JPH02222836A - 特異的に結合する物質及び対応する結合性物質の反応生成物の、増大された視覚化のための方法及びそのためのテストキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、特異的に結合する物雪及び対応する結合性物
質との間の反応の成分をテストサンプルにおいて検出及
び／または測定する方法であって、そのような成分及び
少なくとも一つのラベルされた成分の相互の反応性を用
い、任意的に遊離の及び結合されたラベルされた成分を
分離した後に、テストサンプルまたは分離後に得られた
画分の一つ中の該ラベルを検出するところの方法に関す
る。

〔従来の技術〕

そのような方法は最近の多数の刊行物、例えば金属また
は金属化合物のゾル粒子、特に金及び銀のゾル粒子を含
むラベルされた成分のラベルとしての使用を開示した欧
州特許出願ＥＰ−Ａ−０００７６５４号公報〔アクゾ　
エヌ　　ブイ（Ａｋｚｏ　Ｎ、　Ｖ、）、　１９８０年
２月６日発刊〕およびＥＰ−へ−０１５８７４６号公報
〔ヤンセン　ファルマシニーティカ　エヌ　ブイ（Ｊａ
ｎｓｓｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ　Ｎ、　　Ｖ
、）、　　１９８５年１０月２３日発刊〕より知られて
いる。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−００３２２７０号公報（
アクゾ　エヌ　ブイ、　１９８１年７月２２日発刊）中
には、疎水性染料または顔料のゾル粒子の、ラベルとし
ての有用性が開示されている。非金属元素、例えばセレ
ン（ｓｅ）、テルル（Ｔｅ）及びイオウ（Ｓ）のゾル粒
子の、ラベルとしての使用が、欧州特許出願ＥＰ−へ−
０，２９８３６８号公報〔アボット研究所（Ａｂｂｏｔ
ｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。

１９８９年１月１１日発刊〕及びオランダ国特許出願Ｎ
Ｌ−Ａ−８７，０２７６９号公報及び欧州特許出願へ一
０３２１００８号公報〔ホランド　バイオチクノロ　ジ
ビー　ブイ（Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｖ　Ｂ、　Ｖ、）、エイチ　ビー　ティー（Ｈ，Ｂ、
　Ｔ、）の名で、１９８９年６月２１日発刊〕の対応す
る部分に開示されている。

上記の欧州特許出願Ａ−０１５８７４６号公報において
、固定化されたマトリックス、例えばデイツプスティッ
ク　アッセイ（ｄｉｐｓｔｉｃｋ　ａｓｓａｙ）中で使
用されるニトロセルロースストリップの表面に結合した
コロイド金属粒子の検出は、物理的現像（ｐｈｙｓｌｃ
ａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の結果としてそれらの
可視性を増大させることにより、改善することができる
ことが示唆されている。その物理的現像は、銀含有化合
物（このものは金属銀へと還元され得る）、例えば乳酸
銀または硝酸銀を含む物理的現像剤の施与により得られ
る。その物理的現像剤はさらに、還元剤、緩衝剤及び安
定化剤を含有する〔スウィンバーン（Ｓν１ｎｂｕｒｎ
ｅ）、イムノサイトケミストリー　（Ｉｍｍｕｎｏｃｙ
ｔｏｃｂｅａｉｉｓｔｒｙ＞、　１９８７年。

３０〜３７ページを見よ〕。反応は初めに、還元を触媒
する金属粒子の表面で起こり、次に、引き続いてこれら
シード上で自己触媒的となる。金属銀の蓄積により、黒
く、高いコントラストを成すシグナル（ｓｉｇｎａｌ）
が生じる。それより、感度の相当な増大が生じる。

驚くべきことに、そのような物理的現像は、コロイド金
属粒子の改善された視覚化を生じるための銀の使用に限
定されず、コロイド非金属粒子、例えばセレン（Ｓ　ｅ
）元素、テルル（Ｔｅ）元素のゾル粒子の改善された視
覚化のためにも用いることができ、また銀化合物以外の
金属含有化合物についてもまた行い得ることが今、見出
された。

例えば免疫化学的反応（例えばデイツプスティックアッ
セイにおけるもの）のためのマーカー系（ｍａｒｋｅｒ
　ｓｙｓｔｅｍ）としてのゾル粒子の有用性は、一般に
良好な可視性、または、より一般的に言って、ゾル粒子
の良好な検出性を必要とする。

ある種のゾル粒子は、着色されないか、または僅かに着
色されるに過ぎないので、この点において極めて満足な
ものではない。その有用性が高められた可視性によって
改善されるであろうところのゾル粒子の例は、イオウ元
素のゾルからの粒子、及びセレン元素のゾルからの粒子
である。本発明はこの、着色されていない、または僅か
に着色された、非金属元素のゾル粒子の上記問題の解決
を提供することにより、需要を満足する。しかし、それ
自身の強い色を有するゾル粒子についてもまた、本発明
の適用により、高められたコントラスト及び改善された
感度を得ることができる。

本発明は、特異的に結合する＃ＩＡ買＜例えばタンパク
質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリサッカライド）及び対応する
結合性物質との間の反応の成分をテストサンプルにおい
て検出及び／または測定する方法であって、そのような
成分及び少な（とも一つのラベルされた成分の相互の反
応性を用い、任意的に遊離の及び結合したラベルされた
成分を分離した後に、テストサンプルまたは分離の後に
得られた画分の一つ中の該ラベルを検出するところの方
法において、前記のラベルされた成分は、非金属元素の
ゾル粒子でラベルされ、ラベルの検出は金属含有化合物
を用いたシグナルの物理的現像の後に行われる。

“非金属元素のゾル粒子“と言う言葉は、その分散物（
好ましくは水性分散物、しかし、アルコール性分散物及
び他の有機溶媒中の分散物を除外するものではない）よ
り得られる粒子を指し、該粒子は非金属元素から実質的
に成るが、しかしゾル粒子が完全に均一でなく、非金属
元素の少量を化合物の形で含むこと、即ちたとえばセレ
ンのゾル粒子が少量の酸化セレンを含み、しかし、セレ
ンの殆どは元素の形で存在することを排除するものでは
ない。好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少
なくとも７０％、特に好ましくは実質的にセレンの全て
が元素の形で存在するであろう。

同じことは他の非金属元素、例えばイオウ、テルル等の
ゾル粒子にも当てはまる。

勿論、“非金属元素のゾル粒子°°と言う語には、当該
元素がゾルの形で存在することのできる元素であると言
うことが本来備わっている。水素、ヘリウム、酸素等の
ような化学元素はこの固有の要件を満足せず、それ故本
分中で用いられる“元素”と言う語には包含されない。

しかしながら、本発明は特に、例えばセレン、イオウ、
テルル、ヒ素及びリンのゾル粒子に関する。最も好まし
くは、本発明は、セレンまたはテルルのゾル粒子をラベ
ルとして使用する方法に関する。

一般にどのような金属含有化合物、特にどのような金属
塩をもシグナルの物理的現像のために使用することがで
きるが、銀塩、特に乳酸銀または硝酸銀をそのために用
いるのが好ましい。物理的現像剤中での使用に特に適し
ていることが知られている他の金属含有化合物の例は、
水銀塩、例えば塩化水銀、及び銅塩、例えば硫酸銅であ
る。

本発明はさらに、特異的に結合する物質及び対応する結
合性物質の間の反応の成分のテストサンプルにおける検
出及び／または測定のためのテストキットであって、そ
のような成分及び少なくとも一つのラベルされた成分の
相互の反応性を用い、任意的に遊離の及び結合したラベ
ルされた成分を分離した後に、テストサンプルまたは分
離の後に得られた画分の一つ中の該ラベルを検出すると
ころのテストキットにおいて、該テストキットが非金属
元素のゾル粒子でラベルされたところのラベルされた成
分を含み、さらに、シグナルの物理的現像剤くこのもの
は金属含有化合物を含む）を含むところのキットを提供
する。

本発明は、その好ましい実施態様である以下の実施例に
より、より詳細に説明されるであろう。

しかしながら、該実施例は本発明の範囲を限定する意図
のものではなく、単に本発明の例示を提供するに過ぎな
いことに注意すべきである。

〔実　施　例〕

実施例　１ ０．２０ｇの酸化セレン〔ＳｅＯ２、ベーカーケミカル
社（Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）
　）を９９５ｍ１のイオン交換水中に、室温で溶解した
。その溶液を磁気棒で連続的に攪拌した。３分間の攪拌
の後、新規に調製した、０．２５ｓｒのＮ　ａ　Ｂ　Ｈ
、ｉ　　Ｃケメタール社（Ｃｈｅｍｅｔａｌ）　）を５
ｍｌのイオン交換水に溶かした溶液を、激しい攪拌の下
迅速に加えた。Ｈ２を放出しながら、元の無色透明な反
応混合物は、３分間後に透明で濃いオレンジ／赤色とな
った。

その時点以降では、それ以上の色の増加は認められなか
った。

該セレンゾルを精製し、さらに透析によって濃縮した。

該粒子は球状の形及び３５±４ｎｍの平均直径を有した
。そのゾルは安定で、数日間透明なままであった。

該コロイドセレン粒子を、次にアンチ−ｂ−ガラクトシ
ダーゼ免疫グロブリンＧ　（ａｎｔｉ−ｂ−ｇａｌａｃ
ｔｏｓｉｄａｓｅ　ＩｇＧ）　（腹水より）でコートし
た。

０、０１　Ｍのに２Ｃ０３を用いて、該セレンゾル（５
０ｍｌ）をｐＨ７，５に調節した。次に８０ｍ１のアン
チ−ｂ−ガラクトシダーゼ免疫グロブリンＧ（腹水より
）を加えた。カップリングは、室温で１０分間起こった
。該混合物を次に、４℃で１０分間、４６００　ｘｇに
て遠心分離した。ルーズなペレット（ｌｏｏｓｅｐｅｌ
ｌｅｔ）上の上澄みを吸引して除去し、該ペレットを５
ｍ）ＩのＮａＣｌ１　　（元の体積の１／２０部）中に
懸濁させた。追加の安定化剤は懸濁液に添加しなかった
。このようにして得られたアンチ−ｂ−ガラクトシダー
ゼ免疫グロブリンＧ（腹水）−セレンプローブを、検出
目的のために使用した。

一連の濃度の、コート　アンチマウス　ポリクローナル
免疫グロブリンＧ（１２８０ｎｇ〜２．５Ｄ（］）を、
］ニドｏ−ｔ＝ルｏ−ス試験片ｔｅｓｔ　Ｓｔｉ’ｉｐ
）　（１）上にスポットした。乾燥した該試験片を、コ
ートされたセレン粒子と共にインキュベートし、数分間
後に最低の可視１ｇＧスポットを測定しな。最低の可視
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）スポットは、８０Ｄ（Ｊで
あった。

ヤンセン　ファルマシニーテイ力より市販される銀強調
キット（ｓｉｌｖｅｒ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｋｉ
ｔ）を用い、本発明に従う物理的現像法を適用すると、
最低の可視スポットは２０Ｄｌｊであつな。

注（１）；試験片は、０．４５ｍｍの孔径を有し、１．
２ｃｎＸ５．５ｃｍの大きさに切断されたニトロセルロ
ース紙より作られた。試験片に施与されたスポットはｌ
　ｍｌの体積を有した。一連の濃度をスポットした後、
その試験片を３７℃で２０分間乾燥しな。その後直ちに
該試験片の露出した部分（すなわち覆われていなかった
部分）を、リン酸Ｍ街生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ：　ＰＢＳ）中の３
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で、３７℃にてブ
ロック（ｂｌｏｃｋ）　した。２０分後、該試験片は３
７℃にて乾燥され、そうして使用可能となった。

注（２）：該試験片は、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のプロー
ブの１：５０希釈物中で、最大２時間インキュベートさ
れた。インキュベーションの間、該試験片及びインキュ
ベーション混合物を振とう機上でポリプロピレンチュー
ブ中で揺り動かした。

プローブの感度は、最適化されていない系においてスポ
ットされた（固定化された）タンパク質の視覚的に検出
可能な最低濃度によって決定された。

実施例　２ ８０■のテルル酸（ＨＴ　ｅ　Ｏｅ　、メルク社（Ｈｅ
ｒｃｋ）　：）を１ρのイオン交換水に溶解した。室温
で５分間攪拌した後、新規に調製した、０．２０　ｇの
Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４（ケミタール）を２ｍｌのイオン交換
水に溶かした溶液を、激しい攪拌の下、迅速に添加しな
。１分後、透明な紫／茶色のゾルが生じ、これは３分後
に光学密度が安定であった。得られた安定なテルルゾル
を精製し、さらに透析によって濃縮した。

該コロイドテルル粒子を、次にタンパク質Ａ（ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　Ａ）でコートしな。０．０１ＭのＫ　２　ＣＯ
３を用い、該テルルゾル（５０ｍｌ）をｐＨ６，１に調
節した。次に３３０■のタンパク質Ａを加えた。カップ
リングは室温で１０分間起こった。該混合物を次に、４
°Ｃで１０分間、１８０００ｘ　ｇにて遠心分離した。

ルーズなベレット上の」二澄みを吸引によって除去し、
該ベレットを５ｍＭのＮａＣ１（元の体積のｌ／２０部
）中に懸濁させた。追加的な安定化剤は懸濁液中に添加
しなかった。こうして得られたタンパク質Ａ−テルルプ
ローブを、検出目的に使用した。

一連の濃度のラビットＩ　ｇ　Ｇ　（１２８０ｎｇ〜２
．５ｐｇ）をニトロセルロース試験片上にスポットした
。乾燥した試験ストリップを、コートされたテルル粒子
と共にインキュベートし、数分後に最低の可視スポット
を測定した。最低の可視スポットは１．５ｎｇであった
。

本発明に従う物理的現像のために、ヤンセンファルマシ
ニーティカより市販される銀強調キットを使用すると、
最低の可視スポットは６００ｐｇとなった。

実施例　３ 実施例１に記載されたようにして、コロイドセレン粒子
を調製し、同じマウス単クローナル抗体でコートした。

一連の濃度のコート　アンチマウス（ｇｏａｔ　ａｎｔ
ｉ−ｍｏｕｓｅ＞　Ｉ　ｇ　Ｇをニトロセルロース試験
片上にスポットした。乾燥した試験片を、コートされた
セレン粒子と共にインキュベートした。数分後、最低の
可視スポットは１２０ｎｇであることが判明した。

他の、同様に処理した試験片を、塩化水銀に基く別の物
理的現像剤と共にインキュベートした。

その物理的現像剤の組成、及びそれらを使用して得られ
た最低の可視スポット（ｌｏｗｅｓｔ　ｖｆｓｉｂｌ。

５ｐｏｔｓ：　Ｉｖｓ）を第１表に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特異的に結合する物質及び対応する結合性物質との
   間の反応の成分をテストサンプルにおいて検出及び／ま
   たは測定する方法であって、そのような成分及び少なく
   とも一つのラベルされた成分の相互の反応性を用い、任
   意的に遊離の及び結合されたラベルされた成分を分離し
   た後に、テストサンプルまたは分離後に得られた画分の
   一つ中の該ラベルを検出する方法において、前記ラベル
   された成分が非金属元素のゾル粒子でラベルされ、ラベ
   ルの検出が金属含有化合物を用いたシグナルの物理的現
   像の後に行われるところの方法。 ２、ラベルとしてセレン（Ｓｅ）元素のゾル粒子を使用
   する請求項第１項記載の方法。 ３、ラベルとしてテルル（Ｔｅ）元素のゾル粒子を使用
   する請求項第１項記載の方法。 ４、ラベルとしてイオウ（Ｓ）元素のゾル粒子を使用す
   る請求項第１項記載の方法。 ５、シグナルの物理的現像のために銀塩を使用する請求
   項第１項〜第４項のいずれか一つに記載の方法。 ６、シグナルの物理的現像のために乳酸銀または硝酸銀
   を使用する請求項第１項〜第４項のいずれか一つに記載
   の方法。 ７、シグナルの物理的現像のために水銀塩を使用する請
   求項第１項〜第４項のいずれか一つに記載の方法。 ８、シグナルの物理的現像のために塩化水銀を使用する
   請求項第１項〜第４項のいずれか一つに記載の方法。 ９、シグナルの物理的現像のために銅塩を使用する請求
   項第１項〜第４項のいずれか一つに記載の方法。 １０、シグナルの物理的現像のために硫酸銅を使用する
   請求項第１項〜第４項のいずれか一つに記載の方法。 １１、特異的に結合する物質及び対応する結合性物質の
   間の反応の成分をテストサンプルにおいて検出及び／ま
   たは測定するためのテストキットであつて、そのような
   成分及び少なくとも一つのラベルされた成分の相互の反
   応性を用い、任意的に遊離の及び結合されたラベルされ
   た成分を分離した後に、テストサンプルまたは分離後に
   得られた画分の一つ中の該ラベルを検出するためのテス
   トキットにおいて、該テストキットが、非金属元素のゾ
   ル粒子でラベルされたラベルされた成分を含み、さらに
   シグナルの物理的現像剤（このものは金属含有化合物を
   含む）を含むところのテストキット。 １２、該ラベルされた成分が、セレン元素のゾル粒子で
   ラベルされている請求項第１１項記載のテストキット。 １３、ラベルされた成分がテルル元素のゾル粒子でラベ
   ルされているところの、請求項第１１項の記載に従うテ
   ストキット。 １４、ラベルされた成分がイオウ元素のゾル粒子でラベ
   ルされているところの、請求項第１１項の記載に従うテ
   ストキット。 １５、シグナルの物理的現像剤が銀塩を含むところの、
   請求項第１１項〜第１４項のいずれか一つの記載に従う
   テストキット。 １６、シグナルの物理的現像剤が乳酸銀または硝酸銀を
   含むところの、請求項第１１項〜第１４項のいずれか一
   つの記載に従うテストキット。 １７、シグナルの物理的現像剤が水銀塩を含むところの
   、請求項第１１項〜第１４項のいずれか一つの記載に従
   うテストキット。 １８、シグナルの物理的現像剤が塩化水銀を含むところ
   の、請求項第１１項〜第１４項のいずれか一つの記載に
   従うテストキット。 １９、シグナルの物理的現像剤が銅塩を含むところの、
   請求項第１１項〜第１４項のいずれか一つの記載に従う
   テストキット。 ２０、シグナルの物理的現像剤が硫酸銅を含むところの
   、請求項第１１項〜第１４項のいずれか一つの記載に従
   うテストキット。