JPH02245661A - ジアザテトラシクロ化合物の酵素免疫測定法、及びそれに使用される化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、特定のジアザテトラシクロ化合物の酵素免
疫測定法に関するものであり、またその方法に使用され
る化合物に関するものである。

（従来の技術） ジアザテトラシクロ化合物のうち ＦＲ６６９７２＄ で表わされる化合物は、抗腫瘍活性を持った抗性物質で
あり、癌の治療に役立つ有用な化合物である〇 式４で表わされる化合物（以下、ＦＲ６６９７３という
）は、これを薬剤として用いた場合、大量に投与すると
、骨髄の機能を阻害するというような副作用を示す。こ
の副作用は、この化合物の血中濃度が高くなるほど顕著
となる。従って、副作用を低くおさえるためには、血中
濃度を低くしなければならない。しかし、血中濃度が低
くなりすぎると、肝腎の薬効も低下する。そこで、この
化合物を薬剤として使用するには、血中濃度を適当な範
囲内にあるように注意しつつ投与する必要がある。

現在用いられている抗癌抗性物質の血中濃度を参考にす
ると、ＦＲ６６９７８を投与した患者の血中濃度をモニ
ターするためには、定量限界がｌｎｐ／／ｎ！程度の定
量法を確立することが必要である。

ＰＲ８８９７Ｂは、単位重量あたり同量投与しても、人
によって血中濃度を興にする。それは、人によって吸収
、分布、代謝、排泄等の機能が異なるからである。その
ほか、併用する他の薬剤によっても異なることがある。

だから、ＦＲ６６９７３を投与する場合には、血中濃度
を測定して、その結果に基づいて投与量を定めるのが、
良い効果をもたらすことになる、と考えられる。

他方、ＦＲ６８９７３は、分子中に３個のアセチル基を
含むが、このうち２個のアセチル基は血中で離脱しやす
いことが知られている。すなわち、ＦＲ６６９７３は、
アセチル基を離脱してＦＲ６８９８０ で表わされる化合物となる０この脱アセチル化反応は迅
速に行われ、その半減期はヒト血液中で２分位である。

こうしてアセチル基が離脱して生成された式３の化合物
（以下、ＦＲ６６９８０という）は、なおアセチル基１
個を含んでいるが、比較的体内で安定であって、アセチ
ル基を容易に離脱させない。その上に、ＦＲ６６９８０
はＦＲ６６９７３と同様に抗臘瘍活性を持っている。

そこで、ＦＲ６８９７３の血中濃度を測定する代わりに
〜それよりも安定なＦ１ａ　８９８０の血中濃度を測定
することが考えられた。ところが、ＦＲ６６９８０は、
有機溶媒によって抽出できないので、ガスクロマトグラ
フィによってその濃度を測定することができない。また
、ＦＲ６６９８０は、紫外線検出器で感度よく検出でき
ないので、高性能液体クロマトグラフィによってその濃
度をｉｌ＋定することができない。さらに、ＦＲ８６９
８０は、高感度に抗菌活性を示すような感受性菌が見出
されていないので、バイオアラ七イ法によってその濃度
を測定することもできない。従って、今亥ではＦＲ８８
９８０の血中濃度を測定するに適した方法がなかった。

（発明が解決しようとする課１［） この発明は、ＦＲ６６９７９を副作用なく薬剤として投
与するために、ＦＲ８６９８０の血中濃度を簡単迅速に
、且つ正確に測定できる方法を確立しようとしてなされ
たものである。

（課題を解決するための手段） この発明者は、上記の課題を解決するために、ＦＲ６６
９８０の血中濃度を酵素免疫的に測定する方法を確立し
ようと企てた。ところが、ＦＲ６６９８０は、それ自身
が抗原性を持たないので、そのままでは抗体を得ること
ができない。そこで、この発明者は、ＦＲ６６９８０の
色々な誘導体を合成し、これをハプテンとして用い、こ
れに蛋白を結合させて、抗原性を付与することを試みた
。すなわち、ＦＲ６６９８０の誘導体と蛋白との複合体
を動物に投与して、抗体を作成した。

また、この発明者は、こうして得た抗体の性質を調べる
ために、ＦＲ６６９８０の誘導体を酵素で標識して酵素
標識体を作り、これを上述の抗体と抗原抗体友応を行わ
せて、その比活性を検討した。

また、抗体と酵素標識体及びＦＲ６６９８０とを混合し
て、ＦＲ６６９８０が酵素標識体と抗体との結合をどの
程度阻害するかを検討した。こうして、抗体に対するＦ
Ｒ６６９８０と酵素標識体との競合性を調べた。その結
果、一般式 で表わされる化合物のうち、Ｒが である化合物を用いると、ＦＲ６８９８０を認識し、酵
素１１１１体とＦＲ６６９８０との敏感な競合反応を行
わせることができることを見出した。この発明は、この
ような知見に基づいてなされたものである。

（発明の要旨） この発明は、 で表わされる化合物と蛋白との結合体を動物に投与して
生成させた抗体、 ＭＢＡ−ＦＲ９００４８２ で表わされる化合物に酵素を結合させてなる酵素標識体
、及び ＦＲ６８９８０ で表わされる化合物を含有する被検体とを混合し、抗原
抗体反応を行わせたのち、抗体と結合した酵素標識体と
、抗体と　結合していない酵素標識体とを分離し、その
何れかの酵素活性を測定し、被検体中の式８で表わされ
る化合物を定量することを特徴とする、式３で表わされ
るジアザテトラシクロ化合物の酵素免疫測定法を要旨と
するものである。但し、ｎは、工ないし６の整数を表わ
す。

また、この発明は、上記の酵素免疫測定法に用いられる
試薬をも含んでいる。その試薬の発明は、試薬ｏｏ：上
記の式１で表わされる化合物と蛋白との結合体を動物に
投与して生成 させた抗体。

試薬（Ｙ）：式２で表わされる化合物と酵素とを結合さ
せた酵素標識体。

との少なくとも２種の試薬により構成されることを特徴
とする、式３で表わされるジアザテトラシクロ化合物の
酵素免疫定量用キットを要旨とするものである。

さらに、式１及び式２で表わされる化合物は、文献未記
載の化合物であるから、この発明は、式１及び式２で表
わされる化合物自体をも含んでいるＯ まず、式１で表わされる化合物の製造方法からの培養液
から得られたＦＲ９００４８２に、Ｎ−マレオイルアミ
ノ脂肪酸を反応させることにより、次式に従ってこれを
作ることができる。

す （ＦＲ９００４８２） （反応１） 上記の式中ｎｍ３のも＋７）（ＭＡＢＡ−ＦＲ９００４
８２）を得るには、Ｎ−マレオイルアミノ脂肪酸として
、Ｎ−マレオイルアミノプチリックアシドを用いる。

式２の化合物は、式１の化合物と同様に、ＦＲ９００４
８２にｍ−マレロイル安息香酸を反応させることにより
、次式に従って合成することができる。

ア七チルメルカプトサクシニックアンハイドライドであ
る。

例えば、蛋白として牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を
用いて、Ｓ−ア七チルメルカプトサクシニックアンハイ
ドライドにより、式１の化合物と蛋白との結合体を作る
には、下記の式で示すような反応を行わせる。

式１の化合物に蛋白を結合させるには、式１の化合物中
のマレイミド基を利用する。この場合、マレイミド基と
反応し得る架橋剤を介して結合させる。蛋白としては、
アルブミン、グロブリン、ゼラチン、ヘモシアニン等を
使用することができる。また、架橋剤としては、蛋白の
種類に応じて色々なものを使用することができる。架橋
剤として好ましいのは、フハク醗の誘導体、例えばＳ　
−υ （反応８） υ （反応８） 上式に従って合成された蛋白との結合体は、これを適当
なアジュバント剤と混合し、この混合物を動物に投与し
て血清を採取するという、公知の処理によって抗体を得
ることができる。この抗体はすなわち試薬Ｘの主成分で
ある。この場合の動物としては、モルモット、ウサギ、
山羊、羊等を用いることができる。また、これらの動物
に投与するには、皮下注射、筋肉注射によることができ
る０ 他方、酵素標識体を作るには、式２の化合物ＭＢＡ−Ｆ
Ｒ９００４８２に、公知の方法に従って酵素を結合させ
る。その結合には、両者を直接結合させることもできる
が、また架橋剤を介して結合させることもできる。酵素
としては各種のものを使用することができる。例えば、
ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、グルツースオキシダーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、
リンゴ醸脱水素酵素、ウレアーゼ等を使用することがで
きる。それらのうちで、好ましいのはβ−ガラクトシダ
ーゼである。

酵素としてβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を用い
、これを式２の化合物ＭＢＡ−ＦＲ９００４８２と結合
させる場合の反応を式で示すと、下記のとおりである。

す ＭＢＡ−ＦＲ９００４８２ こうして得られたＦＲ９００４８２−β−ｇａｌは、酵
素標識体である。これが試薬Ｙの主成分である。

酵素免疫測定を行うにあたっては、被検体中のＦＲ８６
９８０と試薬Ｙとを試薬Ｘに対して競合的に抗原抗体反
応を行わせる。その後、被検体中の抗体と結合している
酵素標識体（すなわちバウンド部分）と、抗体と結合し
ていない酵素標識体（すなわち７リ一部分）とを分離す
る。このＢ／Ｆ分離を容易にするために２つの公知方法
を用いることができる。その１つは、抗体それ自身を不
溶化しておく方法であり、他の１つは、第２抗体を用い
て抗体を不溶化しておく方法である。前者の方法は、抗
体を固定化して固体としておく方法である。後者の方法
は、抗体に対する第２抗体を泪意し、抗原抗体反応の前
後に第２抗体を加えて、抗体を不溶化しておく方法であ
る。

前者の方法により抗体を不溶化するには、細菌ｍ胞壁、
天然の不溶性多糖類、化学処理したデキストランゲル、
寒天ゲル、プラスチックビーズ、アクリルアミドゲル、
ガラスビーズ、微細金属粉などを用いることができる。

第２抗体は、例えば式１で表わされる化合物と蛋白との
結合体をモルモットに注射して、ＦＲ６６９８０の抗体
を得た場合に、モルモットのイムノグｅｌフＩＪンを家
兎に注射して得た抗モルモットイムノグロブリン家兎血
清を、第２抗体として使用することができる。

第２抗体は、通常溶液状態で用いられることが多いが、
これを不溶化しておくこともできる◇この場合の不溶化
には、前述の細菌の細胞壁などを使用することができる
。このように、第２抗体を不溶化しておくと、その使用
量が少なくて済み、また反応時間を短かくすることがで
きる。

Ｂ／Ｆ分離を行ったのち、沈澱又は上清の何れかの酵素
標識体の酵素活性を測定する。例えば、沈澱中の酵素活
性を測定するには、沈澱に基質を加えて酵素反応を一定
の条件下で進行させたのち、これを停止させて、その間
に行われた基質の変化を測定する。その測定は、基質の
種類に応じて適当な手段を用いる。例えば、基質から生
じた化合物が螢光を発する場合には、螢光光度計を用い
て螢光強度の変化を見るのが便利であり、また基質から
生じた化合物が紫外線吸収を示す場合には、紫外線吸収
光度計を用いるのが好都合である。実際には、ＦＲ６６
９８０の濃度と螢光強度又は吸光度との関係を予じめグ
ラフとした標準曲線図を作成しておき、実測して得た螢
光強度又は吸光度から、直ちにＦＲ６８９８０の濃度を
求めることができるようにするのが便利である。

（発明の効果） この発明に係る酵素免疫測定法は、血漿１００ｆｉ！程
度の少量を使用するだけで、測定可能である。従って１
ｆＩｔ！以上を必要とする高性能液体クロマトグラフィ
による方法に比べると、この発明方法は実施が容易であ
る。また、この発明方法は、イヌ、ラット、マウスの血
漿に対しても適用できるが、とくにヒトの血漿に対して
正確な結果が迅速に得られる利点を持っている。血漿だ
けでなく、ヒトの尿を採取して、尿に対してこの発明方
法を実施することもできる。

また、この発明に係る定量用キットは、上述の酵素免疫
測定法を実施するに必要な試薬を提供することになるか
ら、測定を容易にする上で大きな利益をもたらす。さら
に、この発明に係る化合物のＭＡＢＡ−ＦＲ９００４８
２とＭＢＡ−ＦＲ９００４８２とは、上述の酵素免疫測
定法を実施するに必要な材料の中間体として有用なもの
である。

以下に実施例を述べて、この発明をさらに具体的に説明
する。

以下の実施例で緩ｍｌ’！！Ａというのは、リン酸緩衝
液（１００ｍＭ／ｌ、ｐＨ７，４）に、１１あたり０．
１　ＭのＮａＣ１と、１ｍＭのＭｇＣ！、と、１２のＮ
ａＮ、とを含んだ溶液である。また、緩衝液Ｂは、緩衝
液Ａに０．１％の牛血清アルブミンを含ませたものであ
る。

実施例１ この実施例では、弐１の化合物中でｎが３の化合物 を作った。

まず、 で表わされる化合物３２１■（１ｍ　ｎｏ　りと、で表
わされるＮ−マレオイルアミ／ブチリックアシド１８８
〜（１ｍ　ｍｏ　Ｉ）とをモレキニラーシープで乾燥し
たテトラヒドロフラン７０−に溶解し、水冷下でジシク
ロカルボジイミド２０６〜（１ｍｍｏ　りを加えた後４
℃で７２時間攪拌した。その後、不溶性の沈澱をｐ去し
、溶液を濃縮乾固した。

残渣をアセトニトリルとエチルエーテルとの混合溶剤中
で沈澱させて、白色粉末を得た。この粉末は、各種薄層
クロマトグラフィで１スポツトとして現われた。また、
これが式５の化合物であることは、第二次イオン質量分
析法により確認した。

ＳＩＭＳ；ｍ／ｅ　　４８７、ＣＭ＋１：ｌ”実施例２ この実施例では、実施例１で得られた式５の化合物と牛
血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）との複合体を作った。そ
の合成手順は、反応８で示すとおりである。

すなわち、まず、ＢＳＡに架橋剤としてＳ−アセチルメ
ルカプトサクシニックアンハイドライド（ＡＭＳ）を結
合させ、この架橋剤に式４の化合物を結合させた。その
詳細は次のとおりである。

まず、２００〜のＢＳＡを０．２　Ｍのリン酸緩衝液φ
Ｈ７，Ｏ）　５　ｒｎｔに溶解し、窒素ガスの気流下で
、これにＳ−アセチルメルカプトサクシニックアンハイ
ドライド（ＡＭＳ）１２５１ｎｇを徐々に添加し、その
後窒素気流下に２５℃で１時間攪拌を続けた。こうして
得られた反応液を脱イオン水で平衡化した七ファデック
スＧ−７５カラム（ファルマシアファインケミカルズ社
製）　　（２ｈ５Ｘ４０ｃｍ）に通して精製した。カラ
ムから溶出されたＡＭＳ−ＢＳＡを凍結乾燥して、粉末
１１３〜を得た。ＢＳＡに導入されたＳＨ基の数をＥ　
１１ｍａｎ法によって測定したところ、１２５Ｈ／ＢＳ
Ａ　１分子であった。

次に、ＡＭＳ−ＢＳＡの３０ｍｔを０．１　ＭのＮＨ，
ＯＨ水溶液０．５　ｍｅに溶解し、２５℃で３０分間放
置し、その後これに８Ｍの尿素を含んだ０．０２　Ｍの
リン酸緩衝液ωＨ７，Ｄ）の＆〇−を加えた。この溶液
を、実施例１で得た式５の化合物（ＭＢＡ−ＦＲ９００
４８２）の７．８１Ｆ＋９が１００／Ｉｌのアセトニト
リルに溶解されている溶液に添加し、室温で８０分間攪
拌した。

この反応液を、３Ｍの尿素が含まれた０、　１　Ｍのリ
ン醗緩衝液争Ｈ７，Ｏ）で平衡化した七ファデックスＧ
−７５カラム（１５Ｘ４５（Ｍｌｌ）に通し、式５の化
合物（ＭＡＢＡ−ＦＲ９００４８２）どＢＳＡとの複合
体（以下、これをＦＲ９００４８２−ＢＳＡという）を
精製した。この複合体について紫外線スペクトルにより
、ＢＳＡ１分子あたりに含まれるＦＲ９００４８２のモ
ル数を求めたところ、＆４であった。

実施例８ この実施例では、酵素としてβ−ガラクトシダーゼを眉
い、ＭＢＡ−ＦＲ９００４８２からさきに述べた反応４
に従ッテ酵素漂識体（ＦＲ−９００４８２−β−ｇａｌ
）を作った。その詳細は次のとおりである。

まず、ＭＢＡ−ＦＲ９００４８２の合成から説明する。

３２１１ＦＩＦ　（１ｍＭ）のＦＲ９００４８２と２１
７　＃（１ｍＭ）のｍ−マレオイルベンゾイックアシド
を乾燥したテトラヒドロフラン５０ｍ／に溶解し、水冷
下で２０６１ＦｌＦ（１ｍＭ）のジシクロへキシルカル
ボジイミドを加えたのち、４℃で４８時間攪拌して反応
させた。

その後、不溶性の沈澱を一過し、声液を濃縮乾固し、次
いでアセトニトリルとエーテルの混合溶剤から白色の沈
澱を得た◇得られた粉末は、各種薄層クロマトグラフィ
処理において１スざットを示した。また、こうして得た
化合物がＭＢＡ−ＦＲ９００４８２であることは、ツイ
ールドブソープション質量分析法により確認した。

ＦＤＭＳ；ｍ／ｅ　　５２０、Ｍ＋ 次いでＭＢＡ−ＦＲ９００４８２の酵素標識体を次のよ
うにして作った。０．５　ｆｆｖのβ−ガラクトシダー
ゼ（０，１１３１ｎｇの蛋白；０．２１ｎＭ）を１！ｎ
ｌの０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解して
溶液とした。また、上で得たＭＢＡ−ＦＲ９００４８２
の５−５　）’９’　ＣＬｏ、５ｎｂＤを１００ｆｉ／
のアセトニトリルに溶解して得た溶液に、上の溶液を加
えて室温で８０分間攪拌して反応させた。この反応液を
緩衝液Ａにより平衡化したトー１−バールＨＷ−５５＠
ソー社製）（１５Ｘ４５ｃＭＲ）のカラムクロマトグラ
フィ処理して精製し、緩衝液Ａにより溶出して各７ラク
シヨンに分けた。

各フラクションの酵素活性を調べ第１図のグラフを得た
。このうち、比活性の高いフラクション４３から４７の
ものを酵素免疫測定用に選んだ。

この場合、活性の測定は次のように行った。まず、５ｐ
ｌの酵素稀薄溶液を、基質としての０．３　ｍＭの４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトサイド溶液
１００声Ｅに３７℃で８０分間インキュベートしり。そ
の後、これを０．１ＭのＮａ、Ｃｏ３溶液２．、Ｏｄを
加えて反応を停止した。この溶液を３６０ｎｍの波長で
励起し、４５０ｎｍの螢光により螢光光度計で測定した
。１分間に基質１）Ｌｍを加水分解する酵素量を１活性
単位とし、複合体の量はβ−ガラクトシダーゼの活性単
位によって示すこととした。

第１図中で、Ｏは各７ラクシヨンの１／ｌ　Ｏ００溶液
５０，１１１を用いた場合の複合体の酵素活性を示し、
ムはＦＲ６６９８０が存在しない場合に酵素免疫測定に
よって得られた酵素活性を示し、・は５ｎｐのＦＲ６６
９８０が存在した場合に、同様に酵素免疫測定によって
得られた競合的な酵素活性を示している。

実施例４ この実施例では、実施例２で得たＦＲ９００４８２−Ｂ
ＳＡを用いて抗ＦＲ６６９８０抗血清を得た。その詳細
は次のとおりである。

まず、実施例２で得たＦＲ９０Ｑ４８２−ＢＳＡを抗原
とし、これを等体積のフロイント完全アジェバントと混
合し、ホモジナイザー（ポリトロン）によってエマルジ
１ンとした。抗原的０．３■を含んだこの複合体をモル
モットの背中約１０ケ所に皮下注射し、さらに大腿部筋
肉２ケ所に筋肉注射した。その後、２週問おきにこの複
合体を先の半量づつ同様に注射した。注射直前に血清を
少量眼窩静脈叢より採取し、５５℃で３０分間加熱後、
抗体力僅の測定まで一３０℃で保存した。

実施例５ この実施例では、実施例３で得た酵素標識体ＦＲ９００
４８２−β−ｇａｌと、実施例４で得た抗ＦＲ６６９８
０抗血清とを用い、さらに第２抗体を用いて抗原抗体５
反応を行った。その詳細は次のとおりである。

第２抗体としては、米国、カリホルニア、リッチモンド
のバイオランド・ラボラトリーズが販売しているイムノ
ビームと呼ばれる商品を用いた。

この商品は、モルモット免疫グロブリンを兎に注射して
得た抗モルモット免疫グロブリンを主体とするものであ
って、これをポリアクリルアミドビーズに固定して得た
面相化抗体である。この第２抗体５０ｇを緩衝液Ｂの５
０ｊｄ中に懸濁した。

抗ＦＲ６６９８０抗血清とＦＲ９００４８２−β−ｇａ
ｌとを緩衝液Ｂで稀釈した。ＦＲ６６９８０標準溶液（
脱イオン水で稀釈したものでＯ〜２００■／ｍにわたる
）の５０１と、１００バのヒト血漿と、５０１１１のＦ
Ｒ９００４８２−β−ｇａｌ（３６μユニツトと、抗血
清の３００００倍ｉ液５０ｐ１とを、マイクロスビッツ
に取りよ（混合したのち、２５℃で１５時間インキエベ
ートした０次いで、この反応液に上述のイムノビームの
懸濁液５０ａｌを加え、さらに２５℃で１時間インキエ
ベートした。その後、１分間に１００００１１転で５分
間遠心分離をして、上清を吸引除去し、あとに沈澱とし
て抗体と結合した酵素標識体を得た。この沈澱を１ｍの
緩衝液Ｂで２回洗浄した。

その後、この沈澱を０．３ｍＭの４−メチルウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−ガラトサイド１００Ｉ１１で覆い、酵
素反応を３７℃で３０分間行った。その後、０、１　Ｍ
のＮａ、ＣＯ３溶液２ｍを加えて酵素反応を停止させた
。この反応液を３６（ｌｎ＋＊の波長で励起し、４５０
ｎ−の蛍光により蛍光光度計で測定した。その結果を第
２図に示す。

実施例に の実施例では、ＦＲ６６９８０測定用のキットを作った
。

（１）　　Ｆ　Ｒ６６９８０標準曲線用サンプル。

１■のＦＲ６６９８０を１０−のメスフラスコに入れ、
水に溶解して１ｍｇ／１０ｍに調整したものを標準溶液
とした。

この標準溶液を水で稀釈し、例えば１００１５０．２０
．５．２．１．０．５■Ｚ１１１等のＦＲ６６９８０水
溶液を作り、これを検量線検体とする。

この溶液は、測定時まで４℃で保存する。

（２）酵素Ｉ識体 実施例３で製造したＦＲ９００４８２−β−ｇａｌ　　
１００ｄを緩衝液Ｂｌｏｏｄで稀釈し、これを１００ｍ
容量の褐色びんに詰める。この溶液は、測定時まで４℃
に保存したが、６ケ月以上安定である。

（３）抗体 実施例４で製造した抗ＦＲ６６９８０抗血清１０．ａｊ
を緩衝Ｉ８１００ｄで稀釈し、これを１００ｍ容量の褐
色びんに詰める。この溶液を測定時まで４℃に保存した
が、６ケ月以上安定である。

（４）第２抗体 ウサギ抗モルモットＩｇＧとして大日本製薬社製のマー
セラ２０（登録商標）又はノイイオラッド社製イムノビ
ーズ（登録商標）を用１．％る。

（５）基賞 半井化学社製の４−メチルウンベリフェリル−β−Ｏ−
ガラクトシドの粉末を水に溶解し、０．３ｍＭ１液を作
製して褐色びんに入れる。この溶液は、測定時まで４°
Ｃに保存したが、６ケ月以上安定である。

（６）反応停止液 ０．１ＭのＮａｚＣＯ１溶液を作り、これをびんに詰め
て反応停止液とする。

実施例７ 実施例６で得たＦＲ６６９８０測定用キツトを用い、次
の手順に従うてヒト血漿中のＦＲ６６９８０を測定した
。

検量線作製のため、健常人より得たヒトブランク血漿１
００ｄに、ＦＲ６６９８０の検量線検体各５０１１１、
酵素標識体５０パ、抗ＦＲ６６９８０抗血清５０４を加
えた。これをよく攪拌し、次いで、２５℃で１５時間イ
ンキエベートした０次いで、第２抗体（ウサギ抗モルモ
ットＩｇＣ；）５０パを加えた後、２５℃で１時間イン
キエベートした。その後、遠心分離して抗血清と結合し
た酵素標識体を沈澱として得た。

この沈澱に基質溶液１００ｔ１１を加え、３７℃で３０
分間インキエベートした。その後、反応停止液２ｄを加
え、酵素反応を停止し、生じた蛍光を励起波長３６０ｎ
ｍ、蛍光波長４５０ｏｍで蛍光強度を測定し、図２と同
様なＦＲ６６９８０の検量線を作製した。

検体測定の時は、ＦＲ６６９８０標準溶液の代わりに、
水６０ｄを加えて同様の操作を行い、検量線よりＦＲ６
６９８０の濃度を求める。

実施例８ この実施例では、尿中のＦＲ６６９８０の濃度を測定し
た。実施例６で調整したキットを用い、実施例７のヒト
血漿の代わりに、水で１０倍に稀釈した尿を検体として
用い、同様の操作でヒト尿中ＦＲ６６９８０の濃度を測
定した。

作製した検量線の結果を第３図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３で得た酵素標識体の各フラクシツン
と酵素活性との関係を示したグラフである。第２図は、
実施例５で得たＦＲ６６９８０の検量線図である。第３
図は、実施例８で得たヒト尿中ＦＲ６６９８０の検量線
図である。 特許出願人　藤沢薬品工業株式会社 第１図 第５図 フラフシｊン１え （り、０ｐｐｔｌ／試験噌）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式１で表わされる化合物と蛋白との結合体
   を動物に投与して生成させた抗体、下記の式２で表わさ
   れる化合物に酵素を結合させてなる酵素標識体、及び下
   記の式３で表わされる化合物を含有する被検体とを混合
   し、抗原抗体反応を行わせたのち、抗体と結合した酵素
   標識体及び抗体と結合していない酵素標識体とを分離し
   、その何れかの酵素活性を測定し、被検体中の式３で表
   わされる化合物を定量することを特徴とする、式３で表
   わされるジアザテトラシクロ化合物の酵素免疫測定法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（式１） 但し、ｎは１〜６の整数を表わす。 ▲数式、化学式、表等があります▼（式２） ▲数式、化学式、表等があります▼（式３）
2. （２）抗体と結合した酵素標識体と、抗体と結合してい
   ない酵素標識体とを分離するに際し、抗体を第２抗体に
   より不溶化することを特徴とする、特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。
3. （３）蛋白がアルブミン又はグロブリンである、特許請
   求の範囲第１又は第２項記載の方法。
4. （４）動物がモルモットである、特許請求の範囲第１−
   ３項の何れか１つの項に記載の方法。
5. （５）被検体が血漿又は尿である、特許請求の範囲第１
   −４項の何れか１つの項に記載の方法。
6. （６）試薬（Ｘ）：式１で表わされる化合物と蛋白との
   結合体を動物に投与して生成させた抗体。 試薬（Ｙ）：式２で表わされる化合物と酵素とを結合さ
   せた酵素標識体。 との少なくとも２種の試薬により構成される、ことを特
   徴とする、式３で表わされるジアザテトラシクロ化合物
   の酵素免疫定量用キット。但し、式１、式２及び式３は
   前述のとおりである。
7. （７）試薬（Ｘ）を細菌の細胞壁、天然の不溶性多糖類
   、化学処理したデキストランゲル、寒天ゲル、プラスチ
   ックビーズ、アクリルアミドゲル、ガラスビーズ、微細
   金属粉により、不溶化したことを特徴とする、特許請求
   の範囲第６項に記載する定量用キット。
8. （８）試薬（Ｘ）が第２抗体により不溶化されているこ
   とを特徴よする、特許請求の範囲第６項に記載する定量
   用キット。
9. （９）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる化合物。但しＲは▲数式、化学式、表等が
   あります▼ 又は▲数式、化学式、表等があります▼を表わし、ｎは
   １〜６ の整数を表わす。