⅰ의 최적온도를 보여준다.
제11도는 Benz-Ⅰ의 열안정성을 보여준다.
제12도는 Benz-Ⅰ 및 Benz-Ⅱ의 활성에 주는 유리된 염화칼슘농도의 영향을 나타낸다.
제13도는 Benz-Ⅰ 및 Benz-Ⅱ의 활성에 주는 루브를 PX 농도의 영향을 나타낸다.
제14도는 로도스포리디움(Rhodosporidium) IFO 0413(KFCC 11367)의 막 추출액의 모노Q 크로마토그램.
제15도는 한세뉼라(Hansenula) IFO 0980(CBS 4140)으로부터 얻은 막추출액의 모노Q 크로마토그램.
제16도는 스포로볼로마이세스 오드루스(Sporobolomyces odrus) IFO 1597(UBC 948)에서 얻은, 염기성 아미노산에 특이적인 프로테아제의 정제시에 형성된 DEAE/토요피얼 650M 크로마토그램.
제17도는 스포로볼로마이세스 오드루스 IFO 1597(UBC 948)로 부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 Arg/세파로제 크로마토그램이다.
제18도는 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적 pH값을 나타낸다.
제19도는 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적 pH 안정성을 나타낸다.
제20도는 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적 온도를 나타낸다.
제21도는 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 열안정성을 나타낸다.
제22도는 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성에 주는 계면활성제의 영향을 보여준다.
제23도는 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성에 주는 CaCl2의 영향을 보여준다.
제24도는 7.5％ 겔을 사용하는 전기영동에 의하여 측정한, 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 분자량 측정결과를 보여준다.
제25도는 TSK겔 G3000 SWXL을 사용하는 겔 여과에 의하여 측정한, 본 발명의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 분자량 측정결과를 보여준다.
제26도는 IFF겔 3-9를 사용하여 측정한, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 등전점 전기영동의 결과를 보여주는 것이다.
본 발명은 신규 프로테아제에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제에 관한 것이다.
짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제는 프로호르몬으로부터 그에 상응하는 호르몬을 생합성하는데 관여한다. 그러므로 효소적 성질 및 생리학적 기능을 알아내고 그에 의하여 프로호르몬으로부터의 그것의 호르몬의 합성 또는 단백질 또는 펩티드의 제한적 단백질 가수분해에 대한 높은 특이성을 적용하기 위하여 다양한 원으로부터 이러한 프로테아제를 정제하려는 시도가 행해져 왔다.
이러한 프로테아제중에서 지금까지 정제된 것은 다음과 같이 한정된다. 돼지 하수체에서 얻은 IRCM-세린 프로테아제-1(참조 ; J. Biol. Chem., 261, 10850(1986), 소의 하수체에서 얻은 POMC-변환효소(참조 ; J. Biol. Chem., 260, 7194(1985), ibid., 261, 14392(1986)), 효모(맥주효모균)로부터의 포르세신 Y-1(참조 ; Nature, 309, 558(1984)). IRCM-세린 프로테아제-1 및 프로세신 Y-1은 세린 프로테아제로서 분류되는 반면 POMC-변환효소는 아스파르트 프로테아제로서 분류된다.
스포로볼로마이세스 및 클루이베로마이세스에서 생성되는 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제 p-아미노페닐메탄술포닐 플루오리드(pAPMSF), p-클로로메르큐리 벤조산(pCMB), 금속킬레이트제 및 중금속에 의해 저해된다.
IRCM-세린 프로테아제-1, POMC-변환효소 및 스포로볼로마이세스 및 클루이베로 마이세스로부터의 짝지은 염기성 마이노산 잔기에 특이적인 프로테아제는 짝지은 염기성 아미노산의 C-말단측에서 특수히 가수분해하는 반면 포르세신 Y-1은 짝지은 염기성 아미노산 사이를 특수하게 가수분해한다. 또한 짝지은 염기성 아미노산 잔기를 위한 특정 프로테아제는 α-짝짓기 요소의 과정에 있어서 참가하는 KEX2-프로테아제인 것으로 추측되며, 맥주효모군(Saccharomyces cerevisiae)으로부터 부분적으로 정제되어 왔다(참조 ; Biochem, Biophys. Res. Commun., 144, 807(1987)).
또한 KEX2-프로테아제의 클로닝도 발표되어 있다(참조 : Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254(1988)). 그러나 지금까지 발표된 프로테아제는 효소활성 및 안정성등에 있어서 만족스럽지 못하였다.
프로호르몬으로부터 호르몬을 합성하는 경우 또는 재조합기법에 의해 합성된 융합단백질에 프로테아제를 적용할때에는, 상기 프로테아제가 연속되는 염기성 아미노산 잔기의 C-말단측을 특수하게 절단하는 것이 바람직하다. 그러므로 그러한 프로테아제를 검출하는 것이 기대된다.
본 발명은 다음과 같은 견지에서 후속되는 물리화학적 특성을 지닌 프로테아제를 제공한다.
(a) 작용 및 기질 특이성, (b) 최적 pH, (f) 활성화, (g) 저해
(a) 이것은 특히 X-Y-화합물(X는 Arg, Lys 또는 Pro, N-말단측에 펩티드결합이 있거나 없으며, Y는 Arg이고 -은 펩티드결합을 나타낸다)의 Y의 C-말단측상의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있다. (b) 트리스-염산 완충액으로 pH 약 7.0, (f) 이것은 염화칼슘 또는 계면활성화된다. (g) p-아미디노페닐메탄술포닐플루오리드, p-클로로메르큐리벤조산, 금속킬레이트제, 테트라아세트산 또는 중금속에 의하여 저해된다.
본 발명의 프로테아제는 스포로볼로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 필로바시디움(Filobasidium)속, 한세뉼라(Hansenula)속, 이스사첸키아(Issatchenkia)속, 피치아(Pichia)속, 로도스포리디움(Rhodosporiduim)속 또는 사카로미코프시스(Saccharomycopsis)속에 속하는 효모를 배양하는 배지로부터 바람직하게 수득될 수 있다.
본 발명에 따라 상기 규정된 프로테아제는 실시예 A 및 B를 포함한다.
프로테아제 A 및 B는 (a) 및 (b)의 견지에서는 동일하나, (c), (d) 및 (e) 특성에서는 서로 다르다.
(c) pH 안정성, (d) 최적온도 및 (e) 열안정성
(c) 프로테아제 A는 pH 6.0 내지 8.0에서, 프로테아제 B는 pH 6.0 내지 10에서 가장 안정하다. (d) 프로테아제 A는 pH 7.0에서 약 40 내지 47℃가, 프로테아제 B는 pH 7.0에서 약 60℃가 최적온도이다. (e) 프로테아제 A는 pH 7.0, 38℃에서 10분간, 프로테아제 B는 pH 7.0, 55℃에서 10분간 안정하다.
본 발명은 또한 스포로볼로마이세스속에 속하는 효모를 배양하는 배양액으로부터 얻었으며 특성 (b) 내지 (e)에 한정되지 않는 또하나의 프로테아제 A′를 제공한다. 본 발명은 또한 클루이베로마이세스속, 필로바시디움속, 한세뉼라속, 이스사첸키아속, 피치아속, 로도스포리디움속 또는 사카로미코프시스속에 속하는 효모를 배양하는 액으로부터 얻어지며 특성 (b) 내지 (e)에 한정되지 않는 프로테아제 B′를 제공한다.
본 발명은 이하에 A, A′, B 및 B′에 대하여 구체적으로 설명하겠다.
[프로테아제 B 및 B′]
이러한 상황하에서 본 발명자들은 대량으로 유용한 효모로 부터 상기 요구를 만족시키는 프로테아제를 검출하고자 시도하였다. 그 결과 본 발명자는 상기 요구를 만족시키는 프로테아제가 클로이베로마이세스속, 필로바시디움속, 한세뉼라속, 이스사첸키아속, 피치아속, 로도스포리디움속 또는 스포로볼로마이세스속에 속하는 효모에 의하여 생성되며, 상기 효소를 정제하는데 성공하였으며 그것을 물리화학적 특성에 따라 분류하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 다음과 같은 물리화학적 특성 (a) 내지 (e)를 지닌 프로테아제를 제공한다.
(a) 작용 및 기질 특이성 : 이것은 특히 X-Y- 화합물(X는 N-말단측에 펩티드결합을 선택적으로 지닌 Arg, Lys 또는 Pro, Y는 Arg이고 -은 펩티드결합을 나타낸다)의 Y의 C- 말단측의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있다. (b) 최적 pH : 트리스-염산완충액으로 약 7.0, (f) pH안정성 : 6 내지 10에서 가장 안정, (d) 최적온도 : 약 60℃(pH 7.0), (e) 열안정성 : 55℃ 이하(pH 7.0, 10분간)에서 안정
본 발명의 프로테아제의 상술한 것 이외의 물리화학적 특성 및 효소의 특성은 다음과 같다.
(f) 활성화 : 염화칼슘 및 루브를 PX 또는 트리톤 X-100과 같은 계면활성제에 의하여 활성화된다.
(g) 저해 : p-아미노페닐메탄술포닐플루오리드(pAPMSF), p-클로로메르큐리벤조산(pCMB), 금속킬레이트제(예를 들면 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌글리콜비스(2-아미노에틸에테르) 테트라아세트산(EGTA)), 및 중금속(예를 들면 황산구리(Ⅱ), 염화아연 또는 염화수은(Ⅱ) 등에 의하여 저해된다.
(h) 분자량 : TSK 겔 G3000 SWXL을 사용하여 겔 여과에 의하여 측정하였을때 약 100,000이다.
본 발명에서 프로테아제의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정되었다.
활성측정법 :
50μ㏖의 트리스-염산완충제(pH 7.0), 10mg의 루브롤 PX, 0.5μ㏖의 염화칼슘, 0.1μ㏖의 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA(Boc는 t-부틸옥시카르보닐기이고 MCA는 4-메틸큐마린-7-아미드) 및 효소를 함유하는 반응혼합액 1㎖를 30℃에서 반응시켰다. 형성된 7-아미노-4-메틸규마린(AMC)에서 발생되는 형광(발기파장 : 380㎚, 발광파장 : 460㎚)을 시간간격을 두고 측정한다. 1분당 1n㏖의 AMC의 유리를 촉매할 수 있는 효소량을 1U로서 정의한다. 비활성은 단백질 1mg당 U로 나타낸다. 단백질 양은 E1％ 단백질을 10으로 가정하여 280㎚에서의 흡광을 측정하여 결정한다.
본 발명에 있어서, 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제를 생성할 수 있는 미생물에는 클루이베로마이세스속, 필로바시디움속, 한세뉼라속, 이스사첸키아속, 피치아속, 로도스포리디움속 및 사카로미코프시스속에 속하는 짝지은 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제를 생성할 수 있는 모든 균주, 돌연변이 및 변형체가 포함된다.
이러한 균주에서 다음과 같은 것이 바람직하다.
클로이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205) 및 IFO 1267(ATCC 8585 ; KCT 7133 ; NRRL Y-1140), 필로바시디움 캡슐리게늄(Filobasidium capsuligenum) IFO 1119(ATCC 14437) 및 IFO 1185(ATCC 22179), 한세뉼라 홀스티이(Hansenula holstii) IFO 0980(CBS 4140) 및 IFO 0986(CBS 4141), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) ATTC 26012, 피치아 히디이(Pichia heedii) IFO 10019(ATCC 34940), 10020(ATCC 34941), 피치아히디이 변종 테르모톨레란스(thermotolerans) IFO 10024(ATCC 34834 ; CBS 7012) 및 IFO 10026(ATCC 36835 ; CBS 7013), 로도스포리디움 디오보바튬(Rhodosporidium diovovatum) IFO 1830(CBS 6085), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides) IFO 0413(KFCC 11367) 및 IFO 0880(ATCC 10657 ; CBS 349 ; NRRL Y-1588) 및 시카로미코프시스 피불리게라(Saccharomycopsis fibuligera) IFO 0103(KFCC 35041).
상기 균주들은 일본국 오오사까 532 요도가와꾸 주혼마찌 2쪼오메 17-85의 오오사까 발효연구소(Institute for Fermentation)으로부터 구입할 수 있다. 이들은 출원전에 일반에게 공개되어 있다.
본 발명의 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제는 상기 프로테아제를 생산할 수 있으며, 상기 속에 속하는 균주를 YM배지와 같은 통상적 배지내에서 배양하고 배양물로부터 짝지은 염기성 아미노산에 특이적인 목적 프로테아제를 정제하여 제조할 수 있다. 배양액중에는 어떤 특이적인 유도물질이 필요하지 않다. 25 내지 37℃에서 1 내지 3일간 배양하는 것이 바람직하다. 그렇게 생성된 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이한 프로테아제는 전통적인 기법을 결합하여 정제할 수 있다.
예를 들어서 배양물을 원심분리하여 세포를 모으고 Dyno-Mill(품명)으로 파괴한 다음 균질용액을 원심분리하여 세포잔사를 포함하는 펠렛을 분리하고 상징액을 150,000g, 60분과 같은 상태에서 초원심분리하여 막 분획을 얻는다. 목적효소는 막분획으로부터 계면활성제의 사용으로 용해되며 그다음 열처리, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과등으로 정제된다.
[프로테아제 A 및 A′]
이것은 스포로볼로마이세스속에 속하는 효모에서 바람직하게 얻어지며, 다음과 같은 효소적 특성 (a) 내지 (e)를 갖는다.
(a) 기능 및 기질특이성 : 이것은 특히 X-Y- (X는 N-말단측에 펩티드결합을 선택적으로 지닌 Arg, Lys 또는 Pro, Y는 Arg이고 -은 펩티드결합)의 Y의 C- 말단측의 펩티드 결합을 가수분해 한다. (b) 최적 pH : 트리스-염산완충액으로 약 7.0, (f) pH안정성 : 6.0 내지 8.0에서 가장 안정(6 내지 8의 pH, 30℃에서 30분 처리후의 잔류활성은 80％ 이상), (d) 최적온도 : 40 내지 47℃(pH 7.0), (e) 열안정성 : 38℃ 이하에서 안정(pH 7.0, 10분간 가열해도 활성감소 없음)
본 발명의 프로테아제의 상술한 것 이외의 효소적 특성 및 물리화학적 특성은 다음과 같다.
(f) 활성화 : 낮은 농도의 염화칼슘의 사용으로 가장 바람직하게 활성화된다. 루브롤 PX 및 트리톤 X-100과 같은 계면활성제에 의해서도 활성화될 수 있다.
(g) 저해 : 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌 글리콜비스(2-아미노-에틸에테르) 테트라아세트산(EGTA)과 같은 금속키레이트제 또는 황산구리(Ⅱ), 염화아연, 염화수은(Ⅱ)과 같은 중금속 화합물에 의하여 저해된다. 또한, p-클로로메르큐리벤조산(p-CMB) 또는 p-아미디노페닐메탄술포닐 클로라이드(p-APMSF)에 의해서도 저해된다.
(h) 분자량 : TSK 겔 G3000 SWXL을 사용하여 겔 여과에 의하여 측정된 값이 약 47,000이다.
(i) 등전점 : 등전점 전기영동으로 측정한 값이 4.5이다.
본 발명에서 프로테아제의 활성은 다음 방법으로 측정하였다.
활성측정법 :
50μ㏖의 트리스염산완충제(pH 7.0), 10mg의 루브롤 PX, 0.5μ㏖의 염화칼슘, 0.1μ㏖의 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA(Boc는 t-부틸옥시카르보닐기이고 MCA는 4-메틸큐마린-7-아미드) 및 효소를 함유한 반응혼합액을 30℃에서 반응시켰다. 형성된 7-아미노-4-메틸규마린(AMC)에서 발생되는 형광(발기파장 : 380㎚, 발광파장 : 460㎚)을 측정한다. 1분당 1n㏖의 AMC의 유리를 촉매할 수 있는 효소량을 1U로서 규정한다.
본 발명에 있어서, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제를 생성할 수 있는 미생물에는 스포로볼로마이세스속에 속하는, 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제를 생성할 수 있는 모든 균주, 돌연변이체 및 변형체가 포함된다.
본 발명의 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제는 상기 프로테아제를 생산할 수 있으며 스포로볼로마이세스속에 속하는 균주를 YM배지와 같은 통상적인 배지에서 배양하고 배양액으로부터 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 목적 프로테아제를 정제하여 제조할 수 있다. 배양액에는 어떤 특이적인 유도물질을 첨가할 필요가 없다. 25℃ 내지 37℃에서 1 내지 3일간 배양하는 것이 바람직하다. 그렇게 생성된 짝지은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제는 전통적인 기법을 결합하여 정제할 수 있다.
예를 들어서 배양물을 원심분리하여 세포를 모으고 Dyno-Mill(품명)으로 파쇄한 다음, 균질용액을 원심분리하여 잔사세포를 포함하는 펠렛을 분리하고 상징액을 150,000g, 60분과 같은 상태에서 초원심분리하여 막 분획을 얻는다. 목적효소는 막분획으로부터 계면활성제의 사용으로 용해되며 그다음 황산암모늄 분류, 열처리, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과등으로 정제된다.
본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 제한성 없는 실시예는 다음과 같다.
[실시예 1]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 스크리닝 10g/ℓ 글루코스, 5g/ℓ 박토펩톤, 3g/ℓ 이스트추출물 및 3g/ℓ 맥아추출물을 함유한 YM배지(pH 6.0) 750ℓ에 다종의 효모 각각을 2일간 배양하였다. 배양액을 6,700g에서 10분간 원심분리하여 습균체를 얻었다. 이러한 습균체를 알루미나로 파쇄한 균체를 1,000g에서 10분간 원심분리하고 그렇게 얻어진 상징액을 80,000g에서 30분간 더욱 초원심분리하였다. 그다음 막 분획을 침전물로서 얻었다.
얻어진 막분획을 추출용완충액(10mM 트리스 염산완충액, pH 7.0, 루브롤 PX 1％ 및 염화나트륨 0.1M을 함유)에 현탁시키고 4℃에서 1시간 교반하여 막 단백질을 용해시켰다. 현탁액을 80,000g에서 30분간 원심분리하고, 막 추출물내의, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성을 측정하였다.
막 추출물을 50℃에서 10분간 가열하고 15,000g에서 30분간 원심분리하였다. 그렇게 얻어진 상징액(열처리 막추출액이라 할 수 있다)내의, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성을 측정하였다.
표 1에 결과를 요약하였다.
[표 1]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 스크리닝
[실시예 2]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로 부터 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제 클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRHL Y-1205)을 30ℓ의 YM배지에서 2일간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 314g(습중량)의 세포를 얻었다. 이러한 세포를 완충액 1(10mM 트리스염산완충액, pH 7.0, 0.5mM의 염화칼슘함유) 300㎖에 현탁시킨 다음 분쇄기로 파쇄하였다. 그다음 혼합물을 1,700g에서 10분간 원심분리하여 잔사세포를 제거하였다. 얻어진 상징액을 150,000g에서 60분간 초원심분리하였다. 그렇게하여 79.4g의 막 분획을 침전물로서 얻었다. 막 분획을 추출용완충액(10mM 트리스 염산완충액, pH 7.0, 3％ 루브롤 PX 및 0.1M 염화나트륨 함유)에 현탁시키고 일야간 교반하여 효소를 추출하였다.
상술한 바와 같은 조건하에 초원심분리하여 막 추출물을 상징액으로서 얻었다.
막 추출물을 50℃에서 30분간 가열한 다음 형성된 침전물을 39,000g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 상징액을 한외(ultra) 여과로 농축한 다음 완충액 2(20mM 트리스염산완충액, pH 7.0, 염화칼슘 0.5mM 및 루브롤 PX 및 0.2％ 함유)에 대해 투석하였다. 그렇게 얻어진 분획을 열처리 막 추출물로서 언급하였다.
이러한 분획을 완충액 2로 사전평형을 이룬 DEAE/토요피얼 650M 컬럼(2.5×40CM)내에 부었다. 상기 완충액으로 컬럼을 완전히 세척한 다음 0 내지 0.6M 염화나트륨의 광배용출에 의하여 효소를 용출하여 활성분획을 얻었다. 제1도는 용출패턴을 보여준다.
활성분획을 한외여과로 농축하고 0.5M 염화나트륨을 함유한 완충액 2로 사전 평형된 콘카나발린 A(Con A)/세파로제 컬럼(1.6×25CM)에 부었다. 상기 완충액으로 컬럼을 완전히 세척한 다음 0.5M의 염화나트륨과 0.67M의 α-메틸-D-만노시드를 함유한 완충액 2로 효소를 용출하였다. 제2도는 용출패턴을 보여준다. 활성분획을 농축하였으며 Con A/세파로제 분획으로 칭하였다.
Con A/세파로제 분획을 완충액 2에 대하여 투석하고 상기 완충액으로 사전 평형된 아르기닌/세파로제 컬럼(1.6×50CM)에 붓는다. 컬럼을 완전히 세척한 후에 효소를 0 내지 0.5M 염화나트륨으로 광배 용출에 의하여 용출하였다. 제3도는 용출패턴을 보여준다. 활성분획을 한외여과로 농축하고 아르기닌/세파로제 분획이라 칭한다.
아르기닌/세파로제 분획을 완충액 2에 대하여 투석시킨 다음 상기 완충액으로 사전 평형된 모노Q 컬럼(0.5×5.0CM)에 부었다. 상기 완충액으로 컬럼을 완전히 세척한 다음 0 내지 0.5M 염화나트륨으로 광배 용출에 의하여 효소를 용출하였다. 제4도는 용출패턴을 보여준다. 그 다음 두개의 피크가 활성분획으로서 얻어진다. 이러한 피크를 각각 모아서 농축하였다. 그것을 각각 모노 Q-Ⅰ 및 Q-Ⅱ분획이라 칭하였다.
이러한 분획을 완충액 2에 대하여 각각 투석하고 각각을 상기 완충액으로 사전 평형된 벤즈아미딘/세파로제컬럼(1.6×5.0CM)에 부었다. 상기 완충액으로 컬럼을 완전히 세척한 후 0 내지 0.5M 염화나트륨으로 광배용출에 의하여 효소를 용출하였다. 제5 도 및 제6도는 모노 Q-Ⅰ 및 모노 Q-Ⅱ 각각에 상응하는 용출패턴을 보여준다. 그렇게 얻어진 활성분획을 각각 벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ로 칭하였다.
표 2는 결과를 요약한다.
[표 2]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로 부터의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제
벤즈-Ⅰ는 그들의 억제제와의 반응으로부터 벤즈-Ⅱ의 분해생성물임을 추측할 수 있으며, 그것의 최적 pH값이 상호간에 거의 같으며 후술되는 바와 같이 그것의 분자량(벤즈-Ⅰ : 약 60,000 내지 100,000, 벤즈-Ⅱ : 약 100,000)도 거의 같다.
표 2에서 알 수 있듯이 벤즈-Ⅰ의 상대적 활성은 벤즈-Ⅱ의 그것보다 크다. 그러므로 때로는 벤즈-Ⅰ에 배타적으로 관련되는 다음과 같은 서술이 벤즈-Ⅱ에도 적용된다.
[실시예 3]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로 부터 얻은, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 기질특이성
벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ의 활성을 다양한 형광기질을 사용하는 표준적 조건하에서 측정하였다. 각 기질의 활성은 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA의 활성을 100으로 하여 비교한 활성으로 표현하였다.
[표 3]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로 부터 얻은 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 기질특이성
결과적으로 다음 펩티드(1) 내지 (5)에 대한 벤즈Ⅰ의 효과를 측정하였다. 사용된 반응혼합물의 조성 및 측정조건은 다음과 같다. 트리스염산완충액(pH 7.0) 25μ㏖, CaCl20.25μ㏖, 루브롤 PX 5mg, NaN3100㎍, 다양한 농도의 각각의 펩티드 및 다양한 농도의 벤즈-Ⅰ을 함유한 반응혼합물을 50㎕를 30℃에서 20시간 동안 반응시켰다.
반응액 50㎕를 0 및 20시간의 반응후에 채취하여 TFA 0.2％ 및 EDTA 10mM로 구성된 반응정지액 50㎕를 첨가하였다. 결과된 혼합액을 HPLC로 분석하였다. HPLC는 울트론 NC18컬럼(0.45×15CM) 또는 TSK겔 ODS-80TM컬럼(0.46×25CM)를 사용하여 TFA 0.1％ 존재하에 CH3CN 광배용출으로 실시하였다.
[새로운 피크의 규명]
잔류 반응액을 상기 분석조건과 동일한 조건으로 크로마토그래피하고 주피크를 분획화하였다. 분획된 용출액을 건조할 때까지 원심증발기로 증발시킨 다음 110℃에서 24시간 동안 염산으로 분해시켰다. 이러한 각 분획을 아미노산 조성물로 추정한다.
(1) BAM-12P
벤즈-Ⅰ 200mU를 BAM-12P(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Arg-Val-Arg-Pro-Glu) 50n㏖로 반응시켰다. 20시간 반응시킨 후 크로마토그래피에 의해 형성된 피크를 분획하고 각 분획의 아미노산 조성을 분석하였다. 결과적으로 Glu : 1.24, Gly : 1.18, Val : 1.04, Arg : 1.10 및 Pro : 0.916의 아미노산 조성을 갖는 것으로 추측되는 피크부분을 발견하였다. 즉 Val-Gly-Arg-Pro-Glu을 얻었다.
그러므로 벤즈-Ⅰ는 화살표 위치에서 결합을 깨는 것이 예상된다.
(2) 디노르핀A(1-13)
벤즈-Ⅰ 200mU를 디노르핀A(1-13)(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys) 50n㏖과 반응시켰다. 20시간 동안 반응시킨 다음 크로마토그래피에 의해 형성된 피크를 분획하고 각 분획의 아미노산 조성을 분석하였다. 결과적으로 Ile : 0.927, Leu : 1.18, Lys : 1.91, Arg : 1.06 및 Pro : 0.919의 아미노산 조성을 갖는 것으로 추정되는 피크부분, 즉 Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys와 Gly : 2.36, Ley : 0.999, Tyr : 0.715, Phe : 1.11 및 Arg : 1.82인 아미노산 조성을 갖는 것으로 추정되는 피크부분, 즉 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg이 생성됨을 알 수 있었다.
그러므로 벤즈-Ⅰ이 화살표에 의하여 보여지는 위치에서 결합을 절단함을 예상할 수 있다.
(3) 단백질 키나제와 관련된 펩티드
200mU의 벤즈Ⅰ을 단백질 키나제-관련된 펩티드(Arg-Lys-Arg-Ser-Arg-Lys-Glu) 50n㏖과 반응시켰다. 20시간 동안 반응시킨 후 크로마토그래피에 형성된 피크를 분획하고 각 분획의 아미노산 조성을 분석하였다. 결과적으로 Ser : 0.990, Glu : 1.03, Lys : 0.954 및 Arg : 1.03인 아미노산 조성을 갖는 것으로 추정되는 피크부분, 즉 Ser-Arg-Lys-Glu가 얻어짐을 알 수 있었다.
그러므로 벤즈-Ⅰ은 다음 화살표로 지적되는 위치를 절단함을 추정할 수 있다.
(4) 크세놉신
벤즈-Ⅰ 200mU를 50n㏖의 크세놉신(pGlu-Gly-Lys-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu)과 반응시켰다. 20시간 동안 반응시킨 다음 크로마토그래피에 의해 형성된 피크를 분획하고 각 분획의 아미노산 조성을 분석하였다. 결과적으로 Glu : 0.993, Gly : 1.22, Lys : 0.674 및 Arg : 1.11인 아미노산 조성을 갖는 것으로 추정되는 피크부분, 즉 pGlu-Gly-Lys-Arg를 얻었다.
그러므로 벤즈-Ⅰ은 다음 화살표로 보여지는 곳에서 결합을 절단함을 추정하게 된다.
(5) 3200-달튼 아드레날 펩티드 E
벤즈-Ⅰ 200mU를 3200-달톤 아드레날 펩티드 E(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Arg-Vla-Gly-Arg-Pro-Glu-Trp-Trp-Met-Asp-Tyr-Gln-Lys-Arg-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) 25n㏖과 반응시켰다. 20시간 반응후 크로마토그래피에 의해 형성된 피크를 분획하고 각 분획의 아미노산 조성물을 분석하였다. 결과적으로 Gly : 2.53, Met : 0.542, Tyr : 0.897, Phe : 1.03 및 Arg : 2.00의 아미노산 조성임이 추정되는 피크부분, 즉1Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-7Arg, Gly : 2.03, Leu : 1.01, Tyr : 0.913 및 Phe : 1.04인 아미노산 조성물을 갖는 것으로 추정되는 피크분획, 즉21Tyr-Gly-Gly-Phe-25Leu 및 Asp : 0.764, Glu : 1.79, Gly : 3.29, Val : 1.01, Met : 1.26, Tyr : 2.07, Phe : 1.32, Lys : 1.17, Arg : 4.29 및 Pro : 1.03의 아미노산조성을 갖는 것으로 추정되는 피크분획, 즉 Val-Gly-Arg-Pro-Glu-Trp-Trp-Met-Asp-Tyr-Gln-Lys-20Arg이 얻어짐을 발견하였다.
그러므로 Benz-Ⅰ은 다음 화살표 위치에서 결합을 절단함이 추정된다.
[실시예 4]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적 pH 벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ의 활성을 완충액의 종류 및 pH를 바꿔가면서 표준 반응조건하에 측정하였다. 완충액으로서는 50mM의 트리스염산완충액(pH 6 내지 9) 및 7.15mM 브리튼 및 로빈슨 완충액(pH 4 내지 10)을 사용하였다. 그렇게하여 측정한 각각의 활성을 트리스염산완충액(pH 7.0)내의 활성을 100으로 하여 상대적인 값으로 표현하였다. 제7도 및 제8도에 결과를 나타내었다.
[실시예 5]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 pH 안정성.
효소(벤조-Ⅱ)을 루브롤 PX 0.2％ 및 염화칼슘 0.5mM을 함유하는 브리튼 및 로빈슨완충액(pH 3 내지 12) 10.7mM에서 인큐베이트하였다. 그다음 루브롤 PX 0.2％ 및 염화칼슘 0.5mM을 함유한 트리스염산완충액 100mM을 동량 첨가하여 pH를 7에 맞추었다. 잔류 활성은 표준 반응 조건하에서 측정하였다. 제9도는 무처리군의 활성을 100으로 하여 상대활성으로 표현한, 각 처리후의 잔류활성을 준다.
[실시예 6]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적온도.
벤즈-Ⅰ의 활성을 표준적 반응조건하에 측정하되 반응온도를 25 내지 75℃ 사이에서 변환시켰다. 60℃에서의 활성을 100으로 하여 각 온도에서의 상대적인 활성을 제10도에 나타내었다.
[실시예 7]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 온도에 대한 안정성.
효소 벤즈-Ⅰ의 다양한 온도에서 10분간 배양하고 다음 얼음물로 퀀칭시켰다. 각 처리후의 잔류활성을 표준 반응조건하에 측정하였다. 제11도는 각 잔류활성을 무처리 경우의 활성을 100으로 하였을때의 상대적 활성으로 나타낸 것이다.
[실시예 8]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의, 다양한 저해제에 대한 행동.
효소 벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ를 다양한 저해제를 함유한 표준적 반응혼합물내에서 기질없이 25℃로 30분간 배양하였다. 기질 첨가후 각 효소의 잔류활성을 측정하였다. 표 4는 각 잔류활성을 무처리경우 활성을 100으로 하였을때의 상대적인 값으로 나타낸 것이다.
[표 4]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 저해제에 대한 행동
[실시예 9]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된, 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성회복에 주는 다양한 금속이온효과.
벤즈-Ⅰ을 10mM의 EDTA의 존재하, 4℃에서 1시간 배양하였다. 효소가 완전히 활성을 잃었을때 배양액을 0.2％ 루브롤 PX를 함유한 10m 트리스 염산완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하여 EDTA를 완전히 제거하였다. 그렇게 투석된 효소혼합물을 다양한 금속이온을 0.5mM 함유하는 반응액내에서 활성회복에 관하여 측정하였다. 표 5는 무처리 경우의 활성을 100으로 하여 비교한 상대적 활성으로 각 경우의 활성을 표현한 것이다.
[표 5]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성회복에 주는 다양한 금속 이온효과
[실시예 10]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성에 주는 칼슘이온 농도의 효과.
벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ의 활성을 0.1mM EDTA를 함유한 표준적인 반응혼합물에서 염화칼슘의 농도를 변화시키면서 측정하였다. 유리된 염화칼슘의 농도를 겉보기 해리상수 K1(log K1=7.3)로부터 계산하였다. 1mM에서의 활성을 100으로 하여 각각의 염화칼슘 농도에서의 각 효소의 활성을 상대활성으로 표시하였다(제12도).
[실시예 11]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성에 주는 루브롤 PX의 효과.
벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ의 활성을 표준적인 반응조건이되 루브롤 PX농도가 변화하는 조건에서 측정하였다. 제13도는 최고활성을 100으로 하여 상대활성으로 표현한 각 루브롤 PX 농도에서의 활성을 나타낸다.
[실시예 12]
클루이베로마이세스 락티스 IFO 1903(ATCC 8651 ; NRRL Y-1205)으로부터 생성된 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 분자량.
계면활성제가 전혀 없는 상태로 TSK 겔 G3000 SWXL(0.78×30CM)를 사용한 겔 여과에 의하여 벤즈-Ⅰ 및 벤즈-Ⅱ의 분자량을 측정하였다. 결과적으로 벤즈-Ⅰ의 분자량은 약 60,000 내지 100,000, 벤즈-Ⅱ의 분자량은 약 100,000으로 측정되었다.
[실시예 13]
실시예 1에서 얻은 막 추출물내의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 부분정제.
로도스포리디움 IFO 0413(KFCC 11367) 및 한세뉼라 IFO 0980(CBS 4140)으로부터 얻은 실시예 1의 막 추출물 각각의 일부를 완충액1(트리스염산 완충액 10mM, pH 7.0, 염화칼슘 0.5mM 및 루브롤 PX 0.2％ 함유)에 대하여 투석하고 상기 완충액으로 평형이 된 모노Q 컬럼(0.5×5.0CM, 파르마시아AB사의 제품)에 부었다.
상기 완충액으로 컬럼을 완전히 세척한 다음 0 내지 0.1M 염화나트륨의 농도광배에 의하여 효소를 용출하였다.
제14도 및 제15도는 로도스포리디움 IFO 0413(KFCC 11367) 및 한세뉼라 IFO 0980(CBS 4140)의 크로마토그램을 각각 보여준다. 그렇게 얻은 분획을 모아서 그것의 특이활성을 측정하였다.
표 6은 크로마토그래피전에 결정된 특이활성과 그렇게 결정된 특이활성을 나타낸다.
[표 6]
모노Q에 의한 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 부분정제
[실시예 14]
부분정제된 효소의 기질 특이성.
실시예 13에서 정제된 효소의 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA, Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-MCA 및 Pro-Phe-Arg-MCA에 대한 상대활성을 측정하였다.
표 7이 결과이다.
활성의 측정은 각 기질을 100μM 함유하는 혼합물을 사용하여 표준반응조건하에서 행하였고 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA에 대한 활성을 100으로 하여 각각의 상대활성을 나타내었다.
[표 7]
부분정제효소의 기질특이성
주 : A, B 및 C는 각각 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA, Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-MCA 및 Pro-Phe-Arg-MCA를 나타낸다.
[실시예 15]
스포로볼로마이세스 오드루스 IFO 1597(UBC 948)로부터의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제.
스포로볼로마이세스 오드루스 IFO 1597(UBC 948)을 YM배지(글루코스 10g/ℓ, 박토펩톤 5g/ℓ, 이스트추출물 3g/ℓ 및 맥아추출물 3g/ℓ) 33ℓ 중에서 2일간 배양하였다. 그다음 배양액을 원심분리하여 265g(습윤중량)의 균체를 회수하였다. 이 균체를 300㎖의 완충액1(10mM 트리스염산완충액, pH 7.0, 0.5mM CaCl2함유)에 현탁시키고 DYNA-MILL로 분쇄하였다. 그다음 혼합액을 1,000g에서 10분간 원심분리하여 균체잔사를 제거하였다. 수득된 상징액을 150,000g에서 60분간 초원심분리하였다. 막 분획이 침전되었다. 이것을 추출완충액(10mM 트리스염산완충액, pH 7.0, 0.5mM CaCl2, 3％ 루브롤 PX 및 0.1M NaCl 함유) 60㎖에 현탁시키고 일야간 교반하여 효소를 추출하였다. 상술한 것과 동일 조건에서 초원심분리하여 막 추출액을 상징액으로 얻었다.
막추출액에 황산암모늄을 30％ 포화되도록 첨가하고 6000g에서 20분간 원심분리하였다. 그렇게 수득된 상징액에 70％ 포화되도록 황산암모늄을 첨거하였다. 6000g에서 20분간 원심분리하고 침전분획을 30 내지 70％ 황산암모늄 분획으로서 회수하였다.
이 침전물 소량을 완충액2(10mM 트리스염산 완충액, 0.5mM CaCl2, 0.2％ 루브롤 PX pH 8.0)에 용해시키고 동일 완충액에 대하여 투석하였다. 그다음 10분간 50℃로 열처리하였다. 생성된 침전을 39,000g, 20분간 원심분리하여 제거하고 열처리분획을 얻었다.
이 분획을 완충액2(pH 8.0)로 미리 평형을 이룬 DEAE/토요피얼 650M 컬럼(토소주식회사제품 2.5×40CM)에 주입하였다. 동일 완충액으로 충분히 세척한 다음 염화나트륨 0 내지 1M 용액으로 광배용출하여 효소를 용출하고 활성분획을 얻었다. 제16도는 용출패턴을 보여준다.
활성분획을 한외여과하여 농축한 후 완충액2(pH 7.0)에 대해 투석한 다음 완충액2로 미리 평형을 이룬 아르기닌/세파로제컬럼(파르마시아 AB사 제품 : 2.5×10CM)에 주입하였다. 동일 완충액으로 컬럼을 완전히 세척한 후 0 내지 0.5M NaCl을 사용한 광배용출법으로 효소를 용출하였다. 제17도는 용출패턴을 보여준다. 활성분획을 농축하고, Arg/세파로제 분획이라 칭한다.
Arg/세파로제 분획을 Con A/세파로제 컬럼(파르마시아 AB사 제품 : 1.6×25CM)에 주입하였다.
상기 컬럼은 0.5M NaCl을 함유한 완충액2(pH 7.0)으로 미리 평형을 이룬 것이다. 동일 완충액으로 컬럼을 충분히 씻은 다음 0.5M NaCl 및 0.5M α-메틸-D-만도시드를 함유한 완충액2(pH 7.0)로 효소를 용출하였다. 활성분획을 농축하고, Con A/세파로제분획이라 칭한다.
Con A/세파로제 분획을 완충액1(pH 7.0)에 대해 투석하고 상기 완충액으로 평형을 이룬 모노Q 컬럼(파르마시아 AB제품)에 주입하였다. 그다음 0 내지 0.6M NaCl을 사용하여 광배용출법으로 용출시키고 활성분획을 농축하여 모노Q 분획이라 칭한다.
모노Q 분획은 완충액1(pH 7.0)로 평형을 이룬 수페로제12(파르마시아 AB제품)를 통해 겔-여과하였다. 그렇게 얻어진 활성분획을 농축하고 수페로제12 분획이라 칭한다. 그렇게 정제된 효소는 겔여과 및 SDS/PAGE에 의해 측정한 결과 균질하였다. 표 8에 정제결과를 요약하였다.
[표 8]
스포로볼로마이세스 오도루스 IFO 1597(UBC 948)로 부터의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 정제
[실시예 16]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 기질특이성.
표준반응조건하에 다양한 형광성 기질에 대한 효소의 활성을 측정하였다. 각 기질에 대한 활성은 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA에 대한 활성을 100으로 하여 비교한 상대활성으로 나타내었다(표 9).
[표 9]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 기질 특이성
주 :*1X는 벤질옥시카르보닐기를 표시
*2Bz는 벤조일기를 표시
*3Suc는 숙시닐기를 표시
*4Asp(OBL)은 아스파르트산의 β-카르복실기를 벤질에스테르로 보호한 것을 나타낸다.
[실시예 17]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적 pH.
표준반응조건에서 완충액의 종류 및 pH를 변화시키면서 효소의 활성을 측정하였다. 완충액으로서는 50mM 트리스염산완충액(pH 6.0 내지 9.0) 및 7.15mM 브리톤 및 로빈슨 완충액(pH 4.5 내지 10.0)을 사용하였다. 그렇게 측정된 각 활성을 트리스염산완충액(pH 7.0)내에서의 활성을 100으로 하여 비교된 상대 활성으로 표시하였다. 제18도에 결과를 나타내었다.
[실시예 18]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 pH 안정성.
11.9mM 브리톤 및 로빈슨완충액(pH 4∼11, 0.2％ 루브롤 PX, 0.5mM CaCl2함유)에서 30℃, 30분간 효소를 배양하였다. 그다음 동량의 100mM 트리스염산완충액(pH 7.0)을 첨가하여 혼합액의 pH를 7에 맞추었다. 잔류활성을 표준반응조건하에서 측정하였다. 각 처리후의 잔류활성을 무처리의 활성을 100으로 하였을때에 비교하여 상대활성으로 표시하였다(제19도).
[실시예 19]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 최적온도.
표준반응조건하에 반응온도를 25 내지 75℃로 변화시키며 활성을 측정하였다. 각 온도에서의 활성을 45℃에서의 활성을 100으로 하여 상대활성으로 제20도에 표시하였다.
[실시예 20]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 열안정성 효소를 각 온도에서 10분간 배양한 다음 냉수중에서 급냉하였다. 잔류활성을 표준 반응조건하에 측정하였다. 무처리시의 활성을 100으로 하여 각 온도에서의 잔류활성을 상대활성으로 제21도에 표시하였다.
[실시예 21]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 각종의 저해제에 대한 작용.
기질부재하에 각종의 저해제를 함유한 표준 반응혼합물중에서 효소를 25℃, 30분간 배양하였다. 기질 첨가후 각 효소의 잔류활성을 측정하였다. 저해제 부재하에서의 동일 처리에서 측정한 효소활성을 100으로 하여 상대활성으로서 잔류활성을 표시하였다(표 10).
[표 10]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 저해제에 대한 작용
[실시예 22]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성에 미치는 계면 활성제의 영향.
표준반응액에서 계면활성제의 종류와 농도를 변화시켜가며 효소반응을 행하였다. 3％ 루브롤 PX 존재하의 활성을 100으로 하였을때의 상대활성으로 결과를 표시하였다(제22도).
[실시예 23]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성에 주는 CaCl2의 영향.
0.1％ EDTA의 존재하에 CaCl2의 농도를 변화시키면서 효소의 활성을 측정하였다. 0.5mM CaCl2존재하의 활성을 100으로 하여 상대활성으로 표시하였다(제23도).
유리된 CaCl2농도는 EDTA의 CaCl2에 대한 겉보기 해리상수(K1)로부터 계산하였다(log k1=7.3).
[실시예 24]
EDTA 처리후의 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성의 회복을 주는 각종 금속이온의 효과.
기질 비존재하에 1mM EDTA를 함유한 표준반응용액중에 효소를 25℃, 30분간 처리하고, 각종 금속이온을 1.5mM 농도가 되게 첨가하고 30℃에서 5분간 배양하였다. 그다음 각 경우의 활성을 측정하였다. 각 조건에서의 활성을 무처리시의 활성을 100으로 하였을때의 상대활성으로 표시하였다(표 11).
[표 11]
EDTA로 처리된 염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 활성 회복에 주는 각종 금속이온의 효과
[실시예 25]
염기성 아미노산 잔기에 특이적인 프로테아제의 등전점 및 분자량.
12.5％ 겔을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 측정한 경우 효소의 겉보기 분자량은 47,000(제24도 참조)이고 TSK겔 G3000 SWXL을 사용하는 겔 여과(루브롤 PX는 사용안함)시의 측정값은 56,000이였다(제25도 참조).
IEF 겔 3-9를 사용하여 동전점 전기영동으로 측정한 본 효소의 등전점(pⅠ)은 4.5였다(제26도 참조).
Claims (3)
- 다음과 같은 점에서 다음의 효소적 성질을 지닌 프로테아제.(a) 작용 및 기질특이성(b) 최적 pH(f) 활성화(g) 저해(a) 이것은 특히 X가 N-말단측에 펩티드 결합을 지니거나 지니지 않은 Arg, Lys 또는 Pro를 표시하고, Y는 Arg를 표시하고, -은 펩티드 결합을 나타낼때, 화합물 X-Y-의 Y의 C-말단측의 펩티드 결합은 가수분해될 수 있다.(b) 트리스염산완충액으로 약 7.0.(f) 염화칼슘 또는 계면활성제에 의해 활성화된다.(g) p-아미디노페닐메탄술포닐 플루오리드, p-클로로메르큐리벤조산, 금속킬레이트제, 테트라아세트산 또는 중금속에 의해 저해된다.
- 제1항에 있어서, 스포로볼로마이에스속, 클루이베로마이세스속, 필로바시디움속, 한세뉼라속, 피치아속, 로도스포리디움속 또는 사카로미코프시스속에 속하는 효모를 배양하는 배양액으로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 프로테아제.
- 제1항에 있어서, 다음과 같은 점에서 후속되는 효소적 성질 (c), (d) 및 (e)를 지닌 프로테아제 A 또는 B인 것을 특징으로 하는 프로테아제.(c) pH 안정성(d) 최적온도(e) 열안정성(c) 프로테아제 A는 pH 6.0 내지 8.0에서, 프로테아제 B는 pH 6.0 내지 10에서 제일 안정하다.(d) 프로테아제 A의 최적온도는 pH 7.0에서 약 40 내지 47℃이고 프로테아제 B의 최적온도는 pH 7.0에서 약 60℃이다.(e) 프로테아제 A는 pH 7.0, 38℃에서 10분간 안정하고 프로테아제 B는 pH 7.0, 55에서 10분간 안정하다.
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