JPH0235261B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、特異結合分析、例えばイムノアツセ
イ（immunoassay）原理に基づく液体試料中の
リガンドまたは液体試料のリガンド結合能の測定
に使用する試験具の製造方法、すなわち均一系免
疫分析用試験具の製造方法に関する。 試験ストリツプの形の試験具及び同様な固体分
析素子は、使用の際の便利さ及び速さのために、
種々の試料、特に生物学的流体、工学的流体等の
ような液体試料の分析に普通に用いられるように
なつた。試験ストリツプは、血清及び尿のような
生物学的流体における種々の臨床的に重要な物質
を検出するため考案されたものであり、特に人及
び動物の病気の診断及び治療の補助に極めて有利
であることが判明している。 試験ストリツプ型の従来の試験具は、一般に、
吸収性または吸水性マトリツクスのような担体、
例えば紙から成つており、この紙には被分析液体
試料の成分と相互に作用して検出可能な応答、通
常、変色のような電磁線シグナルを生じる試薬が
混入されている。被分析試料は、例えば試験具を
試料中に短時間浸漬するか、または既知量の試料
を装置にかけることによつて、試薬混入担体と接
触され、応答は所定の反応時間後に観察または測
定される。このような試験具の大きな利点は、決
まりきつた用法の便利さ、試料に試薬を添加する
時間や技術者の熟練を必要としないこと、及び容
易に観察しうるか、または機器で読み取りうるシ
グナルを生ずることである。更に、容易に観察し
うるか、または機器で読み取りうるシグナルは迅
速に生ずる。 種々の型の試験ストリツプが公知であり、最も
普通のPH試験紙試験具から、種々の尿成分及び血
液成分、例えばグルコース、蛋白質、潜伏血液等
を検出するための試験管内診断試験具まで、広範
な分野で多年使用されている（例えば米国特許第
3164534号、同第3485587号及び同第3012976号明
細書参照）。このような従来の試験ストリツプ中
に存在する試薬組成物は、直接化学反応によつて
測定される成分と相互に作用し、この理由及び他
の理由で、感度が限られており、従つて、前記試
薬組成物はミリモル範囲またはそれ以上の濃度で
液体試料中に存在する物質の検出に利用される。 他方、特異結合分析技術の発展により、極めて
低濃度で液体媒体中に存在する、診断、医療、環
境及び工業上重要な種々の有機物質を測定する極
めて有用な分析法が提供された。特異結合分析
は、リガンド、即ち測定すべき結合可能の分析物
と、その結合相手との間の特異反応に基づいてい
る。リガンド及びその結合相手の一方が抗体であ
り、他方が対応するハプテンまたは抗原である場
合、分析はイムノアツセイとして知られている。 従来の特異結合分析技術では、分析すべき液体
媒体の試料を種々の組成の試薬を組合せる。この
ような組成物は、標識と結合した結合成分から成
る標識複合体を含む。標識複合体中の結合成分
は、試薬の他の成分（もしあるならば）及び被分
析媒体中のリガンドと関係して、２種の標識複合
体、即ち結合種及び遊離種を生ずる結合反応系を
生成する。結合種においては、標識複合体中の結
合成分、例えばハプテンまたは抗原は対応する結
合相手、例えば抗体によつて結合され、他方、遊
離種では、結合成分はこのように結合されない。
遊離種に対する結合種を生ずる標識複合体の相対
的量または割合は、試験試料中の検出すべきリガ
ンドの存在（または量）の函数である。 結合種中の標識複合体が、遊離種中の標識複合
体の存在で、標識を監視するために使用する手段
によつて本質的に識別しえない場合には、分析を
完成するために結合種及び遊離種を物理的に分離
しなければならない。この種の分析はこの分野で
「不均一系分析」と言われる。標識複合体の結合
種及び遊離種を相互の存在で識別しうる場合に
は、分離工程を回避することができ、この分析は
「均一系分析」と言われる。 最初に発見された高感度特異結合分析は、標識
として放射性同位元素を使用する同位元素標識イ
ムノアツセイであつた。このような分析法は、標
識の検査可能の特性が遊離種及び結合種において
定性的に未変化であるので、必ず不均一系分析法
に従わねばならない。放射性物質の取扱いの不便
さ及び困難さ、及び分離工程の必要性のため、標
識成分として放射性同位元素以外の物質、例え
ば、酵素、バクテリオフアージ、金属及び有機金
属錯体、補酵素、酵素基質、酵素活性剤及び抑制
剤、閉環試薬、有機及び無機触媒、補欠分子族、
化学ルミネツセンス試薬、及び螢光性分子を使用
する均一系分析法が工夫された。このような均一
特異結合分析法は液体試料中の被分析リガンドの
存在または量に関係した検出可能な応答を生じ、
この応答は例えば化学ルミネツセンス、螢光放出
あるいは変色のような電磁線シグナルである。 特異結合分析の実施に使用される市販の試験具
は、通常、分析を行うのに必要な溶液または再水
和可能の組成物を収納する容器の組合せパツケー
ジを含む試験キツトの形である。現実の分析法を
実施するため、少量のこのような溶液を試料を含
む反応容器中に人為的または機器により分配しな
ければならない。人為的に分配する場合には、分
析は当然時間及び技術者の熟練を必要とし、機器
により分配する場合には、分析は当然、分配装置
の費用及び維持を必要とする。 分離工程を必要とする不便さ及び欠点を克服す
るために不均一系特異結合分析に固相試験具が適
用された。この種の一般に使用された固相試験具
は非多孔性表面、例えば試験管または他の容器の
内面に、吸着または共有結合によつて抗体を固着
または被覆したものである。米国特許第3826619
号、同第4001538号、同第4017597号及び同第
4105410号明細書には、抗体を被覆した試験管を
同位元素標識イムノアツセイに使用することを記
載している。また、固相試験具は不均一系酵素イ
ムノアツセイ（米国特許第4016043号及び同第
4147752号明細書）、及び不均一系螢光イムノアツ
セイ（米国特許第4025310号及び同第4056724号明
細書、並びに英国特許第1552374号明細書）にも
使用された。 このような不均一系特異結合分析試験具の使用
例は、いわゆる「ガンマーステイツク
（gammastick）に関する米国特許第4135884号明
細書の方法である。この試験具は抗体試薬を含
み、この試験具を液体試料及び反応系の残りの試
薬、特に膝識複合体と接触させる。温置期間後、
固相試験具を反応溶液から物理的に取り出し、溶
液中または試験具上で標識を測定する。 抗体試薬がゲルまたは紙ウエブのようなマトリ
ツクス中に取り込まれている同様の試験具は、米
国特許第3925017号、同第3970429号、同第
4138474号、同第3966897号、同第3981981号及び
同第3888629号明細書及びドイツ特許出願公開第
2241646号公報に記載されている。同様に、流通
カラムに保持されたマトリツクスに抗体試薬を固
定する不均一系特異結合分析に使用する装置は公
知である（米国特許第4036947号、同第4039652
号、同第4059684号、同第4153675号及び同第
4166102号明細書）。すべての不均一系特異結合分
析試験具の場合のように、試験具は、通常、分析
を実施するため必要な試薬を全部含むわけではな
く、単に必要な分離工程を一層便利にする手段で
あるにすぎない。 最後に、必要な試薬のほとんどまたは全部が同
一の担体要素に混入されている不均一系特異結合
分析試験具は報告されており、この試験具では試
薬と試料を接触させ、遊離相及び結合相の分離を
担体要素に沿つて毛細管移動により達成する（米
国特許第3641235号、同第4094647号及び同第
4168146号明細書）。このような特許に記載されて
いる装置は、一般に、製造し難く、分析を実施す
る間に担体要素及びこのような装置で測定すべき
低濃度のリガンドまたは分析物の間で起る多くの
化学的及び物理的相互作用の錯結合性により非再
現性になりやすいと考えられている。 均一特異結合分析試薬系を固体試験具に施すこ
とは、このような分析系の通常の使用者に大きい
利点を与える。液体試料中に極めて低い濃度で存
在するリガンドの測定は、装置を試料と接触させ
る工程及び肉眼による観察または機器手段によ
り、発生シグナルを測定する工程に簡易化される
であろう。試薬は、従来の試験キツトを使用する
場合に必要なように液体試薬を貯蔵、計量または
混合する必要なく、固体の形で提供される。固体
状態の装置は、従来の液体系より一層オートメー
シヨンに適用しやすい。 従来法は均一特異結合分析試薬系を固体状態の
試験具に施す方法の詳細な教示を欠く。英国特許
第1552607号明細書（普通に譲渡されている）（特
開昭51−146295号公報に対応する）には、化学ル
ミネセンス標識、酵素基質標識及び補酵素標識を
含めて種々の新規標識を使用する均一特異結合分
析系が記載されている。この特許の23頁12行以下
には、液体収納容器または不溶性で、多孔性及び
好ましくは吸収性マトリツクス、例えば吸水紙、
ポリマーフイルム、膜、フリース、またはブロツ
ク（block）、ゲル等を含めて種々の担体に分析
試薬を混入することが示唆されている。 ドイツ特許出願公開第2537275号公報には、均
一特異結合分析試薬系が記載されており、分析を
実施する際に抗体を混入したスライドまたはスト
リツプを使用しうることが提案されている。この
示唆では、標識複合体をまず試料と混合し、その
後抗体を混入した試験具を反応混合物と接触させ
る。適当な定置時間後、試験具を緩衝液で洗浄
し、乾燥し、次にシグナル（フルオレセンス）を
測定することが提案されている。即ち、このドイ
ツ特許出願公開公報は、試験具を液体反応混合物
中に浸漬し、定置し、その後取り出し、洗浄し、
最後に読み取る不均一特異結合分析技術について
既に公知のものと著しく類似した試験具及び分析
方法を示している。更に、提案された試験具は結
合分析試薬の全部を担体要素に混入してはいな
い。特に、抗体だけを担体要素に混入し、提案さ
れた試験具と接触させる前に被分析試料に標識複
合体を別個に加えることが提案されている。 本発明は均一系免疫分析用試験具の製造方法を
提供する。この試験装置は(a)被分析液体試料中の
リガンドの存在（定性または定量的意味で）また
は液体試料のリガンド結合能の函数である検出可
能の応答を生じる均一特異結合分析系用の試薬、
及び(b)このような試薬を混入した固体担体から成
る。一実施態様では、担体に分析試薬を実質的に
均一に混入する。担体は、液体試料に対して吸収
性のマトリツクス、例えば主として天然または合
成のポリマー繊維から成るウエブマトリツクス、
例えば紙、またはポリマーフイルム若しくはゲル
であるのが好ましい。別の実施態様では、担体は
多数の帯域、例えば物理的に異なる層を含み、こ
れらの帯域のそれぞれに分析試薬の種々の試薬ま
たは試薬組成物を混入する。 使用する際には、試験具を液体試料、例えば生
物学的液体、例えば血清または尿と、例えば試薬
を混入した担体を試料中に瞬間的に浸漬するか、
または少量の試料を担体の表面上に計量して施す
ことによつて接触させる。その後、検出可能の応
答を、通常所定の定置時間または反応時間後に、
分析を実施する技術者の観察または機器手段によ
つて測定する。検出可能の応答は最も普通には、
電磁線シグナル、例えば螢光、化学ルミネセン
ス、色の変化及び分光光度の応答である。 好ましい均一特異結合分析系は、酵素反応に関
与する標識を含む従来公知の分析系である。この
ような好ましい分析系の１つは、標識が酵素補欠
分子族であり、アポ酵素がこのような補欠分子族
標識と結合して活性なホロ酵素を形成しうる程度
がリガンドの存在またはリガンド結合能に左右さ
れるものである。ホロ酵素は、比色法に含めて広
範な方法によりその酵素活性により測定すること
ができる。別の好ましい分析系は、標識が酵素基
質であり、酵素がこのような基質標識に作用して
検出可能の生成物を生じうる程度がリガンドの存
在またはその結合能に左右されるものである。こ
のような均一特異結合分析系では、検出可能の生
成物は好ましくは螢光性であり、試験具からの検
出可能の応答は螢光計によつて測定することがで
きる。また、標識が酵素であり、このような酵素
標識の活性がリガンドの存在またはリガンド結合
能に左右される系も、均一特異結合分析系として
有用である。この場合にも、酵素活性を種々の方
法で測定することができる。 本発明は均一系、非放射性同位元素標識特異結
合分析、例えばイムノアツセイを実施する際に使
用され、従来の分析用試験ストリツプ及び同様の
構成の他の試験要素の便利な特徴をすべて有する
試験具を提供する。このような従来装置の場合と
同様に、本発明は所定の分析を実施するために必
要なすべての試薬を混入した固体担体、通常１種
以上のマトリツクスを提供するものであり、これ
により使用者は試験具を試験すべき試料と接触さ
せ、生じる応答を測定するだけですむ。全工程を
自動化する場合には、同じ操作を行なう機器は、
均一系特異結合分析を行なうため現在使用されて
いる従来の液体化学系を取扱わねばならないもの
よりはるかに簡単な設計を有しうる。 均一特異結合分析 かかる試験具には、任意の均一特異結合分析系
用の試薬を混入することができる。一般に、均一
特異結合分析技術は、(1)結合成分と標識の複合体
と(2)複合体中の結合成分に対する結合相手との間
の特殊な反応に基づくものであり、この場合標識
の特性は、標識複合体の結合相手によつて結合さ
れた場合には、結合されなかつた場合とは異な
る。標識の変化した特性は測定可能の性質、即ち
標識の化学的または物理的性質を有していてよ
い。若干の場合には、変化する特性は化学結合
（共有または非共有結合）を形成または破壊する
所定の反応における化学的反応性である。他の場
合には、変化する特性は、化学反応なしに測定し
うる標識の物理的特性である。 大部分の場合に、本発明の方法で製造する試験
具は試料中のリガンドまたはその結合能と免疫化
学的に反応する均一特異結合分析試薬を含む。即
ち、試薬及び／または試料中のリガンドまたはそ
の結合能の間に抗原−抗体またはハプテン−抗体
の関係がある。従つて、このような分析法はイム
ノアツセイと言われ、標識複合体とその結合相手
との特殊な反応は免疫化学的結合である。このよ
うな場合に、標識複合体の結合相手は抗原、ハプ
テンまたは抗体（またはそのフラグメント）であ
り、結合相手は対応する免疫化学結合相手であ
る。しかしながら、標識複合体と結合相手との間
の他の結合反応が、ホルモン、ビタミン、代謝産
物及び医薬、とそれぞれのレセプター及び結合物
質との間の結合反応を含めて均一特異結合分析の
基礎として作用することは良く理解されている。 特定のリガンドの存在または量を測定するため
試料を分析する場合には、均一特異結合分析技術
用の試料は、普通の場合、(1)標識に化学的に結合
したリガンドまたはその結合アナローグから成る
標識複合体、(2)リガンドに対する結合相手、例え
ば抗体またはそのフラグメント、天然レセプター
蛋白質等、及び(3)標識複合体中の標識を測定する
ため必要な任意の補助試薬から成る。試料中のリ
ガンドが結合相手に結合するための標識複合体と
競合するように制限量の結合物質を導入する。従
つて、結合種の遊離種との間の標識の分布が標識
からの検出可能の応答の大きさを決定し、この大
きさはリガンドの存在の函数である。標識複合体
がリガンドの標識結合相手から成り、リガンドに
結合したときに、標識が検出可能の応答に関して
影響される場合に、リガンドを測定する別の方法
が提示される。試料のリガンド結合能が分析され
る場合に、標識複合体はリガンドに化学的に結合
したリガンドまたはその結合アナローグから成
り、これにより例えば試料中にリガンドの結合相
手が存在するために標識複合体を結合する試料の
能力が標識から検出可能のシグナルに対して与え
る影響を決定する。 数種の異なる均一特異結合分析系が従来公知で
あり、下記のものは試験装置に使用する、このよ
うな系の例であり、本発明の範囲を限定するもの
ではない。下記の系は使用する標識の性質により
挙げたものである。 １ 酵素補欠分子族標識 この系において、標識は酵素の補欠分子族で
あり、補欠分子族標識と結合して活性酵素（ホ
ロ酵素）を形成する、触媒として不活性なアポ
酵素の能力は、標識複合体とその結合相手との
結合によつて影響される。生じるホロ酵素活性
は、究極的な検出可能のシグナルを生ずる従来
の検出系によつて測定しうる。この種の分析系
は、譲渡されている、1979年６月４日に出願さ
れた米国特許出願第45423号明細書（公告され
た英国特許第2023607号明細書に対応）に記載
されている。特に好ましい補欠分子族−標識分
析法は、標識としてフラビンアデニンジヌクレ
オチド（FAD）を、アポ酵素としてアポグル
コースオキシダーゼを使用する。生ずるグルコ
ースオキシダーゼ活性は、グルコース、パーオ
キシダーゼ、及び過酸化水素に応答して色の変
化を生じる指示薬系を含む比色検出系によつて
測定しうる。 このような好ましい分析法では、FAD−標
識複合体は式： 〔式中リボフラビン（−Phos）−₂リボースはFAD
中のリボフラビン−ピロホスフエート−リボー
ス基を表わし、Ｒは連結基を表わし、Ｌは結合
成分、即ちリガンドまたはそのアナローグを表
わす〕を有するのが好ましい。 ２ 酵素基質標識 この系において、標識複合体が酵素に対する
基質であり、基質標識複合体に対して作用する
酵素の能力が標識複合体と結合相手との結合に
よつて、陽性または陰性の意味で影響されるよ
うに標識を選択する。基質標識複合体に酵素が
作用すると、ある特性、通常化学的または物理
的特性、例えば指示薬反応における化学的特性
または光学的特性、例えば螢光または吸光
（色）で識別しうる生成物が生じる。この種の
分析系は、譲渡されている、1978年４月10日出
願の米国特許出願第894836号明細書（ドイツ連
邦共和国特許出願公開第2618511号公報に対応）
及び1979年10月23日出願の米国特許出願第
87819号明細書、並びにAnal.Chem.48：1933
（1976）、Anal.Biochem.77：55（1977）及び
Clin.Chem.23：1402（1977）に記載されてい
る。特に好ましい基質標識分析系は式： 〔式中Ｒは連結基を表わし、Ｌは結合成分、例
えばリガンドまたはそのアナローグを表わす〕
の構造の標識複合体を使用し、これにより、酵
素β−ガラクトシダーゼの、螢光によつて識別
しうる生成物を生ずる複合体を分解する能力は
複合体とその結合相手との結合によつて抑制さ
れる。 ３ 補酵素標識 この系における標識複合体はその標識部分に
おいて補酵素活性官能性によつて構成され、こ
のような補酵素標識の酵素反応に関与する能力
は標識複合体とその結合相手との結合によつて
影響される。酵素反応の起る割合は、最終的検
出シグナルを生ずる従来の検出系によつて測定
される。この種の分析系は、譲渡されている、
1978年４月10日出願の米国特許出願第894836号
明細書（ドイツ連邦共和国特許出願公開第
2618511号公報）、及びAnal.Biochem.72：271
（1976）、Anal.Biochem.72：283（1976）及び
Anal.Biochem.76：95（1976）に記載されてい
る。 ４ 酵素変調剤（modulator）標識 この系の標識複合体は、その標識部分におい
て、酵素変調剤、例えば酵素阻害剤または刺激
剤から構成され、このような変調剤標識の、酵
素活性を変調する能力は、標識複合体と結合相
手との結合によつて影響される。酵素反応の起
る割合は、最終的検出シグナルを生ずる従来の
検出系によつて測定しうる。この種の分析系は
共有に係る米国特許第4134792号明細書に記載
されている。 ５ 酵素標識 この系では、標識は酵素であり、酵素標識の
活性は標識複合体とその結合相手との結合によ
つて影響される。生じる酵素活性は最終的に検
出しうるシグナルを生ずる従来の検出系によつ
て測定しうる。この種の分析系は米国特許第
3817837号及び同第4043872号明細書に記載され
ている。 ６ 消光しうる螢光標識 この系の標識複合体は、その標識部分で、標
識複合体がその結合相手、通常抗体のような蛋
白質で結合される場合に、螢光がある測定可能
の程度で消光される螢光物質から構成される。
螢光物質は直接測定でき、その螢光が検出可能
のシグナルである。この種の分析系は米国特許
第4160016号明細書及びJ.Clin.Path.30：526
（1977）に記載されている。 ７ 螢光偏光標識 この系の標識は螢光物質である。しかし、影
響される特性は標識複合体がその結合相手、通
常抗体のような蛋白質に結合されることによる
螢光の偏光である。この種の分析系はJ.Exp.
Med.122：1029（1965）に記載されている。 ８ 化学的に励起された螢光標識 この系では、標識は再び螢光物質であるが、
螢光を発するエネルギー状態に化学的に励起さ
れる、螢光物質標識の能力が、標識複合体とそ
の結合相手との結合によつて影響される。標識
の化学的励起は通常、螢光標識をその場で形成
される高エネルギー化合物にさらすことによつ
て達成される。この種の分析系は1979年１月18
日に出願された共有の米国特許出願第4580号明
細書に記載されている。 ９ 二重抗体立体障害標識 別の分析系は米国特許第3935074号及び同第
3998943号明細書に記載されている二重抗体イ
ムノアツセイ系である。標識複合体は２種のエ
ピトープを含み、その一方はリガンド及び抗リ
ガンド抗体との免疫学的反応に関与し、他方は
第二の抗体によつて結合されうるが、２種の抗
体が同時に標識複合体に結合するのを妨害され
ている。第二のエピトープは、螢光が第二の抗
体結合によつて消光される螢光物質であるか、
または第二の抗体に結合するため第二のエピト
ープの標識形との補助的競合結合反応に関与し
てもよい。種々の検出系は前記特許に記載され
ているような系で可能である。関連分析系は米
国特許第4130462号及び同第4164515号明細書及
び英国特許第1560852号明細書に記載されてい
る。 10 エネルギー移動標識 この系では、標識はエネルギー移動ドナー・
アクセプター対の一方であり、結合相手はこの
ような対の他方と複合する。従つて、標識複合
体が結合相手によつて結合される場合、対のド
ナー成分のエネルギー表現はアクセプター成分
への移動によつて変わる。通常、ドナーは螢光
物質であり、アクセプターはその消光物質であ
り、消光物質は同様に螢光物質であつても、そ
うでなくてもよい。このような実施態様におい
て、検出可能のシグナルは螢光であるが、他の
検出系であつてもよい。このような分析系は、
米国特許第3996345号、同第4174384号及び同第
4199559号明細書及び英国特許第2018424号明細
書に記載されている。 11 他の標識 本発明で得られた試験具に使用しうる、文献
記載の、他の均一特異結合分析系は下記のよう
な標識の使用を含む； (a) 非酵素触媒、例えば電子移動剤（米国特許
第4160645号明細書参照） (b) 非酵素化学発酵物質（共有に係る前記米国
特許出願第894836号明細書参照） (c) 「チヤンネリング（channeling）」標識
（英国特許第2018986号明細書参照） (d) 「粒子」標識（英国特許第2019562号明細
書参照）、及び (e) 標識リポソーム粒子（米国特許第4193983
号明細書参照）。 リガンド 本発明で得られた試験具を使用した分析法は、
特異結合相手が存在する任意のリガンドの検出及
び、逆に、リガンドを結合する液体媒体の能力の
存在の検出（通常、媒体中のリガンドに対する結
合成分の存在による）に適用することができる。
リガンドは、通常、ペプチド、ポリペプチド、蛋
白質、炭水化物、糖蛋白質、ステロイド、または
特異結合相手が生物学的系中に存在するか、また
は合成されうる他の有機分子である。リガンド
は、機能の意味で、通常抗原及びこれに対する抗
体、ハプテン及びこれに対する抗体、並びにホル
モン、ビタミン、代謝産物及び医薬、並びにこれ
らのレセプター及び結合物質から成る群から選択
される。通常、リガンドは免疫学的に活性な分子
量1000〜10000000のポリペプチドまたは蛋白質、
例えば抗体または抗原性ポリペプチドまたは蛋白
質、または分子量100〜1500のハプテンである。 代表的ポリペプチドリガンドはアルギオテンシ
ン及び、Ｃ−ペプチド、オキシトシン、バソ
プレシン、ニユーロフイジン、ガストリン、、セ
クレチン、ブラジキニン及びグルカゴンである。 代表的蛋白質リガンドはプロタミン、ムコ蛋白
質、糖蛋白質、グロブリン、アルブミン、硬蛋白
質、リン蛋白質、ヒストン、リポ蛋白質、色素蛋
白質及び核蛋白質の類を含む。特異蛋白質の例は
プレアルブミン、α₁−リボ蛋白質、ヒト血清アル
ブミン、α₁−糖蛋白質、トランスコルチン、チロ
キシン結合グロブリン、ハプトグロビン、ヘモグ
ロビン、ミオグロビン、セルロプラスミン、α₂−
リボ蛋白質、α₂−マクログロブリン、β−リボ蛋
白質、エリトロポエチン、トランスフエリン、ヘ
モペキシン、フイブリノーゲン、免疫グロブリ
ン、例えばI_gＧ、I_gＭ、I_gＡ、I_gＤ及びI_gＥ、並び
にこれらのフラグメント、例えばF_c及びF_ab、補
体因子、プロラクチン、血液凝固因子、例えばフ
イブリノーゲン、トロンビン等、インシユリン、
メラノトロピン、ソマトトロピン、サイロトロピ
ン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ゴナ
ドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤性ラクト
ゲン、内在因子、トランスコバラミン、血清酵
素、例えばアルカリホスフアターゼ、乳酸脱水素
酵素、アミラーゼ、リバーゼ、ホスフアターゼ、
コリンエステラーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸
トランスアミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミナーゼ、及びウロペプシン、エンドル
フイン、エンケフアリン（enkephalin）、ブロタ
ミン、組織抗原、細菌抗原及びウイルス抗原、例
えば肝炎関連抗原（例えばHB_sAg、HB_cAg及び
HB_eAg）の類を含む。 代表的ハプテンリガンドは、薬剤、代謝産物、
ビタミン類、及び同様の有機化合物の一般的類を
含む。ハプテン系ホルモンはチロキシン及びトリ
ヨードサイロニンを含む。ビタミンはビタミン
Ａ、Ｂ、例えばB₁₂、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸及
びチアミンを含む。薬剤は抗生物質、例えばアミ
ノグリコシド、例えばゲンタマイシン、トブラマ
イシン、アミカシン、シソマイシン、カナマイシ
ン、及びネチルマイシン、ペニシリン、テトラサ
イクリン、テラマイシン、クロマイセチン及びア
クチノマイセチン：ヌクレオシド及びヌクレオチ
ド、例えばアデノシンジホスフエート（ADP）、
アデノシントリホスフエート（ATP）、フラビン
モノヌクレオチド（FMN）、ニコチン酸アミド
デニンジヌクレオチド（NAD）及びそのホスフ
エート誘導体（NADP）、チミジン、グアノシン
及びアデノシン；プロスタグランジン：ステロイ
ド、例えばエストロゲン、例えばエストリオール
及びエストラジオール、ステロゲン、アンドロゲ
ン、ジゴキシン、ジギトキシン、及び副腎皮質ス
テロイド：及びその他、例えばフエノバルビター
ル、フエニトイン、プリミドン、エトサクシミ
ド、カルバムアゼピン、バルプロエート、テオフ
イリン、カフエイン、プロプラノロール、プロカ
インアミド、キニジン、アミトリブチリン、コル
チゾール、デシプラミン、ジソピラミド、ドキセ
ピン、ドキソルビシン、ノルトリブチリン、メト
トレキセート、イミプラミン、リドカイン、プロ
カインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、
アンフエタミン、カテコールアミン、及び抗ヒス
タミン剤を含む。 分析すべき液体媒体は、リガンドを含むと思わ
れる天然に存在するか、または人工的に形成した
液体であつてよく、通常生物学的液体またはその
希釈液である。分析することのできる生物学的液
体は血清、血漿、尿、唾液、及び羊水及び脳背髄
液を含む。 担 体 本発明の製造方法で使用する担体は多くの形を
取ることができ、従つて広範なものとする。担体
は１種以上の適切な物質または同一若しくは異な
る吸収性或いは他の物理的特性の媒体を含む単相
または多相であつてよい。担体は疎水性または親
水性、吸水性または非多孔性であつてよい。その
最も有効な具体例では、担体は採用する特定の均
一特異結合分析系の特性に注意深く適合するよう
に調整することができる。 即ち、本明細書に使用したように、用語「担
体」は任意の物質、マトリツクスまたは特異結合
分析試薬を混入しうる表面を含むことができる。
担体は多くの公知形、例えば溶液分析用の化学的
及び酵素試薬ストリツプに利用される形をとるこ
とができる。例えば、米国特許第3846247号明細
書には、フエルト、多孔性セラミツクストリツ
プ、及びガラス繊維織物またはガラス繊維マツト
を使用することが示唆されている。米国特許第
3552928号明細書には、紙の代替物として木材ス
チツク、布、スポンジ材料、及び粘土質物質を使
用することが示唆されている。英国特許第
1369139号明細書には、紙の代わりに合成樹脂フ
リース及びガラス繊維フエルトを使用することが
示唆されている。別の英国特許第1349623号明細
書は、基礎の紙担体要素のためのカバーとして薄
いフイラメントの透光性網細工の使用を示唆して
いる。この文献も、紙を試薬系の一部で含浸し、
網細工を他の非相容性であるかもしれない化学試
薬または酵素試薬で含浸することを示唆してい
る。フランス特許第2170397号明細書には、ポリ
アミド繊維を50％より多く含む担体を使用するこ
とが記載されている。米国特許第4046513号明細
書には担体に関する別のアプローチが開示されて
おり、この場合には適当な担体上に試薬をプリン
トするという概念が使用されている。米国特許第
4046514号明細書は、反応体系中の試薬を保有す
るフイラメントの織物または編成物を開示してい
る。このような担体をすべて、本発明に使用で
き、他の担体も使用しうる。担体は吸水性物質、
例えば紙であるのが好ましく、この場合には担
体を含浸するための特異結合分析系の試薬の溶液
または懸濁液を使用する。担体はこれらの成分を
物理的に捕捉する系、例えば試験試料と接触した
ときに破壊するポリマーマイクロカプセルであつ
てもよい。担体は、成分が担体と液体または半液
体状態で均一に混合され、これをその後に硬化ま
たは固化して成分を捕捉する系であつてもよい。 担体についてどの材料を選択するか、材料が多
孔性であつて、成分を例えば成分を含む溶液で飽
和することにより混入しうるか、材料が非多孔性
で例えば試薬のプリント適用に使用するか、連続
被覆を支持するものか、織物であるか、または編
成物か、組成や構造がどのようなものか、その選
択はいずれにしても予期される用途または試薬系
によつて決定される。例えば、試薬の多工程適用
を利用するのが望ましい。このような場合には、
２種以上の試薬の溶液または懸濁液を調製し、担
体を各溶液または懸濁液に連続的に浸漬し、各浸
漬毎に乾燥工程を入れる。このような場合、紙の
ような多孔性材料が最も有利である。また、多相
担体を利用するのも望ましく、その場合には２層
以上の多孔性材料を上下に重ねて固着する。担体
への混入の更に別のアプローチは連続ポリマーを
イムノアツセイ系の異なる試薬を含む複数の被膜
で連続的に被覆することである。妨害するかもし
れない物質が分析系に達するのを排除し、試料中
に存在する分析物を通過させるために、過層が
担体中に存在してもよい。 従つて、担体の適切な選択はただ２つのフアク
ター、即ち予定の用途及び採用する特異結合分析
系の性質に左右されることが判る。この示唆があ
れば、適切な担体を選択することは、通常の実験
の問題となる。 試験具の製造 本発明の製造方法は担体に試験系の成分を混入
することから成る。この混入が本発明による分析
試薬の溶液での含浸によるものである場合には、
こうして含浸した担体を乾燥する。本発明の製造
方法では典型的な含浸の他に、例えば担体材料の
層上に組成物をプリントまたは噴霧するか、また
は溶液をフイルムを形成する液体中に配合し、こ
うして調製した担体材料に含浸させ、硬化または
固化することによつて作ることができる。 担体が多層、例えば紙または他の繊維材料から
成る場合、このような層を層間に液体を通すこと
のできる接着剤によつて層関係を保持することが
できる。フイルム形成剤を使用して一体構造の分
析要素を製造する場合には、層を別々に予め形成
させ、積層して完成要素を作ることができる。フ
イルム層の材料は可塑剤及び寸法安定性を与える
ため適当なポリマーから成る組成物であつてよ
い。このような方法で製造される層を溶液または
分散液から表面（乾燥した層を物理的に剥離しう
るもの）の上に被覆するのが一般的である。しか
しながら何回もの剥離・積層工程を回避しうる便
利な方法は、最初の層を剥離表面または必要に応
じ支持体上に被覆し、その後これらの予被覆層上
に直接連続層を被覆することである。このような
被覆はナイフ塗布装置を使用して手で、または浸
漬またはビーズ被覆のような技術を使用して機械
で達成することができる。機械被覆法を使用する
場合には、感光性写真フイルム及び紙の製造に周
知のホツパー被覆法を使用して隣接層を同時に被
覆することも屡々可能である。 ブラツシ（Blush）ポリマー層をフイルム層材
料として使用することができる。フイルムは、ポ
リマーを下記の２種の液体の混合物中に溶かすこ
とによつて基材上に形成される。それらの液体の
一方は低沸点で、ポリマーに対する良好な溶媒で
あり、他方は高沸点で、ポリマーに対して非溶媒
であるか、または少なくとも貧溶媒である。この
ようなポリマー溶液を次に基材上に被覆し、制御
した条件下で乾燥する。低沸点溶媒はより容易に
蒸発し、被膜は貧溶媒または非溶媒である液体中
で濃厚になる。適切な条件下で蒸発が進むに従つ
て、ポリマーは多孔性層を形成する。本発明に使
用する多孔性ブラツシポリマー層を製造するた
め、多数の異なるポリマーを単独または組合せて
使用することができる。ポリマーの代表例はポリ
カーボネート、ポリアミド、ポリウレタン及びセ
ルロースエステル、例えば酢酸セルロースであ
る。標識複合体または他の試薬を含む層のような
層には、マトリツクス及び混入される活性物質を
含む被覆溶液または分散液を製造し、前記のよう
に被覆し、乾燥して寸法安定性の層を形成するこ
とができる。 任意の層の厚さ及び透過性の程度は広く変動で
き、現実の用途に左右される。約5μ〜約100μの
乾燥層は便利であつたが、ある状況では更に広範
な厚さが好ましいこともある。例えば、比較的大
量の相互作用物質、例えば酵素のようなポリマー
物質が必要である場合には、僅かにより厚い層を
製造するのが望ましい。 反射放射測定、例えば反射測光法または同様の
技術によりシグナルの検出を容易にするためのよ
うに、場合により検出する輻射線に対して吸収性
の反射性層を１層以上担体内に含めるのも望まし
い。このような反射性層は前記の層の１つによつ
て設けるか、または要素内に付加的機能を有しな
い付加層によつて設けることができる。反射性層
に役立てるために反射性顔料、例えば二酸化チタ
ン及び硫酸バリウムを使用することができる。ブ
ラツシポリマーは適当な反射性物質である。１つ
の好ましい態様では、ブラツシポリマー層に顔料
を配合して反射性または他の機能を向上させるこ
ともできる。ブラツシポリマーと共に層中に含め
ることができる顔料の量は、著しく変動し、ブラ
ツシポリマー１重量部当り顔料約１〜10重量部の
量が好ましく、ブラツシポリマー１重量部当り顔
料約３〜６重量部の量が最も好ましい。 担体の層中に１種以上の表面活性剤、例えば陰
イオン及び非イオン表面活性剤を配合するのが有
利でありうる。表面活性剤は例えば層配合物の被
覆可能性を高め、表面活性剤のような助剤の不存
在では液体試料によつて容易には湿潤されない層
の湿潤の程度及び範囲を高めることができる。担
体の層中に、選択した分析において化学反応によ
り不活性にしうる物質またはこのような分析に有
害であるかもしれない物質を含むのが望ましいこ
ともある。 前記のように、一体構造の分析要素は自立性で
あるか、または支持体上に被覆されていてもよ
い。支持体は光または他のエネルギーに対して不
透明または透明であつてよい。特定の担体のため
選択する支持体はシグナル検出の所定の態様に適
合する。好ましい支持体は約200nｍ〜約900nｍ
の範囲の波長の電磁線を透過しうる透明な支持体
材料である。支持体は、もちろん200〜900nｍの
全範囲にわたつて透過する必要はないが、支持体
を通る分析結果の螢光測定検出には、支持体がよ
り広い範囲で透過するか、または検出に使用する
螢光物質の吸収及び放出スペクトルで透過するの
が望ましい。１つ以上の狭い波長バンドを透過
し、隣接する波長バンドに対して不透明の支持体
を有することも望ましい。これは、例えば適当な
吸収特性を有する１種以上の着色剤で支持体を含
浸または被覆することによつて達成される。 次に、本発明の試験具の製造方法で採用する多
更含浸法について説明する。 多重含浸法 担体材料の層を第一溶媒（水性媒体）中の試薬
の第一溶液または懸濁液で含浸し、乾燥する。そ
の後、担体材料を第一溶媒によつて含浸された試
薬との反応を防止する第二溶媒（有機溶媒）中の
残りの試薬の第二溶液または懸濁液で含浸し、乾
燥する。この方法で、それぞれ溶液中の試薬は試
験具の製造の間に実質的に相互作用できず、早期
に反応しない。好ましい実施態様では、第一の試
薬を水性浸漬浴を使用して担体材料の層に混入す
る。残りの試薬のため、適当な有機溶媒、例えば
トルエン、アセトン、クロロホルム、塩化メチレ
ン、ｎ−プロパノール及び二塩化エチレンを使用
す。この層は有機溶媒を蒸発させることによつて
硬化させる。更に詳細なことは下記の実施例に示
す。 多層要素 第一層または上層に使用する特異結合分析系の
試薬の全部ではないが、若干のものを混入し、第
二層または下層に残りの試薬を混入し、個々の層
を例えば乾燥により硬化し、固定して相互に積層
関係にすることによつて多層要素を製造する。吸
収性担体材料を使用する場合には、これらの要素
を、個々の層を含浸し、こうして含浸した層を乾
燥することによつて製造する。 第一層及び第二層はそれぞれ一対の対向面を有
する。第一層の１つの表面は第二層の一方の面と
積層関係にあり、試料を前記のどちらかの層の他
方の表面に施す。積層関係とは、液体であろう
と、気体であろうち、流体が、このような層の重
ねられた表面の間を通過できることを意味する。
このような層は連続しているか、または介在層に
よつて隔てられていてもよい。介在層はすべての
層の間の通過を妨げるべきではない。 凍結乾燥法 この方法は単層分析要素中で非認容性の試薬の
間の反応を防止しながら配合する操作から成る。
例えば、吸収性担体材料を使用する場合には、第
一群の試薬を高温で（または凍結乾燥により）層
材料に混入し、処理した層を硬化する。周囲温度
で第一群と反応する試薬を含む第二群の試薬を施
し、要素を急速に凍結する。凍結は早期の反応を
防止し、凍結乾燥によるその後の水の除去は、層
を室温にもどしたときの早期の反応を防止する。 好ましい実施態様では、一方の試薬群を水溶液
として層に施し、乾燥することができる。水溶液
中の第二群の試薬の添加に続いて迅速に凍結し、
次に凍結乾燥して水を除去する。この操作により
水にだけ溶ける若干の試薬を混入し、相互反応を
防止することができる。更に、若干の試薬（例え
ば酵素）に悪い影響を与えるかもしれない有機溶
媒の使用を回避することができる。 この操作によれば、均一特異結合分析試薬を利
用して、すべての試薬を単層要素内に加えた要素
の調製をすることができる。 可逆的錯体形成方法 試料リガンドと結合相手（ここでは抗体「A_b」
で例示する）に結合するための標識リガンドとの
間の競合は、下記の式でまとめることができる： リガンド ＋ 標識リガンド AbA_b：リガンド ＋ Ab：標識リガンド 前記の系で、抗体及び標識リガンドを試料を導
入するまで別々に保つ。本発明のこの実施態様は
下記の式で示したように可逆反応及びリガンドと
の再平衡を使用するもので、置換される標識リガ
ンドの量は試料のリガンド濃度に関係する： リガンド ＋ Ab：標識リガンドAb：リガンド ＋ 標識リガンド 利点は、すべての試薬成分を１つの配合媒体中
で混合して試験すべき試料の添加だけを必要とす
る系を作りうることである。 分析要素を、与えられた複合体をそのそれぞれ
の抗血清と共に短時間、例えば15分間定置するこ
とによつて分析要素を製造する。次に、付加的試
薬を加え、系を更に定置する。こうして形成した
溶液を含浸するか、または担体材料の層に混入
し、次にこれを硬化させる。 検出可能の応答 前記のように、最近工夫された均一特異結合分
析系の多くは、液体試料中の被分析リガンドの存
在または量に関係する検出可能の応答、例えば色
の変化、化学ルミネセンスまたは螢光を生じる
か、またはこれらを生じるように容易に適合する
ことができる。 本明細書において用語「検出可能の種」及び同
様の用語は、自体直接若しくは間接的に検出しう
る原子、化学基（即ち分子の一部）または化合物
に関し、本明細書に使用する同様の用語はこのよ
うな種の存在の検出可能の証拠に関する。例え
ば、電磁線シグナル、例えば螢光、隣光、化学ル
ミネセンス、可視の色の変化を生ずる。可視スペ
クトルにおける光の吸収または反射の変化、可視
範囲外、例えば紫外または赤外範囲の光の吸収ま
たは反射の変化である。イムノアツセイの分野の
当業者には明らかなとおり、本明細書に使用する
用語「検出可能の応答」は最も広い意味で使用す
るものである。用語「検出可能の応答」は系パラ
メータにおける観察しうる変化、例えば試薬の変
化若しくは試薬の外観の変化、試験試料中の任意
の成分の観察しうる沈澱、またはイムノアツセイ
系若しくは試験試料における他の任意のパラメー
タの変化を含むものである。このような他の検出
可能の応答は電気化学的応答及び熱量の応答を含
む。更に、検出可能の応答は、感覚器官によつて
直接、または補助的検出装置、例えば分光光度
計、紫外線検出装置、螢光計、分光螢光計、PH計
及び他の検出装置を使用することによつて観察し
うる応答である。意図する分析の基礎である分析
物の作用により生ずる拡散性生成物の量に影響す
ることなく、充分量の検出可能の種に上記のよう
な検出可能性を便利に与えるのが望ましい。 検出可能の変化として分析結果を得た後、通
常、反射、透過または螢光測光のため適当な装置
が設けられている帯域に試験要素を通すことによ
り変化を測定する。このような装置は、一実施態
様では支持体を通る光のようなエネルギーの束を
支配するのに役立つ。次に、光を要素の背部から
検出装置へ反射させるか、または透過検出の場合
には要素を通つて検出器へ通過する。好ましい態
様では、分析結果は要素の領域で、このような結
果が生じる領域内で全部検出される。反射分光測
光法を使用することは、要素の層上または層中に
残つた残渣、例えば血球または尿の沈渣または非
典型的尿の色からの光学的干渉を有効に回避する
ので、若干の状態では有利である。必要に応じ、
従来の螢光測光法を使用することもできる。更
に、要素の一方の表面で輻射エネルギーの流れ、
例えば紫外線、可視光線または赤外線を反応さ
せ、要素の反対側の表面からそのエネルギーの出
力を測定することによつて、指示反応生成物を検
出、定量するため透過法を使用することができ
る。一般に、約200〜900nｍの範囲内の電磁線が
このような測定に有用であることが判明したが、
要素が透過性であり、要素中で生じる生成物を定
量しうる任意の輻射線を使用することもできる。
分析のための対照標準を提供するため、種々の検
量法を使用することができる。例えば、分析に示
差測定を使用しうるように試料の滴を置く領域に
隣接して、被分析リガンドの標準溶液の試料を施
すことができる。 実施例 下記の例は、本発明を開発する際に行なつた実
験を記載したものである。これらの実施例は好ま
しい実施態様を説明するものであり、本発明の範
囲を決して限定するものではない。 Ａ 補欠分子族−標識イムノアツセイ試験具 例 モデル系 英国特許第2023607号明細書に記載されている
補欠分子族−標識均一イムノアツセイ試薬系を標
準乾式試験具中に混入するときの種々のパラメー
タを研究するために、モデル系を実験的に工夫し
た。モデル系が応答するリガンドはＮ−（２，４
−ジニトロフエニル）−ε−アミノカプロン酸
（以下「DNP」と記す）であつた。この系の免疫
化学的成分を成す試薬は、DNPに対する抗体、
DNPとフラビンアデニンジヌクレオチドの複合
体（以下「DNP−FAD」と記す）、及びアポグ
ルコースオキシダーゼを含んでいた。 系を、DNP−FAD複合体によるアポグルコー
スオキシダーゼの活性化による色を示すことによ
つてDNPに応答するようにした。抗体によつて
結合されないDNP−FADはDNP濃度に直接比例
する。DNP−FADは、アポグルコースオキシダ
ーゼと結合して活性グルコースオキシダーゼ酵素
を生じうることによつて検出しうる。反応系は、
アポ酵素の他に、抗体及び複合体を含み、グルコ
ースオキシダーゼ検出系はグルコース、３，3′，
５，5′−テトラメチルベンジジン（TMB）、及び
西洋わさびパーオキシダーゼから成る。アポ酵素
をグルコースオキシダーゼに活性化すると、グル
コースを過酸化水素に酸化し、その後パーオキシ
ダーゼの存在でTMBをその青色の酸化状態に変
えるため青色が生じた。 １ アポ酵素の製造 マイルス・ラボラトリイス社（Miles
Labora−tories、Inc.）から入手した、高度精
製グルコースオキシダーゼ（カタログNo.31−
619）の試料からアポ酵素を製造した。この酵
溶素液（1000単位／ml）10.5mlをグリセロール
4.5mlとガラスビーカー中で混合し、混合物を
０〜４℃の温度に冷却した。混合物のPHを、10
％硫酸水溶液を使用して、PH1.4に達するまで
低下した。ビーカーを氷浴中に浸漬して、この
操作を常に撹拌しながら実施し、撹拌を２時間
続けた。この時間後、溶液をセフアデツクスＧ
−50（媒体）交叉結合したゲル過媒体の1.5×
43cmのカラム上に注いだ。セフアデツクスを、
酵素溶液を導入する前に、PH1.4の30容量％グ
リセロール水溶液で平衡にした。酵素溶液をセ
フアデツクスカラムに導入したのに続いて、30
％グリセロール溶液を更に使用してアポ酵素を
希釈した。流出液をフラクシヨンに分け、
280nｍでのUV吸収を使用して観察した。この
波長に吸収を有するフラクシヨンを、活性炭50
mg及びデキストラン〔フアルマシア・カムパニ
イ（Pharmacia Company）No.Ｔ−70〕25mgを
含む緩衝液と混合した。緩衝液は、１モルのト
リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンにグ
ルタミン酸をPHが7.0に達するまで添加した水
溶液から成るものであつた。次に、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタンの飽和溶液
を使用して、生じた流出溶液のPHを再調整し
た。この最終溶液を氷浴中で１時間撹拌した。
次に、アポ酵素溶液を遠心分離し、上澄液をミ
リポール・コーポレーシヨン（Millipore
Corporation）から得た0.5μｍの過器及び
0.22μｍの過器を通して過した。 ２ DNP−FAD複合体の製造 複合体を下記のように製造した。N₆−（トリ
フルオロアセトアミドヘキシル）アデノシン−
5′−モノホスフエートをトレイヤー（Trayer）
らの方法〔Biochem.J.139、609〜623（1974）〕
によつて合成した。N⁶−（トリフルオロアセト
アミドヘキシル）アデノシン−5′−モノホスフ
エート56mg（0.1ミリモル）を水約10ml中に溶
かし、トリ−ｎ−ブチルアミン25μ（0.1ミリ
モル）を加えた。水を真空下で除去し、残渣を
無水のジメチルホルムアミド10ml中に溶解し、
次にジメチルホルムアミドを真空下に除去し
た。残分を無水ジメチルホルムアミドから更に
３回蒸発させた。最後の残分を乾燥ジメチルホ
ルムアミド10ml中に溶かした。Ｎ，N′−カル
ボニルジイミダゾール80mg（0.5ミリモル）を
加え、1.5時間反応させた。次に水15μを加
え、溶媒を真空下に除去した。N⁶−（トリフル
オロアセトアミドヘキシル）アデノシン−5′−
モノホスフエートの残渣をジメチルホルムアミ
ド10ml中に溶かす。 ジヨンソン（Johnson）らの方法（Anal.
biochem.86、526〜530、1978年）によつて精
製した47mgを水約10mlに溶かし、トリ−ｎ−オ
クチルアミン43μ（0.1ミリモル）を含むアセ
トン20mlに滴加した。添加前に生成した沈殿は
完成していた。リブフラビン−5′−モノホスフ
エートが溶解するまで、溶媒を回転蒸発器で除
去した。次に、アセトン５ml及びジメチルホル
ムアミド５〜10mlを加え、混合物を乾燥させ
た。残分を乾燥ジメチルホルムアミド15〜20ml
中に溶かし、乾燥させた。この操作を３回繰り
返した。残分をジメチルホルムアミド５mlに溶
かし、ジメチルホルムアミド中のイミダゾリド
の溶液の前記10mlと混合した。反応混合物を室
温で一夜放置し、次に溶媒を除去した。残分を
水50ml中に取り、重炭酸塩の形のDEAE−セル
ロース〔フアツトマン（Whatman）DE23：ニ
ユージヤージー州クリフトンのフアツトマン社
（Whatman、Inc.〕の2.5×25cmのカラムに施し
た。水２及び0.3M重炭酸アンモニウム２
で生じた線状傾斜でクロマトグラムを展開し
た。シリカゲル60F254〔西ドイツ、ダルムシユ
タツトのエー・メルク（E.Merck）〕上でエタ
ノール／1M−トリエチルアンモニウム重炭酸
塩PH7.8（容量で７：３）を使用して薄層クロマ
トグラフイーを行ない、68〜73番のフラクシヨ
ンが多量の（R_F0.75）及び少量の（R_F0.36）黄
色化合物を含むことが判つた。これらのフラク
シヨンをプールし、光学的吸収スペクトルは
267nｍ、373nｍ及び450nｍで最大であつた。 プールした材料から溶媒を除去し、残分を水
約５mlに溶解した。この溶液を5M−NaOHで
PH11.0に調節し、室温で９時間放置した。薄層
クロマトグラフイーにより、R_F0.75の成分は消
えたが、R_F0.37の新しい黄色物質が現われたこ
とが判つた。反応混合物を塩酸でPH8.0に調節
し、重炭酸塩の形のDEAE−セルロースのカラ
ムに施した。クロマトグラムを水１及び
0.2M重炭酸アンモニウム１の線状傾斜で展
開した。カラムからの黄色流出液をプールし、
溶媒を除去した。残分をエタノール／1M−重
炭酸トリエチルアンモニウム（PH7.8、容量で
８：２）で平衡にしたシリカゲル50ｇのカラム
の上に置いたシリカゲル２ｇ上に吸着させた。
クロマトグラムを同じ溶媒で展開し、R_F0.37の
黄色成分を集め、溶媒を除去した。フラビン
N⁶−６−Ｎ−アミノヘキシルアデニンジヌク
レオチド〔以下N⁶（アミノヘキシル）FADと
記す〕の収率は、450nｍでの吸収に基づいて
約10％であつた。 N⁶（アミノヘキシル）FAD0.06ミリモルを含
む0.21M重炭酸ナトリウム溶液10mlに無水エタ
ノール１ml中の２，４−ジニトロフルオロベン
ゼン17μを撹拌しながら滴加した。反応混合
物を暗所で４〜６時間撹拌し、次にエタノール
0.5mlに溶かした２，４−ジニトロフルオロベ
ンゼン10μを加えた。反応混合物を一夜撹拌
した。シリカゲル（シリカゲル60、Ｆ−254、
エー・メルク社）上でPH7.5のエタノール／重
炭酸トリエチルアンモニウム（７：３）溶媒を
使用して薄層クロマトグラフイーを行ない、
N⁶（アミノヘキシル）FADが完全に反応した
ことが判つた。 反応混合物をフアツトマンの＃１紙を通し
て過し、液を0.3M重炭酸アンモニウムで
平衡にしたセフアデツクスLH−20の2.5×56cm
のカラムに施した。クロマトグラムをこの溶液
で展開し、数種の黄色物質を別々のピークとし
て溶離した。0.3M重炭酸アンモニウム470〜
590mlの間で溶出するピークはアポグルコース
オキシダーゼを活性化したものだけであつた。
前記のように薄層クロマトグラフイーを行なう
と、この物質はR_F＝0.84及び0.89の２つの黄色
螢光スポツトに分かれる。最高吸収スペクトル
は265nｍ、370nｍ及び455nｍに最大を有する。 生成物の試料をワーシントン・バイオケミカ
ル社（Worthington Biochemical Corp.）か
ら得られた蛇毒ホスホジエステラーゼ製剤〔ク
ロテウス・アダマトセス（Croteus
adamatoces）〕と反応させた。薄層クロマトグ
ラフイーは、反応生成物がリボフラビン−5′−
モノホスフエート及びN⁶−（２，４−ジニトロ
フエニル−アミノヘキシル）アデノシン−5′−
モノホスフエートであつたことを示した。スポ
ツトの強度から、R_F＝0.84の物質が酵素によつ
て消化される物質であることが判つた。消化は
３日後に完全ではなかつた。 ３ 試験具の製造 成分を紙担体マトリツクス中に二浸漬法で混
入することによつて試験具を製造した。第一回
含浸浸漬はTMB中で２ｍＭにしたアセトン溶
液であつた。寸法４cmの平方のイートン・アン
ド・ダイクマン（Eaton＆Dikeman）の205
紙片をTMB溶液中に浸漬し（第一回浸漬）、
取り出し、強制通風炉中で90℃で１〜２分乾燥
した。 下記の成分を下記の順序で結合することによ
つて第二浸漬溶液を製造した： 水性緩衝液（PH6.4）^* 0.4ml グルコース（1M） 0.2ml 西洋わさびパーオキシダーゼ（135単位／mg：
1.25mg／ml） 0.2ml ポリビニルアルコール〔モンサント
（Monsanto）20〜30：10ｇ／100ml水〕 0.2ml 牛血清アルブミン（マイルス・ラボラトリイス
社：20mg／水１ml） 0.05ml アポグルコース・オキシダーゼ（FAD結合部
位5.0ナノモル／ml） 0.4ml DNP^**に対する部分的に精製した抗体 0.56ml ＊緩衝液は溶液100ml当りトリス−（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン10.8ｇ、グルタミン酸
9.7ｇ及びクエン酸1.6ｇの水溶液である。 ＊＊部分的に精製した抗体は、マイルス・ラボ
ラトリイス社から得られたDND抗血清から
作つたものである。リビングストン
（Livingston）によつて「メソツド・イン・
エンツイモロジイ（Methods in
Enzymology）」巻（W.B.Jakoby及
びM.Wilchek、3ds）、725頁〔1974年ニユー
ヨークのアカデミツク・プレス（Academic
Press）発行〕に記載されているように硫酸
アンモニウムで沈殿することによつてイムノ
グロプリンフラクシヨンを単離した。この操
作からの最終的沈殿を50ｍＭ燐酸カリウム
（PH6.8）に溶かして全容量を使用した血清の
もとの容量にした。この溶液を同じ緩衝液
（50ｍＭ燐酸カリウム）500容量に対して４℃
で一夜透析した。 本発明の実験に使用する前に、前記のように
製造したアポ酵素をマンニツト10重量％を含む
PH7.0の20ｍＭトリス−グルタミン酸塩緩衝液
に対して透析した。 次にこの第二の浸漬溶液を使用して、TMB
で予め含浸した紙を含浸した。TMB−支持紙
を第二の浸漬溶液に浸漬し、取り出し、強制通
風炉中で90℃で６分間乾燥した。 寸法約0.5×8.3cmの２軸配向ポリスチレンス
トリツプの一端に0.5cm平方の乾燥した紙を載
置した試験具装置を製造した。載置は、スリー
エム社（3M Company）から入手しうる、ダ
ブル−ステイツク（Double−Stick）として知
られている両面接着テープを使用して達成し
た。 前記のように製造した試薬装置をDNP−
FAD複合体を1μMにした水溶液と接触させる
ことによつて試薬系を完成した。装置を試験す
る際に利用した溶液はすべて、前記量の複合体
を含み、リガンド、DNPを全く含まないかま
たは種々の量で含む。従つて、４種の試験溶液
を下記のように作つた：

【表】 ４ 性能評価 試験具の性能を試験するに当り、それぞれを
前記試験溶液の１つの15μで湿潤した。試験
溶液と接触させた後、各装置を底に紙の湿潤
片を置いた、蓋をしたシヤーレ中に６分間定置
した。このシヤーレは湿潤室として作用する。 前記のように製造し、定置した試薬装置の性能
を、「ラピツド・スキヤンナー（Rapid
Scanner）」として知られている装置を使用して
機器により分析した。この装置は、デイジタル・
イクイプメント・コーポレイシヨン（Digital
Equipment Corporation）から得られるPDP−
12コンピユータを中間に置いた走査反射分光光度
計である。この装置を、可視範囲で反射スペクト
ルの迅速測定のため使用する。コンピユータはス
ペクトルデータを貯蔵、計算することができる。
ラピツド・スキヤンナーにおける試験ストリツプ
の性能の測定は、同じ装置の肉眼による観察より
下記の利点を有する： １ 光源及び試料を取りまく条件は一定のままで
ある。肉眼の読みでは、光源は波長成分におい
てばかりでなく、観察するストリツプの位置に
関しても変動しうる。 ２ 検出特性はラピツド・スキヤンナーにおいて
一定のままである。肉眼による観察では、検出
値（即ち、観察者の目における）は人により、
同じ人でも日により変動する。 ３ ラピツド・スキヤンナーは人の観察よりデー
タの一層精確な定量を可能にし、肉眼観察より
一層客観的方法で結果を比較することができ
る。 ラピツド・スキヤンナー装置は、アメリカ合
衆国インデイアナ州エルカートのマイルス・ラ
ボラトリイス社のエイムス・カンパニイ・デイ
ビジヨン（Ames Company Division）によつ
て作られたものであり、この会社から構造及び
性能特性に関する完全な情報が得られる。 ４種の溶液を接種した試験具をラビツド・ス
キヤンナーを用いて分析した。この分析から得
たスペクトルを第１図に示す。第１図の４本の
曲線は反射率−波長曲線である。酸化された
TMBの青色範囲における最大吸収波長である
660nｍでのストリツプの性能は特に興味深い。
反射率はリガンド濃度の増加と共に減少し、こ
れによりDNP−カプロエートの種々の濃度の
定量分析溶液における装置の有効性を示す。更
に、各リガンド溶液に関する色の差異は、試験
具の色とリガンドの濃度との間に目に見える相
関関係を生じうるのに充分に大きかつた。 この実験により、抗体及びアポ酵素はそれぞ
れの複合体、この場合にはDNP−FADに関し
て、試薬の添加順序を定めることなく、同時に
競合しうることが判る。更に、免疫化学的分析
系の試薬を分析を実施する時間以前に混合し、
長く貯蔵する実用性が証明される。 例 単位化イムノアツセイ試験具 分析を行なう前に複合体を直接担体要素中に混
入し、これにより均一イムノアツセイ試験具を作
ることにより、例のモデル系を改良することを
試みた実験を行なつた。 寸法3.75×6.25cmのバツクアイ（Buckeye）Ｓ
−22の紙片を、乳化剤〔GAF ON−870、ジエネ
ラル・アニリン・アンド・フイルム社（General
Aniline＆Film Corp.〕を0.1ｇ／100ml含むアセ
トン中の５ｍＭ TMBの第一浸漬液中に浸漬し
た。第一浸漬溶液のこの後者の成分は、長鎖脂肪
アルコールで末端をキヤツプしたポリエチレンオ
キシドポリマーである。ポリマーを構成するエチ
レンオキシド：脂肪アルコールのモル比は30：１
である。次に、紙を50℃で１分間乾燥した。 乾燥に続いて、下記の成分を混合することによ
つて製造した第二浸漬溶液中に紙を浸漬した： 水性緩衝液（1Mトリス・グルタミン酸塩、PH
6.4） 0.4ml グルコース（1.0M） 0.2ml 西洋わさびパーオキシダーゼ（153単位／mg、
1.25mg／ml） 0.2ml ポリビニルアルコール（モンサント20〜30：10
ｇ／100ml水） 0.2ml 牛血清アルブミン（マイルス・ラボラトリイス
社：20mg／ml水） 0.05ml アポグルコースオキシダーゼ（FAD結合部位50
ナノモル／ml） 0.08ml DNPに対する部分的に精製した抗体（例１参照）
0.27ml 蒸留水 0.6ml 50℃で12分間乾燥した後、水中の80μM DNP
−FAD複合体250μをｎ−プロパノール9.75ml
と混合してDNP−FAD2μMの浸漬溶液を生ずる
ことによつて製造した第三の浸漬溶液中に紙を浸
漬した。第三の含浸に続いて、紙を50℃で４分間
乾燥した。 寸法約0.5×8.3cmの２軸配向ポリスチレンスト
リツプの一端に載置した0.5cm平方の３重含浸紙
を有する試験具を製造した。載置は、ダブル−ス
テツク（スリーエム社）として知られている両面
接着テープを使用して達成した。 これらの試験具を各溶液中に浸漬し、浸漬した
ストリツプを３分間定置し、ストリツプをラピツ
ド・スキヤンナー（例参照）で分析して光の反
射率を測定することによつて種々の濃度のDNP
に対する応答性について試験した。660nｍで得
たデータを第２図にグラフで表わすが、この図に
はＫ／ＳをDNP濃度に対してプロツトした。
Ｋ／Ｓは下記の式により定義される： Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）²／2R 〔式中Ｋは定数であり、Ｓは特定の反射媒体の散
乱係数であり、Ｒは試験ストリツプからの反射率
の分数である〕。この関係は周知のクベルカ−ム
ンク（Kubelka−Munk）の等式の簡単にした形
である〔グスタフ・コルテユーム（Gustav
Kortu¨m）、「リフレクタンス・スペクトロスコピ
イ（Reflectance Spectroscopy）」、106〜111頁、
ニユーヨークのスプリンガー・フエルラツツ
（Springer−Verlaz）、1969年〕。 ラピツド・スキヤンナーからの結果を使用し
て、Ａ表に示した色差単位（ΔE）を計算するこ
とによつて性能を評価した。ΔEは試験具中に存
在する指示薬、パーオキシダーゼ及びグルコース
と共にアポ酸素及びDNP−FAD複合体が存在す
る結果として色の外観に比例する数値である。ラ
ピツド・スキヤンナーからの三刺激値を使用し
て、「サプリメントNo.２・トウ・コミツシヨン・
インターナシヨナル・ド・レクラレージ
（SupplementNo.２ to Commission
International de L′Eclairage）（パリ）、パブリ
ケイシヨンNo.15 カロリメトリイ
（Colorimetry）．（E.−1.3.1）、1971年」に記載さ
れている従来法によりΔEを計算する。 Ａ 表 DNP−カプロエートのレベルの間の肉眼による
差異DNP−カプロエート（μM） ΔE ０−１ 10.5 １−２ 3.2 ２−４ 4.5 ４−８ 5.2 これらのデータは、固体状態で完全に単位化さ
れた均一系イムノアツセイの有用性を示す。 例 担体マトリツクスにおけるアボ酵素の安定性の
改良 実験の努力は、紙のような担体マトリツクス中
でアポグルコースオキシダーゼを安定化し、これ
により試験具のより大きい反応性、感度及び貯蔵
可能期間を保証する方法に関するものであつた。
抗体を省く以外は例と同様に試薬ストリツプを
製造した。２浸漬系を利用し、寸法４cm平方のイ
ートン・アンド・ダイクマンの205紙片を
TMB及びアセトンを含む第一浸漬液で含浸し、
乾燥し、複合体に対して感受性の試薬系を構成す
る他の成分を含む第二の浸漬溶液で再含浸した。
この方法で製造した装置を熱応力に付し、複合体
を接種して牛血清アルブミン（BSA）及びポリ
ビニルアルコール（PVA）の、アボ酵素の安定
性に対する効果を研究した。 アセトン中の３，3′，５，5′−テトラメチルベ
ンジジン（TMB）の２ｍＭ溶液２mlを使用し
て、イートン・アンド・ダイクマン205紙の４
cm平方の片を含浸した。この紙片を強制通風炉
中で90℃で１〜２分間乾燥した。 トリス−グルタミン酸塩クエン酸塩緩衝液（PH
6.4）を0.33M（例参照）の濃度で、グルコース
を0.1Mで、西洋わさびパーオキシダーゼ19単
位／ml、グルコースオキシダーゼアポ酵素
（FAD結合部位1.3nモル／ml）、牛血清アルブミ
ン（BSA）を0.5mg／ml及びポリビニルアルコー
ル（PVA）を10mg／mlで含む第二の浸漬溶液を
製造した。TMB含浸紙を次に瞬間的に第二の浸
漬溶液中に浸漬し、取り出し、強制通風炉中で90
℃で約９分間乾燥した。 含浸し、乾燥した0.5cm平方の紙片を寸法約
0.5×8.3cmの２軸配向ポリスチレンストリツプの
末端上に載置した試験具を製造した。この載置は
スリーエム社から入手でき、ダブル−ステツクと
して知られている両面接着テープを使用すること
により達成した。この方法で製造したストリツプ
を、熱応力実験に付す前に、褐色びん中で４℃で
シリカゲル乾燥剤と共に貯蔵した。 BSA及びPVAを含むストリツプ並びにこれら
の物質を含まないストリツプを、蓋をし、乾燥剤
を含むびん中で50℃で３日間貯蔵することによつ
て熱応力に付した。4μM DNP−FAD溶液15μ
をパツド上にピペツドで滴加し、底に湿めつた
紙片を置いた蓋をしたシヤーレ中で６分間定置す
ることによつて、応力を加えた試薬ストリツプの
性能を評価した。応力を加えなかつたストリツプ
を前記のように接種し、２分間定置した。定置
後、前記の例に記載したようにラピツド・スキ
ヤンナー装置を使用してストリツプを分析した。
ラピツド・スキヤンナーの情報を、対照基準とし
て未反応のストリツプ、即ちDNP−FAD複合体
の代わりに蒸留水だけで湿潤したストリツプを使
用して色差単位（ΔE）として表わした。応力を
加えた安定化された試験装置のラピツド・スキヤ
ンナー分析を下記のＢ表に示す。 Ｂ 表 ΔE ΔE BSA／PVA 未応力 応力 なし 2.2 2.1 BSA＋PVA 19.9 13.6 Ｂ表のデータは、BSA及びPVAが存在しなけ
れば、ストリツプの応答性は著しく減少するが、
BSA及びPVAが存在すると、色差単位は6.5〜９
倍増加することを示す。更に、配合物中のBSA
及びPVAの存在は熱応力に対してストリツプを
安定化する。この実験のデータは、アポ酵素を基
質とするイムノアツセイを固体状態で生じるこれ
らの安定剤を使用する際に劇的利点を示す。 例 テオフイリン分析へのモデル系の適用 例〜例に記載したモデル系を、臨床的意義
を有する実際的応用、即ちテオフイリンに関する
試験に適応させる試みで実験を実なつた。テオフ
イリン〔１，３−ジメチルキサンチン、ザ・メル
ク・インデツクス（The Merck Index）、第９
版1196頁（1976）〕は喘息の治療に有用な薬剤で
ある。多くの患者において、血清濃度の治療範囲
は10〜20μｇ／mlであり、弾性はほとんど常に
35μｇ／ml以上の血中濃度で現われる。使用した
複合体がテオフイリンと共有結合したFADから
成り、使用した抗体がテオフイリンに対する部分
的に精製された抗体であることを除いて、前記実
施例と同様に試験具を製造した。 １ 複合体の合成 FADがテオフイリンに共有結合した複合体
分子を下記のようにして製造した：クツク
（Cook）らの方法^*により製造した１，３−ジ
メチル−１，６，７，８−テトラヒドロピリド
〔１，2e〕−プリン−２，４，９−〔3H〕−トリ
オン（0.9mg／3.62μｍmol）を、N⁶−（アミノ
ヘキシル）FAD2.4μmolを含むジメチルスルホ
キシド0.2mlに加えた。４時間後、更に1.8mg
（7.3μmol）を加えた。溶液を一夜撹拌し、溶
媒を真空（0.1mmHg）下で蒸発させ、残分をPH
7.8の0.3M重炭酸トリエチルアンモニウムで平
衡にしたセフアデツクスLH−20のカラム（2.5
×90cm）上でクロマトグラフイーした。流出液
の216〜246mlの間で流出する粗製生成物を集
め、20×20cm×100μｍのシリカゲルプレート
に施し、PH7.8のエタノール／1M重炭酸トリエ
チルアンモニウム（容量で８：２）を使用して
クロマトグラフイー処理した。所望の生成物を
含むバンド（R_F0.77）をプレートから掻き取
り、PH7.8の1M重炭酸トリエチルアンモニウム
緩衝液で抽出し、過し、濃縮した。0.3M緩
衝液で平衡にしたセフアデツクスLH−20上で
クロマトグラフイーにより最終的に精製する
と、450nｍでの吸収で測定してテオフイリン
−FAD1.26μmol（収率53％）が得られた。 こうして製造した複合体は、「酵素補欠分子
族標識」の表題の下に記載し、−Ｒ−Ｌ−が下
記の式を有する構造を有する： ＊クツク（Cook、C.E.）、トワイン（Twine、
M.E.）、メイヤース（Meyers、M.）、アマー
ソン（Amerson、E.）、ケプラー（Kepler、
J.A.）及びテイラー（Taylor、G.F.）著
Res.Commun.Chem.Path.Pharmacol.13巻
497〜505頁（1976）． ２ 試験具の製造 このテオフイリン−FAD複合体を使用して、
テオフイリン分析用の試薬ストリツプを製造し
た。寸法４cm平方のバツクアイＳ−22の紙片
を、ON−870として知られ、ジエネラル・ア
ニリン・アンド・フイルム・コーポレイシヨン
社によつて市販されている乳化剤0.1ｇ／100ml
を含むアセトン中に５ｍＭのTMBを含む第一
浸漬溶液で含浸した。第一浸漬溶液中に浸漬し
た後、含浸した紙を強制通風炉中で50℃で１分
間乾燥した。乾燥に続いて、次に紙を第二浸漬
溶液で含浸した。第二浸漬溶液は、PH6.4にす
るため例に記載した緩衝液0.33M、グルコー
ス0.1M、西洋わさびパーオキシダーゼ19単
位／ml、グルコースオキシダーゼアポ酵素
（FAD結合部位1.0nmol／ml）、テオフイリンに
対する部分的に精製された抗体（浸漬溶液１ml
当り抗体0.14ml）、牛血清アルブミン0.5mg／ml
及びポリビニルアルコール0.5ｇ／100mlの水溶
液であつた。テオフイリンに対する抗血清は、
クツクらによりRes.Comm.Chem.Path.
Pharmacol.13巻497〜505頁（1976）に記載さ
れたようにテオフイリン免疫原複合体で免疫に
したウサギから集めた。この血清を例と同様
に部分的に精製した。第二浸漬溶液中に乾燥し
た紙を簡単に浸漬した後、第二の乾燥を強制通
風炉中で50℃で12分間行なつた。 ２回含浸した紙を次に更に、アセトン中の
0.5μMの濃度でFAD−テオフイリン複合体を
含む第三の溶液で含浸した。これらの紙を次に
強制通風炉中で50℃で１分間乾燥した。 ダブル−スチツク（スリーエム社）として知
られている両面接着テープを利用して、寸法
0.5×8.3cmのポリスチレンストリツプ上に0.5cm
平方の３重含浸紙を置いた試験具を製造した。 製造した試験具の性能を試験するため、０〜
8μMの範囲にテオフイリン濃度を有するテオ
フイリン水溶液を製造した。試験具をこれらの
溶液中に浸漬し、２分の定置時間後に、例に
記載したラピツド・スキヤンナーで分析した。
第３図には、用量−応答曲線を示し、Ｋ／Ｓを
テオフイリンン濃度に対してプロツトした。 プロツトしたデータは、溶液中のテオフイリ
ンの量の変動に対して観察しうる色強度の変化
があり、この変化は特定のテオフイリン濃度の
指標であることを示す。 例 モデル系の、フエニトイン分析への応力 例と同様に、例〜例のモデル系を臨床的
に重要な分析物、フエニトインの分析に適合させ
る実験を実施した。この実験により、均一系補欠
分子族標識イムノアツセイをフエニトイン検出の
ため乾式試薬ストリツプに適用しうることが証明
された。前記実施例と同様に、担体マトリツクス
型は、補欠分子族−標識フエニトインと分析物
（フエニトイン）との間で、フエニトインに対す
る抗体に結合するため同時に競合反応させる。 １ フエニトイン−FAD複合体の合成 モレキユラーシーブで乾燥したジメチルホル
ムアミド（DMF）1.8ml中の５−（2′−カルボキ
シブチルオキシフエニル−５−フエニルヒダン
トイン14.7mg（40.0μmol）に、アルゴン下に、
DMF中のクロロギ酸イソブチルの400μM溶液
0.10ml（40.0μmol）を加えた。反応混合物を室
温で１時間撹拌した。反応混合物にモレキユラ
ーシーブで乾燥したジメチルスルホキシド
（DMSO）2.0ml中のN⁶−（アミノヘキシル）
FAD10.0μmolの溶液、次にDMF中のトリエチ
ルアミンの400μM溶液0.05mlを加えた。混合物
を室温で19時間撹拌し、次に水で450mlに希釈
し、蠕動ポンプによりフアツトマンDE−52セ
ルロース陰イオン交換樹脂（重炭酸塩型）の
1.5×30cmのカラムに施した。次に、カラムを
0.3M重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液1.5
に対して水1.5の傾斜で溶出した。約16ml
のフラクシヨンを集め、フラクシヨン70〜88を
生成物を含むものとしてアポグルコースオキシ
ダーゼとの活性に基づいて測定した。これらの
フラクシヨンを合し、溶液をPH７に調節した。
収量は、FADのミリモル吸光係数（E₄₅₀＝
11.3）を使用して450nｍでの溶液の吸収に基づ
いて4.78μmol（47.8％の収率）であつた。 ２ 試験具の製造 それぞれ、フエニトインの存在に対して応答
しうるイムノアツセイ系の種々の成分を含む３
種の溶液中に連続的に浸漬し、各浸漬ごとに乾
燥することによつて試験具を製造した。従つ
て、寸法４cm平方の紙片（Ｓ−22、テネシー州
メンフイスのバツクアイ・セルロース・コーポ
レイシヨン社製）をON−870（ジエネラル・ア
ニリン・アンド・フイルム・コーポレイシヨン
社製）として知られている乳化剤を0.1％
（ｗ／ｖ）を含むアセトン中のTMBの５ｍＭ
溶液中に浸漬した。50℃で１分間乾燥した後、
紙をPH6.4のトリス・グルタミン酸塩緩衝液
0.2M、グルコース0.1M、西洋わさびパーオキ
シダーゼ（19単位／ml）、アポグルコースオキ
シダーゼ（FAD結合部位1.0nmol／ml）、牛血
清アルブミン0.5mg／ml、、ポリビニルアルコー
ル（例参照）0.5ｇ／100ml、及び抗フエニト
イン血清（抗血清0.14ml／ml）である第二水溶
液中に浸漬した。抗血清を例と同様にｏ−カ
プロイルジフエニルヒダントインに対して上昇
させた。 強制通風炉中で50℃で12分間乾燥した後、ｎ
−プロパノール中にFAD−フエニトイン複合
体（0.5μM）を、ガフクオート（Gafquat）
734（ペンダント第四級アミン基を有するポリマ
ー、ジエネラル・アニリン・アンド・フイル
ム・コーポレイシヨン社製）0.1ｇ／100mlと共
に含む第三の溶液中に浸漬することによつて含
浸した。 50℃で３〜４分間の乾燥に続いて、含浸した
紙を使用して、0.5cm平行の試薬負荷紙を寸法
0.5×8.3cmの２軸配向ポリスチレンのストリツ
プの一端に載置した試験ストリツプを作つた。
載置をダブル−スチツク（スリーエム社）とし
て知られている両面接着テープを使用して達成
した。 フエニトインの存在に応答するこれらの試験
具の有用性を評価するために、試験具に０〜
8μMの濃度範囲で分析物を含む試験溶液を接
種し、接種後２分にラピツド・スキヤンナーで
分析した。第４図は、水中の０、0.5、１、２、
４及び8μMのフエニトイン濃度に対してＫ／
Ｓの変化を示す。 第４図に示したデータは、試験具がフエニト
インの存在に良好に応答し、分析物の種々の濃
度を容易に測定することができる。 例 螢光イムノアツセイ試験具への単位化モデル系
の適用 螢光イムノアツセイへの例の単位化モデル系
の適用性を説明するため実験を行なつた。従つ
て、TMBをｐ−ヒドロキシフエニル酢酸で代え
て、例と同様に試験具を製造した。パーオキシ
ダーゼの存在で過酸化物によりｐ−ヒドロキシフ
エニル酢酸を酸化すると、螢光測定により検出可
能の生成物が生じる。 装置を下記のように製造した。バツクアイＳ−
22の紙片を下記の成分を含む溶液で含浸した： トリス−グルタミン酸塩緩衝液（1M、PH6.4）
0.8ml グルコース（1M水溶液） 0.4ml 西洋わさびパーオキシダーゼ（153単位／mg、
1.25mg／ml） 0.4ml ポリビニルアルコール（５ｇ／100ml） 0.4ml 牛血清アルブミン（20mg／ml） 0.1ml ガフクオート734（10ｇ／100ml水、例参照）
0.2ml アポグルコースオキシダーゼ（FAD結合部位
40nmol／ml） 0.16ml 部分的に精製したDNP−抗体（例参照）
0.54ml ｐ−ヒドロキシフエニル酢酸（水中80ｍＭ）
0.04ml 蒸留水 0.96ml 含浸に続いて、紙を空気炉中で550℃で22分乾
燥した。 乾燥した紙をｎ−プロパノール中のDNP−
FAD複合体の2μM溶液で含浸し、50℃で５分間
乾燥した。 金属マイラーテープ（スリーエム社）を乾燥し
た試薬紙の片側に施した。紙をマイラー層に施し
たダブル−スチツク接着テープを使用して２軸配
向ポリスチレンフイルム上に置いた。生じる試験
具は寸法0.2×3.5inのポリスチレンストリツプ上
に置いたマイラー裏張り試薬紙の0.2×0.4inの片
から成る。 試験具と比較するための対照試験具として、未
含浸紙を同様にマイラー及びダブル−スチツクを
用いてポリスチレンストリツプに施した。 光電子増倍管を使用して、螢光性ストリツプを
それらの性能について試験した。石英フアイバー
オプチツクを試験すべき試験具の平面に対して
45゜の角度で置いた。このフアイバーオプチツク
に水銀ランプ及び励起バンド−通過フイルターを
設けた。与えられた装置の螢光は、試料試験具の
平面に対して45゜の角度で配置され、干渉フイル
ター（420nｍ）を設けた別のフアイバーオプチ
ツクから直接得られた、強度は光電子増倍管を使
用してミリボルトで読み取つた。 螢光試験具の効力を試験するため、DNP−含
有試験溶液30μをピペツトで試薬紙部分上に滴
加し、調湿室中で室温で11分間定置した。DNP
試験溶液は０〜8μMDNPの濃度で変動した。光
電子増倍管装置を使用して０、１、２、４及び
8μM溶液について螢光強度を測定した。対照試
験具を使用して測定を反復した。第５図は試験具
の用量−応答曲線を示す。対照試験具からのデー
タは、第５図のデータがDNP分析物の固有螢光
によつて影響されないことを証明した。 この実験は従つて、検出可能の応答として螢光
を使用する均一イムノアツセイ法を固相試験具に
有効に適用しうることを立証する。 Ｂ 酵素基質−標識イムノアツセイ試験具 例 紙多層要素 本例に記載する実験では、一体構造の多層分析
要素を製造し、液体試料中のテオフイリンの存在
を、前面螢光測定による読みとして定量的に測定
する能力について試験した。 抗血清の製造 テオフイリンに対する抗血清を、1979年10月23
日に出願され、現在の譲受人に譲渡されている。
係属中の米国特許出願第87819号明細書（参考と
して本明細書に含む）に記載されている方法によ
つて製造した。 複合体の製造 ガラクトシル−ウンベリフエロン−テオフイリ
ン（複合体）を前記の係属中の米国特許出願第
87819号明細書に記載されている方法によつて製
造した。 要素の製造 テオフイリン特異性要素の一層を製造する際に
使用した溶液は下記の成分を含んでいた：成 分 量 水 27μ 0.1Mビシン（Bicine）緩衝液（PH8.5） 20μ テオフイリン抗血清 100μ β−ガラクトシダーゼ（78U／ml）^* 3μ ＊ 単位はClin.Chem.23：1402（1977）に定義さ
れている。 フアツトマン31ET紙（ニユージヤージー州ク
リフトンのフアツトマン社）の３×1.2cmの層を
8.2×1.2cmのポリスチレン支持体上に両面接着テ
ープによつて設置し、次に前記のように製造した
溶液をピペツトでフアツトマン31ET紙の層上に
滴加した。紙を対流炉中で50℃で10分間乾燥し
た。 複合体を水50μ中に溶かして、この溶液に関
して14.4μMの最終濃度にすることによつて第二
の溶液を製造した。こうして製造した溶液をピペ
ツトでフアツトマン54紙の1.0×3.0cmの層上に滴
加した。この含浸した層を次に対流炉中で50℃で
10分間乾燥した。 第二の層を両面接着したテープのストリツプに
よつて第一層の一端に固定した。 試験溶液 テオフイリンを少量の0.05Mビシン緩衝液 （PH8.5）に加えて、それぞれ、0.5、1.0、2.5、
5.0及び40μｇ／mlの最終テオフイリン濃度にし
た。 分析操作 前記のように製造し、支持体に固定した分析要
素を螢光計に試験具を垂直に配置するため適当な
機械的保持具中にそれぞれ挿入した。要素及び保
持具を螢光計中に挿入する直前に、前記のように
製造したテオフイリン溶液の１つの250μをピ
ペツトで複合体含有層の露呈面上に滴加した。 螢光計を調節して、垂線から表面へ60゜の角度
で要素を表面に光をあてる405nｍの波長の励起
光源を生じ、450nｍの波長で放出する光を検出
するようにした。垂線からパツドへ30゜の角度で
螢光の前面測定を行なつた。 各試料の螢光応答をまず０〜200秒の時間にわ
たつて測定し、次に200秒でそれぞれの読みを取
つた。 結 果 この分析操作によつて得られる読みは相対的螢
光度の形であつた。観察した相対的螢光度は、処
理する試料中に存在するテオフイリンの量に匹敵
した。螢光の応答を経時的に第６図に示す。200
秒での螢光をテオフイリン濃度の函数としてプロ
ツトし、第７図のテオフイリン標準曲線を得た。 結 論 生ずるデータは、一体構造の分析要素が試験し
たアリコートのそれぞれのテオフイリン濃度に対
して検出可能の定量的応答を生ずることを示す。
テオフイリンに対する抗体の存在によつて反応の
抑制が起つた。テオフイリンの濃度が増加する
と、その抑制を克服して螢光性生成物がテオフイ
リンに依存して増加する。 例 凍結乾燥要素 本例で報告する実験では、試薬の早すぎる反応
を防止するため温度制御法を使用して、テオフイ
リン測定用の単層要素を達成した。 抗血清の製造 前記の係属中の米国特許出願第87819号明細書
に記載されている方法によつてテオフイリンに対
する抗血清を製造した。この抗血清を硫酸アンモ
ニウム水溶液33mg／dlで沈殿させ、沈殿を0.05M
ビシン緩衝液（PH8.5）に溶かし、この緩衝液に
対して透析し、テオフイリン抗体濃厚物が得られ
た。この濃厚物は１ml当りテオフイリン結合部位
を約200μmol含んでいた。 複合体の製造 前記の係属中の米国特許出願第87819号明細書
に記載されている方法によりガラクトシル−ウン
ベリフエロン−テオフイリン（複合体）を製造し
た。 要素の構造 単層テオフイリン特異性要素の製造に使用した
第一溶液は下記の成分を含んでいた：成 分 量 0.5Mビシン緩衝液（PH8.5） 10μ テオフイリン抗体濃厚物 150μ β−ガラクトシダーゼ（88U／ml） 40μ フアツトマン31ET紙（ニユージヤージー州ク
リフトンのフアツトマン社製）の0.5×1.0cmの層
を両面接着テープによつて8.2×0.5cmのポリスチ
レン支持体上に載置し、次に、前記のように製造
した溶液20μをペピツトでフアツトマン31ET
紙の層上に滴加した。紙を対流炉中で50℃で10分
間乾燥し、次に低湿度室中でドライアイス上で５
分間予備冷却した。 ジメチルスルホキシド（DMSO）中のテオフ
イリン−ウンベリフエロン−ガラクトースの6.13
ミリモル（ｍＭ）溶液を水中の0.077ｍＭ溶液に
希釈し、その20μを前記のように処理した紙層
のそれぞれに施した。要素を一夜凍結乾燥した。 試験溶液 テオフイリンを少量の0.05Mビシン緩衝液に加
えて、それぞれ0.0、4.0、16.0及び40μｇ／mlの最
終テオフイリン濃度にした。 分析操作 前記のように製造し、支持体に固定した分析要
素をそれぞれ、反射光度計に試験具を水平に配置
するため適当な機械的保持具中に挿入した。要素
及び保持具を反射光度計中に挿入する直前に、前
記のように製造したテオフイリン溶液の１つの
50μを露呈面上にピペツトで滴加した。光度計
を400nｍでの反射率の変化に従うように調節し
た。 まずそれぞれの反射率を０〜200秒の時間にわ
たつて測定し、次にそれぞれの読みを200秒で取
つた。 結 果 前記の操作によつて得られたデータを第８図に
グラフで示す。縦座標の単位（Ｋ／Ｓ）は例に
定義した。 結 論 生じるデータは、一体構造の分析要素が試験し
たそれぞれのアリコートのテオフイリン濃度に対
して定量的色原体応答を生じることを示す。 これらの条件下で、反応は抗血清の存在によつ
て抑制され、この抑制はテオフイリンの濃度を増
加することによつて徐々に克服される。 例 多重含浸要素 この例で説明する実験では、単一層要素を製造
し、液体試料中のテオフイリンの存在を、前面螢
光測定による読みとして定量的に測定する能力に
ついて試験した。 抗血清の製造 前記の係属中の米国特許出願第87819号明細書
に記載されている方法によつてテオフイリンに対
する抗血清を製造した。 複合体の製造 前記の係属中の米国特許出願第87819号明細書
に記載されている方法によりガラクトシル−ウン
ベリフエロン−テオフイリン（複合体）を製造し
た。 要素の製造 テオフイリン特異性要素の製造に使用した溶液
は下記の成分を含んでいた： 水溶液成 分 量 テオフイリン抗血清 400μ 0.5Mビシン緩衝液、PH8.5 160μ 水 35μ β−ガラクトシダーゼ（132.7U／ml） 5μ 有機溶液成 分 量 塩化メチレン 1.00ml 複合体（DMSO中771μM） 4.2μ フアツトマン31ET紙の１×１cmの層を銀マイ
ラー（スリーエム社）上に積層し、両面接着テー
プにより8.3×１cmのポリスチレン支持体上に設
置し、次に、前記のように製造した水溶液をピペ
ツトでフアツトマン31ET紙の層上に滴加した。
他の反射性下層、例えば銀メツキしたか、または
不透明な層は同様に安定である。紙を対流炉中で
50℃で15分間乾燥した。有機溶液を次に水溶液の
乾燥残分を含む紙上にピペツトで加え、対流炉中
で50℃で15分間乾燥した。 試験溶液 テオフイリンを少量の水に加えて、それぞれ
0.125、0.25、0.50、1.00、10.0、20.0及び40.0μ
ｇ／mlの最終濃度にした。 分析操作 前記のように製造し、支持体に固定した分析要
素を、螢光計に装置を水平に配置するのに適当な
機械的保持具中に挿入した。要素及び保持具を螢
光計中に挿入する直前に、前記のように製造した
テオフイリン溶液の１つの70μをピペツトで要
素の露呈面上に加えた。 螢光計を調節して、90゜の角度で要素の表面に
光をあてる405nｍでの励起光源を生じ、450nｍ
の波長で放出される光を検出するようにした。螢
光の前面測定をパツドから90゜の角度で行なつた。 それぞれの螢光応答をまず一定時間（０〜６
分）にわたつて測定しそれぞれの読みを６分で取
つた。 結 果 前記の操作で得たデータは第９図にグラフで示
す。縦座標の単位はミリボルトで示す。 結 論 生じるデータは、分析要素が試験したアリコー
トのそれぞれのテオフイリン濃度に対して検出可
能の定量的応答を生じることを示す。 これらの条件下で、反応は抗血清の存在によつ
て抑制され、この抑制はテオフイリンの濃度を増
加することによつて徐々に克服される。 例 可逆的錯体形成要素 この例で説明する実験では、単層要素を製造
し、テオフイリン、カルバムアゼピン、トブラマ
イシン及びゲンタマイシンの存在を、前面螢光測
定による読みとして定量的に測定する能力につい
て試験した。各薬剤の血清濃度の治療範囲及び最
低毒性レベルを下記の表にまとめる：

【表】 抗血清の製造 テオフイリン、カルバムアゼピン、トブラマイ
シン及びゲンタマイシンに対する抗血清を、前記
の係属中の米国特許出願第87819号明細書に記載
されている方法によつて製造した。 複合体の製造 ガラクトシル−ウンベリフエロン−テオフイリ
ン、ガラクトシル−ウンベリフエロン−カルバム
アゼピン、ガラクトシル−ウンベリフエロン−ト
ブラマイシン及びガラクトシル−ウンベリフエロ
ン−シソマイシン（ゲンタマイシンのアナロー
グ）を前記の係属中の米国特許出願第87819号明
細書に記載されている方法により製造した。 要素の製造 テオフイリン、カルバムアゼピン、トブラマイ
シン及びゲンタマイシン特異性要素の１層の製造
に使用した溶液はＣ表に示す成分を含んでいた。

【表】 フアツトマン31ET紙（ニユージヤージ州クリ
フトンのフアツトマン社製）の１×１cmの層を銀
マイラー上に積層し、両面接着テープに8.3×１
cmのポリスチレン支持体上に設置し、次に前記の
ように製造した溶液をフアツトマン31ET紙の層
上にピペツトで滴加した。紙を対流炉中で50℃で
15分間乾燥した。 試験溶液 テオフイリン、カルバムアゼピン、トブラマイ
シン及びゲンタマイシンを少量の水を加えて、下
記の最終濃度範囲の試料を作つた。薬 剤 濃度範囲 テオフイリン ０〜4.0μｇ／ml カルバムアゼピン ０〜0.4μｇ／ml トブラマイシン ０〜0.6μｇ／ml ゲンタマイシン ０〜2.0μｇ／ml 分析操作 前記のように製造し、支持体に固定した分析要
素を一定の湿度を保持するのに適当な室中に置い
た。室を閉鎖する前に、前記のように製造した薬
剤溶液70μをそれぞれの分析要素の露呈面上に
ピペツトで滴加した。 15分の終りに室温で発生する螢光を、分析要素
を水平に配置するのに適当な機械的保持具を設け
た螢光計で測定した。螢光計を調節して90゜の角
度で表面に光をあてる405nｍの励起光源を生じ、
450nｍの波長で放出される光を検出するように
する。螢光の前面測定を、パツドから90゜の角度
で行なつた。 結 果 前記の操作によつて得られたデータを、それぞ
れテオフイリン、カルバムアゼピン、トブラマイ
シン及びゲンタマイシンについて第１０図、第１
１図、第１２図及び第１３図にグラフで示す。縦
座標の単位は電気出力で示す。 結 論 得られたデータは、一体構造の分析要素がそれ
ぞれの薬剤の濃度範囲に対して検出可能の定量的
応答を生じることを示す。テオフイリン、カルバ
ムアゼピン、トブラマイシン及びゲンタマイシン
の濃度を増加すると、薬剤に依存して各分析要素
の螢光が増加する。前記実験に使用した技術はす
べての成分を単一要素中に混入することを可能に
した。 例 XI フイルム多層要素 この例に記載する実験では、基質標識螢光イム
ノアツセイ用の成分を含むフイルム２枚を使用し
た一体構造の二層成分要素を作つた。この要素を
前面螢光測定によつてテオフイリンを定量する能
力について試験した。 抗血清及び複合体の製造 抗血清及び複合体を例に記載したようにして
製造した。 要素の製造 下記のストツク溶液を使用した： PH8.5の0.05Mビシン緩衝液中の２％アガロー
ス（マイルス＃49−051）。試料を100℃で溶解し、
次に60℃で恒温に保持した。 10％トリトン×100 β−ガラクトシダーゼ、PH8.5の0.5Mビシン緩
衝液中で86単位／ml、 クロロホルム中の6.67％ポリビニルピロリドン
〔アルドリツヒ（Aldrich）＃85、647−９、平均
分子量360000〕 ガラクトシル−ウンベリフエロン−テオフイリ
ン（複合体）、ジメチルスルホキシド6.16ｍM. テオフイリン抗血清及びβ−ガラクトシダーゼ
を60℃のアガロース溶液中に配合して処方の組成
物を生じた：成 分 量 アガロース溶液 0.25ml テオフイリン抗血清 0.75ml β−ガラクトシダーゼ 0.03ml トリトン×100 0.01ml 抗血清を混合前に60℃に予熱した。0.5cmのフ
イルム厚に設定した常用のドクターナイフを使用
してポリエステルシート（スリーエム社、2352
型）上に2.5cm幅のフイルムを塗布した。ゲル化
した後、フイルムを47℃で10分間乾燥した。 0.005cmに設定したドクターナイフを使用して
第一のフイルム上に第二のフイルムを塗布した。
フイルムはクロロホルム中のポリビニルピロリド
ン（PVP）の溶液中に複合体を含み、下記の処
方を有していた：成 分 量 クロロホルム中のPVP 0.4ml クロロホルム 0.6ml 複合体溶液 0.015ml フイルムを室温で乾燥した。ポリエステルシー
トを銀メツキしたマイラー上に両面接着テープで
設置した。この物質の0.5×１cmのセグメントを、
再び両面接着テープを使用して、ポリスチレン担
体上に設置した。 試験溶液 テオフイリンをPH8.5の0.05Mビシン緩衝液に
加えて、１、２、４、８及び40μｇ／mlの最終的
テオフイリン濃度にした。 分析操作 試験溶液の１つの30μを前記の分析要素に施
し、５分後に螢光応答を測定した。例に記載し
たように螢光を測定した。 結 果 前記操作で得たデータを第１４図にグラフで示
す。任意単位で螢光度をテオフイリン濃度に対し
てプロツトする。 結 論 前記の結果から、分析成分の早期反応を起さ
ず、試料添加後に分析物を定量的に検出しうる多
量のフイルムを使用して、イムノアツセイの非相
容性試薬を１つの分析要素に組込みうることが判
る。 Ｃ 螢光消光イムノアツセイ試験具 例 XII この例で説明する実験では、単層要素を製造
し、液体試料中のテオフイリンの存在を、前面螢
光測定による読みとして定量的に測定する直接消
光螢光イムノアツセイを実施する能力について試
験した。 抗血清の製造 前記の係属中の米国特許出願第87819号明細書
に記載されている方法によつてテオフイリンに対
する抗血清を製造した。 複合体の製造 ガラクトシル−ウンベリフエロン−テオフイリ
ン（GUT）をβ−ガラクトシダーゼで加水分解
することによつてウンベリフエロン−テオフイリ
ン（複合体）を製造した。前記の係属中の米国特
許出願第87819号明細書に記載されている方法に
よりGUTを製造した。 要素の製造 テオフイリン特異性要素の製造に使用した溶液
は下記の成分を含んでいた： 水溶液成 分 量 テオフイリン 50μ 水 30μ 0.5MビシンPH8.5 20μ 有機溶液成 分 量 トルエン 1.00ml 複合体（トルエン中の0.16ｍＭストツク液） 4μ フアツトマン31ET紙の１×１cmの層を銀マイ
ラー上に積層し、両面接着テープによつて8.3×
１cmのポリスチレン支持体上に設置し、次に、前
記のように製造した水溶液20μをフアツトマン
31ET紙の層上にピペツトで滴加した。他の反射
性下層、例えば、銀メツキまたは不透明の層は同
様に適当である。紙を対流炉中で40℃で20分間乾
燥した。次に、有機溶液（20μ）を、水溶液の
乾燥残分を含む紙上にピペツトで滴加し、対流炉
中で50℃で15分間乾燥した。 試験結果 テオフイリンを少量の水に加えて、それぞれ
0.125、0.25、0.50、1.00、10.0、20.0及び40.0μ
ｇ／mlの最終テオフイリン濃度を生じた。 分析操作 前記のように製造し、支持体に固定された分析
要素を、試験具を螢光計中に水平に配置するのに
適当な機械的保持具中に挿入した。要素及び保持
具を螢光計中に挿入する直前に、前記のように製
造したテオフイリン溶液の１つの70μをピペツ
トで要素の露呈面上に滴加した。 螢光計を調節して、80゜の角度で要素の表面に
光をあてる励起光源を405nｍで生じ、450nｍの
波長で放出される光を検出するようにした。螢光
の前面測定をパツドから90゜の角度で行なつた。 それぞれの螢光応答を２分後に測定した。 結 果 前記操作で得たデータを第１５図にグラフで示
す。縦座標の単位を消光パーセントとして示す。 結 論 得られたデータは、分析要素が試験したそれぞ
れのアリコートのテオフイリン濃度に対して検出
しうる定量的応答を生じることを示す。 これらの条件下で、螢光は抗血清の存在で消光
され、この消光はテオフイリンの濃度を増加する
ことによつて徐々に克服されうる。 Ｄ 酵素標識イムノアツセイ試験具 例 この例で報告する実験で、テオフイリンについ
て酵素標識均一イムノアツセイを行なうのに必要
なすべての成分を含む多層要素を製造した。 抗血清 カリフオルニア州パロアルトのシバ・カンパニ
イ（Syva Company）から販売されているエミ
ツト−アード（EMIT −add）テオフイリン試
験キツトからテオフイリンに対する抗血清を得
た。 複合体の製造 エミツト−アードテオフイリン試験キツトから
同様にG6PDH−テオフイリン（複合体）を得
た。 要素の構造 テオフイリン特異性要素の一層の製造に使用す
る溶液は、シバ・カンパニイからエミツト−アー
ドデオフイリン試験キツトに試薬Ａ（テオフイリ
ンに対する抗血清及び酵素基質を含む）と言われ
ているものである。 フアツトマン54紙（ニユージヤージー州クリフ
トンのフアツトマン社）の0.5×1.0cmの層を両面
接着テープにより8.2×0.5cmのポリスチレン支持
体上に設置し、次に前記溶液10μをフアツトマ
ン31ET紙の上にピペツトで滴加した。紙を対流
炉中で50℃で10分間乾燥した。 ジアホラーゼ／ｐ−ヨードニトロテトラゾリウ
ムバイオレツト（INT）溶液〔PH7.9の0.055Mト
リス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
2.5ml中のジアホラーゼ1.5mg及びINT1mg〕及び
エミツト・アードキツトにおいて試薬Ｂ（酵素標
識テオフイリン複合体を含む）と言われている溶
液の等容量を混合することによつて第二の溶液を
製造した。20μをフアツトマン54紙の0.6×1.0
cmの層上にピペツトで滴加した。この含浸層を対
流炉中で50℃で10分間乾燥した。 次に、第二層を両面接着テープのストリツプに
よつて第一層に一端で固定した。 試験溶液 テオフイリンを少量の水に加えて、それぞれ
0.5、1.0、2.5、5.0及び40μｇ／の最終的テオフ
イリン濃度にした。 分析操作 前記のように製造し、ポリスチレン支持体に固
定した分析要素をそれぞれ反射光度計に装置を水
平に配置するのに適当な機械的保持具中に挿入し
た。光度計中に要素及び保持具を挿入する直前
に、前記のように製造したテオフイリン溶液の１
つの50μを露呈面上にピペツトで滴加した。光
度計を500nｍでの反射率の変化を従うように調
節した。 それぞれの反射率をまず一定時間（０〜200秒）
にわたつて測定し、次にそれぞれの読みを200秒
で取つた〔Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）²／2R；式中Ｒは反
射率である。〕 結 果 前記の操作によつて得たデータを第１６図にグ
ラフで示す。 結 論 得られたデータは、一体構造の分析要素が試験
した各アリコートのテオフイリン濃度に対して半
定量的に検出可能の応答を生じることを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図から第１６図は各実施例の実験から得ら
れたデータに基づくグラフである。即ち、第１図
は例の実験結果を示す反射率−波長のグラフ、
第２図は例の実験結果を示すＫ／Ｓ−DNP濃
度のグラフ、第３図は例の実験結果を示すＫ／
Ｓ−テオフイリン濃度のグラフ、第４図は例の
実験結果を示すＫ／Ｓ−フエニトイン濃度のグラ
フ、第５図は例の実験結果を示す螢光強度−
DNP濃度のグラフ、第６図は例の実験結果を
示す螢光−時間のグラフ、第７図は例の実験結
果を示す螢光−テオフイリン濃度のグラフ、第８
図は例の実験結果を示すＫ／Ｓ−時間のグラ
フ、第９図は例の実験結果を示す螢光−テオフ
イリン濃度のグラフ、第１０図、第１１図、第１
２図及び第１３図は例の実験結果を示し、それ
ぞれ螢光に対するテオフイリン、カルバムアゼピ
ン、トブラマイシン、及びゲンタマイシン濃度の
グラフである。第１４図は例XIの実験結果を示す
螢光−テオフイリン濃度のグラフ、第１５図は例
XIIの実験結果を示す消光パーセント−テオフイリ
ン濃度のグラフ、第１６図は例の実験結果を
示すＫ／Ｓ−時間のグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体試験試料中のリガンドを測定するための
   均一系免疫分析用試験具を、固体担体に該リガン
   ド部分又はその特異結合アナローグに結合してい
   る標識成分を有する標識複合体及び該リガンドの
   結合相手を含む化学的試薬組成物を組み込むこと
   によつて製造するための多重含浸方法であつて、
   該固体担体が非ゲル状固体の多孔性マトリツクス
   であり、該方法が次の工程： (a) 該多孔性マトリツクスに水性である第一液中
   の、該標識複合体と該結合相手のうちの一方の
   溶液を含浸せしめ、該マトリツクスを乾燥し、
   その後、 (b) 該多孔性マトリツクスに、該結合相手と該標
   識複合体間の反応を防止する第二液である有機
   溶媒中の、該標識複合体と該結合相手のうちの
   他方の溶液を含浸せしめ、該マトリツクスを乾
   燥する工程、 からなり、それによつて得られる試薬が組み込ま
   れたマトリツクスが該結合相手及び該標識複合体
   を互いに実質的に結合することなく含むことを特
   徴とする方法。 ２ 工程(a)がマトリツクスへの該結合相手の水溶
   液又は懸濁液の含浸及び該マトリツクスの乾燥を
   伴い、工程(b)がマトリツクスへの該標識複合体の
   有機溶媒溶液の含浸及び該マトリツクスの乾燥を
   伴う特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 有機溶媒がトルエン、アセトン、クロロホル
   ム、ｎ−プロパノール、塩化メチレン又は二塩化
   エチレンである特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ４ 結合相手が抗体又は他の天然に存在する結合
   性蛋白質である特許請求の範囲第１項〜第３項の
   いずれか１項に記載の方法。 ５ マトリツクスが天然もしくは合成のポリマー
   繊維からなるウエブマトリツクスである特許請求
   の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方
   法。 ６ 標識が酵素に対する基質であり、該酵素が同
   一の液中に結合相手として組み込まれ、該基質に
   作用して蛍光性生成物を生じることができる特許
   請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載
   の方法。 ７ 標識がアポ酵素と結合して活性酵素を形成す
   る補欠分子族であり、該アポ酵素が同一の液中に
   結合相手として組み込まれている特許請求の範囲
   第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 ８ 標識がフラビンアデニンジヌクレオチドであ
   り、アポ酵素がアポグルコースオキシダーゼであ
   る特許請求の範囲第７項記載の方法。