JPH02223531A - 日本脳炎ワクチンの製造法 - Google Patents
日本脳炎ワクチンの製造法Info
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- JPH02223531A JPH02223531A JP29144389A JP29144389A JPH02223531A JP H02223531 A JPH02223531 A JP H02223531A JP 29144389 A JP29144389 A JP 29144389A JP 29144389 A JP29144389 A JP 29144389A JP H02223531 A JPH02223531 A JP H02223531A
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は日本脳炎ワクチンおよびその製造法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）従来
、日本脳炎ウィルスのホルマリン処理による不活化後の
精製には密度勾配遠心法が用いられてきたが、不活化処
理中にホルマリンとマウス脳由来の不純蛋白どの凝集が
生じるので、ウィルスと同し粒子の形あるいは同し密度
をもつ不純蛋白を分離することが不可能であった。また
、不活化処理前に生ウィルスを密度勾配遠心した場合に
は、ウィルス活性が著しく低下し、日本脳炎ワクチンの
蛋白質含量光たりの力価を向上させることは困難であっ
た。
、日本脳炎ウィルスのホルマリン処理による不活化後の
精製には密度勾配遠心法が用いられてきたが、不活化処
理中にホルマリンとマウス脳由来の不純蛋白どの凝集が
生じるので、ウィルスと同し粒子の形あるいは同し密度
をもつ不純蛋白を分離することが不可能であった。また
、不活化処理前に生ウィルスを密度勾配遠心した場合に
は、ウィルス活性が著しく低下し、日本脳炎ワクチンの
蛋白質含量光たりの力価を向上させることは困難であっ
た。
方、限外ろ適法は分離・精製・濃縮手段として用いられ
ているが、従来市販されている分画分子量１００万以下
の限外ろ過膜では、蛋白質が吸着するため目づまりしや
すく、日本脳炎ウィルスの精製に使用することはできな
かった。また、最近開発された疎水性樹脂ポリスルフォ
ンを原料とした分画分子量３００万の限外ろ過膜（ＴＳ
３０００、東ソー社製）をセットした限外ろ過機では、
膜表面を高速で液循環させることによって目づまりを防
止しているため、日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤を
精製原料として適用することは可能となったが、該限外
ろ過機をそのまま使用しても日本脳炎ワクチンの蛋白質
含量光たりの力価を向上させることはできなかった。
ているが、従来市販されている分画分子量１００万以下
の限外ろ過膜では、蛋白質が吸着するため目づまりしや
すく、日本脳炎ウィルスの精製に使用することはできな
かった。また、最近開発された疎水性樹脂ポリスルフォ
ンを原料とした分画分子量３００万の限外ろ過膜（ＴＳ
３０００、東ソー社製）をセットした限外ろ過機では、
膜表面を高速で液循環させることによって目づまりを防
止しているため、日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤を
精製原料として適用することは可能となったが、該限外
ろ過機をそのまま使用しても日本脳炎ワクチンの蛋白質
含量光たりの力価を向上させることはできなかった。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤から
得られるウィルス浮遊液を、限外ろ過精製（−次精製）
を行いマウス脳由来の不純蛋白を除去した後、ホルマリ
ンによるウィルス不活化処理に付し、さらに限外ろ過精
製（二次精製）を行うことによって、得られる日本脳炎
ワクチンの蛋白質含量光たりの力価か向上することを見
い出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成した。
得られるウィルス浮遊液を、限外ろ過精製（−次精製）
を行いマウス脳由来の不純蛋白を除去した後、ホルマリ
ンによるウィルス不活化処理に付し、さらに限外ろ過精
製（二次精製）を行うことによって、得られる日本脳炎
ワクチンの蛋白質含量光たりの力価か向上することを見
い出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成した。
すなわち本発明は、
（１）日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤から得られる
ウィルス浮遊液を、安定剤の共存下に、疎水性限外ろ過
膜で回分ろ過し、ウィルス不活化処理後、強アルカリで
処理した限外ろ過膜で回分ろ過することを特徴とする日
本脳炎ワクチンの製造法、および（２）蛋白質含量２０
μｇ／ｍＱ当たりの力価が、１０３以上である日本脳炎
ワクチンを提供するものである。
ウィルス浮遊液を、安定剤の共存下に、疎水性限外ろ過
膜で回分ろ過し、ウィルス不活化処理後、強アルカリで
処理した限外ろ過膜で回分ろ過することを特徴とする日
本脳炎ワクチンの製造法、および（２）蛋白質含量２０
μｇ／ｍＱ当たりの力価が、１０３以上である日本脳炎
ワクチンを提供するものである。
日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤から得られるウィル
ス浮遊液は、公知の方法たとえば日本脳ンにおいても共
存させることが望ましい。
ス浮遊液は、公知の方法たとえば日本脳ンにおいても共
存させることが望ましい。
上記安定剤の添加後限外ろ過精製を行うが、限外ろ過精
製に先立ち、ボアザイズ約０．３〜０．８μｍなかでも
約０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過を行うのが望ま
しい。
製に先立ち、ボアザイズ約０．３〜０．８μｍなかでも
約０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過を行うのが望ま
しい。
本発明で用いられる限外ろ過膜は、分画分子量約１００
〜３００万の限外ろ過膜なかでも疎水性限外ろ過膜が好
ましく、さらに分画分子量約３００万の疎水性ポリスル
フォン樹脂を原料とする限外ろ過膜（例、ＴＳ−３００
０（東ソー社製）なと）が好ましい。上記した限外ろ過
膜のなかでも、牛血清γ−グロブリンの透過阻止率が約
３５〜６２％とりわけ約４５〜６０％の限外ろ過膜を用
いるのが好ましく、さらにウィルス透過量がマウスＬＤ
５ｏで約１０５５１０．０Ｍ以下とりわけ約１０５１０
．０３ｍｆ２以下の限外ろ過膜を用いるのが好ましい。
〜３００万の限外ろ過膜なかでも疎水性限外ろ過膜が好
ましく、さらに分画分子量約３００万の疎水性ポリスル
フォン樹脂を原料とする限外ろ過膜（例、ＴＳ−３００
０（東ソー社製）なと）が好ましい。上記した限外ろ過
膜のなかでも、牛血清γ−グロブリンの透過阻止率が約
３５〜６２％とりわけ約４５〜６０％の限外ろ過膜を用
いるのが好ましく、さらにウィルス透過量がマウスＬＤ
５ｏで約１０５５１０．０Ｍ以下とりわけ約１０５１０
．０３ｍｆ２以下の限外ろ過膜を用いるのが好ましい。
ウィルス不活化処理前の限外ろ過精製（−次精製）で用
いられる限外ろ過膜としては、上記した限外ろ過膜をそ
のまま用いてもよいが、次亜塩素炎ウィルス感染マウス
脳を］ ０．００ Ｏｒｐｍ、８分間ホモジナイズして
得られる脳乳剤を４，０００ｒｐｍ、 １５分間低速遠
心後、硫酸プロクミン１．２ｍｇ／戒を添加し、２時間
後に再び４．ＯＯＯｒｐｍ。
いられる限外ろ過膜としては、上記した限外ろ過膜をそ
のまま用いてもよいが、次亜塩素炎ウィルス感染マウス
脳を］ ０．００ Ｏｒｐｍ、８分間ホモジナイズして
得られる脳乳剤を４，０００ｒｐｍ、 １５分間低速遠
心後、硫酸プロクミン１．２ｍｇ／戒を添加し、２時間
後に再び４．ＯＯＯｒｐｍ。
１５分間低速遠心することにより調製することかできる
。
。
本発明の製造法では、製造工程中の日本脳炎ウィルスの
失活を防止するため、安定剤の共存下に日本脳炎ワクチ
ンの製造を行うが、用いられる安定剤としては、約０．
１〜２．５ｗ／ｖ％好ましくは約０．２〜１．Ｏｗ／ｖ
％の糖アルコール（例、エリＩ・リト−ル、マンニト−
ル、ソルヒト−ル、イノシト−ルなと）、約０．００４
−０．１ｗ／ｖ％好ましくは約０．０］〜０゜０５ｗ／
ｖ％のゼラチンなどがあげられ、なかでも約０．５ｗ／
ｖ％のソルビトールおよび約０．０２ｗ／ｖ％のゼラチ
ンを安定剤として用いるのが好ましい。上記安定剤は、
通常日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤から得られるウ
ィルス浮遊液に添加されるが、以下の工程において共存
させ、また最終生産物である日本脳炎ワタヂ酸ソーダ、
苛性ソーダ、蛋白分解酵素などで再生（前処理）した膜
を用いるのが好ましく、なかでも次亜塩素酸ソーダで再
生（前処理）した膜を用いるのか好ましい。次亜塩素酸
ソーダで再生する場合、有効塩素濃度は約５０〜］００
０ｐｐｍが好ましく、作用時間約０．５〜５時間なかで
も約１時間、２回処理するのが好ましい。
失活を防止するため、安定剤の共存下に日本脳炎ワクチ
ンの製造を行うが、用いられる安定剤としては、約０．
１〜２．５ｗ／ｖ％好ましくは約０．２〜１．Ｏｗ／ｖ
％の糖アルコール（例、エリＩ・リト−ル、マンニト−
ル、ソルヒト−ル、イノシト−ルなと）、約０．００４
−０．１ｗ／ｖ％好ましくは約０．０］〜０゜０５ｗ／
ｖ％のゼラチンなどがあげられ、なかでも約０．５ｗ／
ｖ％のソルビトールおよび約０．０２ｗ／ｖ％のゼラチ
ンを安定剤として用いるのが好ましい。上記安定剤は、
通常日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤から得られるウ
ィルス浮遊液に添加されるが、以下の工程において共存
させ、また最終生産物である日本脳炎ワタヂ酸ソーダ、
苛性ソーダ、蛋白分解酵素などで再生（前処理）した膜
を用いるのが好ましく、なかでも次亜塩素酸ソーダで再
生（前処理）した膜を用いるのか好ましい。次亜塩素酸
ソーダで再生する場合、有効塩素濃度は約５０〜］００
０ｐｐｍが好ましく、作用時間約０．５〜５時間なかで
も約１時間、２回処理するのが好ましい。
一次精製における回分回数は１〜５回なかでも２〜３回
が好ましく、例えば、膜面積３ ｍ２の限外ろ過膜を利
用した場合、流速は約ｌＯ〜２５α／分なかでも約１６
Ｑ／分が好ましい。
が好ましく、例えば、膜面積３ ｍ２の限外ろ過膜を利
用した場合、流速は約ｌＯ〜２５α／分なかでも約１６
Ｑ／分が好ましい。
次精製では精製しすぎるとワクチンの力価が低下するの
で、ウィルス濃度をワクチンにおける濃度の約１〜３倍
なかでも約１．５倍とするのが好ましく、また−吹精製
後の蛋白量が高すぎるとウィルス不活化処理後の限外ろ
過膜精製への適用が困難となるため、蛋白量を約５００
〜２０００μｇ／ｍｌなかでも約１０００μｇ／−とす
るのが好ましい。
で、ウィルス濃度をワクチンにおける濃度の約１〜３倍
なかでも約１．５倍とするのが好ましく、また−吹精製
後の蛋白量が高すぎるとウィルス不活化処理後の限外ろ
過膜精製への適用が困難となるため、蛋白量を約５００
〜２０００μｇ／ｍｌなかでも約１０００μｇ／−とす
るのが好ましい。
吹精製後ウイルス不活化処理を行うが、ウイルス不活化
処理に先立ち、ポアサイズ約０．２〜０．４５μｍなか
でも約０．３ｚ１ｍのフィルターで除去ろ過を行うのが
望ましい。
処理に先立ち、ポアサイズ約０．２〜０．４５μｍなか
でも約０．３ｚ１ｍのフィルターで除去ろ過を行うのが
望ましい。
ウィルス不活化処理としては、例えは約０．０３−０
、２ ｖ／ｖ％好ましくは約０．０２−０．ｌｖ／ｖ％
のポルマリンを添加し、４°Ｃにて１４日間以上かけて
不活化するなとの公知の方法かあげられる。
、２ ｖ／ｖ％好ましくは約０．０２−０．ｌｖ／ｖ％
のポルマリンを添加し、４°Ｃにて１４日間以上かけて
不活化するなとの公知の方法かあげられる。
ウィルス不活化処理後の限外ろ過積製（二次精製）て用
いられる限外ろ過膜としては、上記した限外ろ過膜を強
アルカリ（例、苛性ソーダ、水酸化カリウムなど）好ま
しくは苛性ソータで処理した膜を用いるのが好ましい。
いられる限外ろ過膜としては、上記した限外ろ過膜を強
アルカリ（例、苛性ソーダ、水酸化カリウムなど）好ま
しくは苛性ソータで処理した膜を用いるのが好ましい。
苛性ソーダで処理する場合、濃度は約０．０５〜５．０
ｗ／ｖ％なかでも約１、ｏｗ／ｖ％が好ましく、作用時
間約０，５〜２５時間なかでも１時間、２回処理するの
が好ましい。
ｗ／ｖ％なかでも約１、ｏｗ／ｖ％が好ましく、作用時
間約０，５〜２５時間なかでも１時間、２回処理するの
が好ましい。
さらに二次精製で用いる膜は、牛血清γ−グロブリンの
透過阻止率か約３０％以下としておくことか望ましく、
その目的には一次精製で用いた限外ろ過膜をそのまま上
記強アルカリ処理に付して用いるが、あるいは正常マウ
ス脳を日本脳炎ウィル本発明の日本脳炎ワクチンの製造
法によれば、蛋白質含量２０μｇ／戒当たりの力価（ブ
ラック中和抗体価）が１０３以上好ましくは１０００以
上の高純度で熱安定性に優れた高品質の日本脳炎ワクチ
ンを、高収率で得ることができる。
透過阻止率か約３０％以下としておくことか望ましく、
その目的には一次精製で用いた限外ろ過膜をそのまま上
記強アルカリ処理に付して用いるが、あるいは正常マウ
ス脳を日本脳炎ウィル本発明の日本脳炎ワクチンの製造
法によれば、蛋白質含量２０μｇ／戒当たりの力価（ブ
ラック中和抗体価）が１０３以上好ましくは１０００以
上の高純度で熱安定性に優れた高品質の日本脳炎ワクチ
ンを、高収率で得ることができる。
（実施例）
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものでないことは言う
までもない。
が、本発明はこれらに限定されるものでないことは言う
までもない。
実施例１
（１）ウィルス浮遊液の調製
日本脳炎感染マウス脳に５倍量のＭ／１５０１Ｊン酸塩
緩衝塩化ナトリウム液（１）Ｈ８，０）を加え、１０．
０００ｒｐｍ、８分間ホモジナイズして得られる脳乳剤
を４，０００ ｒｐｍ、１５分間低速遠心後、上清に１
．２ｍｇ／ｍｉ２の硫酸プロタミンを添加し、２時間後
に４．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間低速遠心して」二清より
ウィルス浮遊液を得た（蛋白含量：約３３００μｇ／顧
）。
緩衝塩化ナトリウム液（１）Ｈ８，０）を加え、１０．
０００ｒｐｍ、８分間ホモジナイズして得られる脳乳剤
を４，０００ ｒｐｍ、１５分間低速遠心後、上清に１
．２ｍｇ／ｍｉ２の硫酸プロタミンを添加し、２時間後
に４．ＯＯＯｒｐｍ、１５分間低速遠心して」二清より
ウィルス浮遊液を得た（蛋白含量：約３３００μｇ／顧
）。
ス感染マウス脳と同様に処理して得られる正常マウス脳
プロタミン精製材料を一次精製で用いる限外ろ過膜表面
に吸着させた後、上記強アルカリ処理に付して用いるの
がよい。
プロタミン精製材料を一次精製で用いる限外ろ過膜表面
に吸着させた後、上記強アルカリ処理に付して用いるの
がよい。
二次精製における回分回数は３〜８回なかでも５〜６回
が好ましく、例えば、膜面積３ ｍ２の限外ろ過機を利
用した場合、流速は約１５〜３０ａ／分なかでも約２２
Ｑ／分が好ましい。
が好ましく、例えば、膜面積３ ｍ２の限外ろ過機を利
用した場合、流速は約１５〜３０ａ／分なかでも約２２
Ｑ／分が好ましい。
二次精製終了後のウィルス濃度をワクチンにおける濃度
の約５〜１０倍なかでも約７倍とするのが好ましく、蛋
白量を約７０〜３００μｇ／顧なかでも約１４０μｇ／
ｕｎとするのが好ましい。
の約５〜１０倍なかでも約７倍とするのが好ましく、蛋
白量を約７０〜３００μｇ／顧なかでも約１４０μｇ／
ｕｎとするのが好ましい。
かくして得られる日本脳炎ワクチン原液は、例えばリン
酸塩緩衝塩化すｌ・リウム液等で希釈して最終バルクと
するが、ポアサイズ約０．３〜０．８７７１１１なかで
も約０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過することが望
ましく、さらに適当な安定剤、保存剤（例、０．０１ｗ
／ｖ％チメロザールなと）などを加えてもよく、また必
要であれば分注、凍結乾燥してもよい。
酸塩緩衝塩化すｌ・リウム液等で希釈して最終バルクと
するが、ポアサイズ約０．３〜０．８７７１１１なかで
も約０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過することが望
ましく、さらに適当な安定剤、保存剤（例、０．０１ｗ
／ｖ％チメロザールなと）などを加えてもよく、また必
要であれば分注、凍結乾燥してもよい。
■限外ろ過膜の再生
疎水性ポリスルフォン樹脂限外ろ過膜Ｔ、Ｓ３０００（
東ソー社製；分画分子量＝３００万）から、牛血清γ−
グロブリン透過阻止率か４５〜６０％。
東ソー社製；分画分子量＝３００万）から、牛血清γ−
グロブリン透過阻止率か４５〜６０％。
ウィルス透過量がマウスＬＤ５ｏで１０５１０．０３舖
以下の膜を選択し、膜面積を３ｍ２（Ｉ ＯＸ ｌ ０
ｃｍ２の膜を３００枚使用）として限外ろ過機にセツト
シＩこ。
以下の膜を選択し、膜面積を３ｍ２（Ｉ ＯＸ ｌ ０
ｃｍ２の膜を３００枚使用）として限外ろ過機にセツト
シＩこ。
限外ろ過機の貯槽タンク内および配管内の泡あるいは蛋
白の凝集塊を完全に取り除くために蒸留水の循環運転お
よび排出を５回以上繰り返し行なった。有効塩素濃度５
Ｑ Ｏｐｐｍの次亜塩素酸ソダ液を限外ろ過機の貯槽
タンク内に満たし、１時間、２回繰り返し循環運転を行
なった後、限外ろ過板系内の次亜塩素酸ソーダを完全に
取り除くため、限外ろ過機の貯槽に蒸留水を満たし、循
環運転および排出を５回以上繰り返し行なった。さらに
消毒のため、１■／ｖ％のホルマリン液を限外ろ過機の
貯槽に満だ１１０分間、２回繰り返し循環運転を行ない
、密閉し消毒した。約１２時間以上消毒した後、系内に
充填されたホルマリンを取り除くため、限外ろ過機の貯
槽に満たした滅菌蒸留水で循環運転および排出を５回以
上繰り返して系内を洗浄踵以下の精製に用いた。
白の凝集塊を完全に取り除くために蒸留水の循環運転お
よび排出を５回以上繰り返し行なった。有効塩素濃度５
Ｑ Ｏｐｐｍの次亜塩素酸ソダ液を限外ろ過機の貯槽
タンク内に満たし、１時間、２回繰り返し循環運転を行
なった後、限外ろ過板系内の次亜塩素酸ソーダを完全に
取り除くため、限外ろ過機の貯槽に蒸留水を満たし、循
環運転および排出を５回以上繰り返し行なった。さらに
消毒のため、１■／ｖ％のホルマリン液を限外ろ過機の
貯槽に満だ１１０分間、２回繰り返し循環運転を行ない
、密閉し消毒した。約１２時間以上消毒した後、系内に
充填されたホルマリンを取り除くため、限外ろ過機の貯
槽に満たした滅菌蒸留水で循環運転および排出を５回以
上繰り返して系内を洗浄踵以下の精製に用いた。
■限外ろ過精製
実施例１”−（１）で得たウィルス浮遊液に、ゼラチン
およびＤ−ソルビトールを最終濃度がそれぞれ０．０２
ｗ／ｖ％および０．５ｗ／ｖ％となるように添加し、ポ
アサイズ０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過を行ない
、ろ液２０Ｉ２を上記■で調整した限外ろ過機にて流速
約１６Ｑ／分で循環運転を開始した。透過液側に１５Ｑ
を排出したところで限外ろ過機の循環運転を停止し、循
環内液５αに対して２倍量の希釈液（０，０２ｗ／ｖ％
ゼラチンおよび０．５Ｗ／Ｖ％Ｄ−ソルビト−ルを含有
するＭ／３０リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液、ｐＨ７，
１）ｌｃＮ２を加え、循環運転を開始した。透過液側に
ｌＯＱを排出したところで循環運転を停止し、循環内液
に上記希釈液を添加して蛋白含量を約１０００μｇ／−
とし、ポアサイズ０．３μｍのフ＋１− に蒸留水を満たし、循環運転および排出を５回以上繰り
返し行なった。さらに消毒のため、ｌｖ／ｖ％のホルマ
リン液を限外ろ過機の貯槽タンク内に満たし、１０分間
、２回繰り返し循環運転を行ない、密閉し消毒した。約
１２時間以上消毒した後、系内に充填されたホルマリン
を取り除くため、限外ろ過機の貯槽に満たした滅菌蒸留
水で循環運転および排出を５回以上繰り返して系内を洗
浄し、以下の精製に用いた。
およびＤ−ソルビトールを最終濃度がそれぞれ０．０２
ｗ／ｖ％および０．５ｗ／ｖ％となるように添加し、ポ
アサイズ０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過を行ない
、ろ液２０Ｉ２を上記■で調整した限外ろ過機にて流速
約１６Ｑ／分で循環運転を開始した。透過液側に１５Ｑ
を排出したところで限外ろ過機の循環運転を停止し、循
環内液５αに対して２倍量の希釈液（０，０２ｗ／ｖ％
ゼラチンおよび０．５Ｗ／Ｖ％Ｄ−ソルビト−ルを含有
するＭ／３０リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液、ｐＨ７，
１）ｌｃＮ２を加え、循環運転を開始した。透過液側に
ｌＯＱを排出したところで循環運転を停止し、循環内液
に上記希釈液を添加して蛋白含量を約１０００μｇ／−
とし、ポアサイズ０．３μｍのフ＋１− に蒸留水を満たし、循環運転および排出を５回以上繰り
返し行なった。さらに消毒のため、ｌｖ／ｖ％のホルマ
リン液を限外ろ過機の貯槽タンク内に満たし、１０分間
、２回繰り返し循環運転を行ない、密閉し消毒した。約
１２時間以上消毒した後、系内に充填されたホルマリン
を取り除くため、限外ろ過機の貯槽に満たした滅菌蒸留
水で循環運転および排出を５回以上繰り返して系内を洗
浄し、以下の精製に用いた。
■限外ろ過精製
実施例１−（３）で得た不活化処理後のウィルス浮遊液
６０１２を、上記■で調整した限外ろ過機にて流速２２
Ｑ／分で循環運転を開始した。透過液側に５５αを排出
したところで循環運転を停止し、循環内液５Ｑに対して
４倍量の希釈液（０，０２Ｗ／Ｖ％ゼラチンおよび０．
５ｗ／ｖ％Ｄ−ソルビトールを含有するＭ／１００リン
酸塩緩衝塩化す［・リウム液、ｐＨ７，１）２０αを加
え、循環運転を開始した。透過液側に２００．を排出し
たところで循環運転を停止し、以下希釈液２Ｏｃｔ添加
、循環運転、透イルターで除菌ろ過した。
６０１２を、上記■で調整した限外ろ過機にて流速２２
Ｑ／分で循環運転を開始した。透過液側に５５αを排出
したところで循環運転を停止し、循環内液５Ｑに対して
４倍量の希釈液（０，０２Ｗ／Ｖ％ゼラチンおよび０．
５ｗ／ｖ％Ｄ−ソルビトールを含有するＭ／１００リン
酸塩緩衝塩化す［・リウム液、ｐＨ７，１）２０αを加
え、循環運転を開始した。透過液側に２００．を排出し
たところで循環運転を停止し、以下希釈液２Ｏｃｔ添加
、循環運転、透イルターで除菌ろ過した。
（３）ウィルス不活化処理
実施例１−（２）で得たろ液に、ホルマリンを最終濃度
が０．１ｖ／ｖ％となるように添加し、４°Ｃにて１４
日間以上かけてウィルスを不活化処理しＩこ。
が０．１ｖ／ｖ％となるように添加し、４°Ｃにて１４
日間以上かけてウィルスを不活化処理しＩこ。
（４）限外ろ過精製（二次精製）
■限外ろ過膜の再生
実施例１−（２）−■で調整した限外ろ過機を用い、日
本脳炎ウィルスに感染していない正常マウス脳を実施例
１−（１）と同様に処理して得られる正常マウス脳プロ
タミン精製材料を、実施例１−（２）−■と同様に処理
して限外ろ過精製を行なった。限外ろ過精製を行なった
限外ろ過機の貯槽および配管内の泡や蛋白の凝集塊を取
り除くために蒸留水の循環運転および排出を５回以上繰
り返し行なった。Ｉｗ／ｖ％の苛性ソーダ液を限外ろ過
機の貯槽内に満たし、１時間、２回繰り返し循環運転を
行なった後、限外ろ過機系内の苛性ソーダを完全に取り
除くため、限外ろ過機の貯槽タンク内１２〜 過液２０Ｉ２排出、停止の操作を３〜４回繰り返し、回
分ろ過を計５〜６回行なった後、循環内液に上記希釈液
を添加して約１３１２とし蛋白含量を約１４０μｇ／ｒ
ｎＱとした。
本脳炎ウィルスに感染していない正常マウス脳を実施例
１−（１）と同様に処理して得られる正常マウス脳プロ
タミン精製材料を、実施例１−（２）−■と同様に処理
して限外ろ過精製を行なった。限外ろ過精製を行なった
限外ろ過機の貯槽および配管内の泡や蛋白の凝集塊を取
り除くために蒸留水の循環運転および排出を５回以上繰
り返し行なった。Ｉｗ／ｖ％の苛性ソーダ液を限外ろ過
機の貯槽内に満たし、１時間、２回繰り返し循環運転を
行なった後、限外ろ過機系内の苛性ソーダを完全に取り
除くため、限外ろ過機の貯槽タンク内１２〜 過液２０Ｉ２排出、停止の操作を３〜４回繰り返し、回
分ろ過を計５〜６回行なった後、循環内液に上記希釈液
を添加して約１３１２とし蛋白含量を約１４０μｇ／ｒ
ｎＱとした。
チメロザールおよびＴｗｅｅｎ ８０を、最終濃度がそ
れぞれ０．Ｏ１ｗ／ｖ％および０．０５ｖ／ｖ％となる
よう添加した後、ポアサイズ０．４５μｍのフィルター
で除菌ろ過して日本脳炎ワクチン原液を得た。
れぞれ０．Ｏ１ｗ／ｖ％および０．０５ｖ／ｖ％となる
よう添加した後、ポアサイズ０．４５μｍのフィルター
で除菌ろ過して日本脳炎ワクチン原液を得た。
（５）ワクチンの調製
実施例］−（４）で得た日本脳炎ワクチン原液を０．０
２ｗ／ｖ％ゼラチンおよび０．５ｗ／ｖ％Ｄ−ソルビト
ールを含有するＭ／１００リン酸塩緩衝塩化ナトリウム
液で希釈し、更にチメロサールおよびＴｗｅｅｎ ８０
を最終濃度がそれぞれ０．０１ｗ／ｖ％および０．０２
５Ｖ／Ｖ％となるように添加し、日本脳炎ワクチンを調
製した。
２ｗ／ｖ％ゼラチンおよび０．５ｗ／ｖ％Ｄ−ソルビト
ールを含有するＭ／１００リン酸塩緩衝塩化ナトリウム
液で希釈し、更にチメロサールおよびＴｗｅｅｎ ８０
を最終濃度がそれぞれ０．０１ｗ／ｖ％および０．０２
５Ｖ／Ｖ％となるように添加し、日本脳炎ワクチンを調
製した。
得られた日本脳炎ワクチンは、蛋白質含量１７μｇ／Ｍ
ｔ当たりの力価（ブラック中和抗体価）が１０３６であ
った。
ｔ当たりの力価（ブラック中和抗体価）が１０３６であ
った。
発明の効果
本発明の製造法によれば、蛋白質含量２０ｐｇ／ｍＱ当
たりの力価が１０３以上の高純度で熱安定性に優れた高
品質の日本脳炎ワクチンを、高収率で製造することがで
きる。
たりの力価が１０３以上の高純度で熱安定性に優れた高
品質の日本脳炎ワクチンを、高収率で製造することがで
きる。
代理人 弁理士 岩 １） 弘
（ほか４名）
Claims (2)
- （１）日本脳炎ウィルス感染マウス脳乳剤から得られる
ウィルス浮遊液を、安定剤の共存下に、疎水性限外ろ過
膜で回分ろ過し、ウィルス不活化処理後、強アルカリで
処理した限外ろ過膜で回分ろ過することを特徴とする日
本脳炎ワクチンの製造法。 - （２）蛋白質含量２０μｇ／ｍｌ当たりの力価が、１０
＾３以上である日本脳炎ワクチン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1291443A JPH085803B2 (ja) | 1988-11-10 | 1989-11-09 | 日本脳炎ワクチンの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28556488 | 1988-11-10 | ||
| JP63-285564 | 1988-11-10 | ||
| JP1291443A JPH085803B2 (ja) | 1988-11-10 | 1989-11-09 | 日本脳炎ワクチンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02223531A true JPH02223531A (ja) | 1990-09-05 |
| JPH085803B2 JPH085803B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=26555940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1291443A Expired - Lifetime JPH085803B2 (ja) | 1988-11-10 | 1989-11-09 | 日本脳炎ワクチンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH085803B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011762A1 (en) * | 1997-08-28 | 1999-03-11 | Cheil Jedang Corporation | An attenuated japanese encephalitis virus adapted to vero cell and a japanese encephalitis vaccine |
| JP2001253833A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-18 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン |
| WO2005014803A1 (ja) * | 2003-08-07 | 2005-02-17 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 西ナイルウイルスワクチン |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5048118A (ja) * | 1973-08-29 | 1975-04-30 |
-
1989
- 1989-11-09 JP JP1291443A patent/JPH085803B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5048118A (ja) * | 1973-08-29 | 1975-04-30 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011762A1 (en) * | 1997-08-28 | 1999-03-11 | Cheil Jedang Corporation | An attenuated japanese encephalitis virus adapted to vero cell and a japanese encephalitis vaccine |
| EP1604685A3 (en) * | 1997-08-28 | 2006-07-05 | Cheil Jedang Corporation | An attenuated japanese encephalitis virus |
| JP2001253833A (ja) * | 2000-03-10 | 2001-09-18 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン |
| WO2005014803A1 (ja) * | 2003-08-07 | 2005-02-17 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 西ナイルウイルスワクチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH085803B2 (ja) | 1996-01-24 |
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