BRPI0706400B1 - Selective enzymatic hydrolysis of terc-butil c-terminal esters of peptide substrates, for the convergent synthesis of a peptide of two or more peptide fragments, for the enzymatic synthesis of stages of a peptide in the direction of terminal c, e for peptide synthesis - Google Patents

Description

“PROCESSOS PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SELETIVA DE TERC-BUTIL ESTERES C-TERMINAIS DE SUBSTRATOS DE PEPTÍDEO, PARA A SÍNTESE CONVERGENTE DE UM PEPTÍDEO DE DOIS OU MAIS FRAGMENTOS DE PEPTÍDEO, PARA A SÍNTESE ENZIMÁTICA POR ETAPAS DE UM PEPTÍDEO NA DIREÇÃO DO TERMINAL C, E PARA A SÍNTESE DE PEPTÍDEO” A invenção diz respeito a um processo para a hidrólise enzimática seletiva de terc-butil ésteres C-terminais de substratos de peptídeo na síntese de peptídeos.

Na síntese de peptídeos, a seleção apropriada de grupos de proteção é muito importante. Na síntese química de peptídeos, o prolongamento do desenvolvimento do peptídeo, usualmente ocorre na direção do terminal N para evitar a racemização dos aminoácidos constituintes. Para permitir o prolongamento por etapas do desenvolvimento do peptídeo na direção do terminal N, o grupo de proteção para a função amino do terminal N é de uma natureza temporária. Este grupo é seletivamente clivado a partir do peptídeo em cada ciclo de uma síntese de peptídeo sem afetar os grupos de proteção semi-permanentes nas cadeias secundárias funcionais e o terminal C. Os grupos funcionais nas cadeias secundárias dos aminoácidos constituintes são usualmente protegidos a fim de evitar reações secundárias.

Na síntese química de peptídeos, um método completamente linear ou um método convergente podem ser seguidos, isto é, um método em que o peptídeo final é montado a partir de partir de fragmentos de peptídeo protegidos. O último método é, no geral, preferido para peptídeos mais longos, visto que os rendimentos totais são intrinsecamente mais altos e os fragmentos podem ser preparados em paralelo resultando em um tempo de síntese total mais curto. Em uma síntese convergente, todos os fragmentos, mas o fragmento de terminal C deve ser protegido em seu terminal C com uma função de proteção que pode ser seletivamente clivada. No caso da síntese de peptídeo em um suporte sólido, esta função é usualmente fornecida por um controle no suporte por si só. Para a síntese de peptídeo em uma escala de fabricação, a síntese na fase de solução é, entretanto, preferida na síntese de fase sólida. É particularmente preferida, uma síntese de acordo com DioRaSSP®, um método de fase de solução que combina as vantagens da fase sólida e o processo de fase de solução clássica (EP-A-1,291,356; US 6.864.357; Eggen I. et al., Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J. Pept. Sei. 2005, 11, 633-641). O éster de terminal C em uma síntese convergente deve ser estável sob as condições da montagem do peptídeo e mais notavelmente sob as condições da desproteção do grupo de proteção de terminal N temporário, que é repetido em cada ciclo de uma síntese de peptídeo. Por outro lado, o grupo de proteção de terminal N e grupos de proteção das cadeias secundárias necessárias para permanecer não afetado quando o éster no terminal C é removido antes do acomplamento de fragmento real. Embora uma faixa de ésteres seja conhecida, a qual pode ser usada para a proteção do terminal C dos fragmentos de peptídeo e diversas opções estão disponíveis para a desproteção química, nenhum dos métodos disponíveis é, no geral, aplicável. A maioria destes ésteres são de uma natureza primária, por exemplo, metil ésteres e, desta maneira, causa a formação de dicetopiperazina o estágio do dipeptídeo desprotegido. Além disso, a introdução da função éster, freqüentemente requer um ativação relativamente forte da função carboxílica resultando na perda da integridade enantiomérica do aminoácido esterificado. Finalmente, a função éster, é freqüentemente desbloqueada sob condições ácidas ou básicas que leva a modificações no peptídeo real. Na base de sua estabilidade alta, sua facilidade de introdução e sua biodisponibilidade comercial ampla, o terc-butil éster é preferido se a desproteção seletiva na presença de grupos de proteção de cadeia secundária puder ser atingida.

Entretanto, a desproteção química é, no geral, não aplicável para este propósito.

Os métodos enzimáticos ganharam interesse na síntese de peptídeo durante alguns anos passados. As enzimas freqüentemente apresentam quimio-, regio- e estereo-seletividade alta. Além disso, as enzimas, usualmente, operam sob condições muito brandas, em valores de pH neutro e em temperaturas de 20 a 50°C. desta maneira, sob tais condições, as reações secundárias catalisadas por ácido ou base podem ser evitadas. É conhecido na técnica que alguns grupos de acoplamento são cliváveis por enzimas, que podem ser usadas no desbloqueio de peptídeos. Em particular, os ésteres podem ser aplicados, que podem ser hidrolisados por lipases, esterases e proteases. As lipases e esterases são, usualmente consideradas como, mais no geral, aplicáveis à química do grupo de proteção na síntese de peptídeo, visto que uma desvantagem das proteases é que estas também podem hidrolisar as ligações de peptídeo (atividade de endopeptidase). Recentemente, foi observado que certas lipases e esterases que carregam o motivo de aminoácido GGG(A)X (em que G indica glicina e X qualquer aminoácido; em algumas enzimas, uma glicina é substituída por alanina, A) mostram remoção branda e seletiva de grupos de proteção de terc-butil éster em derivados de aminoácido e compostos relacionados. Foi concluído que, em particular, duas enzimas, BsubpNBE (p-nitrobenzil esterase recombinante de Bacillus subtilis produzidos em E. coli) e CAL-A (lipase A de Candida antarctica (Novozymes)) podem ser usadas na química orgânica sintética para a clivagem de terc-butil ésteres de vários substratos (Schmidt M. et al., J. Org. Chem. 2005, 70, 3737-3740). As atividades daquelas enzimas, entretanto, não foram testadas em terc-butil ésteres C-terminais de peptídeos, com a exceção de um dipeptídeo que não mostra qualquer atividade. A solubilidade de peptídeos protegidos provavelmente apresentará um problema nos sistemas de solvente que foram aplicados para testar as atividades enzimáticas, usando-se, em particular, tolueno, n-hexano e éter dietüico como co-solventes. No geral, entretanto, peptídeos protegidos e, especialmente peptídeos protegidos longos requerem solventes polares para dissolução (por exemplo, DMF, NMP, diclorometano, metanol ou acetonitrila). A despeito do fato que as proteases são menos preferidas, o uso de uma protease denominada termitase relatadamente resultou na hidrólise eficaz de ésteres de peptídeo (Schultz M. et al., Synlett. 1992, 1, 3738). Entretanto, a termitase não encontrou uso amplo na síntese de peptídeo a partir do tempo quando esta foi relatada. Isto, entre outras razões, deve ocorrer devido à sua disponibilidade comercial limitada (código de família EC 3.4.21.66), que impede gravemente o escalonamento até a escala industrial.

Desta maneira, ainda existe uma necessidade quanto aos processos enzimáticos geralmente aplicáveis para a remoção de ésteres C-terminais, em particular terc-butil ésteres, na química de peptídeo, especialmente para processos em escala industrial.

Além disso, como uma alternativa à síntese química de peptídeos, existe um interesse de desenvolvimento na síntese enzimática de peptídeos, em que tanto as etapas de acoplamento quanto de desproteção podem ser mediadas pelas enzimas específicas. Visto que as etapas de acoplamento mediadas pelas enzimas não evocam nenhuma racemização como oposto à alternativa química, o alongamento do desenvolvimento de peptídeos pode ocorrer na direção do terminal C. Uma tal síntese está em efeito de uma síntese convergente em que o fragmento de terminal C é substituído por um derivado de aminoácido; do mesmo modo, este, portanto, deve tirar proveito da disponibilidade de, no geral, processos enzimáticos aplicáveis para a remoção de ésteres C-terminais, em particular, terc-butil ésteres.

Finalmente, a disponibilidade de processos aplicáveis para a remoção de ésteres C-terminais, em particular terc-butil ésteres, devem ser muito proveitosos na síntese de peptídeo que compreende ciclizações de peptídeo que envolve o terminal C do precursor linear (isto é, ciclizações de cadeia parte frontal-a-parte final e parte final-a-parte lateral). Tais ciclizações podem acontecer na solução, mas também em um suporte sólido quando o precursor linear é ancorado por intermédio de sua cadeia N-terminal ou secundária.

Um novo processo foi agora observado para a hidrólise enzimática seletiva de terc-butil ésteres de substratos de peptídeo na síntese de peptídeos, que compreende hidrolisar um ou mais substratos de peptídeo que compreende terc-butil ésteres C-terminais usando-se a protease subtilisina em qualquer forma adequada.

Surpreendentemente, foi observado que rendimentos altos, até quantitativos, do produto hidrolisado podem ser obtidos usando-se a protease subtilisina, enquanto a atividade de endopeptidase é substancialmente suprimida. O novo processo desta invenção pode ser convenientemente usado na produção de peptídeos protegidos e não protegidos. O processo é, em particular, favorável na síntese convergente de peptídeos.

Preferivelmente, o terc-butil éster C-terminal dos substratos de peptídeo compreende um resíduo de acila C-terminal que é um resíduo de examino acila de origem natural ou sintética. O resíduo de α-amino acila C-terminal pode ser protegido ou desprotegido na cadeia secundária. Em particular, são preferidos os resíduo de α-amino acila C-terminal selecionados de Ala, Cys protegido, Asp protegido, Glu protegido, Phe, Gly, His, Lys (protegido), Leu, Met, Asn, Gin, Arg (protegido), Ser (protegido), Thr, Vai, Trp (protegido) e Tyr (protegido), em que os parênteses em tomo da palavra "protegido" significa que o resíduo pode estar presente tanto na forma de protegida quanto desprotegida de cadeia secundária. O código de três letras para os aminoácidos é usado aqui, de acordo com a nomenclatura IUPAC (IUPAC-IUB Commission (1985) J. Biol. Chem. 260, 14-42).

Preferivelmente, substratos de peptídeo protegidos ou desprotegidos usados no processo desta invenção são preparados pela síntese na fase de solução. Em uma outra forma de realização preferida, os substratos de peptídeo protegidos ou desprotegidos usados no processo desta invenção são preparados de acordo com DioRaSSP®. Desta maneira, um substrato de peptídeo que compreende um terc-butil éster C-terminal é preferivelmente preparado de acordo com este processo para a síntese em solução rápida de um peptídeo em um solvente orgânico ou uma mistura de solventes orgânicos, o processo compreendendo ciclos repetitivos das etapas de (a) a (d): (a) uma etapa de acoplamento, usando um excesso de um componente carboxílico ativado para acilar um componente amino, (b) uma etapa de extinção em que um removedor é usado para a remoção de funções carboxílicas ativadas residuais, em que o removedor também pode ser usado para a desproteção do peptídeo de desenvolvimento, (c) uma ou mais extrações aquosas e opcionalmente, (d) uma etapa de desproteção separada, seguida por uma ou mais extrações aquosas, desse modo em pelo menos um ciclo na etapa de processo b, uma amina que compreende um ânion livre ou um ânion latente é usado como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais. A amina é preferivelmente é preferivelmente β-alaninato de benzila ou um sal do mesmo. A hidrólise do processo da presente invenção pode ser realizada em um tampão aquoso. Entretanto, para propósitos de solubilidade e/ou para suprimir a atividade de endopeptidase, a hidrólise do processo da invenção é preferivelmente realizada em uma mistura de um tampão aquoso e um ou mais solventes orgânicos. Os tampões adequados podem ser selecionados a partir de tampões que são, no geral, usados para transformações usando-se enzimas proteolíticas. Em particular, o tampão aquoso é um tampão de fosfato, borato ou TRIS. Os solventes orgânicos polares são preferidos e, em particular, o solvente orgânico é selecionado de Ν,Ν-dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetraidrofurano (THF), acetonitrila e terc-butanol. Particularmente preferido é o DMF. Conseqüentemente, a porcentagem do solvente orgânico na mistura pode variar de 0 a 60% (v/v), preferivelmente de 30 a 60% (v/v). isto é especialmente útil quando a porcentagem do solvente orgânico na mistura é de cerca de 50 a 60% (v/v). O pH em que a reação é realizada pode ser selecionado da faixa de 6,5 a 10, em particular de 6,5 a 8 e, preferivelmente, o pH é 7.

As temperaturas de para a hidrólise podem ser adequadamente selecionadas na faixa de 20 a 60°C. é preferida uma temperatura de reação de 40°C. A quantidade de enzima pode ser adequadamente selecionada na faixa de 1 a 50% em peso de enzima com relação ao substrato de peptídeo.

Em uma outra forma de realização da invenção, a hidrólise é realizada adicionando-se porções por etapas da protease subtilisina (em qualquer forma adequada) à mistura de reação que compreende um ou mais substratos de peptídeo que compreende terc-butil ésteres C-terminal.

Os substratos de peptídeo cujos terc-butil ésteres C-terminais são hidrolisados no processo da invenção, pode carregar grupos de proteção em outras partes de sua seqüência de peptídeo. A hidrólise pode ser realizado com um substrato de peptídeo bem como uma mistura destes. Foi estabelecido que o desempenho da hidrólise de uma mistura de substratos de peptídeo que compreende terc-butil ésteres C-terminais não é significantemente reduzido pela presença de mais do que um substrato de peptídeo.

Um processo adequado de acordo com a presente invenção é como segue. A uma solução agitada de terc-butil éster de um peptídeo em uma mistura de um solvente orgânico adequado (ou mistura de solventes orgânicos) e um tampão, a subtilisina é adicionada [por exemplo: a 0,1 mmol de um terc-butil éster de um peptídeo em uma mistura de 2,5 ml de DMF e 2,5 ml de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0, 40°C), 5 mg de subtilisina são adicionados]. Quando a conversão de substrato atingiu um nível desejado, por exemplo, maior do que 95% (como determinado por HPLC), uma quantidade de acetato de etila é adicionada. Após a separação da fase aquosa, a fase orgânica é extraída duas vezes com solução de cloreto de sódio e concentrado a vácuo. O peptídeo desprotegido de terminal C ou o fragmento de polipeptídeo é isolado pela precipitação com um éter dietílico, éter metil terc-butüico ou heptano semelhante não solvente. No caso de uma enzima imobilizada, a enzima é removida pela filtração antes do procedimento de trabalho descrito. A protease subtilisina (EC 3.4.21.62) pode ser usada no processo da invenção em qualquer forma, desta maneira esta pode ser usada na forma solúvel e/ou cristalizada, mas também na forma imobilizada ou outra forma insolúvel, por exemplo, na forma de agregados de enzima reticulados (CLEA) ou cristais de enzima reticulados (CLEC). O termo ‘substrato’ aqui, significa uma entidade que é convertida a um produto pela protease subtilisina em qualquer forma. Este produto pode ser um produto de peptídeo final, desse modo, se presente apenas os grupos secundários protegidos, ainda devem ser desprotegidos. Altemativamente, este produto também pode ser um fragmento de peptídeo que é subseqüentemente reagido com outros fragmentos de peptídeo em uma síntese convergente para obter um peptídeo mais longo com o número final requerido de aminoácidos.

Uma pessoa habilitada na técnica pode identificar facilmente os substratos adequados, por exemplo, pela realização de uma hidrólise de teste simples de um peptídeo selecionado que compreende uma funcionalidade de terc-butil éster C-terminal sob condições adequadas como descrito anieriormente e seguindo a conversão, por exemplo, pelas técnicas de HPLC. Isto foi observado pela hidrólise de dipeptídeos modelo da estrutura geral Z-Val-X-OBu1 na presença de Alcalase CLEA e 50% v/v de DMF (para detalhes, ver o Exemplo 3} cuja reatividade para estes substratos modelo que compreendem uma funcionalidade de terc-butil éster C-terminal pode ser dividida em quatro categorias: Se a reatividade for indicada ser "não responsiva", também após a otimização, o peptídeo selecionado não é um substrato de acordo com a invenção, Com base na estrutura destes substratos de peptídeo modelo os resultados são considerados indicativos da reatividade do derivado de aminoãcido X selecionado com relação à protease subtil isina em qualquer forma adequada. Isto é confirmado pelo Exemplo 5 em que foi testado que combinações de aminoãcido são suscetíveis à atividade de endopeptídase da protease subtilisina. Mais particularmente, os substratos de tetrapeptídeo modelo da estrutura geral Z-Val-Val-X-Leu-OBu' foram hidrolísados na presença de Alcalase CLEA e 50% v/v de DMF (para detalhes, ver Exemplo 5). Além disso, o Exemplo 5 demonstra que a atividade de esterase em relação com o derivado de aminoãcido X é indicativo da atividade de endopeptídase com relação àquele derivado de aminoãcido X. Entretanto, é enfatizado que sob as condições otimizadas do processo da presente invenção. a atividade de endopeptidase é significantemente menor do que a atividade de esterase. É estabelecido que o processo é muito adequado para a preparação de peptídeos curtos, tais como dipeptídeos, tripeptídeos e tetrapeptídeos. Além disso, com base nos argumentos mencionados acima na base dos Exemplos 3 e 5 um homem habilitado também é capaz de preparar peptídeos mais longos que compreendem derivados de aminoácido que são esperados ter reatividade ruim ou medíocre em qualquer mas a posição do terminal C do peptídeo. Neste sentido, os derivados de aminoácido D podem ser considerados como derivados de aminoácido não responsivos e, desta maneira, os peptídeos também podem ser preparados com aminoácidos D em qualquer, mas na posição de terminal C. O termo ‘protegido’ significa que os grupos funcionais (dentro do peptídeo) são protegidos com os grupos de proteção adequados. Uma pessoa habilitada na técnica conhecerá qual tipo de proteção selecionar para aquele tipo de grupo funcional. Por exemplo, funções amina presentes nos compostos podem ser protegidas durante o procedimento sintético por um grupo de proteção N, que significa um grupo comumente usado na química de peptídeo para a proteção de um grupo α-amino, como o grupo terc-butiloxicarbonila (Boc), o grupo benziloxicarbonila (Z) ou o grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Visões gerais de grupos de proteção amino e métodos para a sua remoção são dados em Geiger R. and Konig W. (1981) em Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol 3, Gross E. and Meienhofer, J., eds, Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-99, e Peptides: Chemistry and Biology, Sewald N. and Jakubke H.-D., eds, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, pp. 143 - 154. As funções do tipo terc-butila ou funções de instabilidade similar são preferidas para a proteção de outros grupos funcionais nas cadeias secundárias; estes incluem - mas não são limitados a - terc-butila (Bul) para a proteção das cadeias secundárias de Asp, Glu, Ser, Thr e Tyr, terc- butoxicarbonila (Boc) para a proteção das cadeias secundárias Lys e Trp, tritila (Trt) para a desproteção das cadeias secundárias Asn, Gin e His e 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonila (Pmc) ou 2,2,4,6,7-pentametildiidrobenzofurano-5-sulfonila (Pbf) para a proteção da cadeia secundária Arg [Barany, G. and Merrifield, R.B. (1980) em: 'The Peptides', vol. 2 (Gross, E. and Meienhofer, J., eds.) Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-284; para Trp(Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) e Gln(Trt): Sieber, P. and Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. and Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; para Pmc: Ramage, R. and Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832]. A invenção ainda é ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como uma limitação desta invenção.

EXEMPLOS O tetrapeptídeo do Exemplo 2 e o tetrapeptídeo do Exemplo 5 em que X = Met foi preparado de acordo com DioRaSSP® (EP-A-1.291.356; US 6.864.357; Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J. Pept. Sei. 2005, 11, 633-641), visto que os dipeptídeos, tripeptídeos, e o tetrapeptídeo do Exemplo 5 em que X = Arg foram produzidos de acordo com métodos de fase de solução convencional para síntese de peptídeo. Os outros tetrapeptídeos do Exemplo 5 são preparados de acordo com os métodos de fase de solução convencional aplicando-se um protocolo de divisão e mistura. O protocolo de divisão e mistura foi aplicado a fim de reduzir a quantidade de trabalho preparativo. A enzima subtilisina A livre (S. Carlsberg) usando no Exemplo 1 foi adquirida de Sigma Aldrich. A enzima subtilisina A livre usando nos outros exemplos foi adquirida de Novozymes. Alcalase CLEA foi obtido de CLEA Technologies B.V., Delft, The Netherlands.

Exemplo 1 Subtilisina livre Procedimento geral Subtilisina A: 0,1 mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em uma mistura termoestabelecida de 2,5 ml de DMF e 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7, 5 mg de enzima foram adicionados à solução de peptídeo, A mistura de reação foi incubada a 40°C para um total de duas horas. As misturas de reação foram analisadas após 2 horas usando HPLC. (Alguns resultados selecionados de substratos de subtilisina bons são mostrados.) Tabela 1 Exemplo 2 0,05 mmol de Boc -G1 y - Phe- Phe- Leu -OB u1 foi dissolvido em uma mistura termoestabelecida de 2,5 ml de NMP e 2,5 ml de tampão de fosfato (),1M pH 8. Para esta solução 5 mg de Alcalase CLEA foram adicionados. A mistura de reação foi incubada a 40°C para um total de 17 horas. A conversão de substrato é determinada pelo HPLC, A reação resultou, após 17 horas, em > 95% dc rendimento de Boc-Gly-Phc-Phe-Leu-OH. Exemplo 3 Desprotecão de dlpeptfdeos modelos oor Alcalase CLEA e subtilisina A Procedimento gerai Subtilisina A: 0, l mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em 2,5 ml de DMF. 5 mg de enzima foram dissolvidos em 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 Μ ρΗ 7 e foram adicionados à solução de peptídeo. A mistura de reação foi incubada a 40°C para um total de seis horas. As misturas de reação foram analisadas após 6 horas usando HPLC e LC/MS.

Procedimento gerai Aicaiase CLEA: 0,1 mrnol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em 2,5 ml de DMF. Para esta solução 5 mg de enzima foram adicionados junto com 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7. A mistura de reação foi incubada a 40°C para um total de seis horas. As misturas de reação foram analisadas após ó horas usando HPLC e LC/MS.

Tabela 2 Exemplo 4 Otimização da quantidade de enzima para um substrato de peptfdeo bom e um medíocre Procedim mio g e ml 0,1 mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em 2,5 ml de DMF. A subtilisina A foi dissolvida em 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7 e adicionado à solução de peptídeo, A mistura de reação foi incubada a 40°C. As misturas de reação foram submetidas a amostragem no período de reação indicada e analisada por HPLC. Quando necessário porções extras de enzima foram adicionadas em intervalos de 2 horas.

Tabela 3 Exemplo 5 Identificação de substratos de peptfdeo susceptíveis a divagem endopeptidica.

Procedimento geral Alcala.se CLEA: 0,1 mmol de cada um dos tetrapeptídeos (ou misturas de tetrapeptídeos) foram dissolvidos em 2,5 ml de DMF. Para esta solução 5 mg de enzima foram adicionados junto com 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7 e foram adicionados à solução prévia. A mistura de reação foi incubada a 40ÜC. As misturas de reação foram analisadas após 2 horas e ó horas por HPLC. No caso da reação não atingir a finalização, porções adicionais de enzima [5 mg cada] foram adicionadas no finai de seis horas e durante a noite (aproximadamente 24 horas de reação). A ultima alíquota foi analisada por LC/MS para verificar a presença do composto desejado e de quaisquer impurezas sendo Z-Val-Val-X-OH e/ou 'H-XLeu-OH, Tabela 4 1} traços de substrato detectado em LC/MS; 2> Tempo de retenção de substrato igual àquele de Z-VaI-Val-Arg{Pbf)-Leu- OH; 3í Tempo de retenção de substrato igual àquele de Z-Val-Val-Tyr(Bu')-Leu-OH. n.d. = nenhuma impureza de endopeptidase detectada Exemplo 6 Escalonamento do procedimento Para uma solução agitada de 606 mg (1 mmol) Z-VabTrp-Leu-OBu' em 25 ml de DMF 25 mg de A leal ase CLEA foram adicionados junto com 25 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7. A mistura foi agitada a 40°C. O progresso da reação foi monitorada por HPLC. As porções extras de enzima (25 mg de cada Alcalase CLEA) foram adicionados após 24 horas e após 48 horas. Após 6 dias a reação foi interrompida. A mistura de reação foi acidificada a pH 2 e DMF foi evaporado. O produto foi extraído com acetato de etila. A camada orgânica foi secada usando sulfato de sódio, concentrado à vácuo e o produto final precipitado a partir de heptano. Nenhuma impureza relacionada com a endopeptidase foi identificada durante a análise do composto final tanto por HPLC quanto por LC/MS.

Rendimento: 96,2% Pureza de HPLC: 96,5% a/a (o composto final também continha 2,5% a/a do material de partida).

REIVINDICAÇÕES

Claims (23)

1. Processo para a htdrólise enzimática seletiva de terc-butil ésteres C-terminais de substratos de peptídeo, caracterizado pelo fato de ser na síntese de peptídeos, compreendendo bidrolísar um ou mais substratos de peptídeo compreendem terc-butil ésteres C-terminais usando-se a protease subtilisina em qualquer forma adequada, em que o substrato de peptídeo é um di-, tri- ou tetrapeptídeo,

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de peptídeo que compreende o terc-butil éster C-terminal compreende resíduo de acila C-terminal que é um resíduo de a-amino acila de origem natural ou sintética.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo de α-amtno acila é selecionado de Ala» Cys protegido, Asp protegido» Glu protegido» Phe, Gly, His» Lys (protegido), Leu, Met, Asn, Gin, Arg (protegido), Ser (protegido)» Thr, Vai, Trp (protegido) e Tyr (protegido),

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o substrato de peptídeo é preparado pela síntese na fase de solução.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o substrato de peptídeo é preparado de acordo com um processo para a síntese em solução rápida de um peptídeo em um solvente orgânico ou uma mistura de solventes orgânicos, o processo compreendendo ciclos repetitivos das etapas (a) a (d): a) uma etapa de acoplamento, usando um excesso de um componente carboxílico ativado para adiar um componente amino, b) uma etapa de extinção em que um removedor é usado para a remoção de funções earboxílicas ativadas residuais, em que o removedor também pode ser usado para a desproteçao do peptídeo de desenvolvimento, c) uma ou mais extrações aquosas e opcionalmente, (d) uma etapa de desproteção separada, seguida por uma ou mais extrações aquosas, desse modo em pelo menos um ciclo na etapa de processo b uma amina que compreende um ânion livre ou um ânion latente é usado como um removedor de funções carboxílicas ativadas residuais.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a protease subtilisina é da família EC 3.4.21.62.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a protease subtilisina é subtilisina livre.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a protease subtilisina é subtilisina agregada de enzima reticulada (CLEA).

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a hidrólise é realizada em uma mistura de um tampão aquoso e um solvente orgânico.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é um solvente polar.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é selecionado de A,A-dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, A,A-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetraidrofurano (THF), acetonitrila e terc-butanol.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é DMF.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a porcentagem do solvente orgânico na mistura é de 50 a 60%.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o pH em que a reação é realizada é selecionado da faixa de 6,5 a 10.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o pH é selecionado da faixa de 6,5 a 8.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o pH é 7.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a temperatura de reação para a hidrólise é de 20 a 60°C.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a temperatura de reação para a hidrólise é de 40°C.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a quantidade de enzima varia de 1 a 50% em peso com relação ao substrato de peptídeo.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a hidrólise é realizada adicionando-se as porções por etapas da protease subtilisina na mistura de reação que compreende um ou mais substratos de peptídeo que compreende terc-butil ésteres C-terminal.

21. Processo para a síntese convergente de um peptídeo de dois ou mais fragmentos de peptídeo, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos fragmentos de peptídeo é preparado de acordo com um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20.

22. Processo para a síntese enzimática por etapas de um peptídeo na direção do terminal C, caracterizado pelo fato de estar de acordo com um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20.

23. Processo para a síntese de peptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende a ciclização de peptídeo que envolve o terminal C do precursor linear de acordo com um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20.