JPH0240983B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫学的検定法、さらにくわしくは微
細に分割した粒子の凝集反応を含む免疫学的検定
法に関する。 現在にいたるまでに、微細に分割した粒子の凝
集反応を含む数種の免疫学的検定法が知られてき
た。それらの検定法においては、検定すべき被分
析物を含む液体試料と、試薬を保持している微細
に分割した粒子（通常試薬は粒子上のコーテイン
グとして存在する）とを混合し、試料中の被分析
物の存在および（または）量に応じた程度で前記
粒子を凝集させる。そうして被分析物の存在およ
び（または）量を決定できる。種種の方法におい
てこのような検定法が実際に役立つ。抗原（例え
ばα―フエトプロテイン）の検定法としてよく知
られているある操作法においては、前記抗原に対
する抗体を持つ既知量のラテツクス粒子（通常は
ポリスチレン）と液体試料とを混合する。抗体と
抗原とが結合して複合体を形成するので、粒子は
存在する抗原の量に比例（ただし普通は全くの正
比例ではない）して凝集する。次に凝集反応の程
度を、好ましくは未凝集粒子を選択的にカウント
することによつて測定する。 凝集反応を使う免疫学的検定法の用途として
は、特にヒトの体液例えば血清の検定がある。し
かしそのような液体は検定すべき特定の被分析物
の他に凝集を起こしたりまたは阻害したりする物
質を含むのが普通であり、これらの物質は検定を
さまたげ定量結果に誤りを起こすことがわかつ
た。この種の妨害は、検定結果をブランクの血清
（すなわち対象としている被分析物を含まない血
清）についての同じ方法による検定結果と比較す
ることでは適切に補正できない。それはブランク
の血清が、検定すべき被分析物を含む特定の患者
の血清の完全な代わりはならないからである。 発明者らは以前に、ラテツクス凝集反応検定法
を妨害する主な因子は、検定すべき液体中のC1q
（補体の成分）および（または）リウマチ因子
（RF）の存在であることを知つた。これらの物質
はヒト血清中に内在するものであり、その影響は
それらの物質を除去または不活性化することまた
はより好ましくは免疫グロブリン抗体のＦ（ab′）₂
フラグメントを〔Ｆ(c)フラグメントおよび免疫グ
ロブリン全体の不存在下に〕検定に使うことによ
つてなくせる。そのような操作法については発明
者らの特開昭54−119292号明細書に記載している
ので詳細についてはこれを参考とする。 しかし、C1qおよびRFによる主な妨害が避け
られた場合でも他の因子による小さな（マイナー
な）妨害がまた残ることもわかつた。このような
妨害は通常は検定を無効にするほどの重大な問題
ではないが、感度と精度を低下させる、明らかに
望ましくないものである。発明者らはこれらの妨
害の原因を確かめその影響を除去するための種種
の検討を行なつた結果、それをなくする方法を見
い出した。 粒子凝集反応検定法において最も普通に最も広
く使われている粒子はラテツクス粒子と呼ばれる
もので、通常は合成重合体材料例えばポリスチレ
ンから成つている。他の型の粒子例えば種種のク
レー粒子も使えるがあまり適用範囲が広くない。
粒子には検定用の反応に参加する物質である試薬
が付着している。多くの場合、粒子材料は検定用
反応混合物にさらされるとそれらの混合物とそれ
自身反応する性質があるので、粒子表面に保護コ
ーテイングを施しておおつておくのが普通であ
る。試薬それ自身がコーテイングを形成している
材料例えば免疫グロブリンである場合は試薬のコ
ーテイングは基になつている粒子核の保護のため
に行なう。それに対して試薬自身が保護コーテイ
ングを形成できない場合、例えば試薬が抗原また
はハプテンである場合は核をカバーするために不
活性コーテイングを粒子に施す。種種の理由から
そのような不活性コーテイング材料として最も普
通に使われているのはタンパク質例えばウシ血清
アルブミンである。試薬は核に付着してもよいし
コーテイングに付着していてもよい。従つて粒子
凝集反応検定法においては、粒子は検定用の免疫
特異的反応に対して不活性であるか、または前記
反応中の試薬を構成しているタンパク質コーテイ
ングを持つのが普通である。 粒子上にタンパク質コーテイングを施すことは
普通に行なわれ受け入れられているが、発明者ら
は、それが前記の小さな妨害作用に寄与している
ことを見出した。さらにある種の測定においては
これらの小さな妨害作用は検定混合物中の非特異
的タンパク質―タンパク質相互作用に原因がある
ことを知つた。そのような相互作用は他の免疫学
的検定法例えば放射性免疫学的検定法またはケイ
光免疫学的検定法においてもある程度は必ず起こ
る可能性のあるものであるが、凝集反応検定法に
おいては粒子上のタンパク質コーテイングの使用
が一般的に行なわれるという単純な理由から、よ
り重要な意味を持つものである。従つてタンパク
質コーテイングを長く使うとタンパク質―タンパ
ク質妨害作用が起こる機会が増す。 広範囲な検討の結果として前記の小さな妨害の
原因がわかり、いわゆるケイオトロピツク
（chaotropic）剤を調節した量で検定混合物に加
えることにより、これらの妨害が除去されるかま
たは少なくとも実質的に減少することがわかつ
た。 ケイオトロピツク剤はそれ自身公知であり多く
の性質をもつがなかでも非共有結合例えば水素結
合、静電結合および疎水結合を破壊するかまたは
弱める。原則としては従つてそれらは本発明の目
的に適するものであり、本発明において弱いタン
パク質―タンパク質相互作用を減らすことすなわ
ち静電結合および水素結合を引き離すことが可能
である。しかしこれらケイオトロピツク剤は抗体
―抗原複合体中の結合を弱める作用も持つことが
わかつている（例えばClinica chimica Acta、
第80巻、第361〜372頁、1977年）。大部分の凝集
反応免疫検定法は抗体・抗原複合体形成に基づい
ているから、重大な不利な効果が起こることなく
ケイオトロピツク剤を意識的に使用できるのは驚
くべきことである。しかし発明者らはそのような
ケイオトロピツク剤の使用が可能であつて同時に
前記の小さな妨害をなくすかまたは減少させる実
質的な利点があることを見出した。 本発明によれば、液体試料中の被分析物の免疫
学的検定法が提供され、それは、タンパク質コー
テイングを施されている粒子であつてそのコーテ
イングが試薬自身から成るかまたは粒子が試薬を
保持しているものである微細に分割した固体粒子
と液体試料との混合物をつくり、存在する被分析
物の量に応じた程度に前記粒子を特異的凝集反応
させ、次にその凝集の程度を測定して存在する被
分析物の量を決定することから成る方法であつ
て、前記混合物が、非特異的タンパク質相互作用
による凝集反応に対する妨害作用を減少させるに
充分な量の前記妨害を減らす１種またはそれ以上
のケイオトロピツク剤または似ケイオトロピツク
剤をも含むことを特徴とする。 本発明はさらに、次に述べる液体試料中の被分
析物の免疫学的検定法を含むものであり、それは
タンパク質コーテイングを施されている粒子であ
つてそのコーテイングが試薬自身から成るかまた
は粒子が試薬を保持しているものである微細に分
割した固体粒子と液体試料との混合物をつくり、
存在する被分析物の量に応じた程度に粒子を特異
的凝集反応させ、次にその凝集の程度を測定して
存在する被分析物の量を決定することから成り、 (a) 予備段階として、検定すべき被分析物と同じ
被分析物の溶液と、種種の量のケイオトロピツ
ク剤または似ケイオトロピツク剤および前記粒
子とを混合して溶液の検定を行ない、検定の基
礎となつている所望の免疫特異的反応は残す一
方非特異的タンパク質相互作用による妨害を減
少させるケイオトロピツク剤の最適量範囲を決
め、 (b) 前記範囲内の量の前記ケイオトロピツク剤の
存在下に前記液体試料中の被分析物を検定す
る、 ことを特徴とする。 前記のように高濃度のケイオトロピツク剤は、
抗原と抗体との間に形成している結合に対し例え
ばタンパク質を変性させることにより影響を及ぼ
すことがありうる。従つて本発明方法においては
所望の抗体・抗原免疫特異的反応に対して大きな
妨害が起こる濃度未満にケイオトロピツク剤の量
を保つことが重要である。どのような種類の免疫
学的検定用混合物においてもその中に存在しても
よいケイオトロピツク剤の最大量は問題としてい
る検定およびケイオトロピツク剤そのものの性質
に依存するが、いずれの場合もやり方の決まつて
いる試験と実験とで決めることができる。多くの
場合ケイオトロピツク剤は約0.5〜約２モル／
の量が望ましいが、変動する量なので正確な最適
量は個個の場合について調べなければならない。
しかしながら、先願特許出願の存在により、１モ
ル／以下の量である場合については本発明の技
術的範囲から除かれた。 最も一般的なケイオトロピツク剤の中ではグア
ニジン、グアニジニウム―塩酸塩または―チオシ
アネート、ナトリウムチオシアネートおよびアン
モニウムチオシアネートおよび尿素が挙げられ
る。これらは本発明による検定法に使うのに適し
ているが、他のケイオトロピツク剤例えば種種の
洗剤も使える。 本発明によれば〓似ケイオトロピツク剤〓を使
うこともできる。ここで似ケイオトロピツク剤と
は、通常は真のケイオトロピツク剤とみなされな
いがそれでも凝集反応免疫学的検定法における妨
害作用を減らす性質を持つ物質である。そのよう
な似ケイオトロピツク剤として挙げられることが
わかつたのは例えば塩化ナトリウム、エチレンジ
アミン四酢酸（EDTA）、硝酸リチウム、塩素酸
リチウム、リチウムイソシアネート、臭化リチウ
ム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、カリウムチ
オシアネート、塩化カルシウム、塩化リチウムま
たはヨウ化リチウムである。塩例えば比較的低溶
解度の塩化ナトリウムを飽和状態に対して約30〜
100％の量で使うのが好ましい。もつと溶解度の
高い塩は0.5〜2Mまたはそれ以上の量で使う。
EDTAは約10〜30ミリモル／例えば約20ミリ
モル／の濃度で使う。これらの物質は凝集反応
免疫学的検定法において適当な濃度で使うと血清
タンパク質による妨害を減らす効果がある。この
効果は一般的には、血清中のイオン強度の増加と
関係があると思われる。 周知のように、ヒト血清の免疫学的検定法は生
理的塩濃度（0.9重量％）での塩水中でしばしば
行なわれる。１つの理由はこれが血清中に存在す
るタンパク質の沈殿を妨害するからである。しか
し前記の低濃度での塩化ナトリウムは似ケイオト
ロピツク剤ではなく、従つてこのような方法での
その適用は本発明の構成要件ではない。ケイオト
ロピツク効果を働かせるためには塩化ナトリウム
の濃度を0.9％より大きく例えば30〜100％飽和に
しなければならない。同様に比較的高い濃度では
ケイオトロピツク効果を及ばす他の物質を、従来
はケイオトロピツク活性をほとんど持たない低い
濃度でのみ粒子凝集反応免疫学的検定法に使用し
たきた。このような物質の例はある種の緩衝液で
ある。ケイオトロピツク活性をほとんどまたは全
く及ばさない前記物質の低濃度での適用は本発明
の構成要件ではない。粒子凝集反応検定法におけ
る非―特異的妨害作用を減少させるのに非常に有
効な効果を持つ高濃度での前記実質の適用は当業
界において以前には実現されなかつた。 前記のように本発明の方法において使用するケ
イオトロピツク剤または似ケイオトロピツク剤の
量は最適結果を達成するために注意深くコントロ
ールしなければならない。特に試薬の過少（結果
として妨害作用がほとんど減少しない）と試薬の
過多（結果として特異的凝集反応の減少をひきお
こす）との間のバランスを達成しなければならな
い。特異的凝集反応を保持しながら非特異的妨害
作用を最大に減少させるために、検定混合物中に
特異的凝集反応を高める高分子物質を含有させる
ことが好ましい。前記物質の例はデキストリンお
よびポリエチレングリコールである。 本発明の凝集反応検定法において、微細に分割
した固体粒子は少くとも１種の試薬を保持し、粒
子上のタンパク質コーテイング自身が試薬を構成
していてもよい。一方、タンパク質コーテイング
は検定中不活性でもよく、そして（粒子核または
タンパク質コーテイングに結合している）試薬の
みが検定反応に関与する。被分析物の存在下、粒
子の凝集反応は存在する被分析物の量に依存した
程度に生ずる。凝集反応の程度は以下により詳細
に説明するように被分析物の量に一般に比例また
は反比例している。被分析物は抗原〔この言葉は
ハプテン、および抗体または同様の結合性タンパ
ク質により結合できる他の物質（例えば薬）をも
意味する〕かまたは抗体（その言葉は純粋な抗体
および厳密には抗体ではない他の同様の結合性タ
ンパク質をも意味する）であつてもよい。 最も簡単で最も公知の方法においては、凝集反
応免疫学的検定法は抗体かまたは抗原を保持する
微細に分割した粒子と、各各抗原かまたは抗体で
ある被分析物を含有する試料溶液とを混合するこ
とから成る。被分析物は同時に２個またはそれ以
上の粒子と結合して粒子の凝集を起こす。そして
この凝集反応の程度により存在する被分析物の量
の測定ができる。この方法は公知である。 本発明者らの特開昭53−104726号明細書に記載
の別の方法においては２種の異なる微粒子または
サブ微粒子試薬を使用していて、それらはいつし
よにインキユベートすると相互に凝集するもので
ある。被分析物は前記の凝集反応を阻害するた
め、この場合凝集反応の量は試料中の被分析物の
量に反比例する。この方法は特にハプテンの検定
に有用である。この方法の変法は本発明者らの特
開昭55−156866号明細書に記載されており、この
中で２種の微粒子試薬の１つは被分析物と結結し
て粒子：被分析物複合体を形成し、第２の微粒子
試薬はこの粒子：被分析物複合体と凝集反応を起
こす。この方法は特に少量の被分析物の検定に有
用である。 これ以上の詳細は前記の公報を参照されたい。 上記のすべての場合、凝集反応の量は未凝集粒
子を選択的にカウントすることにより好ましくは
測定され、そして存在する被分析物の量は標準曲
線（または他の標準結果）の使用により決定され
る。この方法は公知であり、本明細書にはこれ以
上記載しない。 前記の凝集反応検定法については以下の実施例
で本発明の方法においてのみ使用する操作法につ
いて記載する。他の凝集反応検定の操作法は当業
者には公知であり、そしてそれらは本発明の方法
においても使用できる。 本発明者らの特開昭54−119292号明細書におい
ては抗体の代わりにＦ（ab′）₂フラグメントを使用
する免疫学的検定法が記載されている。ヒト血清
の検定において内因性RFおよびC1qによる妨害
作用を減少させるこの方法は本発明の方法におい
ても使用できる。従つて抗原被分析物の検定にお
いて粒子は全抗体の代わりにＦ（ab′）₂フラグメン
トを保持する。これ以上の詳細については前記特
開昭54−119292号明細書を参照されたい。 本発明の方法は前に記載した本発明者らの明細
書に記載のように手動の断続的な方法または自動
的な連続フロー方法で行つてもよい。 本発明をさらに説明するために以下に例および
比較結果を示すが、これらは本発明を限定するも
のではない。記号〓μ〓は〓ミクロン〓の意味で
ある。 例 １ ヒト血清中でのウマ脾臓フエリチン（HSF）
の検定 ポリスチレン粒子（直径0.8μ）をウサギ抗―
HSF IgGでコーテイングする（ポリスチレンを
アミノ化し、次に通常の方法によりジアゾ化を行
う）。それから粒子を種種の血清試料例えばHSF
を加えたもの、加えないものおよびケイオトロピ
ツク剤を加えたもの、加えないもの中でインキユ
ベートする。37℃で30分間インキユベートした
後、テクニコンオートカウンター（Technicon
Autocounter）を使つて非凝集粒子の数を選択的
にカウントすることにより粒子の凝集反応を測定
する。凝集反応は残つた非凝集粒子に相当するピ
ーク高度の減少により表わされる。 (a) 種種の病気にかかつた患者26人からの血清を
ラテツクス粒子上でのそれらの凝集活性につい
て試験する。血清のいずれにもHSFを添加し
ない。こうすると観察される凝集反応はいずれ
も非特異的であり、すなわち、粒子上の抗―
HSF IgGと血清中の遊離のHSFとの間の免疫
特異的反応によらないものである。血清のいく
つかに２種のケイトロピツク剤を種種の量含有
させる。その結果を表１に示す。

【表】 表１からわかるようにケイオトロピツク剤を全
く含まないかまたは少量含むピーク高度はそれぞ
れの血清ごとに明らかに変化していてこれは非特
異的凝集反応の頻ぱんな発生を示す。しかし、２
種のケイオトロピツク剤が1Mおよび2M量存在す
る場合、この非特異的凝集反応は実質的に非常に
減少しそして全体のピーク高度は粒子懸濁液のみ
（すなわち血清なし）の場合に観察されるピーク
高度に非常に近くなる。 (b) インキユベーシヨンのために〔(a)の外部イン
キユベーシヨンとは逆に〕ビレン（Billen）の
サンプラーを使用しそしてウサギ抗―HSF
IgG抗体のＦ（ab′）₂フラグメントでコーテイン
グしたラテツクスを使用し、それ以外は20人の
患者からの血清について上記の(a)の方法をくり
返す。その結果を表２に示す。

【表】 表１と比べてこの結果はＦ（ab′）₂フラグメント
を使用した結果、非特異的凝集反応は全体として
減少するけれども、試料相互間の変化はまだ明ら
かに存在することを示す。使用するケイオトロピ
ツク剤の量はそれぞれ適当に変える必要があるけ
れども、この試料相互間の変動はケイオトロピツ
ク剤の使用により実質的に減少する。この場合、
グアニジニウム―チオシアネートが最も効果であ
る。0.5M濃度で、ピーク高度における変動は非
常に小さくなり、そしてピーク高度は粒子懸濁液
のみ（すなわち血清なし）に対するピーク高度に
非常に近くなる。 (c) 患者20人からの血清に各各の血清中のHSF
が同じ濃度になる量のHSFを添加する。それ
ぞれ５および100ngHSF／ml含有する２つの血
清バツチをこのようにして製造する。それから
各試料中のHSFの量をケイオトロピツク剤を
種種の量加えてまたは加えないで前記の凝集反
応試験により検定した。その結果を表３に示
す。

【表】

【表】 使用した粒子は（カルボジイミド方法により）
それらと結合したウサギ抗―HSF IgG抗体のＦ
（ab′）₂フラグメントを持つ。表３からわかるよう
に、ケイオトロピツク剤としてグアニジニウム塩
酸塩を使つてもある程度の改良が得られるけれど
も、ナトリウムチオシアネートを使用すれば十分
な改良が得られる。ケイオトロピツク剤が存在し
ない場合、ピーク高度の変動は明白である。 例 ２ ヒト血清中のジゴキシンの検定 ジゴキシンは例１でHSFに対して使用した直
接の凝集反応法により十分に検定できないハプテ
ンである。従つて本発明者らの以前の特開昭53−
104726号明細書に記載のいわゆる混合凝集反応法
を使用する。この方法においては２種の異る微粒
子試薬を使用する。第１のものはジゴキシンに対
する抗体でコーテイングした小さい粒子（0.2μ）
である。第２のものはジゴキシンでコーテイング
したより大きな粒子（0.8μ）である。２種の微粒
子試薬を混合する場合、それらは相互に凝集す
る。しかし遊離のジゴキシンが存在する場合、凝
集は〓遊離〓のジゴキシンが抗体でコーテイング
した小さい粒子と結合するために阻害される。 前記の混合凝集反応法において、血清タンパク
質は非特異的妨害作用により、それぞれより高い
またはより低い凝集反応の結果となる、小さい粒
子または大きな粒子あるいはその両方を検定にお
いて阻害することができる。 この方法におけるケイオトロピツク剤の効果を
以下のように試験する。 (a) 患者最高25人からの血清を（大きな）ラテツ
クス（0.8μ）でインキユベートする。このラテ
ツクスはウシ血清アルブミン（BSA）とジゴ
キシンとをカルボジイミド方法によりこれにつ
ないで結合したカルボキシル化したラテツクス
である。このラテツクスの0.05（Ｗ／Ｖ）懸濁
液１容量（25μ）を５倍に希釈した血清１容
量とかきまぜながら25℃で15分間イオキユベー
トする。血清の希釈剤はNaCl0.15MとEDTA
（エチレンジアミンテトラ酢酸）50mMと種種
の濃度のケイオトロピツク剤とを含むNaOH
―リジン0.1M緩衝液（PH9.2）である（表４）。
結果を表４の(a)部分に示す。 ケイオトロピツク剤が存在しないかまたは低
い濃度で存在する場合、いくつかの血清中で明
白な凝集反応が起こることがわかつた。ケイオ
トロピツク剤の濃度が高い場合、これは実質的
に非常に減少する。 (b) 抗―ジゴキシン抗体を保持する小さい粒子
（0.2μ）もまた混合物中に含有させること以外
は(a)の方法をくり返す。再びケイオトロピツク
剤が存在しないかまたは低い濃度で存在する場
合、血清タンパク質からの非特異的相互作用の
ためにピーク高度に明白な変動が生じる。これ
はケイオトロピツク剤の増量で減少する。 (c) 各各の血清中にジゴキシン（1μｇ／ml）を
含有させること以外は(b)の方法をくり返す。再
びケイオトロピツク剤が存在しない場合、ピー
ク高度に非常に重要な変動が生じる。しかし前
記試薬の増量によりこの変動はカウンター自体
の変動のレベルである狭いレベル（約５％）に
まで著しく減少する。 ケイオトロピツク剤として尿素を使用して同
様の試験を行う。これは有効な効果を示すけれ
ど、上記の例におけるグアニジニウム塩酸塩ま
たはナトリウムチオシアネートほど効果的では
ない。

【表】 例 ３ 本発明におけるEDTAとNaClとの溶液の使用
法 前記のように非特異的凝集反応において血清タ
ンパク質の効果を減少させる〓似ケイオトロピツ
ク剤〓が存在する。２種の前記試薬はEDTAお
よび塩化ナトリウムである。この効果を証明する
ために血清（１部）を正常ウサギ血清９部とウシ
血清アルブミン１部とから成る水性混合物９部で
希釈して血清ブエリチンに対する検定を行う。次
にこの混合物30μlを10％ラテツクス懸濁液30μlお
よび以下の表５に記載の種種のケイオトロピツク
溶液30μlと混合する。表に記載のようにインキユ
ベートし、１つの場合ラテツクスはラテツクス
50μ当たりＦ（ab′）₂フラグメント500μｇを含有し、
別の場合ラテツクスはラテツクス30μl当たりＦ
（ab′）₂フラグメント90μｇしか含有しない。（フラ
グメントは抗―フエリチン抗体から誘導される。） 結果を表５に示す。

【表】 例 ４ 血清妨害作用を減ずるグアニジンの効果を証明
するために、チロキシン（T4）を含有する試料
をグアニジンの存在または不在下ラテツクス凝集
反応と放射性免疫学的検定法（RIA.）との両方
により検定する。試料はRFを含有する。ラテツ
クス凝集反応の結果を第１図および第２図に示
す。第１図はグアニジンの不在下での自発的な
（すなわち抗―血清の全く存在しない）ラテツク
ス凝集反応を示す。そのピーク高度はかなり変動
していることがわかる。しかし第２図においてグ
アニジンが存在する場合、ピーク高度の変動がほ
とんどない、すなわち自発的凝集反応がほとんど
ないという結果を示す。 第３図および第４図はグアニジン不在の場合
（第３図）およびグアニジン存在の場合（第４図）
の同じ試料のラテツクス凝集反応検定法と放射性
免疫学的検定法との間の相関を示す。 検定混合物中のグアニジニウム塩酸塩の量は
1.28Mであり、そしてベロナール緩衝液（PH9.1）
はEDTA0.075Mといつしよに使用する。

【図面の簡単な説明】

第１図はグアニジン不在下での自発的なラテツ
クス凝集反応の結果を示す図表である。第２図は
グアニジン存在下でのラテツクス凝集反応の結果
を示す図表である。第３図はグアニジン不在下で
のラテツクス凝集反応検定法と放射性免疫学的検
定法（RIA.）との間の相関を示す図表である。
第４図はグアニジン存在下でのラテツクス凝集反
応検定法と放射性免疫学的検定法（RIA.）との
間の相関を示す図表である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ タンパク質コーテイングを施されている粒子
   であつてそのコーテイング自身が試薬であるかま
   たは該粒子に他の手段によりさらに試薬を保持さ
   せたものであるそして該試薬は液体試料中に被分
   析物が存在するとその存在量に応じた程度に前記
   粒子を免疫反応により特異的に凝集させるもので
   ある微細に分割した固体粒子と液体試料との混合
   物をつくり、次にその凝集の程度を測定して存在
   する被分析物の量を決定することから成る免疫学
   的検定法において、前記混合物が (a) グアニジニウム塩酸塩、グアニジニウムチオ
   シアネート、ナトリウムチオシアネート、アン
   モニウムチオシアネートおよび尿素から成る群
   から選んだ少なくとも１種のケイオトロピツク
   剤を1.0Mより高い濃度で、そして (b) 塩化ナトリウム、EDTA、硝酸リチウム、
   塩素酸リチウム、リチウムイソシアネート、臭
   化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、
   カリウムチオシアネート、塩化カルシウム、塩
   化リチウムおよびヨウ化リチウムから成る群か
   ら選んだ少なくとも１種の似ケイオトロピツク
   剤を非特異的タンパク質相互作用による凝集反
   応に対する妨害作用を減少させるに充分な量
   で、 含むことを特徴とする、液体試料中の被分析物の
   免疫学的検定法。 ２ 混合物として特異的凝集反応を強める高分子
   物質をも含むものを使うことを特徴とする、前項
   １に記載の方法。 ３ 抗原またはハプテンを被分析物とし、混合物
   として前記被分析物に対して特異的な免疫グロブ
   リンのＦ（ab′）₂フラグメントをも含み免疫グロブ
   リン全体およびＦ(c)フラグメントを含まないもの
   を使うことを特徴とする、前項１または２に記載
   の方法。 ４ 混合物として、粒子の大きさまたは粒子が保
   持している試薬またはその両方の点で互いに異な
   る、タンパク質コーテイングを施された２種の異
   なる粒子を含むものを使うことを特徴とする、前
   項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５ 凝集してない粒子をカウントすることによつ
   て前記凝集反応の程度を決めることを特徴とす
   る、前項１〜４のいずれかに記載の方法。