JPH0222732B2

JPH0222732B2 -

Info

Publication number: JPH0222732B2
Application number: JP4050684A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Seiki; Seiichi Ishizuka; Naryuki Ishii; Masayoshi Kumegawa
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1984-03-05
Filing date: 1984-03-05
Publication date: 1990-05-21
Also published as: JPS60185715A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は骨形成促進剤に関する。更に詳細には
本発明は1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミン
D₃26，23（Ｓ）−ラクトンを有効成分とする骨形
成促進剤に関する。従来、骨粗鬆症、骨軟化症等の治療に有用な化
合物として、例えば1α−ヒドロキシコレカルシ
フエロール、1α，24−ジヒドロキシコレカルシ
フエロール、1α，25−ジヒドロキシコレカルシ
フエロール等の活性型ビタミンD₃化合物が知ら
れている。一方近時において、1α、ヒドロキシコレカル
シフエロールあるいは1α，25−ジヒドロキシコ
レカルシフエロールの新規な代謝産物として、
1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンD₃26，23
（Ｓ）−ラクトンが単離同定された（FEBS
LETTERS，134，207〜211，1981；Arch.
Biochem.Biophys.，204，339〜391，1980）。1α，
25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンD₃26，23（Ｓ）−
ラクトンの薬理作用としては、例えば血清中の異
常に高まつたカルシウムレベルを下げる作用（特
開昭58−118516号公報）、腫瘍細胞増殖抑制作用
もしくは殺細胞効果（特開昭58−210011号公報）
等が報告されている。本発明者らは、1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビ
タミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンの、特に骨に対
する作用について詳細に検討したところ、強力な
骨吸収阻害作用あるいは骨形成細胞活性化作用等
を有し、かかる化合物が骨形成促進剤として有用
であることを見出し本発明に到達したものであ
る。すなわち、本発明は、1α，25（Ｒ）−ジヒドロ
キシビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンを有効成
分とする骨形成促進剤である。本発明で用いられる1α，25（Ｒ）−ジヒドロキ
シビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンは下記式で表わされる。本化合物は、例えば25（Ｒ）−ヒド
ロキシビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンに1α−
水酸化酵素を作用させる方法（FEBS
LETTERS，134，207〜211，1981）、あるいは
対応するＡ環骨格とＣ，Ｄ環骨格とをWitting反
応によつて縮合する化学合成法（J.Org.Chem.，
48，4433〜4436，1983）等によつて得ることがで
きる。本化合物は、骨からのカルシウムの溶出（骨吸
収）を抑制する作用、及び骨形成細胞に対してア
ルカリフオスフアターゼ活性あるいはコラーゲン
合成能を高めて骨形成細胞を活性化する作用を有
する。従つて本化合物は骨形成促進剤として有用
な化合物であり、骨粗鬆症、骨軟化症等の治療も
しくは予防に有効である。本発明の1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミン
D₃26，23（Ｓ）−ラクトンは、経口的にあるいは
静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、経皮等の
非経口的に投与される。経口投与の剤型として
は、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など
が挙げられる。錠剤は結晶セルロース、ポリビニ
ルピロリドン、乳糖、でんぷんなどから通常の方
法により成形される。顆粒剤、散剤も同様の基剤
を用いて通常の方法により成形される。カプセル
剤は、本化合物をココナツツ油、綿実油、中鎖脂
肪酸のトリグリセライドエステル等に溶解せしめ
て得られる溶液をゼラチンのソトカプセルに充填
することによつて成形される。静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下などの非経口投
与の剤型としては、本化合物をアルコール等の溶
液に溶解し、安定剤、防腐剤等を添加して得らる
注射剤があげられる。経皮投与の剤型としては、軟膏剤、クリーム剤
などが挙げられ、直腸内投与の剤型としてはソフ
トカプセル剤などがある。本発明の1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミン
D₃26，23（Ｓ）−ラクトンの投与量は、患者の年
齢、性別、疾患の程度、剤型などによつて異なる
が通常成人に対して１日当り0.01〜100μｇ、好ま
しくは0.1〜30μｇ投与される。以下本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。実施例１ in vitroにおける骨からのカルシウム溶出試験溶出試験 1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンD₃26，23
（Ｓ）−ラクトンの、骨からのカルシウム溶出（骨
吸収）に対する作用を調べた。生後２−３日目のマウスに生理食塩水に溶解し
た⁴⁵CaCl₂を腹腔内投与（0.5〜1μCi／head）し、
その２−３日後に頭頂骨を摘出した。左右の頭頂
骨をほぼ同量切り取り、一方を対照群、他方を処
置群とした。最初の24時間は前培養期間とし、10
％ウシ胎仔血清を含む修正BGJb培養液中で培養
した。その後は５％ウマ血清を含む修正BGJb培
養液に処置群ではエタノール溶解した1α，25
（Ｒ）−（OH）₂D₃−2623（Ｓ）−ラクトンを加え、
対照群では同量のエタノールを加え、96時間培養
した。培養終了後、頭頂骨は生理食塩水で洗浄
後、約24時間IN塩酸中に浸し、カルシウムを溶
出させ、液体シンレーシヨンカウンターによりそ
の放射能量を測定した。培養液もその１部をとり
同様に放射能量を測定した。次式により⁴⁵Caの溶
出率を計算した。⁴⁵ Ca溶出率＝培養液中放射能量／培養液中放射能量＋骨
中放射能量同一個体から得られた頭頂骨の⁴⁵Ca溶出率の対
照群に対する処置群の比を第１表に示した。

【表】

【表】以下で阻害を示す。
第１表から明らかなように、1α，25（Ｒ）−ジ
ヒドロキシビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンは
骨吸収阻害作用を有する。実施例２ 1α，25−ジヒドロキシビタミンD₃による骨吸
収促進に対する1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビ
タミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンの作用 1α，25−ジヒドロキシビタミンD₃（1α，25−
（OH）₂D₃）による骨吸収促進に対する1α，25
（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラ
クトンの作用を調べた。培養方法は対照群の培養液中に1α，25−
（OH）₂D₃にエタノールあるいは1α，25（OH）₂D₃
−26，23（Ｓ）−ラクトンを加えた以外実施例１に
同じである。結果は第２表に示した通りである。

【表】第２表より明らかな如く、1α，25−（OH）₂D₃
による骨吸収の促進を、1α，25（Ｒ）−
（OH）₂D₃26，23（Ｓ）−ラクトンが濃度依存的に
阻害する。実施例３骨形成細胞に対する1α，25（Ｒ）−（OH）₂D₃−
26，25（Ｓ）−ラクトンの効果骨形成細胞に対する1α，25（Ｒ）−（OH）₂D₃−
26，25（Ｓ）−ラクトンの効果を、アルカリフオス
フアターゼ（ALP）活性およびコラーゲン合成
能（プロリンの取り込み）によつて測定した。 (i) ALP活性マウス新生仔頭頂骨から、高ALP活性を指標
として得られたMC3T3−E1細胞を用いた、細胞
は５％CO₂、95％空気中37℃で、10％仔牛血清を
含むαMEM培養液で培養した。５日目毎に、
0.001％pronase Ｅ、0.02％EDTAを含む、PBS
（−）でsubcultureした。実験前に５×10⁴の細胞
を２mlのαMEM（10％仔牛血清を含む）培養液に
加え、35mmのプラステイツクデイシユ中で培養し
た。５日後、ビタミンD₃類縁体を加えたαMEM
（２％仔牛血清）培養液中に移し、培養し、12〜
16時間後にALP活性を測定した。 ALP活性はLowryらの方法に従いｐ−ニトロ
フエニルフオスフエイトを基質として測定した。
10mMの基質、0.7M2−アミノ−２−メチル−１
−プロパノール、1mM MgCl₂と適当量の試料を
加えて0.1M炭酸ナトリウム緩衝液中（PH10）に
とかし、終容積を１mlとした。これを37℃30min
incubatelし、反応を0.1N NaOH ２mlを加える
ことにより終了させた。生成したｐ−ニトロフエ
ノール量を△10nmの吸光度により測定した。結
果は第３表に示した通りである。

【表】第３表より、1α，25（Ｒ）−（OH）₂D₃26，25
（Ｓ）−ラクトンはALP活性を高めることがわか
る。 (ii) コラーゲン合成能 ALP活性測定の項と同じ方法で細胞を調整し
た。細胞を50μｇのアスコルビン酸、β−アミノ
ピロピルニトリルと10μCiのＬ−〔３，４−³H〕
プロリンを含む１mlαMEMに移し、３時間
incubateする。培養液を除去後、0.2MNaOH １
mlを加え、ホモゲナイズする培養液と、細胞の蛋
白質を各々、５％タンニン酸を含む50％TCA
0.2ml加え沈降させる。１％タンニン酸を含む10
％TCAで３回、氷冷アセトンで２回洗浄する。
0.05MNaOH １mlを加え溶解する。これを２つ
にわけ、100mMCaCl₂と2mMN−エチル−マレ
イミドを含む0.2MTris−HCl緩衝液（PH7.5）を
加え、25Vのコラーゲナーゼを存在下で37℃３時
間incubationする。TCAを終濃度10％となるよ
うに加え、蛋白質を沈降後、上清部分の放射能を
測定した。これをコラーゲナーゼで可溶化された
コラーゲン量とした。結果は第４表に示した。

【表】第４表より、1α，25（Ｒ）−（OH）₂D₃26，25
（Ｓ）−ラクトンはコラーゲン合成能を高めること
がわかる。実施例４分画ココナツツオイル１Kgに1α，25（Ｒ）−ジ
ヒドロキシビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトン５
mgを溶解し、１カプセル中に1α，25（Ｒ）−ジヒ
ドロキシビタミンD₃26，23（Ｓ）−ラクトンを0.5μ
ｇ含有するように下記剤皮成分を加温溶解し軟カ
プセル製造機を用いて常温により軟カプセル剤を
作成した。剤皮成分ゼラチン 10重量部グリセリン２〃防腐剤 0.05 〃チタンホワイト 0.2 〃水 0.2 〃

Claims

【特許請求の範囲】

１ 1α，25（Ｒ）−ジヒドロキシビタミンD₃26，
23（Ｓ）−ラクトンを有効成分とする骨形成促進
剤。