JPH02207097A - Ｈｉｖプロテアーゼのための迅速開裂性基質 - Google Patents

Ｈｉｖプロテアーゼのための迅速開裂性基質

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JPH02207097A
JPH02207097A JP1322805A JP32280589A JPH02207097A JP H02207097 A JPH02207097 A JP H02207097A JP 1322805 A JP1322805 A JP 1322805A JP 32280589 A JP32280589 A JP 32280589A JP H02207097 A JPH02207097 A JP H02207097A
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glutamine
phenylalanine
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peptide
isoleucine
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JP1322805A
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Karin Moelling
カリン・メリング
Stephan Dr Henke
シユテフアン・ヘンケ
Gerhard Breipohl
ゲールハルト・ブライポール
Wolfgang Koenig
ヴオルフガング・ケーニヒ
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Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
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Publication date
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はへデタペプチドないしノナベグチＰ１およびＨ
ＩＶプロテアーゼの所在確認および検出へのその使用な
らびにＨＩＶプロテアーゼのありうるインヒビターの検
査へのその使用に関する。
レトロウィルスプロテアーゼであるＨＩＭプロテアーゼ
はエイズウィルスのｇａｇおよびｇａｇ　−ｐＯ１前駆
体タン・ゼク質を機能性タンパク質に開裂させる。この
正確な開裂はエイズの感染に必要であるＣ　Ｎ、Ｅ、　
Ｋｏｈｌ等、　８１ｇａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ８Ａ　８５　（Ｉ９８８）　
４６８６−４６９０　）このプロテアーゼはｐｏｌ遺伝
子の５′領域でコードされている（例えばＨＴＬＶ　−
ｍ　ｐｏｌ　（６９〜１６７　）　）それはアスノＲル
チルグロテアーゼインヒビターであるペプスタチンによ
り阻害されうる特異的なアスノクルチルプロテアーゼで
ある。細胞に入ることができ、かつこのＨＩＶプロテア
ーゼに対して良好なインヒビターはエイズに感染した患
者の治療にとって重要である。
この酵素は９９個のみのアミノ酸で構成されそして明ら
かｌＩＣ６Ｂ−６９位オヨび１６７−１７５８位の２個
のＰｈｅ　−Ｐｒｏ結合の加水分解によりｐｏｌ遺伝子
から自身を離脱させている（　Ｍ、Ｃ。
Ｇｒ　ａｖｅ　ａ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ８Ａ　８５（Ｉ９８８）２４４９〜
２４５３：Ｊ、Ｈａｎｓｅｎ等、ＴｈｅＥＭＢＯＪ、　
７　（Ｉ９８８）１７８５〜１７９１：Ｅ、Ｐ。
Ｌｉ１ｌｅｈｏｊ等、Ｊ、　ＶｉｒｏｌｏｇＹ　６２　
（Ｉ９８８）　３０５３〜５０５８　：　Ｊ　、　８ｃ
ｈｎｅｉｄｅｒ等、Ｃｅ１ｌ　５４（Ｉ９８８）６６３
〜６６８〕 これまでＨＩＭプロテアーゼ用に用いられてきた基質は
下記ペプチドであり、これらは指示されたポイントで開
裂された（　Ｊ、　８ｃｈｎｅｉｄｅｒ等、Ｃｅ、１１
　５４（Ｉ９８８）５６３〜３６８）：ＲＲ８ＮＱＶＳ
ＱＮＹ↓ＰＩＶＱＮＩＱＧＲＲＧＨＫＡＲＶＬ↓ｌＡＭ
ｓＱＶＴＮ８ＡＴＩＭ↓ヮ。ＲＧＮＦＲＮＱＲＫＤＲＱ
ＧＴｖＳＦＮＦ↓ＰＱ’／’ｒＬＷＱＲＰＬＲＲＱＩＧ
ＡＴＬＮＦ’ＰＩ１３ＰＩＥＴＶＲＲａ（Ｐ、Ｌ、　Ｄ
ａｒｋｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｒ
ｅｓ。
Ｃｏｍｍｕｎ、１５６（Ｉ９８８）２９７〜５０５）：
Ｉ（ＩＶ−１： ｇａｇ−（Ｉ２４−１３８） ↓ Ｈ８５ＱＶ８ＱＮＹ　　ＰＩｖＱＮＩ ＶＳＱＮＹ　　ＰＩＶ ＳＱＮＹ　　ＰＩＶＱ ＳＱＮＹ　　ＰＩＶ ＧＨＫＡＲＶＬ　　ＡＥＡＭＳＱＶ ＶＴＮＴＡＴＩＭ　　ＭＱＫｆｆｌｔｌｌＦＳＹＫＧＲ
ＰＧＮＦ　　ＬＱＳＲＰ ＤＲＱＧＴＶＳＦＮＦ　　ＰＱＩＴ ＧＣＴＬＮＦ　　ＰＩＳＰＩＥＴ ｇａｇ−（３５７−３７０） ｇａｇ−（３７０−３８３） ｇａｇ−（４４０−４５？１） ｐｏｌ−（５９−７２） ｐｏｌ−（Ｉ６２−１７４） ｐｏｌ−（７２１−７３４）　　　　　ＡＧＩＲＫＩＬ
　　ＦＬＤＧＩＤＫＨＩＭ−２： ｇａｇ−（Ｉ２９−１４２）　　　　　８ＥＫＧＧＮＹ
　　ｐｖＱ）（ｖＣ）（）トリ内臓白血病ウィルスから
得られる同様のプロテアーゼも同様にしてＴｙｒ−Ｐｒ
ｏ結合を開裂させる（　Ｍ、　Ｋｏｔｌｅｒ等、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ８５（Ｉ９８８）４１８５〜４１８９）：’Ｉ’
ＦＱＡＹ’ＰＬｉＡ ＴＦＱＡＦ　　ＰＬｌｌｉ：Ａ 今、驚くべきことにこれら配列中のＰｒｏを５−オキサ
プロリンで置換するとＨＩＶプロテアーゼによってかな
りより速やかに開裂される基質を生ずることが見出され
た。従ってこれら基質を用いると、より速やかに結果が
得られそして取得困難で高価なＨＩＶプロテアーゼの必
要が低下する。
本発明は一般式Ｉ Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｏｐｒ−Ｆ−Ｇ−Ｈ（Ｉ）で示さ
れるヘデタペプチｒないしノナペプチドならびにその塩
に関する。
ここで式中、 Ａは存在しないかまたはバリン、イソロイシンまたはト
レオニンを表わし、 Ｂはセリン、トレオニンまたはフェニルアラニンを表わ
し、 Ｃはロイシン、グルタミンまたはフェニルアラニンを表
わし、 Ｄはアスノぞラザンまたはアラニンを嚢わし、Ｅはチロ
シンまたはフェニルアラニンを表わし、 Ｏｐｒはインオキサゾリン−３−カルボン酸（＝５−オ
キサプロリン）を表わし、 Ｐはイソロイシン、ロイシン、ノ々リン、トレオニンま
たはグルタミンな懺わし。
Ｇはバリン、イソロイシン、セリンまたはアルイニンを
表わし、そして Ｈは存在しないかまたはグルタミン、グルタミン酸、プ
ロリンまたはトレオニンを表ワス。
好ましい式Ｉのペプチドは、 Ａが存在しないかまたはバリンを表わし、Ｂがセリンを
表わし、 Ｃがグルタミンまたはフェニルアラニンヲ表わし、 Ｄがアスパラギンを表わし、 Ｅがチロシンまたはフェニルアラニンを表わし。
Ｆがイソロイシンまたはグルタミンを表わし、Ｇがバリ
ンまたはイソロイシンを表わし、そして Ｈが存在しないかまたはグルタミンを表わすペプチドで
ある。
特に好ましい式ｌのベデチＰは Ａが存在せず、 Ｂがセリンであり、 Ｃがフェニルアラニンであり、 ｐがアスノぞラインであり、 Ｅがフェニルアラニンであり、 Ｆがグルタミンであり、 Ｇがイソロイシンであり、そして Ｈが存在しない ペプチドである。
特に適当な塩をあげればアルカリ金属およびアルカリ土
類金属の塩、アミノとの塩および例えば塩酸、臭化水素
酸、硫酸、マレイン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または
フマル酸のような無機または有機酸との塩である。
本発明はさらに ａ）　　Ｃ−末端に遊離のカルボキシル基を有するフラ
グメントまたはその活性化された誘導体をＮ−末端に遊
離アミノ基を有する相当するフラグメントと反応させる
か、または ｂ）ベグチＰを段階的に合成し。
（ａ）または（ｂ）で得られた化合物中における他の官
能基を保護するために場合により一時的に導入された１
種またはそれ以上の保護基を除去し、このようにして得
られた式ｉを有するペプチドを場合によりその塩に変換
することからなる式！で示されるペゾチｒの製法にも関
する。
本発明のベデチＰはペプチド化学に一般に知られた方法
、例えばＨｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ
　ｄｅｒｏｒｇａｎｉａｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　）、ｖｏｌｕｍｅ　１５／２、好ましくは例えばＢ
、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ、　８５．２１４９（Ｉ９６５）、Ｒ，Ｃ，
８ｈｅｐｐａｒｄ　Ｉｎｔ、　Ｊ、　ＰｅｐｔｉｄｅＰ
ｒｏもｅｌｎ　Ｒｅ５−２１　、１１８（Ｉ９８５）　
　またはＢＰ−Ａ−２３１，７５２（Ｈｏｇ　８６／Ｆ
　０９９Ｊ）に記載されるかまたはヨーロッパ特許出願
４８８１１１０１１．８に提案される方法のような固相
合成によって、またはそれと同等の既知方法によって製
造された。
α−７ミノ保護基としては例えば第三ブチルオキ７カル
ボニル（ＢｏＣ）またはフルオレニルメチルオキシカル
ボニル（Ｆｍｏｃ）保護基のようなウレタン保護基が用
（・られる。副反応を阻止するためまたは特異的なペゾ
チｒを合成するために必要な場合は、アミノ酸の側鎖中
の官能基は適当な保護基によりさらに保護される（例え
ばＴ、Ｗ。
Ｇｒｅｅｎｅ、　−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇ・ｒｏｕ
ｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　８ｙｎ−ｔｈｅ８１８”
ｏｒ　ＥＰ−Ａ−２３１，７５２参照）本発明によるペ
プチドはＨＩＶプロテアーゼの所在確認および検出、な
らびＩＣＨＩＶプロテアーゼのありうるインヒビターの
検査に用いられる。
これらはクローン化ＨＩＭグロテアーゼ溶液の種種のパ
ッチが用いられる下記開裂実験により示されるように、
Ｈ工Ｖプロテアーゼにより非常に迅速に開裂される点で
際立っている。
Ａ）　　５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｏｐｒ−Ｇ
ｌｎ−１１ｅを用いるＨＩＶプロテアーゼインヒビター
検査のための一般的操作 ａ）基質溶液のｐｉ製 ８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｏｐｒ−Ｇｉｎ−１
１ｅ　２　ＷをＭＧＴＥ　１５緩備液１ＷＬＩ！中に（
場合により超音波使用）溶解させセして次に無菌フィル
ター（０，４５μｍ）を通してＰ遇する。
ｂ）インヒビター溶液の調製 溶液１−当り所望モル濃度の２．５倍のインヒビターを
秤りそしてＤＭＳＯＫ溶解させる（最終容量の１０％）
。この溶液をＭ（）ＴＥ１５緩衝液を用いて最終容量と
なるｔ″ｃ希釈しそして無菌フィルター（０，４５μ倶
）で−過する。
Ｃ）プロテアーゼ溶液の調製 ＨＩＭプロテアーゼ溶液５μｌを必要に応じＭＧＴＥ　
２５緩衝液で希釈する。
ｄ）試験操作 基質溶液１０μｌずつをスクリューキャップを用いて試
験管（Ｉ６Ｘｉ００）Ｋピペットで加える。ブランクに
は１０％ＤＭ８０を含有するＭＧＴｇ　１５緩衝液１０
μｊをピペットで加える。残りの試験管にインヒビター
溶液１０μｊずつを加える。これらの試料を３７℃で５
〜１０分間インキュベーションしそして次にそれぞれに
５μノのプロテアーゼ溶液を加える。３７℃で２時間反
応させたのち。
各試料の１０または２０μｌ　（ＨＰＬＣ装置の感度に
よる）をピペットで取り出し、ヤイクロパイアル中に入
れそしてＨＰＬＣ溶媒１２０μｌで希釈する。
ｅ）　　ＨＰＬＣ分析条件 溶媒系二　８０％［１１Ｍ燐酸ｐＨ２，５２０％（ｖｒ
／ｗ　）アセトニトリシ カ２ム：　　Ｍｅｒｃｋ’ＬＩＣＨＲＯ８ＯＲＢＲＰ１
８（５μｍ）２５０ｘ４流　速＝　　１ｄ／分 カラム温度：４２℃ 検出器パラメーター：　　２１５ｎｍ、０．０８　ＡＵ
Ｆ、１８２℃分析時間：１１分 基質の保持時間二８．１分 Ｎ−末端テトラペプチドの保持時間＝３．９分子）必要
な溶媒 １）　　ＭＧＴｇ１５緩衝液： ２０　ｍＭモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＮ）１５
％（ｗ／’ｖ　）グリセリン ＣＬＯ１％（ｖ／ｖ）　　）リドン（Ｔｒｉｔｏｎ）　
ｘｌ　００５　ｍＭ　ＨＤ’ｌ’Ａ Ｏ，５Ｍ　　ＮａＣｔ １ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライ）’（ＰＭ
８Ｆ）２）　　ＭＧＴｇ　２５緩衝液： 下記のことが相異する他はＭＧ’ｒｇ１５緩衝液と同じ
組成、すなわち ２５％（ｗ／ｖ　）　　グリセリン。
プラス１　ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）ＭＥＳ　
、ＥＤＴＡ　、　ＮａＣ６、ＤＴＴおよびＰＭＳ　Ｆを
三角フラスコに秤り入れ、少量の水に溶解させセしてＰ
Ｉ（６に調整する。適当量のグリセリンをメスフラスコ
に秤り入れそしてトリトン×１００をピペットで加える
。水溶液をこのメスフラスコに移し、これに水を印のと
ころまで加える。
３）　　）（ＰＬＯ溶媒： オルト燐酸０．１Ｍ溶液（ＦＬＵＫＡ特級純度）を調製
する。この溶液をトリエチルアミノ（ＦＩ、ＵＫＡ特級
純度）を用いて正確ＫｐＨ２，５に調整する。この溶液
の重量を測定し、そして適当量のアセトニトリル（Ｎ、
Ｂ、）を秤り入れる。充分に混合しそしてヘリウム５．
０を用いて約５分間脱気する。
ｇ）評価 ここに選択される条件下に酵素的開裂により生成された
Ｎ−末端テトラペグチＰからへブタペプチドを分離する
。テトラペプチｒ＋へブタベグチド全体忙対するテトラ
ベデチＰピーク含量％が開裂された割合罠相当する。
Ｂ）　　ＨＩＶプロテアーゼ動力学に関する操作（第１
〜４表） ＭＧＴＫ１５緩衝液中の基質溶液（２〜４■／−）１０
μ！および１０％ジメチルスルホ牛シＰを含有するＭ（
）Ｔｇ１５緩衝液１０μｌを混合して６７℃で５〜１０
分インキュベーションスル。これにＭＧＴ’Ｅ　２５緩
衝液中のＨＩＭプロテアーゼ溶液５μｊを加え、この混
合物を３７℃で振盪する。５．１０．２０．４０．８０
．１６０および３６０分後に２μｊずつ採取しセしてＨ
ＰＬＣ溶媒５０μｊ中にピペットで加える（反応停止）
。マイクロリッター注射器を用いてＨＰＬＣカラム＜全
ｔを負荷させる。ＨＰＬＣ条件はＡ）項におけると同じ
である。
Ｃ）　　ＨＩＶプロテアーゼ動力学に関する操作（第６
表） ＭＧＴＥ１５緩衝液中の基質溶液（２雫／ｙ）　１゜μ
ｌおよびＭＧＴＥ　１５緩衝液１０μノを混合して３７
℃で５〜１０分間インキュベーションする。
これＫ　ＨＩＶデロテｙ−セｉ　Ｍ　（ＭＧＴＥ２５緩
衝液を用いて１：４に希釈）５μｌを加え、この混合物
を３７℃で振盪する。以後の操作はＢ）項におけると同
様である。
ＨＰＬＣ条件： カラム：　Ｍｅｒｃｋ　ＨＩＢＡＲ”ＬＩｃＨＲＯ８Ｏ
ＲＢ　ＲＰ８　（７ｐｍ）５０Ｘ４ 流　速：　１ｄ／分（８ＦＮＦＰＱＩおよび８ＦＮＦ′
ＯＱＩに関し）０．５ｓｄ／分（ＶＳＱＮＹＰＩＶＱお
よびＶＳＱＮＹＯＩＶＱ　Ｋ関し） それ以外はＡｅ）項におけると同じ。
保持時間：　　８ＦＮＦＰＱＩ　：　　　　６．７　分
５ＦＮＦＯＱＩ　：　　６．５分 ５ＦＮＦ　：　　　３．７分 ＶＳＱＮＹＰＩＶＱ　：　　５．３分 ＶＳＱＮＹＯＩＶＱ　：　　５．５分 Ｖ８ＱＮＹ　：　　　４．６分 第１表および第２表は同じ条件下における８ｅｒ−Ｐｈ
ｉ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−１１ｅ（８ＦＮ
ＦＰＱＩ） よび８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｏｐｒ−Ｇｉｎ
−ＩＬｅ　（８ＦＮＦＯＱＩ）の開裂を示す。Ｎ−末端
テトラペプチドおよびＣ−末端トリペプチドへの−ｅｆ
ｆ）”の開裂はＨＰＬＣにより追跡する。５分間の開裂
後でＰｒｏ含有へプタペプチｒが約４％開裂されたが（
第１表参照）、Ｏｐｒ含有へプタペプチドは同じ時間内
ですでに４０〜４３％が開裂されていた（第２表参照）
従って、開裂は本発明による基質では約１０倍の速さで
起る。第３表および第４表は、希釈度の高いＨＩＭゾロ
テアーゼ溶液でもこの新規な基質で良好な開裂速度が得
られることを示している。第５表ではこれらＯｐｒを含
有する配列の開裂が阻害されうろことが示され、そこで
はペプスタチンＡがＨＩＶプロテアーゼをＩＣ５゜約１
０−６Ｍで阻害することが示されている。第６表は前記
へブタペプチドとノナペプチドＶａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｎ
−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ　
（ＶＳＱＮＹＰＩＶＱ）およびＭａｌ−８ａ　ｒ−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｏｐｒ−Ｉ　１ｅ−Ｖａ　１−Ｇ
ｉｎ（ＶＳＱＮＹＯＩＶＱ）とを直接比較して示す。
第　　１　　表 ｍ９／ａ／）の開裂 ４．００ ８．１９ １４．５７ ２３．４０ ５８、ｉ ７α１６ ４．１５ ７、５４ １４．３５ ２！ＬＯＯ ５７、６Ｂ ５７．１１ ７２．５１ 第　　２　　表 第　　４　　表 ＊／ｄ）の開裂 １：１０ １：２０ １：３０ １：４０ 第　　５ 表 第　　６　　表 １１８　（２ダ／−）の開裂 濃度（Ｍ） 開裂（％） 工Ｃ５０ ペプスタチンＡ ペデスタチｙＡ ペプスタチンＡ ペプスタチンＡ ４．７３ １Ｂ、２２ ２５．０９ 約１０″″６Ｍ 第　　６ 表 ＨＩ■プロテアーゼＡＩ［（Ｉ：４）を用いる数種の基
質（２Ｍ９７ｄ）の開裂速度の比較０．２５ ４．６８ ７．０１ ４８．１８ ３α０９ ｚ３５ ｉｏｏ、ｏ。
１００．００ １０α００ ３．６６ ６．５３ ｔ３１ ２α３２ ３１．４９ ５５．００ ６２．４８ １０．２７ ２０．７２ ４α４７ ｃＬ５０ Ｂ８．９８ ０ａ００ １０α００ 実施例　１ ８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｏｐｒ−Ｇｌｎ−Ｉ
　ｌｅの合成Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社
の４３ＯＡ　屋ペプチドシンセサイザーを用い、そして
Ｆｍｏｃ−１１ｅ−ＯＨでエステル化されたＮｏｖａｂ
ｉｏｃｈｅｍ社のｐ−ベンジルオキシベンジルアルコー
ル樹脂に対してＦｍｏｃ法を用いて標的ペプチドを段階
的に合成した（負荷的０．５ミリモル／樹脂？）。樹脂
１２を用い、そしてＦｍｏ　ｃ法用忙改良された合成プ
ログラムを用いて合成を行った。
下記アミノ酸誘・導体が用いられる：　Ｆｍｏｃ−Ｇｌ
ｎ−ＯＨ％Ｆｍｏｃ−Ｏｐｒ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ
−００ｂｔ　、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨａｎｄ　Ｆｍｏ
ｃ−８ｅｒ（もＢｕ）−００ｂｔ　、　Ｆｍｏｃ−Ｏｐ
ｒ−ＯＨを合成するには、　Ｖａｓｅｌｌａ等の方法（
Ｊ、Ｃ，Ｓ、Ｃｈｅｍ。
Ｃｏｍｍ、　　１９８１．９７〜９８　）　ＫよりＨ−
Ｏｐｒ−ＯｔＢｕを合成しセしてＮａＨＣＯ３の存在下
にジオキサン／水（Ｉ：１）中でＦｍｏｃ−Ｏｓｕと反
応させた。続いてトリフルオロ酢酸を用いて第三ブ、チ
ルエステルヲ開裂させるとＦｍｏｃ−Ｏｐｒ−ＯＨが得
られる。
遊離カルボキシル基を有するアミノ酸誘導体それぞれ１
ミリモルずつをシンセサイザーのカ−トリクジ中に０．
９５ミリモルのＨｏｏｔ）ｔと一緒に秤り入れた。これ
らアミノ酸をＤＭＦ　Ａ　ｍ中に溶解させそしてＤＭＦ
中のジイソプロピルカルボジイミドのＱ、５５モル溶液
２ｄを加えるととＫより直接カートリッジ中で予め活性
化した。他のアミノ酸のＨＯＯｂｔエステルなＮＭＰ　
６−中に溶解させ、その場で予備活性化されたアミノ酸
と全く同様に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで予め脱保
護された樹脂に結合させた。合成完了後、カチオン捕集
剤としてチオアニソールおよびエタンジチオールを用い
トリフルオロ酢酸でペゾチｒを樹脂から解裂させ、同時
に側鎖保護基を除去した。トリフルオロ酢酸を除去した
後に得られる残留物を酢酸エチルで何回も浸漬しそして
遠心分離した。残留物を１０％酢酸を含有するアルキル
化デキストランゲルでクロマトグラフィーした。純粋な
一１！ブチＰを含有するフラクションを合して凍結乾燥
した。
マススペクトル（ＦＡＢ）　：　８５４　（Ｍ＋Ｈ”）
アミノ酸分析値：　　Ａｓｐ：０．９８：　Ｓｅｒ：α
８０：　　Ｇｌｕ：１．００：１１ｅ：１．０５：　Ｐ
ｈｅ：２．１０；　ＮＨ３：１．７６゜実施例　２ Ｈ−８ｏｒ−Ｐｈｅ−Ａａｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ
−Ｉ　１ｅ−ＯＨの合成Ｎα−Ｆｍｏｃ保護されたアミ
ノ酸を用い、Ｌａｂｏｒもｅｃ社製ＳＰ　６４０型半自
動式ペプチドシンセサイデーで合成を行った。Ｆｍｏｃ
−１１ｓ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂５９
（負荷ｏ、４３　ミリモル／ｆ）を用いた。下記合成工
程を循環して行った。
１、２０％ピペリジン／ＤＭＦ　（２Ｘ５０ｄ）を用い
てＦｍｏ　ｃ保護基の除去。
２、　　ＤＭＦを用いる樹脂の洗浄（７ｘｓｏｄ）、３
、　　ＨＯＢｔエステルとしてその場で予備活性化され
たＦｍｏｃ−アミノ酸の結合（ＤＭＦ中のジイソデロビ
ルカルボジイミ）＋１を用いる予備活性化）（アミノ酸
、　ＨＯＢｔおよびカルボジイミＰ０５当量１反応進行
の指示薬としてのＨＯＯｂｔ　Ｏ，１５当量）、 ４、　　ＤＭＦでの洗浄（５Ｘ６０ｄ）。
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（５）が結合されたのち樹脂の
１０％をとり出し、そしてＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（２
）が結合されたのちさらに２０％の樹脂をとり出して別
に除去を行った。ヘプタ（ブチＰの合成が完了しセして
Ｆｍｏｃの除去および樹脂をＤＭＦ％ＤＣＭおよびＭＴ
Ｂ　エーテルで洗ったのち、Ｈ−ｓｅｔ（ｔＢｕ）−ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉ　１ｅ−樹
脂４．２ｔが得られた。
このイデチＰを９５％トリフルオロ酢酸／Ｈ２０で処理
することにより（室温２．５時間）樹脂からとり外した
。樹脂を濾過して９５％ＴＦＡで洗った。炉液を蒸発乾
固させ、エーテルと攪拌しそして高真空下に乾燥した。
粗製ペプチドの収量１．１３Ｆ、溶離剤として１０％水
性酢酸を用いてアルキル化デキストランゲルで精製した
。純粋なベデチＰを含有するフラクションを合して凍結
乾燥した。
収量：　　３２３１１１Ｐ ＭＳ（ＦＡＢ）　：　８５２　（Ｍ　＋　Ｈ”）アミノ
酸分析：　　Ａｓｐ：１．０１：　　８ｅｒ：０．７５
；　　（）ｌｕ：０．９７；Ｐｒｏ：ｉ、０３：　　Ｉ
ｌｅ：１．００Ｓ　　Ｐｈｅ：２．００　。
実施例　３ Ｈ−Ｖａｌ−８ｅｒ−（）ｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−１１ｅ−Ｖａｌ−（）Ｉｎ−ＯＨの合成 単離されたＦｍｏｃアミノ酸ｏｏｂｔ、エステルまたは
その場で活性化されたＨＯＢ　ｔエステルを用い、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ＋ｅｍｓ社の４６０Ａ型自
動式ペプチドシンセサイザーで合成を行った。下記工程
を循環させた。
ｔＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いるＦｍｏｃの除去
、 ２．　　ＮＭＰＫよる樹脂の洗浄、 ５、ＮＭＰ中のＦｍ０Ｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ
−００ｂｔ　。
Ｆｍｏｃ−１１ｅ−００ｂｔ　、　Ｆｍｏｃ−ＰＴｏ−
００ｂｔ　％Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−００ｂｔ、
　、　Ｆｍｏｃ−８ｅｒ（ｔＢｕ）−００ｂｔ、）また
はＤＭＦ中のＦｍｏｃ−アミノ酸（その場でジイソプロ
ピルカルボジイミドを用いてＨＯＢ　ｔエステルとして
予備活性化したＦｍ０Ｃ−Ａ８ｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−０
１ｎ−ＯＨアミノ酸）、 ４、　　ＮＭＰでの洗浄。
西ドイツ特許出願Ｐ３７４３６２０．１に記載されるア
ミＰ固定化樹脂にｒ−カルボキシル基を介してＦｍｏｃ
−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕが結合されたもので合成を行った。
この樹脂は酸で脱離させるとＣ−末端グルタミンを与え
る。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨ−アンカー）−ＯｔＢｕ樹
脂５００Ｗ９が用いられた。
合成完了およびＦｍｏｃの除去後［８１７ｍｇのベデチ
Ｐ樹脂が得られた。このベプチＰを９５％トリフルオロ
酢酸／Ｈ２０で処理することＫより（室温３時間）樹脂
からとり外した。樹脂を濾過して９５％ＴＦＡで洗った
。Ｆ液を蒸発乾固させ、エーテルと攪拌しそして高真空
下に乾燥した。
粗製ペプチドの収量２３６　Ｍｇ。溶離剤として１０％
水性酢酸を用いてアルキル化デキストランゲルで精製し
た。純粋なペプチドを含有するフラクションを合して凍
結乾燥した。
収量：１４２ｍ９ ＭＳ（ＦＡＢ）＝１０４７　（Ｍ＋Ｈ”）アミノ酸分析
：　　Ａｓｐ：１．００：　　Ｓｅｒ：０．８７；　　
Ｇｌｕ：２．０４；Ｐｒｏ：１．００：Ｖａｌ：１．９
６：ＩＩｓ二０．８６：Ｔｙｒ：０．９１　　。
実施例　４ Ｈ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−’ｒｙｒ−Ｏｐ
ｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−ＯＨの合成 単離されたＦｍｏ　ｃアミノ酸００ｂジエステルまたは
その場で活性化されたＨＯＢｔエステルを用い、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａ社の４３０Ａ型自動式
ペプチドシンセサイデーで合成を行った。下記工程を循
環させた。
ｔ　　ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いるＦｍｏｃの
除去、 ２、　　ＮＭＰによる樹脂の洗浄。
ｘ　　ＮＭＰ中のＦｍｏ　ｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−’
Ｖａｌ−００ｂｔ　。
Ｆｍｏｃ−１１ｅ−００ｂｔ　％Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ　（
ｔＢｕ）−〇Ｏｂｔ　、Ｆｍｏｃ−８ｅｒ（ｂＢｕ）−
ｏｏｂｔ）またはＤＭＦ中のＦｍｏｃ−アミノ酸（その
場でジイソデロビルカルボジイミＰを用いてＨＯＢｔエ
ステルとして予備活性化したＦｍｏｃ−Ｏｐｒ−ＯＨ、
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨアミ
ノ酸）、 ４、　　ＮＭＰでの洗浄。
西ドイツ特許出願Ｐ３７４３６２０．ＩＫ記載されるア
ミＰ固定化樹脂にγ−カルボキシル基を介してＦｍ０Ｃ
−Ｇｌｕ−Ｏｔ、Ｂｕが結合されたもので合成を行った
。この樹脂は酸で脱離させるとＣ−末端グルタミンを与
える。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＮＨ−アンカー）−ＯｔＢｕ
樹脂５０Ｍが用いられた。合成完了およびＦｍｏｃの除
去後に８２０■のベプチＰ樹脂が得られた。このペグチ
ｒを９５％トリフルオロ酢酸／Ｈ２０で処理することに
より（室温３時間）樹脂からとり外した。樹脂を濾過し
て９５％ＴＦＡで洗った。ｐ液を蒸発乾固させ、エーテ
ルと攪拌しそして高真空下に乾燥した。粗製ペプチドの
収量２６０■。溶離剤として１０％水性酢酸を用いてア
ルキル化デキストランゲルで精製した。
純粋なペプチドを含有するフラクションを合して凍結乾
燥した。
収量＝６９ダ ＭＳ（ＦＡＢ）　：　　１０４７　（Ｍ＋Ｈ”）アミノ
酸分析： Ｏｐｒ：ｔｏｌ： Ａｓｐ：　ｔＯＯ： ８ｅｒ：０．８８： Ｇｌｕ：２．０７： Ｖａｌ：　ｔ８８： １１ｅ：Ｑ、８５： Ｔｙｒ：α４４゜

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）式 I Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｏｐｒ−Ｆ−Ｇ−Ｈ（ I ）で示
    されるヘプタペプチドないしノナペプチドおよびその塩
    、 ここで式中、 Ａは存在しないかまたはバリン、イソロイ シンまたはトレオニンを表わし、 Ｂはセリン、トレオニンまたはフェニルア ラニンを表わし、 Ｃはロイシン、グルタミンまたはフェニル アラニンを表わし、 Ｄはアスパラギンまたはアラニンを表わし、Ｅはチロシ
    ンまたはフェニルアラニンを表 わし、 Ｏｐｒはイソオキサゾリジン−３−カルボン酸（＝５−
    オキサプロリン）を表わし、 Ｆはイソロイシン、ロイシン、バリン、ト レオニンまたはグルタミンを表わし、 Ｇはバリン、イソロイシン、セリンまたは アルギニンを表わし、そして Ｈは存在しないかまたはグルタミン、グル タミン酸、プロリンまたはトレオニンを表わす。 ２）Ａが存在しないかまたはバリンを表わし、Ｂがセリ
    ンを表わし、 Ｃがグルタミンまたはフェニルアラニンを 表わし、 Ｄがアスパラギンを表わし、 Ｅがチロシンまたはフェニルアラニンを表 わし、 Ｆがイソロイシンまたはグルタミンを表わ し、 Ｇがバリンまたはイソロイシンを表わし、 そして Ｈが存在しないかまたはグルタミンを表わ す 請求項１記載の式 I で示されるペプチドおよびその塩
    。 ３）Ａが存在せず、 Ｂがセリンであり、 Ｃがフェニルアラニンであり、 Ｄがアスパラギンであり、 Ｅがフェニルアラニンであり、 Ｆがグルタミンであり、 Ｇがイソロイシンであり、そして Ｈが存在しない 請求項１または２に記載の式 I で示されるペプチドお
    よびその塩。 ４）ａ）Ｃ−末端に遊離のカルボキシル基を有するフラ
    グメントまたはその活性化された誘導体をＮ−末端に遊
    離アミノ基を有する相当するフラグメントと反応させる
    か、または ｂ）ペプチドを段階的に合成し、 （ａ）または（ｂ）で得られた化合物中における他の官
    能基を保護するために場合により一時的に導入された１
    種またはそれ以上の保護基を除去し、このようにして得
    られた式 I を有するペプチドを場合によりその塩に変
    換することからなる請求項１〜３のいずれかに記載の式
    I で示されるペプチドの製法。 ５）ＨＩＶプロテアーゼの所在確認および検出のための
    請求項１〜３のいずれかに記載の式 I で示されるペプ
    チドの使用。 ６）ＨＩＶプロテアーゼのありうるインヒビターを検査
    するための請求項１〜３のいずれかに記載の式 I で示
    されるペプチドの使用。
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