JPH02275825A - 後天性免疫不全症候群治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、後天性免疫不全症候群治療剤に関し、更に詳
しくはプロテアーゼインヒビターの１つであるトリプス
タチンを有効成分とする後天性免疫不全症候群治療剤に
ｆｌｕる。

［従来の技術］ 後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎ
。

ｄｃｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　：　Ａ　Ｉ
　Ｄ　Ｓ　）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）によ
って引き起こされる重篤な免疫不全症であり、現在では
全世界的に広がりつつありその治療薬の開発が望まれて
いる。

ＡＩＤＳの病因ウィルスであるＨＩＶはＲＮＡを遺伝子
として持つレトロウィルスの１種であり、１９８３年に
パスツール研究所のＨｏｎｔａｇｎｉｅｒらによって最
初にヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶｌ）がリンパ腺
腫患者のリンパ球から単離され、そのｌｌｆｔ１９８６
年に同グループによって西アフリカのＡＩＤＳ患者より
ヒト免疫不全ウィルス２型（ＨＩＶ−２）がｊｌ　１１
されている［旧ｒｅｉｄｌｌｃ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３２６．６６２　（１９８７）　］。

これらＨＩＶの感染機構については、ＨＩＶ粒子が、免
疫１１当ｍ胞の１種であっＣその細胞表面にＣＤ４抗原
を有するヘルパーＴ細胞に結合してｍ膣内に侵入し、ヘ
ルパーＴ細胞を死滅ぼしめて免疫不全を引き起こりと考
えられている［Ｄａｌｇｌｃｉｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｎａ
ｔｕｒｅ　　３１２　７６３　（１９８４）；にＩａｔ
ｚｍａｍｎ　ｃ−ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１２　
、　７６７　（１９８４）］。

ＨＩＶの感染はＨＩＶのエンベロープ蛋白質である（Ｊ
ｐｌ　２０がヘルパーＴ細胞表面のＣＤ４抗原分子に結
合することによって開始することも明らかにされている
［Ｄａｌｇｌａｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　　
３１２、７６３　（１９８４）　；Ｋｌａｔｚｎ＋ａｍ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　　３１　２．　７６７　　（１９８４）
　　：ＨｃＤｏｕｇａｌ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２３１　、　３８２　　（１９８６）］
。このような感染Ｉ１１＃Ｒの知見から、Ｑｐ１２０に
対する抗体をＨＩＶＩ染抑制剤として使用するアプロー
チが考えられている［　Ｒｏｂｅｙｅｔ　ａｌ、、　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾　８３．
７０２３　（１９８６）］。

更に、ｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体とＱｌ）
１２０を構成するアミノ酸配列の一部を含む各種の合成
オリゴペプチドとの反応性を検討したところ、Ｑｐ１２
０の３０８−３３１番目のアミノ酸に対応する合成オリ
ゴペプチドとのみ、該モノクローナル抗体が反応したこ
とが報告されている［Ｈａｔｓｕｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２　、２１０７　（１９８８
）］。

逆に、ｇｐ１２０を構成するアミノ酸配列の一部を含む
各種のオリゴペプチドを合成し、それぞれに対する抗体
を作成したところ、ａｐ１２０の３０３−３２１７ｆｔ
目のアミノ酸に対応する合成オリゴペプチドに対する抗
体が、ト＋　ｔ　ｖ感染抑制の指標である合胞体形成抑
制能を有していたことが報告されている［Ｐａ１ｋｃｒ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ　８５．１９３２　（
１９８８）］。

他方、３０３−３２１番目のアミノ酸に対応するこの領
域は、Ｑｐ１２０とＣＤ４との結合に関与している領域
ではないことが知られている［Ｋｏｗａｌｓｋｉ　ｅｔ
　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　　２３７．１３５１（１
９８７）　；Ｌａ５ｋｙ　ｅｃ　ａｌ、、　Ｃａ１ｌ　
　５０．９７５　（１９８７）］。従って、Ｑｐ１２０
の分子中のＣＤ４と結合すると考えられている領域以外
の領域に対する抗体でも、ＱＤ１２０と結合することに
よって、その立体構造を修篩し、ｇ＋）１２０とＣＤ４
との結合を阻害すると考えることも可能である。しかし
ながら上述した領域以外の領域、例えばＣＭ）１２０の
５０４−５１８７ｆｔ目のアミノ酸に対応する合成オリ
ゴペプチドに対する抗体は、ｇｐ１２０自身との反応性
は右しているものの、合胞体形成抑制能は有していなか
ったことが報告されている［Ｐａ１ｋｃｒ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄＳｃｉ、ＵＳＡ　８
５．１９３２　＜１９８８）Ｊ　。

これらの事実から、（３０１２０分子の中で、例、ｔＧ
ｆ５０４−５１８番目のアミノ酸に対応する領域と、３
０３−３２１番目或いは３０８−３３１番目のアミノ酸
に対応する領域を比較すると、両者とも立体構造の上で
抗体によっｃ認識され得る部位に位ｎしていながら、後
者に対する抗体がＱｐ１２０とＣＤ４との結合を阻害し
たことがら、後者の領域が両者の結合に深く関与してい
る可能性が考えられる。この領域は可変領域と呼ばれ、
臨床的に分離されたト１１Ｖの間でアミノ酸配列の違い
がしばしば見出されている領域である。

一方、新しいプロテアーゼインヒビターの１つとして、
最近においてラットの肥満細胞からトリプスタチンが１
１ｉ離生成されその一次構造が決定されている［にｉｄ
ｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３
　、１８１０４　（１９８８）：木戸ら、細胞工学、７
゜８５１　（１９８８）；木戸ら９代謝、ＶＯ１，２５
゜臨時増刊号“代謝病ハイライト″　１８７（１９８８
）］。

トリブスタヂンの生理学的作用としては、ＩｇＥｌｌ！
与のアレルギー性炎症の病像形成に深く関与しているこ
とが示唆されて、１３す［木戸ら、Ｉ１１胞工学　ヱ、
８５１　（１９８８）；にｉｄｏ　ｃｔ　ａＢｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｉｎｔ、　、　　工０，８６３　（１９８５）］
、また血液凝固系においてブＯト１コンピンからα−ト
ロンビンへの変換を阻止し、また活性型血液凝固第Ｘ因
子の作用を阻止することが知られている［Ｋｉｄｏ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ
、Ｃｏｍｌ１＋ｕｎ、　　１３２、６１３　（１９８５
）　：Ｋｉｄｏ　ａｔ　ａｌ、、ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、２３９．４３６　（１９８５）　
Ｊ。

トリプスタチンがこのような生卵作用を有することから
、トリプスタチンの医薬品としての（７１発が望まれて
いる。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、トリプスタヂンのＡＩＤＳ治療剤としての新
たな医薬用途を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、ＨＩＶＰＪ４染の初ｍ段階であるＣＪＤ１
２０とヘルパー■細胞表面のＣＤ４抗原分子との結合に
深く関与していると考えられる前記ｇｐ１２０の可変領
域に注目し、その中で、比較的良く保存されている配列
、すなわらＧＩ”Ｔ／−Ｐｒ。

Ｇｌｙ−△ｒｇ−△Ｉ　ａ−Ｐｈｅという配列を見出し
た。もし、この可変領域がＣＤ４との結合に深く関与し
ているならば、上記配列はまさにこの結合に深く関与し
ていると考えられ、上記配列と類似の配列を有する物質
は、ａｐｌ　２０とＣＤ４との結合を阻害することが期
待される。そのような物質として、本発明名はトリプス
タチンに注目し、トリプスタチンの＋」Ｉ　Ｖ感染抑制
効果の指標である合胞体形成抑制能について調べたとこ
ろ、トリプスタチンは強い合胞体形成抑制能を有し、従
ってトリブスタヂンはＡＩＤＳ治療剤として極めて有効
であることを見出し本発明を完成した。

即ち、本発明は、トリプスタチンを有効成分とするＡＩ
ＤＳ治療剤である。

本発明のトリプスタチンのＨＩＶｒｓ染抑制作用は極め
て特異的である。即ち、トリプスタチンと同様のトリプ
シンインヒビターであって同様のアミノ酸配列を有する
インターα−トリプシンインヒビターに比べて本発明の
トリプスタチンは約１０００倍高いＨＩＶＦ／！Ａ染抑
制作用を示し、他方、細胞ｉが性は示さない。

本発明で用いるトリプスタチンは、特に限定されず、例
えばラットの腹膜、肝臓、肺、舌等の肥満細胞から単離
ｆｌ’ｔ１！Ｊされるものが用いられる［木戸ら、細胞
工学、ヱ、８５１　（１９８８）：木戸ら１代謝、２５
．臨時増刊号、”代謝病ハイライト”、１８７　（１９
ＢＢ）］。例えばトリプスタチンは、ラットのｍ膜の肥
ＩＩＩ胞のホモシネ−１〜より、例えばトリプシノーゲ
ン−セファロース４Ｂ１セフアデツクスＧ−７５カラム
などによるカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィー等を適宜組合せた単離精製により得ること
ができる［にｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｗ、　　２６３．１８１０４　（１９８８）］。

またヒトの肥満細胞由来のトリプスタチンでもよく、ヒ
トトリプスタチンもラットの場合と同様にして単離精製
することができる。あるいは、トリプスタチンのアミン
酸配列［Ｋｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅ園、２６３．１８１０４　（１９８８）］より化学
的に合成することも出来、またアミノ酸配列に対応する
ＤＮＡ塩基配列を用いて組換えＤＮＡ技術により得るこ
とも出来る。

本発明者により、トリプスタチンはＨＩＶの感染を抑制
することが明らかにされた。即ち、ヒト急、性リンパ芽
球性白血病細胞であるＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ番号
ｉ号：ＣＲＬ−１５８２）と、同様の白血病細胞である
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１１９
）にＨＩＶの一種であるＬ　Ａ　Ｖ　−１［Ｂａｒｒｅ
−８ｉｎｏｕｓｓｉ　ｅｔ　ａｔ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、２２０，８６８　（１９８３）］を持
続感染させたＯＥＭ／ＬＡＶ−細胞とを一緒に培養する
とＨＩＶの感染の指標である合胞体が形成され、これに
対してトリプスタチンを添加して同様に培養した場合に
は合胞体の形成が抑制され、従ってトリプスタチンがＨ
ＩＶの感染を抑制することが確認された。

本発明で用いるトリブスタヂンは、トリプシンインヒビ
ターのなかでも特に強いＨＩＶの感染抑制効果を有して
おり、他方、細胞毒性を示さないものであり、従ってＡ
ＩＤＳ治療剤として極めて有用である。

トリプスタチンは、ＡＩＤＳ患者に対して、静脈内、動
脈内、筋肉内、経鼻、皮下、直腸内などの非経口投与に
より、あるいは経口投与により投与することができる。

静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などの非経口投与用製剤
としては、注射剤、注入剤などが挙げられ、これら製剤
はそれ自体公知の方法によって調製することが出来る。

即ち、注射剤、注入剤などは、トリプスタチン単独、あ
るいはマンニトール、ラクトース、アルブミンなどの担
体とともに凍結乾燥しバイアル等に充填することによっ
てｌｌＩ’Ｊることが出来る。レシチン、リゾレシチン
、スフィンゴミエリンなどのリン脂質の［２からなるリ
ポソーム製剤であってもよい。皮下に留置して用いるイ
ンブラント型製剤でもよい。

経典投与用製剤としては、トリプスタチンと、ヒドロキ
シプロピルセルロースなどのヒルロース低級アルキルエ
ーテル類、ポリアクリル酸ナトリウムなどのポリアクリ
ル酸類、結晶性セルロースなどの担体とからなる粉末剤
などが挙げられる。

直腸内投与用製剤としては半開が挙げられる。

半開としては、通常用いられるカカオ脂などの半開用基
剤に、例えば脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン誘
導体類、ピリドキシン脂肪酸エステル類、ショ糖脂肪酸
エステル類、リン脂質類等の界面活性剤とともに、トリ
プスタチンを均質に分散せしめた半開などがある。

経口投与用製剤としては上記したリポソーム製剤などが
挙げられる。

上記した製剤は、いずれもそれ自体公知の方法によって
調製することができ、またこれら製剤には、通常使用さ
れる保存剤、着色剤、安定化剤などを必要に応じて添加
することができる。

トリプスタチンの投与量は、患者の年令、体重、症状等
によって変動し得るが、通常０．１〜５００　ｑ／　Ｋ
ｆＪ体重／日、好ましくは１０〜１００ｓｙ／に９体重
／日である。

［発明の効果］ トリプスタチンはＨＩＶの感染を強く抑ａ１１１シ、他
方細胞毒性を示さないため、トリプスタチンを有効成分
とする本発明の治療剤はＡＩＤＳの治療に極めて有効で
ある。

［実施例１ 以下、試験例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明
づる。

〈試験例〉 トリプスタチンはラット舌よりＫｉｄｏらの方法［Ｋｉ
ｄｏ　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　
２６３．１８１０４　（１９８８）］で精製した。ラッ
ト腹膜由来のトリプスタチンと同様の物性をｈしていた
。

ヒト、インターαトリプシンインヒビターはヒト血清よ
りＷａｃｈｔｅｒらの方法［Ｗａｃｈｔｅｒ　ａｔ　ａ
ｔｌｌｏｐｐｅ−３ｅｙｌｃｒ’ｓＺ、Ｐｈｙｓｉｏｌ
、Ｃｈｅｔ　３６２　、１３５１（１９８１）］で精製
した。

２、使用した細胞 ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞、ＭＯＬＴ−４ｍ胞（
ＡＴＣＣ番号　ＣＲＬ−１５８２）　、およびＣＣＲＦ
−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１１９）　にＨＩ
Ｖ（７）一種Ｆ　ア８１−　Ａ　Ｖ　−１［Ｂａｒｒｅ
−８ｉｎｏｕｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　
２２０　、８６８　（１９８３）］を持続感染させたＯ
ＥＭ／ＬＡＶ−１細胞を使用した。

３、　ＨＵ胞の培養 細胞は１０％ＦＣ８を添加したＲＰＭ１１６４０培地で
３７℃、５％Ｃ０２、相対へ度９５％の条件で培養した
。

４、合胞体形成の抑制試験 （１）方法 合胞体形成の抑制試験はＬｉｆｓｏｎらの方法に準じた
［Ｌｉｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｈｅｄ、
　１６４　、２１０１（１９８６）］。簡単に述べると
、ＭＯＬＴ−４細゛胞の培養液の一部を２０００　ｒｌ
）１ｍで５分間遠心してＩｌｌ胞を集め、上清を除去し
た侵、細胞をＡＳＦ１０４培地（味の素社製）で懸濁し
、細胞数が５×１０５／Ｉｄになるように調製した。こ
の１１胞懸濁液に種々の濃度のトリプスタチン、あるい
はトリプスタチンと類似のアミノ酸配列を有するヒト、
インターαトリプシンインヒビターを添加して細胞濃度
が１Ｘ１０５／ウエルになるように９６ウエルのマイク
ロタイタープレートに分注し、３７℃で３０分放置した
。これにＯＥＭ／ＬＡＶ−１１１１１ｔｌ　（ＩＩＪｌ
ｌｉｌｆｉｌ　Ｘｌ、０７／Ｒ１）　ヲ２μｍ添加して
良く混合して３７℃、５％ＣＯ２て１２時間培養し、倒
立顕微鏡で各ウェルを２００倍で観察した。合胞体形成
が６０％より多く阻害される場合を廿、３０％より多く
且つ６０％以下阻害される場合を＋、３０％以下阻害さ
れる場合を士、全（阻害されない場合を−として合胞体
形成抑制能を評価した。

（２）結果 上記の如く、トリプスタチンはＳ度に依存して合胞体形
成を抑制した。ヒト、インターαトリプシンインヒビタ
ーは合胞体形成を６０％以上抑制するのにｌａＨ必要で
あり、そのような高濃度では細胞毒性が認められた。

〈実施例１〉 注射剤 凍結乾燥トリプスタチン６００Ｍｇに注射用生理食塩水
６ｄを加えて溶解し、無菌濾過（０，２２μｍ口径、ミ
リボア社製）処理後、その２ｅをアンプルに充填しアン
プル空間を窒素ガスｒｆｆｌ換後密封し注射剤を得た。

く実施例２〉 リポソーム製剤 卵黄レシチン１１０μｍ０１、コレステ０−ル５０μｍ
ｏｌを１０ｄのクロロホルム溶液に溶解し、１００ｄの
フラスコに入れよく混合した侵、４０℃の温浴中で減圧
下に溶媒を溜去しフラスコ内壁に薄膜を形成させた。デ
シケータ−中でさらに３時間真空乾燥した。トリプスタ
チン３０μｓｏｌを１０ｍの生理食塩水に溶解し前述の
フラスコに入れボルテキシングミキサーで振鏝しさらに
超音波をかげた後、口径０．２２μｍのフィルター（ミ
リボア社製）に通した。この溶液１ｏＩｄをアンプルに
充填しアンプル空間を窒素ガスで置換後密封し注射用リ
ポソーム製剤を得た。

〈実施例３〉 坐　　剤 カカオ脂１７ｇにグリコール酸ナトリウム１．０ｇを加
え乳鉢中でよく混練した。トリプスタチン２ｇを乳鉢中
に採取しこれに上記基剤を除徐に加えて混合して緊密な
半開相成物とし、これを所定のコンテナーに２ｇ充填し
生薬製剤を得た。

〈実施例４〉 経鼻投与用粉末剤 凍結乾燥トリプスタチン１００ｑとヒドロキシルプロピ
ルセルロースとを乳鉢中に採取しよく混合することによ
って均一な粉末状組成物を得た。

この組成物を所定のカプセルに充填することにより経鼻
投与用トリプスタチン製剤を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）トリプスタチンを有効成分とする後天性免疫不全
   症候群治療剤。