JPH02225599A - 修飾酵素を用いる酵素的過酸漂白系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に過酸漂白に関連するものであり、特に新
規な酵素曲送加水分解（ｐｃｒｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）
系および漂白向上のための水溶液における上記分解系の
使用法に関連するものである。

（従来技術） 各種漂白剤が織物の洗浄および前洗浄などの多数の洗浄
用途ならびに堅い表面の洗浄のような他の用途に長年、
使用されてきている。これらの用途では、漂白剤がｍ物
、繊維および堅い表面の種々のじみや汚れを酸化する。

過酸化水素、過炭酸ナトリウムおよび過ホウ酸ナトリウ
ムのような過酸化物漂白物質は酸化力があるので乾燥漂
白剤処方において有用であることがみとめられている。

過ホウ酸塩漂白剤にテトラアセチルエチレンジアミンの
ような活性化剤などのある種の有機物質を添加すると、
艮肛Ｊ　（ｉｎ　５ｉｔｕ　）において過酸が生成する
ため、漂白性能を改善できることもみとめられている。

織物、繊維その他の材料用の洗浄成分である種のじみや
汚れを除去する各種酵素を含むものも！］１１発されて
いる１例えば、タンパク分解酵素は特に織物の洗浄にお
いてタンパク質によるじみを加水分解するために有用で
あることがみとめられている。酵素アミラーゼは例えば
食品に起因する炭水化物によるしみに対して有用である
ことがみとめられている。酵素リパーゼも前洗浄または
前浸漬の段階で脂質によるじみを加水分Ｂするために有
用であることがみとめられている。

洗浄または界面活性剤における酵素の使用に関連して、
ノボ、インデス１−リー＾フ５社申請の欧州共同体特許
出願、公開番号・第（１１３００６４号は洗浄用途にお
いて界面活性剤ととらに使用する酵素添加剤の改善に関
Ｃ系するものである。この発行文献では、６０°Ｃ以下
の比較的低温を含む広汎な洗浄温度において、脂質分解
性の洗浄効率を実質的に改善するため、酵素リパーゼの
使用が考察されている。

この文献では、さらに、脂質によるじみを少くとも部分
的に溶解または軟化する手段として、じみや汚れと直接
相互作用するためのリパーゼなどの酵素の使用が開示さ
れている。

１９７６年８月１０日に１４ｅｙｎに対して与えられた
米国特許第３，９７４，０８２号ではアルキルエステル
を水溶液中で酵素エステラーゼまたはリパーゼと混合し
、上記エステルからアシル基が遊離すると主張されてい
る漂白成分およびその使用法が開示されている。　Ｗｅ
ｙｎの特許では、さらに、この混合物を過酸化！ｌ！Ｊ
質と併用すると、九痘ｊにおいて過酸が生成すると主張
されている。

したがって、高温における性能を維持しながら、低温に
おける洗浄条件において水溶液中の性能を向上させるこ
とができる改善された漂白性または活性化酸化剤系の必
要性があることがみとめられている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明により過酸を生成するための、過酸化水素源の存
在下で基質を酵素的に退却水分解し、過酸を生成する活
性化酸化剤系が得られる０本発明の斬新な酵素は触媒的
に作用し、基質の反応性を向上させ、結果的に１±１に
おいて過酸を生成させる。これらの酵素はアニオン性界
面活性剤が存在しても基質トリグリセリドに対して秀れ
た退却水分解特性および良好な反応性を示す、したがっ
て、本発明の酵素的過加水分解系はアニオン性界面活性
剤を利用している市販の界面活性剤と併用することが可
能である。

本発明の斬新な酵素は基準酵素に関連して修飾されてい
る。基準酵素はＰｓａｕｄｏｎｏｎａｓ　　ｕ口ｄａへ
Ｉｃｅ　５３５５２からｆｉｔ　Ａｔ可能で、次表のア
ミノ酸配列をもつ。

ａｌｓ　　　ｐｒｏ　　　　Ｉｓｕ　　　　　ｐｒｏ　
　　ａｓｐ　　　Ｉｈｒ　　　　　Ｄｅａ　　　（１１
ｙ　　　ｓｌａ　　　−ｐｒｏ　　　ｐｈａ　　　ｐｒ
。

ｉｌａ　　　ｖａｌ　　　ｉｌａ　　　　　ａｉｎ　　
　ｐｈｅ　　　ａａａ　　　　　ｓｒｏ　　ｓａｒ　　
　ｇｌｙ　　　　　ｐｒｏ　　　Ｉｙｒ　　　竜ｈ「ａ
ｙ　　ｐｔＯｓｉｒ　　　ｌｈｒ　　Ｉｙｒ　　ａｌａ
　　　ｇｌｙ　　Ｉｅｕ　　ｔａｕ　　　ｓａｒ　　１
ｔｌｓ　　１ｒｐａｌａ　　　ａａｒ　　　ｌ１ｌｓ　
　　　　ｌｙ　　　ｏｂａ　　　ｖａｌ　　　　　ｖａ
ｌ　　　ａｌｉ　　　ｉｌａ　　　　　ｉｌｉ　　　０
１１１　　１ｈｒ妬 ｓｌｙ　　　ｌｈｒ　　　ｓｉｒ　　　　ｇｌｙ　　　
ｈｌｓ　　　ｓｅｒ　　　　ｇｌｎ　　　ｇｌｙ　　　
ｇｌｙ　　　　ｇｌｙ　　　ｇｌｙ　　　ｔａｒＩＩｓ
　　　ｍ＠電　　−１ａ　　　　ｇｌｙ　　　ｇｌｎ　
　　ａｓｐ　　　　Ｉｈｒ　　　ａｒｇ　　　ｖａｌ　
　　　　ａｒｇ　　ｌｈｒ　　　ｌｈ「ｐｒｏ　　　Ｉ
ｙｒ　　　　Ｉｅｕ　　　　　ｓｉｎ　　　ａｌａ　　
　ｏｌｎ　　　　　ｐｒｏ　　　ｖａｌ　　　　ｌｙｒ
　　　　　ａｒＩＩ　　ａｒｅ　　　１ｓｕｎｖａｔｐ
ｒｏｖａｔｐｌｔ＠ｌｒｌｌＩＩＶｇｌｕａＱａｒｌｌ
ｌｙｒｖａ１１６ ｓ＠ｒ　　ｈｌｓ　　ｐｉｎ　　　ａｌｕ　　ｐｒｏ　
　ｖａｌ　　　ａｌｙ　　ｓｉｒ　　ｇｌｙ　　　ｇｌ
ｙ　　ｉｌａ　　１ｙｒａｌｓ　　ｇｌｎ　　ｃｙｓ　
　　ｓａｒ　　ｌｏｕ　　ｃｙｓ　　　ｌｈｒ　　ｈｅ
ｒ　　ｔａｕ　　　ｌａｕ　　ｌｒ＋＋ｓａｒ　　ｖｉ
ｌ　　ａｌｙ　　　ａｒｌｌａｒｅ　　ａｌｖ　　　Ｉ
ｅｕ本発明の修＾１酵累は次のいずれかにある、少くと
も　１個のアミノ酸が基準酵素と異なっている：１１）
　　１２６番目のセリン、１７６番目のアスパラギン酸
または２０６番［１のヒスチジンから約１５オングスト
ローム以内（基準酵素の３次ｆ！Ｉｌ遣に関連して）；
または（２）　１２６番目のセリン、１７６番目のアス
パラギン酸または２０６番目のヒスチジンのいずれかの
側のアミノ酸６個以内（基準酵素の１次構造に関連して
）、活性化酸化剤系の基質を過酸化水素源の存在下にお
いて過酸を生成させる、酵素が触媒する反応のために選
択する。各種のトリグリセリドは基質を形成するために
特に適している。特に望ましい基質はｌ・リオクタノイ
ンオ３よびトリデカツインである。

本発明の酸化別系には基質と混合し、酵素により活性化
されると【Ｌｌ＜　ｉｎ　５ｉｔｕ　）において有機性
過酸を生成する過酸化水素源が含まれる。米国における
洗濯条件では、このように生成きれる、特に望ましい有
機性過酸はベルオクタン酸である。

本発明の酵素的過加水分解系には、比較的安価な基質を
少量の酵素と共に用いて過酸を生成させるなど数多くの
利点がある。望ましいトリグリセリド基質では等濃度の
単純なエステル基質に比較し高濃度の過酸が得られる６
本発明の酵素的過加水分解系は低温の洗浄溶液において
過酸を生成するのに非常に有効であることが見出されて
いる。

（課題を解決するだめの手段） 本発明の酵素曲送加水分解（ｐｅｒｈｙｄｒｏｔｙｓｉ
ｓ）系は本質的に、上記に明確にした斬新な酵素、基質
および過酸化水素源からなる。したがって、本発明は過
酸または退却水分解の化学を基盤としている。

新規な酵素、基質および過酸化水素源を含む酵素的過加
水分解系の本質的な成分の他に、本発明の退却水分解系
には水：Ｆｊ液液中ある場合、基質を！！＃ｉ濁状態に
維持したり、基質を溶解するために、また過酸化水素源
からの過酸化水素の存在下での基質と酵素の相互作用を
促進するために選択する１種以上の乳化剤も含まれるこ
とが望ましい、この種の１種以上の乳化剤を使用するこ
とは、乳化剤が酵素とグリセリド基質の相互作用を向上
させることのできる液相界面の形成を促進する作用をも
つように特に考慮される。退却水分解系には下記により
詳細に述べる緩衝剤、安定化剤および池の添加剤も含め
ることが望ましい。

（発明が解決しようとする課題）および（実施例）およ
び特許請求の範囲を含む本発明を確実に正しく理解し、
解釈するために、本明細書で使用する術語の使用法を明
確にするために下記に、定義を述べる。定義する術蒲に
は次のものが含まれる。

「退却水分解（ｐｅｒｂｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）　Ｊは選
択した基質と過酸化物の反応により過酸と水が生成する
ことと定義する。

過酸を生成、する望ましい通油水分解反応では、過酸化
物出発材料と過酸生成物は共に酸化剤である。従来、無
機性過酸化物は例えばドライクリーニング漂白剤の酸化
剤として使用されている。過酸生成物はその酸化作用に
よりクリーニング漂白にとって有効な汚れ除去剤となる
が、酸化剤としての過酸生成物はクリーニング漂白製品
に使用されている染料その他の添加剤とほとんど反応し
ないほど十分緩和であるので、本発明によれば過酸生成
物は通常、クリーニング漂白に望ましい酸化剤である。

しかし、酵素的過加水分解系を化学的過加水分解系と併
用することは本発明の範囲内である。

［化学曲送加水分解」には−爪に、活性化剤または過酸
前駆体が過酸化水素源と化合する通船水分解反応が大ま
れる。化学曲送加水分解の過酸前駆体の１種は本出願と
同一出願人による“旧ＰＥＲＯＸＹＡＣＩＤ　ＰｎＥＣ
ｔｌＲ３ＯｎＳ　ＡＮＤ　Ｈ［Ｔｌｌ０Ｄ”　と題する
１９８８年４月　５日に与えられた米国特許第４，７３
５，７４０号に開示されている。この明ｌ５ｉｌＩ書で
は水溶性で、過酸化物源と共に水に溶解する際、艮＆屓
（”　””における化学曲送加水分解によりペルオキシ
酸を生成するジカルボン酸のスルポン化フェニルニスデ
ルが述べられている。

「酵素的加水分解」は一般に加水分解酵素と分類され、
下記に具体的に列記される酵素により促進、すなわち触
媒される通船水分解反応と定義する。

酵素的過加水分解系の３つの本質的な成分の特徴および
望ましい実例をまず、下記で考察し、ついで通船水分解
系と共に使用する他の添加剤を簡潔に考察し、さらに本
発明の酵素的過加水分解系を示す多くの実例を述べる。

五ｌ 上記のように、酵素的過加水分解系の基質は過酸化物源
の存在下で過酸を生成するために、酵素により触媒され
、る反応のために選択される。下記にさらに詳細に考察
するように、ある種の基質は通常、固体であるので、基
質、酵素および過酸化物源を含む乾燥処方剤に使用する
のに特に適している。このような製品では乾燥処方剤の
有効期限が長く、処方剤を水溶港に添加するまでは酵素
により触媒される反応が起きないことが重要である。

例えば、クリーニング用界面活性剤に使用する場合には
基質が界面活性特性を示すことがあり、そのため、洗浄
する織物の表面または表面付近で過酸の現場生成が起き
る。このことは漂白作用の原因となる酸化剤の有効性が
高まることを保証される。

酵素的過加水分解系の基質は本発明の新規な酵素はエス
テラーゼ活性をもっているので各種のエステル（ｎｃＯ
ＯＩＩ’）から選択することができ、また本発明の新規
な酵素はリパーゼ活性をもっているので脂質から選択す
ることらでき、また、これら双方から選択することがで
きる（例えば脂肪酸エステル脂質）０本発明によれば、
各種の脂肪酸またはグリセリド型材料が本発明の酵素的
過加水分解系の基質を形成するのに特に適していること
が見出されている。

本発明の基質は次の構造をもつ官能基の付加したエステ
ルであることが望ましい。

Ｒ−Ｃ−０−Ｃ）ｌ　２Ｘ ここで、Ｒは少くとも　１個の炭素原子をもつ置換基で
あり、またＲはフェノール基、ハロゲン基またはハロゲ
ン原子のような１種以上の官能基またはへテロ原子で随
意に置換されている直僅または分子アルキルであること
がさらに望ましく、よたＸは官能基である。基質は上記
に明らかにしたように酵素的加水分解が可能であり、通
常、実質的な化学曲送加水分解は受けないことが望まし
い。

上記官能基は官能基の付加したポリオールまたはポリエ
ーテルからなることがさらに望ましい、さらに広くいえ
ば、官ｆ指基は少くとも　１個の炭素原子および少くと
も　１個の官能基である。

本発明の基質は本質的に次の基質群から選択することが
なお一層望ましい。

（ｉ）次の＃１３１１を６つグリセリドＨＣ−ＱＣ−Ｒ
，１ ＨＣ−ＱＣ−Ｒ２ ＨＣ−ＱＣ−Ｒ３ ここで、Ｒ＝Ｃ−Ｃ、Ｒ＝Ｃ−Ｃ１２ま１　　　１　　
　１２　　　２　　　　または＋（およびｒｔ　　＝ｃ
　　−Ｃ１□またはＨ；（ｉｉ）次の構造をもつエチレ
ングリコール誘導体すなわちエトキシル化エステル Ｒ−Ｃ−０（ｃ）（ｃＨ２０）　　　、ＨＩ３ （ここで、ｎ＝１−１０でＲは上記の通り定義する）、
および （ｉｉｉ）次の構造をもつプロピレングリコール誘導体 Ｒ−Ｃ−０（ｃＨ２（ｊｌＯ）　　　ｎ　Ｉｌ（ここで
、Ｒ１および［ｌは上記の通り定義する。）上記に言及
した望ましい１１４ｍでＲ１はＣ６Ｃ１ｏであることが
さらに望ましく、Ｃ７Ｃ９であることが最も望ましく、
またＲ２はＣ、ｓ　　Ｃ１゜または１１であることがさ
らに望ましく、Ｃ７Ｃ９またはＨであることが最も望ま
しく、よたＲ３はＣｃ、　　Ｃ１ｏまたは）Ｉであるこ
とがさらに望ましく、ｃ　　−Ｃ９または）［であるこ
とが最も望ましい、上記のｔＭ３ｍｍにおいてＲ１、Ｒ
２およびＲ３は鎖長が異なることが可能であり、このよ
うな異なるグリセリドの混合物が本発明に適してている
。

グリセリドは酸または塩基と共に沸騰させる場合または
リパーゼの作用により加水分解を受ける。

グリセリド（すなわち、アシルグリセロール）、特にジ
グリセリド（ジアシルグリセロール）およびトリグリセ
リド（トリアジルグリセロール）は本発明の酵素的過加
水分解系で特に望ましい、これは各トリグリセリド分子
は最高３種の脂肪酸いいかえると過酸分子を当量ずつ生
じさせることができるからである。したがって、下記に
さらに詳細に考察するように、過酸化物源および酵素の
存在下で最大の酸化力を得るのに、上記のようなグリセ
リドを使用することが特に有効であろう。

概して、グリセリドＩＪＭ質は約１個から約１８個の炭
素原子を含む脂肪酸をらつことを特徴とする。

酢酸のような製品に由来する低分子量のグリセリドは天
然には液体である。したがって、洗剤のようなドライ処
方にこのような基質を含めるためには追加的工程Ｖ１．
階が必要であろう、しかし、低分子量グリセリド製品は
高温の洗浄用途においてより有効である傾向らもつ。

鎖長が炭素原子数１７個であることを特徴とするステア
リン酸のような高分子量グリセリド基質は通；Ｗ、固体
であり、したがって、例えばドライ洗剤処方にえぬるの
は容易であろう、しかし、このような高分子量脂肪酸銀
は本発明によれば酸化力が最大にならない場合がある０
本発明の酵素的過加水分解系に使用する最も望ましい基
質は炭素数がそれぞれ８個および１０の（カルボニル炭
素を含む）脂肪酸銀をもつことを特徴とするトリオクタ
ノインまたはトリデカツインのいずれかであることが見
出されている。

これら２種のトリグリセリドら固体である傾向があり、
したがって、上記に考察したドライ処方に含めるのに適
している。同時に、ｌ・リオクタノインおよびトリデカ
ツインは水溶液で界面活性剤的特性を示す傾向があり、
したがって、上記に考察したように【嵐贋（ｉｎ　５ｉ
ｔｕ　）におけろ過酸の処方に適している。ＰＬも望ま
しいｌ・リオクタイノンおよびトリデカツインのような
トリグリセリドを含む、上記に考察した基質のずべては
比較的安価であり、本発明の酵素的過加水分解系の初期
コストを低下させるのに重要である。下記でも考察する
ように、水溶液で考慮される艮痘贋ｕｎ　５ｔｔｕ）に
おけろ過酸の生成を行うのに必要な酵素呈は化学１に論
的な量より少なく、非常に少量でよいという点で、基質
および過酸化水素源は酵素的過加水分解系の２つの主要
な成分である。このように酵素は反応に関与しても、消
費されずに次の反応のために再生ずるという点で触媒様
式で作用する。

羨改上１１ はとんどすべての過酸化物源が本発明の酵素的過加水分
解系の酸化剤源として十分である０例えば、過酸化物源
は過ホウ素酸ナトリウムや過炭酸ナトリウムのような過
ホウ素酸塩や過炭酸塩から構成することができる。さら
に過酸化物源は尿素過酸化水素などから構成され、これ
らの付加物を含む場合がある。

望ましい過酸化物源として過ホウ素酸ナトリウムー水和
物、過ホウ素酸ナトリウム四永和物、炭酸ナトリウムペ
ルオキシ水和物、ビロリン酸ナトリウムペルオキシ水和
物、尿素ペルオキシ水和物、過酸化ナトリウムおよびこ
れらの混合物がある。

過ポウ素酸すｌ・リウムー水和物および過；１；つ素酸
ナトリウム四永和物は特にアルカリ性の過酸化物源とし
て特に望ましい、過酸化物源（すなわち、水溶液中で過
酸化水素を生成する化合物）はそれ自体、過酸化物性漂
白物質である。しかし、酵素的過加水分解系では漂白性
が改善される。したがって、酸化剤源を過酸化水素を生
成するために上記の考察にしたがって選択することを除
けば特定の酸化剤源についてさらに考察することは必要
ないと考えられる。

Ｌ 本発明の修飾酵素は過酸化物および望ましい過酸が存在
するため、酵素的過加水分解系を使用する間、酵素にと
って有害な酸化的環境にある。過酸化物または過酸のい
ずれかが使用中のｌ１８１素を不活性化することがあろ
う、したがって、本発明に適する酵素は予測される範囲
の過酸化水素および望ましい範囲の過酸の存在下で十分
に通油水分解活性を示さなければならない。

本発明の修１￥１Ｉｌｌ酵素は基準酵素に関連して修飾
されている。この基準酵素は１９８６年１１月１９日に
出願された米国特許出願第９３２．７１７号に述べられ
ている。基準酵素（時に「リパーゼ１」と呼ぶ）はンユ
ー′モ　スピユー−（以下、Ｐｓｅｕｄｏｌｌｏｎａｓ
ｐｌｉｄａ又はＰ、　ｐｕｔ　ｉｄａともかく）株から
分泌され、ｌｉｔ　Ｒｇできる。　Ｐｓｅｕｄｏｒ＆ｏ
ｎａｓは％ｆ１ｗ１棒の形をした相閑属である。Ｌ赳貝
」を含むいくつかの細菌株は炭素源をモノオレイン酸ポ
リオキシエヂレン（”ｒｉｙｃｅｎ　８０”、八日ａ　
Ｃｔ＋ａｌｉｃａ１社販売）とする最少培地でわずかに
増殖する。　ｌｌｏｗｅ等によるＪ、　Ｃａｎ。

Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　９２（１）、　１）ｆｌ、　
２３４−２３５（１９７６）を参照。

リパーゼ　１酵素を単離する新規なＰ５３旦史」旦■リ
ー匹ｕｂ株の培養試料はＨＰＥＰ　ＧＯ８，１（Ｐ）に
したがい、＾ｎｅｒｉｃａｎ　１ｙＤｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１Ｐａｒｋｌａ
ｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ　２０８５２の永久培養コレクションに保管さ
れており、ＡＴＣＣ５３５５２と呼ばれている。

基準酵素を時に「リパーゼ１１と呼ぶが、修飾酵素およ
び基準酵素はリパーゼあるいはクチナーゼと考えること
ができることを理解する必要がある。これは基準酵素の
アミノ酸配列の分析により、本酵素のヌクレオチド配列
と、最近、Ｃ，ｃａｐｓｉｃｉについて決定されたクチ
ナーゼ道伝子のヌクレオチド配列との間にはかなりの相
同性があることフ）（示唆されているからである。した
がって、本発明のＩＩＥ１１１酵素および基準酵素を以
後、グリセロールニスデル加水分解酵素、あるいは単に
加水分解活性をもつ酵素と呼ぶことがある。

本発明の修飾酵素は上記に述べたＰｓｅｕｄｏｎｏｎａ
ｓ胆ｔｉｄａ株の天然株あるいは人為的な変異株から得
ることができる。さらに、本発明の菌株を他の細胞の対
応する３ｆｉ伝予に形質転換するような、リパーゼ生成
に適用できる遺伝子工学的手法も適用できる。これらの
手法により生成させ、単離した、加水分解活性をもつ修
飾酵素を本発明に含める。

したがって、例えば基準酵素または修飾酵素を望ましい
酵素の遺伝子を含むＥ、Ｃｏ１１をｉｆｉ常の培地で培
養して生成させ、酵素を単離・生成することができる。

？１ｉ体培養あるいは固体培養を適用することができる
。水中曝気培養は工業的生産に適している６通常の背通
培地を使用することができる。

培養温度は細菌の好適増殖速度により変化させることが
できるが、２５−３５℃であることが望ましい、培養時
間は便宜選択できるが、１５−５０時間である。培養は
加水分解活性をもつ酵素の培地中濃度が最大になった時
に終了させる。

好適な酵素は発酵ブイヨン中に蓄積し、ブイヨンからの
精製酵素の抽出は次のように行うことができる： 細胞および細胞片をまずマイクロフィルターによる口過
および遠心により４０１胞ブイヨン培養試料全体から除
去し、ついで限外ろ過によりリパーゼを濃縮する３次に
過′ｇＩの塩および着色物質は透析またはダイアフィル
トレージョンにより除去する。

さらに、粗酵素７Ｂ液をタンパク質の通常の精製法によ
り精製することができる。凍結乾燥により酵素粉末を得
ることができ、これを本発明の成分に１１、ｌ！用する
ことができる。

リパーゼ１．すなわち、！！準酵素は次の表に示すアミ
ノ酸配列をもつ。

ｌ。

ａｌａ　　ｖａｔ　　ａｌａ　　　Ｒａｎ　　ｐｈａ　
　ａｓｌｌ　　　ａｒＱ　　Ｓｉｒ　　ＱＩＶ　　　ｐ
ｒｏ　　ｌｖｒ　　ｌ１ｌｒ１１１ｒ　　Ｓａｆ　　ｔ
ａｒ　　　Ｑｌｌｌ　　５ｌｌｒ　　ｇｌｕ　　　ＩＩ
ＩＶ　　ｐｒｏ　　Ｓｅｔ　　　ＣＶＳ　　ａｒＱ　　
ｌｌｅＩＩＩＶ　　　ｐｒｏ　　　ａｉｒ　　　　　ｔ
ｈｒ　　　ｔｙｒ　　　ａｌａ　　　　　ａｌｙ　　　
ｌｅｕ　　　　ｌａｕａｌｉ　　ｓａｒ　　ｈｉｓ　　
　ｏｌｙ　　ｐｈｉ　　ｖａｌ　　　　ｖａｔ　　ａｌ
ｉ　　ａｌａＧ ５１ｒ　　ａａｎ　　ａｌａ　　　ｇｌｙ　　Ｉｈｒ　
　ｇｌｙ　　　ａｎｇ　　ｇｌｕ　　ａｓＩｌ８０ Ｓｉｒ　　ｈｌｌ　　１ｒｐ ａｌａ　　ｇｌｕ　　ｌｔ＋ｒ ａｕ　　　ａａ　　　ｃｙｓ ＪＩＪ ｇｌｙ　　　Ｉｈｒ　　　ｉｅｒ　　　　　ｏｌｙ　　
　ｈｉｓ　　　ｓａｒ　　　　ｇｉｎ　　　ｑｌｙ　　
　ｏｌＶ　　　　　ｇｌｖ　　　ＱＩＶ　　　５ａｒ１
４（ｌ Ｉｓ　　）ａｌ　　ａｌａ　　　　Ｑｌｙ　　Ｑｌｎ　
　ａｇｏ　　　　ｌｈｒ　　ａｒｇ　　ｖａｌ　　　　
ａｒｇ　　Ｉｈｒ　　ｌｌ＋ｒａｌａ　　　ｐｒｏ　　
　Ｉｔｓ　　　　　ｏｌｎ　　　ｐｒｏ　　　ｌｖｒ　
　　　　ｌｈｒ　　　ｌａｕ　　　ｇｌＶ　　　　ｌＱ
ｕ　　　ｇｌＶ　　　ｈｌｓＩソ０ ＋１ｒｏ　　　ｌｖｒ　　　ｔｅｌｌ　　　　ａｓＩｌ
　　ａａ　　Ｑｌｌ　　　　ｐｒｏ　　Ｖａ　　　＋Ｙ
ｒ’　　　　ａｒｔｌ　　ａｒＱ　　ａｌａａｓｎ　　
ｖａｌ　　　ｐｒｏ　　　ｖａｌ　　ｐｈａ、　　ｌｒ
ｐ　　　ｇｌｙ　　ｇｌｕ　　ａｒｇ　　　ａｒｇ　　
ｌｖｒ　　ｖａｓａｒ　　　ｈｌｉ　　　ｐｈａ　　　
　　ｇｌｕ　　　ａｒｏ　　　ｖａｌ　　　　　ｇｌｙ
　　　ｓａｒ　　　０１ソ　　　　ＱＩＶ　　　ａｌａ
　　　＋ｙｒｓｌａ　　ｇｉｎ　　ＣＹａ　　　ｓａｒ
　　ｌｅｕ　　ｃｙｓ　　　Ｉｈｒ　　ｓａｒ　　ｌｅ
ｕ　　　ｌｓｕ　　ＩｒｐＳａｔ　　ｖａｌ　　　ａｎ
ｙ　　　　ａｒｇ　　　ａｒａ　　　ＱＶ　　　　ａｌ
ｌＰＳＯＵｄｏｌｏｎａＳ　　ｕｔｉｄａの突然変異株
または変異株は後に示すように環境選択圧力法、ｔ＋Ｖ
照射、あるいは変異原性物質の使用により得ることがで
きる。

また、遺伝子１−学的手法、例えばプラスミドＤＮＡを
複製能力のある宿主に１云達するか、またはリパーゼ生
成細菌１ｔＩＩＩ胞からリパーゼの染色体遺伝子：ｒ　
−１＜を切除し、この遺伝子を適当なベクタ分子にクロ
ーニングさせる方法によっても生成させることができる
１本発明の修１１１酵累は本酵累を生成する作用を保持
し、変動し、または向４−シている突然変異株、変異株
またはり１１−ン化株により得られる。

第１１２１はｐＳＮＥ４の４．３ｋｌ＋　　Ｅｃｏｔｔ
ｌ　フラグメントのマツプである。斜線部はシクナルベ
ブチドコドン（コドン−２２から啼１）を示し、斑点領
域は成熟リパーゼ１ボリベブヂドの：ｔトン＋１から４
２５８に文・１する：１−ド領域を示す、仮定されてい
るジスルフィド結合も示した。目盛は塩基対（ｂｐ）で
表しである。配列が決定されている領域（１３６３ｂｐ
の江旦フラグメンｌ〜）を二重矢印をつけて示しである
。

Ａ１６開始：ｔトンおよびＴＡＡ停止コドンにも印をつ
けである。

基準酵素の生成を行う適当な手段はクローニング法であ
り、実施例９の方法にしたかえは驚くほどの高収量が得
られているので、実施例９で示すリパーゼ１のクローニ
ングおよび表現を以下において述べる。

リパーゼ１は秀れた加水分解活性をらち、環境が酵素に
とって有害で酸化性であっても過酸化物源の存在下で基
質から過酸を生成する。リパーゼ１は通常は酵素の活性
を阻害するアニオン性界面活性剤の存在下でら過酸を生
成する。さらにリパーゼ１ではリパーゼＣＥＳのような
市販の酵素に比較し、過酸／酸の比率（すなわち、すで
に考察している酸／過酸の比率の逆数）が高い、リバー
ゼ１はＬ匹貝知の発酵作用から粗製標品として得られ、
使用することもできるが、イオン交換やゲル透過クロマ
トグラフィのような従来の手段により他のタンパク質と
分離・ｆ？ｌｔ製し、酵素的に実質的に純粋なリパーゼ
１を得ることが望ましい、これは主に、［の粗製発酵ブ
イヨンにリパーゼ１の曲に別の酵素（以下、「リパーゼ
２Ｊと呼ぶ）が大まれているからである。

２種の酵素、リパーゼ１とリパーゼ２はクロマトグラフ
ィのような従来技術により分離することができる。これ
らの酵素はｐ−二ｌ〜ロフェニル酪酸塩およびｐ−二ｌ
−ｓコフェニル力ブリル酸に対する加水分解速度が異な
ることにより識別することができる。リパーゼ１は後に
、さらに特定的に述べるようにＥ、Ｃｏ１１のような宿
主細菌によりクローン化し、本酵素を表現（ｅｘｐｒｅ
ｓｓ）させ、ついでクロン化リパーゼ１のオクチルセフ
ァロースクロマトグラフィによっても精製することがで
きる。

リパーゼ２もグリセリド基質を加水分解するので消化補
助手段として脂質や脂肪加工のような用途に使用するこ
とができる。

本発明にとって望ましい修飾酵素は基準酵素に比較し、
過酸生成の効率が匹敞するか、改善されている。酸／過
酸の比率（ミリ当量／ミリ当Ｊｉ）は過酸を生成する酵
素の効率の指標である。比率が低いほど、通常は過酸の
生成凰がより望ましく多いことを意味する。比率が１に
等しい酵素では約１４分以内に基質から過酸への変換が
最大（約５０％）となる、実施例でさらに１−分に示す
ように、リパーゼ１で実験的に検査すると酸／過酸の比
率は約４−５である８本発明によれば酸／過酸の比率が
約１から約４−５の望ましい修飾酵素が調製されている
。特に望ましい修飾酵素で検査すると酸／過酸の比率は
１−３である。

このような特に望ましい修飾酵素では１個または２個の
アミノ酸が酵素リパーゼ１と異なる。ある特に望ましい
実施例では１２７番目が（グルタミンではなく）セリン
、また２０５番目が（スレオニンではなく）アスパラギ
ンである。この特に望ましい実施例（“Ｓｅｒ　−１２
？／八Ｓ　ｒｌ　−２０５”　ということしある）で良
好な酸／過酸の比率が維持されるｈ　／Ｊ’１の特に望
ましい修飾酵素では２０５番目がアスパラギン、２０７
番目がスレオニンである。この修飾酵素では特異的活性
および酸／過酸の比率が良好である。さらに別の特に望
ましい酵素では２０５番目がアスパラギンである。この
修飾酵素では酵素４度が低い場合、酸／過酸の比率が良
好である。さらに別の特に望ましい修飾酵素では２０５
番目がグルタミンである。この修飾酵素では酵素濃度が
より低いか等しくてらリパーゼ１型酵累と過酸の成板が
実質的に等しい、酸／過酸の比率が秀れているさらに別
の特に望ましい修飾酵素は次の通りである：　５ｅｒ−
１２７／Ｔｈｒ−２０５，Ｔｈｒ−１２７／Ｇ１ｎ−２
０５，Ａｓｎ−１２７／Ｔｈｒ−２０７、１ｈｒ−１２
７／Ａｓｎ−２０５，および八ｒｇ−１２７／＾１ａ−
２０７。

後で分るように、これらのアミノ酸修飾はすべて通常の
１２０番目のセリン、１７６番目のアスパラギン酸また
は２０６番目のヒスチジンから基準酵素の３次格造に関
連して約１５オングストローム以内である。１５オング
ストロ一ム以内の位置の修飾部位を決定するのにその結
晶構造を利用できない場合に、基準酵素のアミノ酸を変
更できる位置を記述する別の方法は基準酵素の１次横遣
に関連して１２６番目のセリン、　１７６番目のアスパ
ラギン酸または２０６番目のヒスチジンのいずれかの側
のアミノ酸６個以内に少くとも　１個のアミノ酸の変更
がみとめられるとする方法である。

本発明の基準酵素および修飾酵素のこれら３つのアミノ
酸の位ｉｔ　（１２６，１７（ｉおよび２０６番目）は
アミドおよびニスデルの加水分解に直接関与していると
考えられるので、時に「触媒性３残基」ということらあ
る、実際には、この触媒性３残基はｒ触媒性４残基」と
いえよう、これは結晶栖逍のｈｖ析により　２１４番目
のセリンが１０２番目のアスパラギン酸から水素結合で
きる１７１２　離内にあることが示されているからであ
る。その結果、本発明の修飾酵素は２１４番目のいずれ
かの側の「修ａＩ領域」以内で基準酵素とさらに異なっ
ていると考えられる。

後に分るように、基準酵素、すなわちリバーゼ１に実質
的に対応する加水分解活性とアミノ酸配列をもつ修飾酵
素をリパーゼ１について記述した方法と類似した方法で
得て、使用することができる。したがって、基準酵素の
調製、精製、およびその性質を示す実験データをまず述
べ、ついで本発明による修飾酵素の調製を説明する。

瓦上月 乳化剤または界面活性剤を使用することは他の過酸系漂
白製品と同様に一般的に望ましい、乳化剤を使用するこ
とは酵素とグリセリド基質の相互作用を促進する相の界
面を確立し、維持するのに特に有用であると考えられる
。同様に乳化剤または界面活性剤は水相内部に酵素と基
質を維持するのに有用である。

アニオン性界面活性剤（一般に市販の洗剤にも含まれて
いる）を使用することができる。このようなアニオン性
界面活性剤の実例にはＣ６−Ｃ１８の脂肪酸および樹脂
酸、直鎖および分校アルキルベンゼンスルポン酸、アル
キル硫酸、アルキルエーテル硫酸、アルカンスルン１；
ン酸、オレフィンスルホン酸、ヒドロキシアルカンスル
ホン酸、アシルサルコシンおよびアシルトメチルタウリ
ンのアンモニウム、ＩＩ換アンモニウム（例えばモノ、
ジおよびトリエタノールアミン）、アルカリ金属および
アルカリ土類金属塩である。

非イオン性界面活性剤も本発明の酵素的過加水分解系に
便用するのに適している。非イオン性界面活性りりとし
ては商標名ＮＥＯＤＯＬで５ｈｅｌｌ　ＣｈｅＩｉｃａ
１社が販売しているような直鎖エトキシル化アルコール
がある。他の非イオン性界面活性剤として平均鎖長が炭
素原子数で約６個から１６（Ｉｔで、アル：２−ル１モ
ル当たりのエチレンオキシド金地が平均的２から２０モ
ルの各種ｖＬ鎖エトキシル化アル；１−ル；平均鎖長が
炭素原子数で約０個から１６個で、アルコール１モル当
たりのエチレンオキシド含敗が平均０から１０　　モル
、プロピレンオキシト含歎が平均的１から１０モルの直
鎖および分枝、１次および２次エトキシル化、グロボキ
シル化アル：１−ル；平均鎖艮が炭素原子数で８から１
６個で、アルコール１モル当たりのエチレンオキシド含
Ｉが平均１．５から３０モルの直鎖および分枝アルキル
フェノキシ（ポリエトキシ）アルコール、別名エトキシ
ル化アルキルフェノール：およびこれらの混合１勿があ
る。

さらに、非イオン性界面活性剤としてプロピレンオキシ
ドおよびエチレンオキシドのある種のブロックコポリマ
ー、グロボＡシル化工ヂレンジアミン基をもつプロピレ
ンオキシドおよびエチレンオキシドのブロックコポリマ
ーおよびアミンオキシド、ホスフィンオキシト、スルホ
キシドおよびこれらのエトキシル化誘導体のような半極
性非イオン性界面活性剤がある。

本発明に適切なカチオン性界面活性剤には、通常、窒素
原子に結合する官能基の１つがＣＢ−Ｃ１８のアルキル
基で、他の３つの官能基がフェノール基のような不活性
の置換基をもつ短鎖アルキル基である第４級アンモニウ
ム化合物がある。

さらに、本発明に適切な両性イオン性界面活性剤（アニ
オン性水可忍性官能基、カチオン性官能基および疎水性
有機性官能基を含む）として、アミノカルボン酸および
塩、アミノジカルボン酸および塩、アルキルベタイン、
アルキルアミノプロピルベタイン、スルホベタイン、ア
ルキルイミダゾリウム誘導体、ある種の第４級アンモニ
ウム化合物およびある種の第３級スルホニウム化合ｌｔ
！ｌ］がある。潜在的に本発明に、ｌ！１切な両性イオ
ン性界面活性刑の他の実例が本明細書に文献として収り
上げであるＪｏｎｃｓの米国特許第１１，００５，０２
９号にみとめられる。

曲の乳化剤の例にポリビニルアルコール（ＰＶ＾）、ポ
リビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルヒドロキシグロ
ビルセルロース（ＨＩＩＰＣ）のような水可溶性または
分散性ポリマーなと、ならびに胆汁その他の天然の乳化
剤がある。

肛些企見Ｉ 考慮する特定の用途に応じて各種の補足的添加パリを本
発明の酵素的過加水分解系とａト用することが考えられ
る０例えば、本発明の酵素的過加水分解系は直接漂白製
品、前洗浄製品（液体であることが多い）および堅い表
面に対する各種洗剤のような広汎な種類の洗剤応用製品
または処方に使用したり加えられることが考えられる。

液体処方の場合には、過酸化物源を基質、酵素のいずれ
かと、できれば双方と分離しておくことが便利であろう
、これは１９８６年４月２９日にＢｅａｃｂａｌらに与
えられ、Ｃｌｏｒｏｘ社を同一出願人とする米国特許第
４，５８５．１５０号に開示されているような複数ヂャ
ンバー式デイスペンサーを用いて行うことができよう。

本発明に適切な添加剤には香料、染料、ビルダ、安定化
剤、ｇ街剤などがある。安定化剤は多くの目的を達成す
るために加えられる０例えば、安定化剤は最初の処方成
分としての酵素あるいは処方を水溶液に加えた後にみと
められる中間生成物でも、その有効性を確立し、維持す
るように作用する。酵素は重金属、有礪化合物などのた
めに基質の加水分解を阻害されることがあるので、例え
ば先行技術で一般に知られている適切な安定化剤を用い
て、そのような影響に拮抗させ、処方中の酵素の有効性
を最大にすることができよう。

酵素的過加水分解系を溶解する水溶液の望ましい１１１
１は約８−１１であり、約９−１０であることがさらに
望ましい、水溶液のｐＨを望ましいアルカリ領域に維持
するため、本発明で緩衝剤を使用することができる。緩
衝剤には一般に洗剤技術の当業者によく知られているよ
うなすべての材料が含まれる。

持に、本発明に使用するのに考慮されるＭＷＩ剤には炭
酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、ホウ酸塩および水酸化物が
含まれるが、これらの緩衝剤に限定はされない。

次の実験法、＄４　′ｊｆ４および結果を本発明を示す
目的に関し述べる。しかし、本発明の範囲の池の視点、
利点、改良点は本発明が関係する技術の当業者には明ら
かであろう。

（実施例および発明の効果） 播種用培地は０．６％甘通ブイヨン（Ｄｉｒｃｏ）およ
び１ｘグルコ〜ス（ｐＨ（ｉ、５）で調製した。この培
地１００ｎｌを５００ｎｌのフェルンバッハフラスコ中
で滅菌した。フラス：１それぞれに背進寒天で増殖させ
、２５０ｒｐｎ、　３７°Ｃの条「トのＮｅｗｂｒｕｎ
ｓｗｉｃｋ振盪装置上に１２時時間−たＬ匹貝ムＡＴＣ
Ｃ５３５５２の一夜培養試ηを白金耳でＩａした。つい
で、１２時間インキュベートした培養試料を１リツトル
の発酵装置（使用容Ｈ，２５０１１）、　１５リツトル
のＢｉｏｌａｆｉｔｔｅ発酵装置（便用容Ｊ１１２リッ
トル）または温度調節装置、Ｉｔ　Ｐ　Ｈ、空気流およ
び圧力の調節装置を装備した１００リツトル（７）Ｂｉ
０１ａｆｉｔＬＯ発酵′Ａｔに所定°川Ｊｉ（１−１０
ＸＶ／Ｖ）播種した０発酵装置の培地には０．６％廿通
ブイヨン（Ｄｉｒｃｏ）、　０．３％リンゴクチン質お
よび０２χ酵１１＃ス（Ｄｉｆｃｏ）を加えた。最初の
ｐＨは６５であった。播種前に、培地のｐＨを６．８に
弱製し、４０分間滅菌した。　ＡＩ閑の増殖および酵素
の生成を発酵装置で１２−１５時間継続させた。

（Ｂ）ミクロフィルターろ過による　素の粗製の発酵培
養状？−１をまず２枚のＲＯ１ｉＣＯｎミリポアフィル
タ−膜ＣＧ、２２μ）をつけた＾ｒｇ　ｉ　ｃｏｎ装置
でろ過し、細胞を除去した。クチン粒子に結合した貯溜
物中の酵素を遠心により集めた。全回収率は９０％に近
かった。

（ｃ）全細胞ろ液の濃縮および透析 Ａｌｌ　１ｃｏｎ装置により回収したろ液を　２枚のＲ
ｏｎ　ｉｃ。

ｎ　Ｐｍ　ｉｏモジュールをっけたＡＩ′１ｉｃｏｎ限
外ろ過装置で３リツトルに濃縮した１次に濃ｗＩ物を０
．０１８リン酸バツフアー２０す・ソトル、　ｐｌ＋７
．５で透析し、塩および着色物を除去した。この段階に
おける回収率は平均して約８０％であった。この粗製調
製物の全活性は８．６８ｘ　　１０６であった。リパー
ゼ活性の単位は０．１ｗｔ％　’ｒｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００を含む０．１ＨＩｒ１ｓ−ＩＩｃＩバッファー、ｐ
ｌ＋８．Ｑ中で２．０ＩＨｐ−二トロフェニル醋酸と２
５℃でインキュベートする場合に４１５ｎｎにおける吸
光度が１分当たり　１．０増加する酵素量と定義する。

実施例１（ｃ）の￥Ｉｌ製調製紙製試料いて　３種のｐ
−二トロフェニル基質の結合および回転率を検討した。

反応条件は０．ＬＷｔＸ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を
含む０．１ＨＴｒｉｓでｐｌ＋　８．０．温度２５゛Ｃ
であった。基質はｐ−ニトロフェニルカプリル ル酸およびｐ−二）−１コフエニルバルミチン酸で、そ
のデータを表１に示した。

表」 ２＆Ｊ’ｒｍ　（ｕＨ）　　　　　’ｍａｘｎｏｌ／　
　／ｒｈ　　　ンバ ＰＭＰＣ　　　２１４　　　　　　　　　８０２ＰＮＰ
１　　　１６７　　　　　　　　　２１４ＰＮＰＰ　　
　ｉ８３　　　　　　　　　１１２実施例１（ｃ）調製
試料をさらに下記に述べる各種実験に用いた．これらの
実験では本発明の酵素的過加水分解系の利用が示されて
いる．しかし、実繕例１（ｃ）調製試料には「リパーゼ
１」および「リパーゼ２」と呼ばれる２種の酵素が含ま
れている。

リパーゼ１はより秀れたベルしドロラーゼであり、本発
明の特に望ましい実施例では酵素的に実質的に純粋なリ
パーゼ調製試料を用いている．実施例１（ｃ）の粗製開
裂試料の分離・精製は実施例３で述べ、リバ〜ゼ１とリ
パーゼ２の完全な分離は実施例４で述べ（酵素的に実質
的に純粋なリパーゼ１を得ることが望ましい）および極
めて純粋なリパーゼ調製試料（すなわち、アミノ酸配列
分析用として純粋）を実施例５に述べる。

リパーゼ１はＯ［＾［セファクリルクロマトグラフィお
よびセフ７デツクスＧ−１００によりＰｓｅｕｄｏｎｏ
ｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ発酵ブイヨンから最初、部分精製
した。

Ｄ［ＡＥカラムは１　０ｒｇ　Ｈリン酸ナトリウムバッ
ファーｐ１１８で平衡化し、￥ｆｉ製タンパク質を同一
バッファーを用いてカラムに充填した．カラムに結合し
ないＰＫＢ（１）−二トロフェニル酪酸）加水分解酵素
活性はリパーゼ１に関連していた．ＤＥＡＥ段階でこの
ようにして得られたリパーゼ１は１０ｎＨリン酸ナトリ
ウムバツフアー　Ｌｌｌ＋８を用いたセファデックスＧ
−１００でクロマトグラフィにか【Ｊられた．リパーゼ
１はこのカラムから明確なピークとして溶出され、ρＮ
Ｂ加水分Ｉ！ギ酵素活性ならびに退却水分解活性により
同定された。

リパーゼ１は疎水性樹脂によるり１コマトグラフイでリ
パーゼ２と完全に分＾ｔできる．１恨界ろ過およびタイ
アワイルター後の実施％ｆｌ（ｃ）の酵素溶液を　０．
５Ｈ　ＮａＣＩＧ，：ｉｌ整し、０．５Ｈ　ＨａＣ！を
含む１０ＩＩＨＴｒｉｓ（ｃＩ）　、ｐＨ１３で平衡化
したＱ．８ｘ７ｃｎオクチルセフア０ール力ラムに充填
し、洗浄して未結合タンパク質を除去した．次の洗ｉ？
ｌ’７１を用いた：　１０ｎＨＴｒ＋Ｓ（ｃＩ）、　０
１１８．　２Ｈ尿素；　１０ｍＭリン酸ナトリウム０１
１８　；　１０ｎＨ　ＩＪ　ン９塩、ｐＨ１８，　０．
５）Ｉ　ＮａＣｌ，洗浄後、カラムを５０Ｘ　ｎ−プロ
パツールになるまで直線的濃度勾配法で展開した．リパ
ーゼ活性の位置を決定するために、カラム画分について
ｐ−ニトロフェニル酪ｆｉ（ＰＮＢ）およびｐ−ニトロ
フェニルカプリル酸（ＰＮＣ）に対する活性を測定した
．２種のリパーゼが明らかに分離された．ずなわち、画
分３２のＰＮＢ／ＰＮＣノ比率！．ｔ　４．６”Ｃ”ｌ
ｙ　’）　、画分５１ノＰＮＢ／ＰＮＣ　ノ比串は１，
４０であった．これら２種のリパーゼをそれぞれリパー
ゼ１およびリパーゼ２と呼んでいる。

このカラムの画分をＳＯＳゲル電気泳動法によりさらに
分析した．この分析により、２種のリパーゼ活性は原核
細胞リパーゼに特徴的な分子量３０、０００のバンド（
ｂａｎｄ）に付随していた．さらに、リパーゼ２は二重
バンドで移動し、リパーゼ１のｆｉｔ−バンドと明らか
に分Ｐｌｉされた．アミノ酸配列分析の前に、これら２
種の部分精製酵素を逆相クロマｌ−グラフィにより高分
子量および低分子−鼠の混入物質と分離した。

アミノ酸配列分析の前に、実施例３の部分精製酵素を　
４，８ｘ１００ＩｎのＳｙｎＣｈｒｏｎＰａｋ　Ｃ４逆
相１１　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムを用いるクロマトグラフィに
よりさらに精製した．このカラム系は０．　０５％　＋
〜リエチルアミン（ＴＥ＾）および０．０５％トリフル
オロ内１’ｌｌ！（ＴＦＡ）　（７Ｂ媒八）を用い０．
５ｍｌ／分の速度で平衡化した．１００Ｊｉｕからｌ１
ｇのリパーゼ１をカラムに注入し、タンパク質を（８媒
へおよび０．０５ＸＴＥＡおよび０．０５″Ｘ■［八を
含む１１−プロパツール（溶媒Ｂ）の複合勾配で０．５
ｍｌ／分の速度で溶出した０通常の勾配はＢがＯから２
０％まで５ｘずつ増加させ、ついで、Ｂが６０％になる
まで１分当りＢを５ｚずつ増加さぜな、すべてのリパー
ゼはこのＩＩＰＬｃ溶媒系により不活性化される。溶媒
Ｂが約３５ｘ（リパーゼ１）および７ｆｊ蝶Ｂが約３９
ｘ（リパーゼ２）で溶出するタンパク質のピークを集め
、以後のアミノ酸配列分析およびＣＮＢｒフラグメント
の調製に用いた。

アミノ酸配列分析のための臭化シアンベプヂドフラクメ
ントを次のように調製・精製した。実施例５でプールし
たリパーゼ１の一部を５ｐｃｅｄＶａｃ遠心２トぐ乾煤
させてから、８Ｈ尿素、８８％ギ酸を用いて１０１１ｇ
／ｉ　ｌになるように再懸）蜀した。この溶液を１容量
のギ酸中２００１醋ｇ／１１のＣＮＢｒと混合し、２時
間、室温、暗所でインキュベートした。生成物を逆相分
析の前に０．８ｘ７ｃ１］Ｂｒ−ＴｒｉｓＡｃｒｙｌ　
Ｇｒ０５（ｃｏａｒｓｅ）カラムを用い、溶媒＾４０χ
１溶媒８５０％（上記参照）で脱塩した。ペプチドを逆
相によるリパーゼ１の精製について上記に示したのと同
一の方式を用いて、最初分離した。しかし、溶媒Ｂは（
ＴＥＡおよびＩｒＡを含む）３５ｘプロパツールおよび
６５％アセト二１−リルに変更した。最初の分解物およ
びクロマトグラフィ後のそのピークはＳＯ３／尿素／ピ
リジンゲルおよび銀染色（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉ
ｎｇ）でら分析した。

クロマトクラムから２つのピークを選択し、今度は０．
４８Ｘ２５ＣＩＩの５ｙｎＣｈｒｏｎＰａｋ　Ｃ４カラ
ムで、上記に述べた条件でこれを再クロマトグラフィに
かけた。再クロマトグラフイ後、精製ペプチドをアミノ
酸配列分析のために閑存した。

（実施例４における）オクチルセファ１１−スカラムに
よるリパーゼ１およびリパーゼ２のＴｈ１％画分のそれ
ぞれを３容量の溶媒＾（０，０５％トリエヂルアミンお
よび０．０５％トリフルオロ酢酸）で希釈し、（実施例
５のように）クロマトグラフィにかけた。

実施例４で述べたように、精製タンパク質を５ＤＳｙル
電気泳動法により分析し、ついで、リパーゼ１とリパー
ゼ２のＣＮＢｒフラグメントおよびＮ末端アミノ酸配列
の比較のために個別にプールした。

リパーゼ１の比活性を実施例４のように精製した酵素を
用いて測定した。酵素的に実質的に純粋なリパーゼ１の
比活性は実施例１（ｃ）の定義にしたがえば３７５０単
位／ｌリタンバク質である。

のＬＢ（Ｌｕｒｉａブイヨン）培地で３７℃で一夜増殖
させた。細胞を遠心により集め、高分子量の全ＤＮ＾を
Ｎｕｃｌｅ＋ｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｒｌｅｓ、７．ｐｐ、１
５１３−１５２３（１９７９）でＢｉｒｎｂｏｉｎに記
述されている標準法に正確にしたがい調製した。　［ｌ
ＮＡを［：ｃｏＲＩで完全に消化し、ＥｃｏＩＩＬで消
化したプラスミドｐＢＲ３２２（八ＴＣＣ３７０１７）
標品に結合させ、細菌性アルカリホスファターゼで脱リ
ン酸した。ＤＮへの収汲いに使用したすべての酵素は製
造元の使用説明書（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａＬ＋ｓまたはＢｃｌｈａｓｄａ　ｌ１ｅｓｅａｒｃｂ
　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にしたがい便用した。結
合さぜたＤＮ＾をＥ、Ｃｏ１１２９４（八１ＣＣ３１４
４５１の形質転換に用い、アンピリジン低抗性（＾ｌ１
ｐｒ）コロニーを選択した。その結果、約２×１０　　
個の形質転換細胞が得られた（約５×１０３／グレー１
〜）、プレートに多量の４−メチルウンベリフェリル酪
酸溶液（５０１Ｈ１ｉｓ−１１ＣＩ、　ｐＨ８，ｏ　１
ｔｌｏｎＨ）を江き°、紫外線ランプ（波長３４０ｎｉ
）で照射した。

基質を加水分解し、螢光性の強い化合物４−メチルウン
ベリフェロンを遊離するコロニーは強い青色として観察
された。この方法を用い、１３個の陽性コＸ７二−が得
られた。これらの陽性；１口二一のそれぞれからプラス
ミド１ｎｉｐｒｅｐを上記のＢｉｒｎｂｏｉｎに記述さ
れているアルカリ溶菌法により調製した。

各プラスミドをＥｃｏ旧で消化し、生じたフラグメント
をＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：八Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎａ　
１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　
５ｐｒｉｎｕ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）でＨａｎｉａｔｉｓらが
述べているポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分
離した。

大半のグラスミドには４．３ｋｂの単一挿入フラグメン
トが含まれていた。ｆｌ！！のプラスミドにはこのフラ
グメント以外のフラグメントが含まれていた。

この結果によりすべての陽性＝１口二一は４．３ｋｂフ
ラグメントに含まれている共通のクローン化遺伝子の表
現の結果として生じたことが示唆された。

４．３ｋｂフラグメンＩ〜のみを含むプラスミドの１つ
（ｐＳＮＥ４と呼ぶ）を詳細な分析のために選択した。

グラスミドｐＳＮ［４を６１＋ｐ　Ｈ識配列を示す各種
制限酵素で消化した。これらの酵素はＪＮ独または組合
せて用いた。これらの実験により得られたフラグメント
の大きさの分析により、５ＮＥ４の４．３ｋｂＥｃｏｌ
ｌＬ挿入断片の予備的挿入比エンドヌクレアーゼ切断地
図が作成できた。この地図を第１図に示した。

少くとも８１１０１１ｐのプラスミドｐｓＮＥＩｌのＥ
ｃｏｌｔｌ挿入断片のいくつかのサブフラグメントを、
いずれかが礪能性遺伝子を含んでいるか否かを検討する
ために、ｐＢＩ１３２２にサブクローン化した。１ｍ能
的リす−ゼ逍遺伝を含むことが見い出されたプラスミド
にｐｓＮＥｓｌがあり、これはｐｓＮＥ４のＥｃｏＩ１
１挿入断片の２．３ｋｂＥｃｏＲ１／５ａｌ１７ラグメ
ントを含んでいた（このフラグメントの地図上の位置に
ついては第１１：４怒照°）。

ＤＳＮＥＳＩの挿入フラグメントをさらに制限酵素で消
化し、生じた小さなフラグメントをＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ユ５ｕｐｐｌｅ１ｅｎｔ　ｒ１６
７−ｒ２０４（１９８４）で口ｏｂａｒｔｓが述べてい
るバクテリオファージ８１３ベクターにサブクローン化
し、Ｐｒｏｃ、　Ｗａｔｔ、＾ｃａｄ。

ｓｃｉ、　ｕｓ＾７４　００．５４６３−５４６７（１
９７７）テ述ヘラレテいるｓａｎｇｅｒらのチエインタ
ーミネータ−法により配列決定を行った。鋒坦部位間の
ＤＮＡの１．３６ｋｂの配列により（第１図参照）、す
べての可能なリーディングフレームで翻訳する場合、直
接的なアミノ酸配列で決定されるタンパク質のアミノ末
端のアミノ酸残基（残基１−１６）を含む大きなオープ
ンリーディングフレームが明らかとなった。このオープ
ンリーディングフレームは池の２つの直接的に配列決定
をしたペプチド（残基９４−１０５および残基１７３−
１９０）の；ｌ−ドら含んでいた。２２番目のメヂオニ
ンはシグナルペプチドに特徴的な疎水性の高いｆｌ域の
コードを開始させるので、開始：Ｔトンであると男えら
れる。このシグナルペプチドは分泌過程中に１番目のア
ラニンのｔ＆で切断されると推定さｈる。オープンリー
ディングフレームは２５９番目で終わるので、これは＝
！−ド化された成熟タンパク質の残基数は２５８個であ
ることを示す。

Ｅ、Ｃｏ１１に才月・）るＬ匹且迦リパーゼ３ｆｉ伝子
の調節された表現を行なわせるために、［ｌＮＡ　２，
１１１］、１８３−１９３（１９８３）で＾ｄｅｌｎ＋
ａｎらが述べているバクテリオファージ１３における特
定部位の突然変異誘発法により＾ＩＧｎｎ飴；１トンの
直前に囮部位をまず導入した。ついで、この修ｆｉ１３
ｊｌ伝子をＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　。

Ｓｃ＋、　ＵＳΔ８０　、　ｐ、２１２５（１９８３）
でｄｅＢｏｅｒらが述べている強力なｔａｃｌｌプロモ
ーターを含む表現ベクターにクローン化した。これはま
ずｐｓＮＥｓｌを囮で消化して行った。

リパーゼのご１−ド配列全体を含む２．４ｋｂ−１酊す
−フラグメントを単離し、鎚■の部位で８１３ｉｐ１９
の複製型分子（Ｒ［）に結合させ、この混合物をＥ、ｃ
。

ｌｉ　　ＪＨｌｏｌ（＾ＩＣＣ３３８７Ｇ）のトランス
フェクションに用いた。透明なプラークを検出し、江」
フラグメントが反時計回りの方向でみとめられるバクテ
リオファージ（初型）　ＤＮＡを調製した。リパーゼ１
のへＩＧ開始コドンからずぐ５００番目位置にＸｂａｌ
を含み、５０個のヌクレオチドからなる部分的にＩ′ｌ
Ｉ補性をもつ一重鎖ＯＮ＾フラグメントを合成した。

この５０個からなるフラグメントは一２７番目のヌクレ
オチドの位置（＾ＴＧ開始コドンの前））から−９番目
の位置および４１（八ＴＧの八）から　＋２０番目の位
置まで鋳型ＤＮ＾と相補性をもつ、しかし、−９番目か
ら何番目の間の生のリパーゼプロモーターＯｒｔ域の配
列５’−ＡＡＣＣＴＴＣＧ−３’はｔａｃ１１プロモー
ターの５゛−１＾ＴＣＴＡＧ＾＾■１−３°に変更しな
ければならず、突然変異を誘発させた。

変更領域を範囲とする３２ｐ像！合成オリゴヌクレオチ
ド（５°−＾ＴＧＡＧＧＴ＾ＴＣＴ＾ＧＡＡＴＴ＾ＩＧ
−３°）とのハイブリッド形成により　３００個のプラ
ークについてスクリーニングを行った。ハイブリッド形
成陽性のクローンの口［を調製し、Ｘｂａｌおよび１尼
で切断した。′Ａ伝子を含むＩｋｂ　腹旺ハ仰Ｌフラグ
メントを甲＾【し、上記のｄｅＢｏｅｒが述べているＥ
ｌｌｌＧＩＩ９０７　ｔａｃｌｌの■Ｕおよび江■の消
化、ｔａｃｌｌプロモーターおよびアンピシリン抵抗性
遺伝子を含む４．１ｋｌ＋のＸｂａｌ／５ｐｈｌフラグ
メントの単離により得られるベクターに結合させた。つ
いでＪＨ１０１細胞を結合混合物で形質転換させた。（
プラスミドｐｓＮｔａｃｌｌを含む一一第２図参照）ア
ンピシリン抵抗性コロニーを選択した。

Ｅ、ｃｏｌｉが合成するクローン化リパーゼ１の濃度を
測定するために、ＪＨ１０１／Ｉ）ＳＮｔａｃｌｌを１
ｎＨのイソブＩコピルーＢ−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＯ）を追加した２０１の１Ｂ培地で３７℃で１０時
間、増殖させた。

２９４／ｐＢＩ１３２２を陰性対照として用いた。　Ａ
ｌｌ＋胞を遠心により培養上清と分離した後、上記のに
ｏｓｈｌａｎｄの方法にしたがい、ペリプラズムおよび
膜／細胞質成分に分画した。各両分についてｐ−ニトロ
フェニル酪酸加水分解による活性を測定した。ｉ胞の分
画法の有効性を確認するためにＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｕｓ＾８１　　ｐｐ、　２６４５−２６４９
（１９８４）でＧｒａｙらが述べている方法にしたがい
、β　−ラクタマーゼ（ペリプラズムマーカー）および
β　−ガラクトシダーゼ（細胞質マーカー）も測定した
。リパーゼ活性の大半（７１％）は培養上清にみとめら
れた。細胞に結合した酵素の大半は細胞洗浄画分にみと
められ（全体の１７％）、ペリプラズム画分（２ｘ）お
よび細胞質／ｐＡ画分（７％）にみとめられたｌは少藍
であった。　２９４／Ｉ）ＢＲ３２２陰性対照培養試料
画分にはリパーゼ活性はみとめられなかった。

プラスミドｐｓＮｔａｃｌｌを含むＥ、ｃｏｌ　１ａＪ
Ｈ１０１の発酵試料のブイヨンを０．５ＨＮａＣ１に調
製し、Ｌ」υ月ュｄａを発酵さぜる場合と実質的に同一
の方法（実施例４）でオクチルセファロースにより精製
した。ただし、プロパツールによる勾配法は除外し、１
０１Ｎリン酸すｌ・リウム、ｐＨ８，ｏ、　０．５ＨＮ
ａＣｌに加えた２０Ｘアセトニトリルで行−）な、（酵
素を表現する遇１天子からクローン化された）単離凛品
をＳ［ｌＳゲルで分離した所、当初のＰｓｃｕｄａｌｏ
ｎａｓ　　ｕｊｉｄａ株から中歪したリパーゼ標品と同
一速度で移動した。

り１７−ン化したリパーゼ１からの臭化シアンフラグメ
ントを次のようにして調製した。クローン化した標品の
オクチルセファロースによる精製品（実施例９）を３容
獄の溶媒＾で希釈し、Ｐｓｅｕｄｏｎ。

ｕＬ匹亘ムからＩｉ’、　ｒ４１　したリパーゼ１およ
びリパーゼ２について述べたように短いＣ，ｌ　ｌｌＰ
ｔ、Ｃカラムでｆ！製した。精製品をＳＯＳゲルで分析
した。

Ｅ、ｃｏｌｉにおいてクローン　したリパーゼ１のＣＮ
ＢｒＮＢｒツーン　の゛ Ｌ匹貝白から得られたリパーゼ１のＣＮＢｒフラグメン
トとＥ、ｃｏｌｉにおいてクローン化したリパーゼ１の
Ｃｔ４Ｂｒ７ラグメントを比較した。Ｐｓｅｕｄｏｎｏ
ｎａｓから得られたＩｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃ精製リパーゼ１お
よび２、およびりＬＴＩ−ン化したリパーゼ１をそれぞ
れ上記の実施例Ｇで述べたようにＣＮＢｒにより加水分
解した。

生成物をＳＯ３／尿素／ピリジン電気泳動法で分析した
。得られた結果はクローン化したタンパク貿は明らかに
リパーゼ１であることを示す、（実施例４−５で示した
）ム１旦ｉｄａから単離されるリパーゼ１は次の基準に
より［、Ｃ０１ｉから”＋Ｉ　Ａｉされるクロン化リパ
ーゼ１と同一であることが示された；（ａ）いずれの細
菌から得られたリパーゼ１ら（実施例４と）同一のクロ
マトグラフィにより単離された；（ｂ）いずれの細菌か
ら単離されたリパーゼ１のＮ末端アミノ酸配列も同一で
あった；（ｃ）Ｃｔ４Ｂｒフラグメントのパターンによ
りリパーゼ１とリパーゼ２は明らかに識別され、またＬ
匹旦ムおよびＥ、ｃｏｌｉ双方から得られるリパーゼ１
のＣＮＢｒフラグメントは同一であることが示された；
（ｄ）双方の細菌から得られたリパーゼ１のｐ−ニトロ
フェニル酪酸塩およびｐ−二トロフェニル力プリル酸基
質に対する活性比率は同一である；および（０）基質を
トリカプリリンとする場合の加水分解／通油水分解の比
率は双方の細菌から単離されたリパーゼ１について同一
である。

実施例１３はｔ！１．よしい酵素（「リパーゼＩＪ　）
ともう一方のそれほど望ましくない池の酵素（「リパー
ゼ２」）を含む「粗製ｊ標品が３０ｐｐｌのベルオクタ
ン酸または８００ｐｐｍまでの過酸化水素のいずれかの
存在下で許容できる加水分解活性をもつことを示すもの
である。

０−フェニレンジアミン（“ＯＰＤ”）の酸化をモニタ
ーすることによる過酸生成ｉ測定法を開発した。

過酸によるＯＰＤの酸化は＋１２０２の場合よりはるか
に迅速であり、４５８ｎｎにおける吸光度がＩｉｌ加す
る。

この測定法では測定する反応混合液０，１１を取り、Ｏ
ＰＤ；ｆｆ液０．２Ｉｌｌを添加しく一部の例ではある
が、ＯＰＤを最初の反応混合液に添加した）、室温で５
分間、インキュベートし、Ｃ１１Ｃ１３／Ｃｌ１３０１
Ｉ（１／１ｖハ）０．９１を添加、１分間、遠心して４
５８ｎＩｌにお０る吸光度を読む、（ｃ８過酸に対する
）標準プロットは少くとも３Ｇｐｏｎの過酸まで直線的
であった。

実施例１の酵素標品（実施例１（ｃ）のようにリパゼ１
とリパーゼ２の混合物を含む）　１ｕ／ｎｌを０．５ｗ
１％のトリオクタノイン、１００１ＩＨＮａＣ１および
１０　ｎ　Ｈリン酸すトリウムと混合し、５例の試料そ
れぞれについて反応液の容量を２ｎｌ、　ＤＩｌｌｏと
した。

各試料の反応混合液を３０゛Ｃに閑った。５例の試７１
に一部いて次のようにして加水分解活性を測定した。

１例の試料についてはベルオクタン酸３０ｐｐｎを添加
し、対照（非ベルオクタン酸添加）の場合と同様に酵素
の加水分解活性を測定した（μｎｏｌｅ　ＮａｏＩｌ／
分）、ｆｌ！！の２例の試料には過酸化水素を添加しく
それぞれ４００ｐｐ＋１および８００ｐｐｎ）　、対照
の場合と同様に加水分解活性を測定した（μ１ｏｌｅ　
Ｎａ０１１／分）１表２にそのデータを示した。

１　　（対！！］　）　０ｐｐＨベルオクタンｉｌｌ　
　　Ｏ，４８２３０１月■ベルオクタン酸　　　　　０
．２４２３　　（対照）Ｏｐｐ＋ａ過酸化水素　　　　
０．５１・１　　４００旧）ＩＩＨ２０２０，４１３５
８００ｐｐｎｌｌ　２０２０．３７９表２に示したよう
に、この１１製酵素標品の加水分解活性はベルオクタン
酸、過酸化水素の存在により低下した。しかし、酵素に
有害な酸化的環境にらかかわらず、酵素標品は十分な加
水分解活性をもつと力えられた。

同様に、同１の市販酵素（Ｋ−３０）に４０００１）１
１または８００ｐｐｎの過酸化水素を添加し、反応液の
容置を２Ｉｌにして測定した。それぞれにおいて０．５
ｗｔＸトリオクタノイン、１００ｎＨＮａＣｌおよび１
０ｎＨリン酸ナトリウムを加えた。対照の場合と同様に
加水分解活性を測定した（　μｎｏｌｅ　Ｎａ０ＩＩ／
分）０表２と比較するためにそのデータを表３に示した
。

友」 言Ｌ！ｌ　　直旌血１　　　　　　　加水分解活性１ｏ
１ｃ　　Ｎａ０１１／ノ ロ　　（対照）　０ｐｐＨＨ２０２０，２２３７４００
ｐ＋＋１ｍ１（２０２０，１３５８８００ｐｐｌ（２０
２０，０５（ｉ 表２と表３とを比較すると、本発明による酵素は既知の
酵素に比較し、酸化的環境におい°（がなり安定性が高
い（感受性が低い）ことが分る。

実施例１４＾は実質的に純粋な望ましい酵素（リパーゼ
１）標品は４ＱＯｐｐ１Ｍの過酸化水素およびトリオク
タノインのペルヒドロ分解により生成する４４−７ｐｐ
のベルオクタン酸の存在下で不活性化されず、秀れた加
水分解活性をもっことを示ずらのである。

実施例１４Ｂは加水分解に対する通船水分解の比率に対
するｐＨの影響を示すものである。

火几ｊ１まし 実施例４の酵素標品（実質的に純粋なリパーゼ１）を過
酸化水素の存在下および非存在下で検査した。加水分解
速度はμｎｏｌｅ／１／１０分の単位で測定した。各試
料には０．１ｗｔ％ドデシル硫酸ナトリウム（”ＳＯ３
”）で乳化した１、０ｗｔ％のトリオクタノインおよび
４１１ｇ／Ｉ’ｌｌのＯ−フェニレンジアミン（０ＰＤ
）を加えた。各試料の反応容１は２１１．温度は２７°
Ｃとした。実質的に純粋なリパーゼ１標晶は４００ｐｐ
１１の過酸化水素、およびペルヒドロ分解によりｆＦ！
！ｌ！！する過酸の存在下で全く不活性化しなかった。

実施例１５は本発明の斬新な酵素はエステルより脂質に
対して強い酵素活性をもつことを示すものである。

各試料において４０ｎＨリン酸バツフアー中、Ｉ＋　２
０２は３８０ｐｐＩＩｌ、　ＯＰＤは２ｎｇ／ｎｌ、酵
素（実施例１でＡ製したリパーゼ１とリパーゼ２の混合
物を含む）は１μす／１１、基質（ＳＯ５で乳化、基質
／ＳＤＳの比率は１０：１）とした、ｐｌｌは９．０（
ｐｌ＋スタット）は１１％、温度は２７°Ｃ１反応容策
は５１であった０表４にμｎｏｌｅ／ｎｌ／１０分の単
位でデータを示した。

［ 実施例４の酵素標品を次の一定した反応条ｅ１−で検査
した二０．１■ｔ％ＳＯ３中の１ｗｔＸ１−リオクタノ
イン、３８０哩ｒａ　１１２０２．１μ＋Ｊ／ＩＩ　＋
酵素、　２ｕ／ｎｌ　ＯＰＤ、反応容Ｊｉ５１ｍｌ、２
７’Ｃ，各反応液の０１１は８から１１に調整し、通油
水分解および加水分解値はμｍ１０１０／Ｔｅ１１５分
の単位で測定した。至″ｉＭｐｌ＋は約ｐｌ＋１０のよ
うである。

トリオクタノイン　　４．２４　　　　　　０．４２オ
クタン酸メチル　０．６６０．１１ データが示すように、本発明の新規な酵素の活性は（単
純なニスデルに関連して）トリグリセリド基質に対して
強く、リパーゼであることが分る。

市販の多くの酵素はアニオン性界面活性剤の存在により
埋置される。実際に、ＳＤＳのようなアニオン性界面活
性剤はタンパク分子に結合し、タンパク質を棒のような
形に変換し、元来の荷電をＳＤＳの負荷なで遮蔽するこ
とによりＳＯ３電気泳動法のような方法においてタンパ
ク質を可溶化するために通當、用いられている。大半で
はないにしても多くの市販の洗剤にはアニオン性界面活
性剤が倉まれているので、アニオン性界面活性剤が存在
してら酵素の加水分解活性が維持される作用は用要な利
点である。

実施例１６はアニオン性界面活性剤の存在下における本
発明による酵素の加水分解活性の維持および比較のため
の市販酵素による活性の阻害を示すものである。

＾ｎａｎｏが市販しているリパーゼに−３０を用いて調
製した。この酵素はΔｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　Ｏ
ｒから得られるもので、濃度は８．７μｇ／ｎ　ｌとし
た０本発明による酵素標品は実施例１のように１６．８
μｇ／ｌ（リパーゼに−３０の加水分解速度に近い）と
した、各紙ｆ４には重量比で１０；１のＳＯ３で乳化し
たトリオクタノインを加えた。バッファーは１０１１Ｍ
リン酸ナトリウＪ１パンファー、ρ１１は１０．温度は
２５°Ｃ１各試Ｌ１の反応容量は共に２１１とした。　
ＳＯＳ存在下におけ各酵素によるトリオクタノインの加
水分解のデータを表５に示した。

特定の酵素を除き、成分および／または反応条「１−を
同一にした試料を調製した。比較試料は敷」 晶」「監」ｊリエわ−基質の加水分解 Ｌ　　Ｇ、ＩＮ　　Ｎａ０１ｌ／ 本発明による酵素の場合： ０．０１　　　　　　　　　　　　２ ０．０５　　　　　　　　　　　　７ ０．１　　　　　　　　　　　　１１ ０．５　　　　　　　　　　　　１３ ｉ、Ｑ　　　　　　　　　　　　　１２裁Ｉ」Ｌ工、Ｌ
ＬＬＬ 基質の加水分解 Ｌ　０．ＩＮ　Ｎａ０ＩＩ／ 市販酵素の場合 ０．０１ ０．０５ ０．１ ０．５ １．０ ７．５ １．５ 表５のデータから分るように、上記２種の酵素では基質
量が０．０５ｗｔ％における加水分解活性は相互にほぼ
匹敵しているが、トリオクタノイン基質量を約０．１ｗ
ｔ％以上に増加させると、ＳＤＳ　Ｉｔの増加につれて
市販酵素は阻害された。すなわちリパーゼに−３０では
通油水分解速度が相対的に不良であった。対照的に、本
発明による酵素は上記アニオン性界面活性剤の存在によ
り実質的に影響されなかった。

乳化剤としてポリビニルアルコールを用いた以外、実施
例１６に類似する検査では市販のリパーゼト３０と本発
明による酵素は良好な加水分解速度を示した。

実施例３における酵素標品について過酸生成を測定し、
０．５ｗｔ％のＳＯ３存在下において２種の市販酵素の
過酸生成と比較した。各検査試料では、過酸化水素を４
＆０ｐｐ１１．酵素濃度を６μす／１、トリオクタノイ
ンをＳｗｔ％およびＳＯ５を０．５ｗｔ％とした。

ｌＪ＋１は１０に固定し、温度は２５℃とした０表６に
本発明による酵素の通油水分解活性を示した。

表」 度Ｌｌｌ−タＬＪ−゛　　　　ノ：１１２３．９ ４７．２ ６８．１ ８９．０ １０　　　　　　　　　　　９．９ 対照的に、市販の酵素リパーゼＣ［Ｓ　（Ｐｓｅｕｄｏ
ｉｏｎａｓ　Ｎ、より得られ、＾ＩＩａｎｏが市販して
いる）による過酸生成量は実質的に一定で低く（過酸が
約０．５ｐｐｎ　）　、また市販のリパーゼ１（による
過酸生成量は実質的に一定で、さらに低かった（過酸が
約０．３１ｐＩＩ）。

加水分解に対する退屈水分解の比率は非常に重要である
。基質からの過酸への変換率ができるだ番゛１高いこと
が望まれる０本発明による酵素では過酸／酸の比率がリ
パーゼＣ［Ｓのような市販酵素より高い、これは本発明
による酵素は過酸生成のために、より効率よく基質を利
用し、したがって、漂白処方に含まれる基質量が少なく
て済むことを意味する。

４００ｐｐＩｌ過酸化水素、０．１２）１１１ＰＯ４、
ｐｌ＋１０．０および種々の濃度の市販酵素（＾ｌ１ａ
ｎＯ性のＣＥＳ）または本発明による酵素（実施例１（
ｃ）の標品）を含む試料について退屈水分解および加水
分解を測定した。退屈水分解は反応時間を１４分として
チオ硫酸滴定により測定した。加水分解はｐｌ＋スタッ
トを用いて連続滴定法により同時測定した。トリオクタ
ノイン基質量はＰ■＾濃度を０．７５ｗｔ％として、１
２．５ｗｔ％であった０本発明による酵素では基質の加
水分解が低いほど、過酸生成量が多く、これは本発明に
よる酵素はリパーゼＣ［Ｓに比較し、基質をより効率的
に利用することを示した。

実施例１（ｃ）に示す粗製標品は「リパーゼ１Ｊおよび
「リパーゼ２」と呼ぶ２種の酵素を含むことが発見され
た。トリオクタノイン基質に対する通油水分解／加水分
解の比率は異なり、リパーゼ１はリパーゼ２に比較し、
通油水分解活性が秀れている。実施例１９はこのような
比率を示すものである。

４例の試７：１を調製した。各試料の基質は１ｗｔ％。

界面活性剤はＯ，ｈｖｔ％（ＳＯ３またハＰＶへ）、Ｉ
Ｉ　２０２は４００ｐＤＩｌ、　ＯＰＯは４Ｈ／ｌ　Ｉ
であった９反応容量は２１１　ｐＨは９．Ｏ１温度は２
７°Ｃであった。リパーゼ１（実施例３の標品または実
施例９の標品）またはリパーゼ２（実施例４の標品）を
試料に添加した。

表７にそのデータを示した。

表７のデータから分るように、アニオン性界面活性剤の
存在下においてリパーゼ１のトリオクタノイン基質に対
するペルヒドロラーゼ活性はリパーゼ２より秀れており
、非イオン性界面活性剤の存在下におけるペルヒドロラ
ーゼ活性とほぼ匹敵している。

実施例２０は本発明による新規な酵素を過剰にすると加
水分ハイは増加するが、過酸は増加しないことを示すも
のである。この場合にも、基質の利用が効率的であるこ
とが示される。

■ 基質は０．１ｗｔ％ＳＯ３で乳化した１ｗｔ％のトリオ
クタノインとし、過酸化水素は４００ｐｐｌ、　ＯＰＤ
は４１’ＲＩＪ／ｉｆ、　Ｄｌｌは９．０．温度は２５
°Ｃ１反応容量は５１１であった。酵素量（実施例４の
標品）は３種類とした。

結果を表８に示す。

３　　　　　　　　　　　　　　１．７　　　　　　　
　３．２６　　　　　　　　　　　　　　　３．５　　
　　　　　　　５．９１２　　　　　　　　　　　　　
　　Ｇ、１　　　　　　　　１０．１ゝ！　　ＩＩ　　
　　、　　　　ｎｏｔｅ／１１５分　　　　　　１０分 ３　　　　　　　　　　　　Ｑ、　４２　　　　　　　
（１，５４６０，５１０，７８ １２０，５７０，８７ １ｊｐ−ニド１７フ工ニル酪ｉ’ｉ！塙加水分解したが
って、加水分解に対する通油水分解の比率は５分後にお
いて、それぞれ０．２５．０．１５および０．０９であ
り、１０分後においてそれぞれ０．１７゜０．１３およ
び０．０９であった。このように、酵素量が少ないほど
、効率が高かった。

リパーゼ１とリパーゼ２を分離すると、ｐ−二ｌ−ロフ
ェニル酪酸塩およびｐ−ニトロフェニルカプリル酸に対
して全く異なる加水分解速度（加水分解活性）をもつこ
とが見い出された。したがって、これら２種の新規な酵
素は実施例２１で示ずようにｐ−ニトロフェニルカプリ
ル酸の加水分解に対するｐ−二ｌ−ロフェニル酪酸塩の
加水分解の比率により識別することができる。

反応は非イオン性界面活性剤行目ｏｎ　Ｘ−１００（Ｒ
ｏｌ＋ｎ　＆　１ｌａａｓ社が市販）　　０．１ｗｔ％
を含む０．ＩＨＩｒ　＋　５−１１ｃ　ｌ　、　ｐＨ８
，Ｏを用い、温度を２５°Ｃとして行った。

リパーゼ１（実施例３の標品）については２．０ＴＲＩ
（ｐ−二）・ロフェニル酪酸塩（ＰＮＢ）を晶質とする
場合の加水分解速度は０．６０（００４１５ｎ１１／分
）であるのに対し、２．０ｉＨｐ−ニトロフェニルカプ
リル酸（ＰＮＣ）を基質とする場合は０．０９であり、
ＰＮＢ／ＰＮＣの比率は７であった。対照的にリパーゼ
２についてはＰＮＢを基質とする場合の加水分解速度は
同一濃度で０．５４であり、同一濃度のＰＮＣを基質と
する場合は０．４４．　したがってＰＮＢ／ＰＮＣの比
率は１であった。

基準酵素はアニオン性界面活性剤の存在のような市販酵
素に対して有害な条件でも広汎な範囲の界面活性剤の存
在下で過酸を生成することが示されている。

ム」 基準酵素（実施例１（ｃ）のＬ品）、市販のリパーゼＫ
または市販のリパーゼＣ［Ｓのいずれかを含む試ｔ１を
基質（トリオクタノイン）、過酸化水素および界面活性
剤（アニオン性および非イオン性）の混合物を倉む水溶
液に溶解した。溶液は室温に保ち、１１１１は１０．０
とした。表９に示すように１４分後におＣ”）る通油水
分解旦を１１０１１中８位で計算した。

表から分るように、基準酵素はアニオン性界面活性剤な
どの界面活性剤の存在下で著明に秀れた退却水分解活性
をもつ。

（プロピレングリコール）４１７ 既に述べた実施例は上記に示した望ましい基質の官能基
（ｉ）をもつトリグリセリド基質の便用に基づいている
。同一の官能基をもつ他のグリセリドを既にのべた実施
例にお（°）るトリグリセリドの代りに使用することが
できた。同時に、上記に示した他の基質、特にエトキシ
ル化エステル（ｉｔ）およびプロポキシル化ニスデル（
ｉｉｉ）からなる望ましい官能基を含む基質を既にのべ
た実施例におけるｌ・リグリセリド基質の代りに使用す
ることができた。

さらに、上記に示した官能基をもつ望ましい基質群ｆｉ
Ｌ　（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に開運して、最初の官能
基群をもつ特異的な基質の実例は既に述べた実施例で明
らかである。ｆｌ！！の２種の基質群の基質の実例は実
施例２３で述べるプロポキシル化エステルの合成法で明
らかにり゛る。

及九匠ハ カルボン酸のプロピレングリコールモノエステル調製法
には次の段階がある： （１）昼り巌且末Ｕユ述：カルボン酸１当殿と炭酸ナト
リＴンム０．０ｇ当量をマグネチックスターラと加熱用
油浴を備えた丸底フラスコ中で混合した。

脱水のために、スラリーを常に１３′Ｌ拌しながら真空
下、１５０″Ｃで約１時間、加熱した後、常圧に戻し、
室温まで冷却した。

（２）互ムデ止進：段階（１）の冷却したカルボン酸／
カルボン酸塩をプロピレンオキシド約６当巣と混合し、
還流しながら約６０°Ｃの油浴で約８時間、加熱し、ニ
スデル化反応を完了させた（エステル化反応が完了した
ことはＧ、測定により確認した）。

（３）還流縮合物を採取し、過剰のプロピレンオキシド
を沸騰・除去した。酸ＩＱＯ＋８ｎｏｌｅ当たりジエチ
ルエーテル約２００ｎＬを添加し、生じた７ｆｉＲを５
ｘ炭酸すｌ〜リウム２容貝を用い、分液ロートで抽出し
た１次にブライン１容量を添加した。エーテル相を硫酸
すトリウムで乾燥、ろ過し、１７−タリエバボレーター
で濃縮してエステル生成物を得た（通常、純度的９０％
）。

官能基のイ・１いた基質群（１１）および（ｉｉｉ）に
したがう官能基の付いた基質の他の実例も同様の方法で
生成することができる。

実施例２４はいくつかの望ましい処方についての着色の
除去試験を示すものである。

支１区Ｂ 酸化剤の性能の評価はクリスタルバイオレットで染色し
た帯状の綿布（１００％）で行った。クリスタルバイオ
レット（０，１２５ｇ）を蒸溜水１．２５リットルに添
加した。長さ２５０ｃｎ、幅５ｃｎの染色されていない
綿布（１００％）を溶液につけ、８時間、撹拌した。（
クリスタルバイオレットで染色された）綿布を染色液か
ら取出し、洗浄液がほとんど無色になるまで冷たい水道
水で反復洗浄した０次に、染色した綿布を個別にアルミ
ボイルに栽ぜ、紙タオルで拭い、風乾した。

対応するえｌ　ｌｊ％ｌ　（ｃｏｎＬｒｏｌ）成分と同
様に、基準酵素を加えた３種の望ましい成分をＦＡ製し
た。基準酵素を象む３種の成分とこれに対応する３種の
対照成分をそれぞれ用いて上記の染色綿布を洗浄し、着
色除去性能をそれぞれについて評価した。性能結果を表
１０に要約した。

恥 梗 何 表１０のデータから分るように、対照成分には過酸化水
素成分が含まれているものの、基準酵素を含む成分では
対照成分に関連して着色除去の効果が改善された。この
ような着色除去の改善は酵素的過加水分解系によるもの
であり、多くの既知の市販酵素を阻害するアニオン性界
面活性剤の存在下でみとめられる点で特に顕著である。

既に述べた種ｙ（の実施例で開示された過加水分解系、
いいかえると活性１ヒ酸化剤系はａ￥１Ａの洗浄に通常
、使用されてい広範囲の洗剤処方と併用して使用するこ
とができる。米国における洗濯用途のための通常の強力
な粉末洗剤にはアニオン性および／または非イオン性界
面活性剤、リン酸または４ｒリン酸ビルダー、緩衝剤、
および光沢剤、香７コ１、タンパク質分解酵素などのよ
うな種々の添加剤が含まれている０本発明の過加水分解
系はそれ自体、または上記の通常の粉末洗剤の微量成分
として使用できる。

ヨーロッパにおける通常の強力な粉末洗剤には米国の洗
剤とほぼ同一の公称成分がえよれているが、洗剤製品の
使用濃度は（米国における通常の濃度ｏ、　ｉｓｘでは
なく）洗濯機中で通常、１．２χである１通常の洗剤処
方と併用して包装する本発明の過加水分解系の望ましい
処方は過酸化物源が約３−３０ｖｔＸ、基質が約０゜６
から約１２Ｗ［，１ＩＩｆｉｌｌｌ＋酵素が約０．００
１カら約０．７ｗｔ％　テある。

米国にお（Ｊる通常の洗濯用途では（通常、洗剤には着
色除去のための酸化性漂白剤および酵素は含まれていな
い）、性能を改善するために洗剤の池に酸化剤（通常は
過ホウ素酸ナトリウムまたは過炭酸す（〜リウム）およ
び酵素（タンパク質分解性およびデンプン分解性）を含
む製品を使用するのが一般的である。このような酸化剤
を含む製品は洗濯機における製品使用濃度が約０．１７
％の場合に約２５−５００Ｄ１１のへ、０．（過酸化水
素）が得られるように通常、処方されている１本発明に
よる過加水分解系を約２１°Ｃから約３８℃の温度で洗
濯水中で洗剤と共に使用することを目的とする場合には
、望ましい処方の過酸化水素源、基質および修飾酵素の
重量比は２４００　：　２００　：　１から４８：２０
：１の範囲であることが望ましい１本発明の特に望まし
い酵素的通油水分ハＴ系における過ホウ素酸ナトリウム
四水和物、トリオクタノインおよび修飾酵素１の重量比
は９５：３９：＋である。このような洗濯用添加処方は
製品の使用濃度が約０．１．７％の場合に洗濯液中で約
２５−５０ｐｐｒれ＾、０（過酸化水素量）　、２−２
０ｐＤｎ　Ａ、０．（ＦＩｌｉＸ論的過酸度曲送よび０
．１ｐｐｎから１０ｐｐｎの酵素を生成する。

実繕例２５は本発明の修飾酵素を得るために＾ＴＣＣ５
３５５２のリパーゼ１について行った特定塩基対の′ｖ
Ｉ異的変更を示すものである。

尺立匠赴 八ＴＣＣ５３５５２から得られるリパーゼ１３！！ｉ伝
子についての特定塩基対の特異的変更はＢ　ｉ　ｏｃ　
１ｅａ１．　Ｊ　。

ユ亘、ｐｐ、　１−７（１９８Ｇ）でＣａｒｔｅｒが述
べている方法により行った。リパーゼ１３！ｉ伝子全体
とｔａｃ　ＩｆブＩ７モーターを含むＰＳＮ　ｔａｃ　
ＩＩのＥｃｏ　Ｒ１−３ｏｈ　１７ラグメントを［ｃｏ
　ＩＩおよびＳｐｌ＋　ｌで消化しである旧３８Ｐ　ｉ
８ベクターに結合さＶた。このようにＤＮＡセンス鎖を
調製し、突然変異誘発鋳型として使用した。アミノ酸の
変更のために望ましい突然変異コードを含む合成プライ
マーを一重１Ｉｌｎ型にアユリングし、１個所以上の不
適正塩基対をもつ二重Ｇｆｌ　ｆｔ域を形成させた。プ
ライマーおよび鋳型がら二重鎖プラスミドを作るために
ヌクレオチドおよび必要な酵素を添加した。得られたプ
ラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　Ｊ旧０１に加えて形質転換を
行なわせ、コロニーについてアミノ酸の変更を起こす望
まし、いヌクレオチドの変更の有無を分析した１例えば
、１２６番目（八１ａまたはＴｙｒで）および２０６番
目（Ｇｌｎで）のアミノ酸が置換されている変異株を特
定部位の突然変異誘発法により調製した。

特定塩基対の特異的変更はアミノ酸の変更を生じないで
、独特のエンドヌクレアーゼ制限部位をｔｉ−るために
もリパーゼ１逍（天子について行った。

用いた方法はＮｏｒｒｉｓら、Ｈｕｅ！ｃｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　ｎｅｓ、　　１１゜０１１、５１０３−５１１２
（１９８３）およびＷａｌｌｓら、Ｇｅｎｅ　　３４ｐ
ｏ、　３１５−３２３（１９８５）に記載されてい乙９
特定部位の突然変異誘発法は１２６番目の活性部位のセ
リンのいずれかの側に２組の独特のＦｉ’Ｊ　Ｎｉｌ　
ｋ作るために行った。これらの変更はアミノ酸配列には
影響ぜず、＾ｆａｔ　ＩＩ−Ｂａｎ　Ｉ１１部位であっ
た。同様に、独特のＢｓＬ　ＸＩ−Ｂａｎ　Ｉ１１部位
を活性部位の２０６番目のヒスチジンの付近に作った。

これらの突然変異のそれぞれは個別に行われ、望ましい
アミノ酸の変更を伴う合成ＯＮ＾いいかえると、カセ、
７１−　ＯＮ八を結合できる（したがって、野生型のリ
パーゼＩｆｉ伝子と交換できる）独特の部位をらつ２８
の異なるプラスミドを生成した。特定の塩基対は次の通
りである： ＾ａｔ　ＩＩ：　ＣＡＣＩＩＣからＧＡＣＧ　ＩｃへＲ
ａｎ　ＩＩＩ：　ＧＧＣＩＣＧからＧＧＡＴＣＣへＢｓ
ｔ　ＸＩ：　ＣＣＧＧＴＧＩＴＣＴＧＧからＣＣＡＧＴ
ＧＴ　ＴＣＴＧＧへＢＡＧ　ＩＩＩ：　ＧＧＩ＾ＧＣか
らＧＧＡＴＣＣへ突然変異を誘発したＢｓＬ　Ｘ１部位
が・２０６番目のヒスデシンカセットに独特であるため
に、１２６番目のセリンのコドンをＴＣＧからＴＣＧへ
変更することにより　１２６番目のＢｓｔ　Ｘ１部位を
除去しなければならなかった。

セリンカセットに突然変異部位をもつプラスミドをｐＧ
Ｃｔａｃ　Ｉ　Ｉ　３八Ｂと呼び、ｔａｃｌｌグロモー
ターと独特の＾ａｔ　ｌｌ−Ｂａｌｌ１１１部位を含む
リパーゼ遺伝子をもつｐＢｎ３２２プラスミドであるこ
とを示す、ヒスチジン部位の変異の１ラスミドはｐｔｌ
ｃ１１９ｔａｃｌ１３ＢＢと呼び、ｔａｃ１１プロモー
ターと独特のＢｓｔ　ＸＩ−ＲａｎＩ＋１部位を含むリ
パーゼ遺伝子なもつｐＵＣプラスミドであることを示す
。

上記の変更以外の単独のアミノ酸の変更を示すすべての
変異は以上の方法で行った。浮動性変異を起こすために
は、浮動性塩基変更を含むカセットを用いた。

二重変異株はΔ５ｐ７１８および八ｃｃ　Ｉを含み、１
２６番目のアミノ酸領域における望ましい変異をもつプ
ラスミドＰＧＣｔａｃ　ＩＩ　３八Ｂを消化して、３０
０個の塩基対フラグメントを単離することにより構成し
た。２０６番目の領域でアミノ酸を変更させるプラスミ
ドＰＵＣ１１９ｔａｃ　ＩＩ　３ＢＢを同一の制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、生じたベクターに３００個の
塩基対をもつフラグメントを結合さぜた。

リパーゼ活性をもつ酵素を次のように単離した。

ＬＢ５ｎ　ｌとカルベニシリン（５０μｇ／ｌ）を入れ
た試験管２木を用い、細胞を３７℃で２０時間、増殖さ
せた。４１１胞を５ｏｒｖａｌｌ　ｌＩＣ−５Ｂを用い
、６０００回転／分、４°Ｃで８分遠心した。各細胞沈
渣を２０％スクロース、１０　＋ｉ　Ｈリン酸すｉ−リ
ウム（フィルター滅菌）を含む冷却液（、ｐＨ８，ｏ）
　１ｎｌおよび０．２５ＨＥＤＴＡ１００μｌに再懸濁
した。懸濁液を水冷して　１０−１５分、インキュベー
トした後、６０ロＯ回転／分、４°Ｃで６分遠心した。

上清について、加水分解活性および通船水分解活性を測
定した。

精製は一般に次のようにして行った１発酵ブイヨンを４
０００７で２０分、遠心した。上清をデカンテーション
で除去し、細胞ベース１−を−７０℃で凍結した。細胞
ペーストを融解し、２０％スクロース、１０ｎＨリン酸
すＩ・リウム、ｐｔ１８．０を含むバッファー４容爪を
加えてワーリングブレンダーでホモジネートと１−な、
３０分、撹拌した後、ポリエチレンイミンを最終濃度が
０．１ｘになるように添加し、さらに５分、撹拌した１
次にスラリーを４０００ｇで２０分、遠心した。上清を
０．２２μのフィルターでろ過し、伝導度が２．２ミリ
オームになるまで１０ｎＨリン酸ナトリウム、　ｐＨ８
，０を上清に添加した。得られた標品について１０１Ｈ
リン酸ナトリウム、ｐｔ１８．０を用いスルボニル−プ
ロピルカチオン交換樹脂でクロマトグラフィを行った。

リパーゼ酵素は２５０ｉＨ塩化ナトリウム、１０ｎＨリ
ン酸ナトリウムｐ１１８を用い、樹脂から溶出した。こ
の時点における酵素標品の純度は５Ｏ３−ＰＡＧＥによ
り判定すると９５Ｘ以上であった。

［。ｃｏｌｉで表現される秀れたペルヒドロラーゼをも
つ変異株を検出するスクリーニング法は次の通りであっ
た。突然変異を誘発したＤＩＩＡを含む形質転換細胞を
Ｌｕｒｉａアガロース（［＾）と５０μｇ／ｎ　Ｉのカ
ルベニシリンのプレートを用い、１．２μのセルロース
アセデートフィルター上で画線培養し、プレー）（１５
０ｉＩシヤーレ）当たり　５００のコロニが得られるよ
うにした。野生型対照株を各プレーｌ〜の小さな部分に
斑点播種し、プレートを３７°Ｃで２０時間、インキュ
ベートした。

形質転換株および野生型対照株を含むセル１７−スアセ
テートフィルターを取り除き、新鮮なし＾とカルベニシ
リンを含むプレートに移し、４°Ｃで保存した。フィル
ターを取り除いたプレートについて、プレート当たり次
の成分を含むアガロースオーバーレイ液１８１を注ぎ、
リパーゼの通油水分解活性のスクリーニングを行った： ０．８Ｘ　７ガＬＶ　　Ｘ　１０−４　ＨＮ　ＥＬＩ　
Ｉ　２　＋　”Ｊ　１１　ｐ　１１９−５０．１％　ト
リオクタノイン７０．０１％ＳＳＯ３５００ｐｐ　＋ｈ
ｃ万 ｉｎ！Ｊ／ＩＩ　Ｑ−トリジン （退却水分解を示す）陽性対照では室温で２時間インキ
ュベートすると晴黄色の呈色が見られた。

対応する各陽性コロニーを最初のフィルターから拾い、
１Ｂと５０μｇ／１１のカルベニシリンを含む液１００
、ｔｔ　１を入れた９６孔滅１ｉｉｔｉｔｅｒｔｃｋプ
レートの孔に措種した（　１列には野生型対照株をｔｔ
種した）。

このプレートについて　６−７時間（または−夜）増殖
させた。９６木の針の付いたプレートスタンバ−を用い
てセルロースアセデートフィルターの付いている［＾と
カルベニシリンを禽むプレートを３７℃で２０時間、増
殖させた。このプレートについて、ａ良の変異株を選択
するために上記のオーバーレイ法を用いて、再びスクリ
ーニングを行った６次にスタンプをしたフィルターから
：Ｉ口二一を拾い、３７°Ｃで６−７時間、５１の［Ｂ
で増殖させることにより単一のグリセロール保存株を調
製した。このグリセロール保存株をさらに大規模な試験
に用いた。

上記の調製およびスクリーニング法により基準酵素に関
連して過酸の生成が四散するか、向上している多くの修
飾酵素が変異リパーゼ１遺伝子をもつ［、Ｃｏ　ｌ　ｉ
コロニーから単離された６表１１に本発明によるこのよ
うな修飾酵素を要約した。

過酸に対する酸の比率を決定する測定条件は次の通りで
あった： 、ＩＪ５負　０．４％トリカブリリン 乳化剤　０．０４％ドデシル硫酸ナトリウムトＩ　２０
２　　　８００ｐｐｌ　　＾、０５０μＨＥＤＴ＾ 反応１３１１　１０．０ 反応温度　ＲＴ 反応時間　１４分 ｐ＋＋スタットではカプリル酸を生成するトリカプリリ
ンの加水分解とベルオクタン酸を生成するトリカプリリ
ンの通油水分解の双方が測定される。

双方の酸生成物はベルオクタン酸のｐにａが８．５であ
り、カプリル（オクタン）酸のｏＫａが３゜５であるの
で１１１１スタツトにより滴定される。データはｐｌ＋
スタットから１４分間における生成皿の全当量数として
得られる。ベルオクタン酸はカタラーゼの添加による１
１□０□の分解後、過剰の酸性化ヨウ化カリウムの添加
および希釈チオ硫酸による滴定によりＢｒｉｎｋｍａｎ
自動適定装置で定見約定装置される。

ＥＤＴ八は金属が触媒する分解を低下させることにより
ベルオクタン酸を安定化させると考えられる。

過酸の滴定により過酸量がＩＱｑで得られ、これをＤＩ
＋スタットで観察される酸の全１から差し引くと正味の
加水分解（Ｇ）Ｉｋが得られる。

表１１のデータから分るように、基準酵素に関連して効
率が匹敵しているか、または相当に向上している多くの
修飾酵素がＦｌ製された。

本発明を特定の実施例と関連させて述べてきたが、実施
例では一層の変更が可能であり、このような応用には、
−数的には本発明の原理にしたがい、また本発明が関係
する技術分野における既知あるいは従来の実施内容の範
囲に関連し、また上記に述べた不可欠な特徴に適用でき
、また本発明の範囲および特許請求の範囲内に入るよう
な開示内容からの新しい試みを含む本発明のあらゆる変
化、用途または適応が含まれると理解されるべきである
。

、−１，Ｉ”７１面の簡惟な説明 第１図はｐｓＮＥ４と呼ぶプラスミドの４．３ｋｂ［ｃ
ｏｎＬフラグメントの地図である。斜線領域はシグナル
ベグヂド＝１トン（コドン−２２から÷１）を示し、斑
点領域はリパーゼ１と呼ぶ成熟ポリペプチドのコード領
域（二Ｉトン＋１から＋２５８）を示す、＾ＴＧ開始コ
ドンおよび■静停止コドンも示しである。

第２図はン一とユニ上」（コニ２、リパーゼ１１伝子の
Ｅ。

ｃｏｌｉ表現ベクターを示したものである６斑点領域は
２２個のアミノ酸からなるリパーゼシグナル配列の＝１
−ド頒域を示す、斜線領域は成熟リパーゼタンパク質の
コード領域を示す、転写は＾ＴＧ開飴コドンで始まり、
矢印が示す方向に進行しＴＡＡ停止コドンで終了する０
両側の太線部分は５°−および３−非転写領域を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、過酸の現場生成のための酸素的過加水分解系であっ
   て、 （ａ）加水分解活性をもつ修飾酵素であつて、加水分解
   活性をもち、シュードモナスピューティダＡＴＣＣ５３
   ５５２から単離可能であるが、それとは次のどちらかの
   位置にある少くとも１個のアミノ酸が異なる酵素に実質
   上、対応するアミノ酸配列をもつ修飾酵素、 （ｉ）修飾酵素が結晶状である場合に１２６番目のセリ
   ン、１７６番目のアスパラギン酸または２０６番目のヒ
   スチジンから約１５Ａ以内；または（ｉｉ）１２６番目
   のセリン、１７６番目のアスパラギンまたは２０６番目
   のヒスチジンのいずれかの側の１次構造からほぼ６個の
   アミノ酸以内；（ｂ）（ａ）の修飾酵素により加水分解
   可能な基質、および （ｃ）（ａ）および（ｂ）と反応し、基質溶解水溶液の
   存在下で過酸を生成する過酸化物源、 から成る過加水分解系。 ２、基質が次の構造をもつ請求項１の酵素的過加水分解
   系。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒは少くとも１個の炭素原子を含む置換基で
   、Ｘは官能基または炭化水素基である。）３、Ｘが、官
   能基が付加したポリオールまたはポリエーテルである請
   求項２の酵素的過加水分解系。 ４、Ｘが少くとも１個の炭素原子と少くとも１個の官能
   基を含む請求項２の酵素的過加水分解系。 ５、（ｂ）の基質を本質的に次の構造からなる基質群か
   ら選択する請求項４の酵素的過加水分解系。 （ｉ）次の構造をもつグリセリド、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ＿１＝Ｃ＿１−Ｃ＿１＿２、Ｒ＿２＝Ｃ＿
   １−Ｃ＿１＿２またはＨおよびＲ＿３＝Ｃ＿１−Ｃ＿１
   ＿２またはＨ）、（ｉｉ）次の構造をもつエチレングリ
   コール誘導体、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、ｎ＝１−１０でＲ＿１は上記の通り定義する
   もの）、 および （ｉｉｉ）次の構造をもつプロピレングリコール誘導体
   。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ＿１およびｎは上記の通り定義するもの） ６、基質が通常は、実質的な化学的過加水分解不能であ
   る請求項５の酵素的過加水分解系。 ７、Ｒ＿１＝Ｃ＿６−Ｃ＿１＿０、Ｒ＿２＝Ｃ＿６−Ｃ
   ＿１＿０またはＨおよびＲ＿３＝Ｃ＿６−Ｃ＿１＿０ま
   たはＨである請求項５の酵素的過加水分解系。 ８、基質が通常は水に不溶性であり、基質溶解水溶液が
   乳化剤を含む請求項１の酵素的過加水分解系。 ９、乳化剤が水溶性ポリマー；カチオン性、非イオン性
   、アニオン性もしくは両性イオン性界面活性剤；胆汁酸
   塩；またはこれらのいずれかの混合物である請求項８の
   酵素的過加水分解系。 １０、炭酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、ホウ酸塩または水
   酸化物の緩衝剤をさらに含む請求項８の酵素的過加水分
   解系。 １１、基質がトリグリセリドである請求項１の酵素的過
   加水分解系。 １２、￥シュードモナスピューティダ￥ＴＣＣ５３５５
   ２から単離可能な酵素が次表のアミノ酸配列をもち、ま
   た修飾酵素が実質的に同一のアミノ酸配列をもつが、２
   ０５番目がグルタミン、２０５番目がアスパラギン、２
   ０５番目がアスパラギンおよび２０７番目がスレオニン
   、１２７番目がセリンおよび２０５番目がアスパラギン
   、１２７番目がセリンおよび２０５番目がスレオニン、
   １２７番目がスレオニンおよび２０５番目がグルタミン
   、１２７番目がアスパラギンおよび２０７番目がスレオ
   ニン、１２７番目がスレオニンおよび２０５番目がアス
   パラギンまたは１２７番目がアルギニンおよび２０７番
   目がアラニンである請求項１の酵素的ペルヒドロ分解系
   。 【アミノ酸配列があります】 １３、基質がトリオクタメインまたはトリデカメインで
   ある請求項１２の酵素的ペルヒドロ分解系。 １４、基質が少くとも１個のグリセリド部位を含む請求
   項１２の酵素的ペルヒドロ分解系。 １５、グリセリド基質を本質的にジグリセリドおよびト
   リグリセリドからなるグリセリド群から選択する請求項
   １４の酵素的ペルヒドロ分解系。 １６、水溶液と材料とを接触させ、この水溶液に過酸の
   現場生成のための次の成分を含む酵素的過加水分解系を
   混合する段階からなる材料漂白方法。 （ａ）加水分解活性をもっており、 加水分解活性をもち、￥シュードモナスピューテティダ
   ￥ＡＴＣＣ５３５５２から単離可能な酵素に実質的に対
   応するアミノ酸配列をもつているが、次のいずれかの位
   置にある少くとも１個のアミノ酸が異なっている修飾酵
   素、： （ｉ）修飾酵素が結晶状である場合、１２６番目のセリ
   ン、１７６番目のアスパラギン酸または２０６番目のヒ
   スチジンから約１５Ａ以内；（ｉｉ）１２６番目のセリ
   ン、１７６番目のアスパラギン酸または２０６番目のヒ
   スチジンのいずれかの側の１次構造から約６個のアミノ
   酸以内；（ｂ）次の構造をもつ官能基が付加したエステ
   ルである基質、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒは少くとも１個の炭素原子を含む置換基で
   あり、Ｘは官能基であり、この基質は酵素（ａ）により
   加水分解可能である）、および（ｃ）（ａ）および（ｂ
   ）と反応し、上記過酸を生成する過酸化物源。 １７、基質（ｂ）が通常は実質的な化学的過加水分解不
   能である請求項１６の方法。 １８、Ｘが、官能基が付加しているポリオールまたはポ
   リエーテルである請求項１６の方法。 １９、Ｘが少くとも１個の炭素原子および少くとも１個
   の官能基を含む請求項１６の方法。 ２０、基質（ｂ）を本質的に次の物質からなる基質群か
   ら選択する請求項１９の方法： （ｉ）次の構造をもつグリセリド ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ＿１＝Ｃ＿１−Ｃ＿１＿２、Ｒ＿２＝Ｃ＿
   １−Ｃ＿１＿２またはＨおよびＲ＿３＝Ｃ＿１Ｃ＿１＿
   ２またはＨ）、（ｉｉ）次の構造をもつエチレングリコ
   ール誘導体 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、ｎ＝１−１０でＲ１は上記の通り定義する）
   、および （ｉｉｉ）次の構造をもつプロピレングリコール誘導体 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ＿１およびｎは上記の通り定義されるもの
   ） ２１、Ｒ＿２＝Ｃ＿６−Ｃ＿１＿０、Ｒ＿２＝Ｃ＿６−
   Ｃ＿１＿０またはＨおよびＲ＿３＝Ｃ＿６−Ｃ＿１＿０
   またはＨである請求項２０の方法。 ２２、基質が通常は水に不溶性であり、過加水分解系に
   さらに乳化剤が含まれ、￥シュードモナスピューティダ
   ￥ＡＴＣＣ５３５５２から単離可能な酵素が次表のアミ
   ノ酸配列をもち、修飾酵素が実質的に同一のアミノ酸配
   列をもつが、２０５番目がグルタミン、２０５番目がア
   スパラギン、２０５番目がアスパラギンおよび２０７番
   目がスレオニン、１２７番目がセリンおよび２０５番目
   がアスパラギン、１２７番目がセリンおよび２０５番目
   がスレオニン、１２７番目がスレオニンおよび２０５番
   目がグルタミン、１２７番目がアスパラギンおよび２０
   ７番目がスレオニン、１２７番目がスレオニンおよび２
   ０５番目がアスパラギンまたは１２７番目がアルギニン
   および２０７番目がアラニンである請求項１６の方法。 【アミノ酸配列があります】 ２３、乳化剤を本質的に水溶性ポリマー、カチオン性、
   非イオン性、アニオン性、両性イオン性、胆汁酸塩およ
   びこれらのいずれかの混合物からなる乳化剤群から選択
   する請求項２２の方法。 ２４、本質的に炭酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、ホウ酸塩
   および水酸化物からなる緩衝剤群から選択する緩衝剤を
   さらに含む請求項１６の方法。 ２５、基質を本質的にジグリセリドおよびトリグリセリ
   ドからなる基質群から選択する請求項１６の方法。 ２６、乳化剤の非存在下で過加水分解系で達成される過
   酸収量を少くとも維持し、または改善することが可能な
   乳化剤をさらに含む請求項１６の方法。