BRPI0706400A2 - processos para a hidrólise enzimática seletiva de terc-butil ésteres c-terminais de substratos de peptìdeo, para a sìntese convergente de um peptìdeo de dois ou mais fragmentos de peptìdeo, para a sìntese enzimática por etapas de um peptìdeo na direção do terminal c, e para a sìntese de peptìdeo - Google Patents
processos para a hidrólise enzimática seletiva de terc-butil ésteres c-terminais de substratos de peptìdeo, para a sìntese convergente de um peptìdeo de dois ou mais fragmentos de peptìdeo, para a sìntese enzimática por etapas de um peptìdeo na direção do terminal c, e para a sìntese de peptìdeo Download PDFInfo
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Abstract
PROCESSOS PARA A HIDRóLISE ENZIMATICA SELETIVA DE TERC-BUTIL éSTERES C-TERMINAIS DE SUBSTRATOS DE PEPTìDEO, PARA A SINTESE CONVERGENTE DE UM PEPTìDEO DE DOIS OU MAIS FRAGMENTOS DE PEPTìDEO, PARA A SINTESE ENZIMATICA POR ETAPAS DE UM PEPTìDEO NA DIREçãO DO TERMINAL C, E PARA A SINTESE DE PEPTìDEO A presente invenção diz respeito a um processo para a hidrólise enzimática seletiva de ésteres C-terminais de substratos de peptídeo na síntese de peptídeos, que compreende hidrolisar terc-butil ésteres C- terminais usando-se a protease subtilisina. Este processo é útil na produção de peptídeos protegidos e não protegidos.
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PROCESSOS PARA A HIDRÓL1SE ENZIMÁTICA SELETIVA DETERC-BUTIL ESTERES C-TERMINAIS DE SUBSTRATOS DEPEPTÍDEO, PARA A SÍNTESE CONVERGENTE DE UM PEPTÍDEO DEDOIS OU MAIS FRAGMENTOS DE PEPTÍDEO, PARA A SÍNTESEENZIMÁTICA POR ETAPAS DE UM PEPTÍDEO NA DIREÇÃO DOTERMINAL C, E PARA A SÍNTESE DE PEPTÍDEO"
A invenção diz respeito a um processo para a hidróliseenzimática seletiva de terc-butil ésteres C-terminais de substratos de peptídeona síntese de peptídeos.
Na síntese de peptídeos, a seleção apropriada de grupos deproteção é muito importante. Na síntese química de peptídeos, oprolongamento do desenvolvimento do peptídeo, usualmente ocorre nadireção do terminal N para evitar a racemização dos aminoácidosconstituintes. Para permitir o prolongamento por etapas do desenvolvimentodo peptídeo na direção do terminal Ν, o grupo de proteção para a funçãoamino do terminal N é de uma natureza temporária. Este grupo éseletivamente clivado a partir do peptídeo em cada ciclo de uma síntese depeptídeo sem afetar os grupos de proteção semi-permanentes nas cadeiassecundárias funcionais e o terminal C. Os grupos funcionais nas cadeiassecundárias dos aminoácidos constituintes são usualmente protegidos a fim deevitar reações secundárias.
Na síntese química de peptídeos, um método completamentelinear ou um método convergente podem ser seguidos, isto é, um método emque o peptídeo final é montado a partir de partir de fragmentos de peptídeoprotegidos. O último método é, no geral, preferido para peptídeos maislongos, visto que os rendimentos totais são intrinsecamente mais altos e osfragmentos podem ser preparados em paralelo resultando em um tempo desíntese total mais curto. Em uma síntese convergente, todos os fragmentos,mas o fragmento de terminal C deve ser protegido em seu terminal C com
uma função de proteção que pode ser seletivamente clivada. No caso dasíntese de peptídeo em um suporte sólido, esta função é usualmente fornecidapor um controle no suporte por si só. Para a síntese de peptídeo em umaescala de fabricação, a síntese na fase de solução é, entretanto, preferida nasíntese de fase sólida. E particularmente preferida, uma síntese de acordo comDioRaS SP®, um método de fase de solução que combina as vantagens dafase sólida e o processo de fase de solução clássica (EP-A-1,291,356; US6.864.357; Eggen I. et al., Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I.et al., J. Pept. Sei. 2005, 11, 633-641).
O éster de terminal C em uma síntese convergente deve serestável sob as condições da montagem do peptídeo e mais notavelmente sobas condições da desproteção do grupo de proteção de terminal N temporário,que é repetido em cada ciclo de uma síntese de peptídeo. Por outro lado, ogrupo de proteção de terminal N e grupos de proteção das cadeias secundáriasnecessárias para permanecer não afetado quando o éster no terminal C éremovido antes da copulação de fragmento real. Embora uma faixa de ésteresseja conhecida, a qual pode ser usada para a proteção do terminal C dosfragmentos de peptídeo e diversas opções estão disponíveis para adesproteção química, nenhum dos métodos disponíveis é, no geral, aplicável.
A maioria destes ésteres são de uma natureza primária, por exemplo, metilésteres e, desta maneira, causa a formação de dicetopiperazina o estágio dodipeptídeo desprotegido. Além disso, a introdução da função éster,freqüentemente requer um ativação relativamente forte da função carboxílicaresultando na perda da integridade enantiomérica do aminoácido esterificado.
Finalmente, a função éster, é freqüentemente desbloqueada sob condiçõesácidas ou básicas que leva a modificações no peptídeo real. Na base de suaestabilidade alta, sua facilidade de introdução e sua biodisponibilidadecomercial ampla, o terc-butil éster é preferido se a desproteção seletiva napresença de grupos de proteção de cadeia secundária puder ser atingida.Entretanto, a desproteção química é, no geral, não aplicável para estepropósito.
Os métodos enzimáticos ganharam interesse na síntese depeptídeo durante alguns anos passados. As enzimas freqüentementeapresentam quimio-, regio- e estereo-seletividade alta. Além disso, asenzimas, usualmente, operam sob condições muito brandas, em valores de pHneutro e em temperaturas de 20 a 50°C. desta maneira, sob tais condições, asreações secundárias catalisadas por ácido ou base podem ser evitadas.
É conhecido na técnica que alguns grupos de copulação sãocliváveis por enzimas, que podem ser usadas no desbloqueio de peptídeos.Em particular, os ésteres podem ser aplicados, que podem ser hidrolisados porlipases, esterases e proteases. As lipases e esterases são, usualmenteconsideradas como, mais no geral, aplicáveis à química do grupo de proteçãona síntese de peptídeo, visto que uma desvantagem das proteases é que estastambém podem hidrolisar as ligações de peptídeo (atividade deendopeptidase). Recentemente, foi observado que certas lipases e esterasesque carregam o motivo de aminoácido GGG(A)X (em que G indica glicina eX qualquer aminoácido; em algumas enzimas, uma glicina é substituída poralanina, A) mostram remoção branda e seletiva de grupos de proteção de terc-butil éster em derivados de aminoácido e compostos relacionados. Foiconcluído que, em particular, duas enzimas, BsubpNBE (p-nitrobenzilesterase recombinante de Bacillus subtilis produzidos em E. coli) e CAL-A(lipase A de Candida antarctica (Novozymes)) podem ser usadas na químicaorgânica sintética para a clivagem de terc-butil ésteres de vários substratos(Schmidt M. et al., J. Org. Chem. 2005, 70, 3737-3740). As atividadesdaquelas enzimas, entretanto, não foram testadas em terc-butil ésteres C-terminais de peptídeos, com a exceção de um dipeptídeo que não mostraqualquer atividade. A solubilidade de peptídeos protegidos provavelmenteapresentará um problema nos sistemas de solvente que foram aplicados paratestar as atividades enzimáticas, usando-se, em particular, tolueno, n-hexano eéter dietílico como co-solventes. No geral, entretanto, peptídeos protegidos e,especialmente peptídeos protegidos longos requerem solventes polares paradissolução (por exemplo, DMF, NMP, diclorometano, metanol ouacetonitrila).
A despeito do fato que as proteases são menos preferidas, ouso de uma protease denominada termitase relatadamente resultou nahidrólise eficaz de ésteres de peptídeo (Schultz M. et ai., Synlett. 1992, 1, 37-38). Entretanto, a termitase não encontrou uso amplo na síntese de peptídeo apartir do tempo quando esta foi relatada. Isto, entre outras razões, deveocorrer devido à sua disponibilidade comercial limitada (código de família EC3.4.21.66), que impede gravemente o escalonamento até a escala industrial.
Desta maneira, ainda existe uma necessidade quanto aosprocessos enzimáticos geralmente aplicáveis para a remoção de ésteres Ο-terminais, em particular terc-butil ésteres, na química de peptídeo,especialmente para processos em escala industrial.
Além disso, como uma alternativa à síntese química depeptídeos, existe um interesse de desenvolvimento na síntese enzimática depeptídeos, em que tanto as etapas de copulação quanto de desproteção podemser mediadas pelas enzimas específicas. Visto que as etapas de copulaçãomediadas pelas enzimas não evocam nenhuma racemização como oposto àalternativa química, o alongamento do desenvolvimento de peptídeos podeocorrer na direção do terminal C. Uma tal síntese está em efeito de umasíntese convergente em que o fragmento de terminal C é substituído por umderivado de aminoácido; do mesmo modo, este, portanto, deve tirar proveitoda disponibilidade de, no geral, processos enzimáticos aplicáveis para aremoção de ésteres C-terminais, em particular, terc-butil ésteres.
Finalmente, a disponibilidade de processos aplicáveis para aremoção de ésteres C-terminais, em particular terc-butil ésteres, devem sermuito proveitosos na síntese de peptídeo que compreende ciclizações depeptídeo que envolve o terminal C do precursor linear (isto é, ciclizações decadeia parte frontal-a-parte final e parte final-a-parte lateral). Tais ciclizaçõespodem acontecer na solução, mas também em um suporte sólido quando oprecursor linear é ancorado por intermédio de sua cadeia N-terminal ousecundária.
Um novo processo foi agora observado para a hidróliseenzimática seletiva de terc-butil ésteres de substratos de peptídeo na síntesede peptídeos, que compreende hidrolisar um ou mais substratos de peptídeoque compreende terc-butil ésteres C-terminais usando-se a protease subtilisinaem qualquer forma adequada.
Surpreendentemente, foi observado que rendimentos altos, atéquantitativos, do produto hidrolisado podem ser obtidos usando-se a proteasesubtilisina, enquanto a atividade de endopeptidase é substancialmentesuprimida.
O novo processo desta invenção pode ser convenientementeusado na produção de peptídeos protegidos e não protegidos. O processo é,em particular, favorável na síntese convergente de peptídeos.
Preferivelmente, o terc-butil éster C-terminal dos substratos depeptídeo compreende um resíduo de acila C-terminal que é um resíduo de a-amino acila de origem natural ou sintética. O resíduo de α-amino acila C-terminal pode ser protegido ou desprotegido na cadeia secundária. Emparticular, são preferidos os resíduo de α-amino acila C-terminal selecionadosde Ala, Cys protegido, Asp protegido, Glu protegido, Phe, Gly, His, Lys(protegido), Leu, Met, Asn, Gln, Arg (protegido), Ser (protegido), Thr, Vai,Trp (protegido) e Tyr (protegido), em que os parênteses em torno da palavra"protegido" significa que o resíduo pode estar presente tanto na forma deprotegida quanto desprotegida de cadeia secundária. O código de três letraspara os aminoácidos é usado aqui, de acordo com a nomenclatura IUPAC(IUPAC-IUB Commission (1985) J. Biol Chem. 260, 14-42).
Preferivelmente, substratos de peptídeo protegidos oudesprotegidos usados no processo desta invenção são preparados pela síntesena fase de solução. Em uma outra forma de realização preferida, os substratosde peptídeo protegidos ou desprotegidos usados no processo desta invençãosão preparados de acordo com DioRaSSP®. Desta maneira, um substrato depeptídeo que compreende um terc-butil éster C-terminal é preferivelmentepreparado de acordo com este processo para a síntese em solução rápida deum peptídeo em um solvente orgânico ou uma mistura de solventes orgânicos,o processo compreendendo ciclos repetitivos das etapas de (a) a (d):
(a) uma etapa de copulação, usando um excesso de umcomponente carboxílico ativado para acilar um componente amino,
(b) uma etapa de extinção em que um removedor é usado paraa remoção de funções carboxílicas ativadas residuais, em que o removedortambém pode ser usado para a desproteção do peptídeo de desenvolvimento,
(c) uma ou mais extrações aquosas eopcionalmente, (d) uma etapa de desproteção separada,seguida por uma ou mais extrações aquosas, desse modo em pelo menos umciclo na etapa de processo b, uma amina que compreende um ânion livre ouum ânion latente é usado como um removedor de funções carboxílicasativadas residuais. A amina é preferivelmente é preferivelmente β-alaninatode benzila ou um sal do mesmo.
A hidrólise do processo da presente invenção pode serrealizada em um tampão aquoso. Entretanto, para propósitos de solubilidadee/ou para suprimir a atividade de endopeptidase, a hidrólise do processo dainvenção é preferivelmente realizada em uma mistura de um tampão aquoso eum ou mais solventes orgânicos. Os tampões adequados podem serselecionados a partir de tampões que são, no geral, usados paratransformações usando-se enzimas proteolíticas. Em particular, o tampãoaquoso é um tampão de fosfato, borato ou TRIS. Os solventes orgânicospolares são preferidos e, em particular, o solvente orgânico é selecionado deΝ,Ν-dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, TV1TV-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetraidrofurano (THF),acetonitrila e terc-butanol. Particularmente preferido é o DMF.Conseqüentemente, a porcentagem do solvente orgânico na mistura podevariar de O a 60% (v/v), preferivelmente de 30 a 60% (v/v), isto éespecialmente útil quando a porcentagem do solvente orgânico na mistura éde cerca de 50 a 60% (v/v).
O pH em que a reação é realizada pode ser selecionado dafaixa de 6,5 a 10, em particular de 6,5 a 8 e, preferivelmente, o pH é 7.
As temperaturas de para a hidrólise podem ser adequadamenteselecionadas na faixa de 20 a 60°C. é preferida uma temperatura de reação de40°C.
A quantidade de enzima pode ser adequadamente selecionadana faixa de 1 a 50% em peso de enzima com relação ao substrato de peptídeo.
Em uma outra forma de realização da invenção, a hidrólise érealizada adicionando-se porções por etapas da protease subtilisina (emqualquer forma adequada) à mistura de reação que compreende um ou maissubstratos de peptídeo que compreende terc-butil ésteres C-terminal.
Os substratos de peptídeo cujos terc-butil ésteres C-terminaissão hidrolisados no processo da invenção, pode carregar grupos de proteçãoem outras partes de sua seqüência de peptídeo. A hidrólise pode ser realizadocom um substrato de peptídeo bem como uma mistura destes. Foi estabelecidoque o desempenho da hidrólise de uma mistura de substratos de peptídeo quecompreende terc-butil ésteres C-terminais não é significantemente reduzidopela presença de mais do que um substrato de peptídeo.
Um processo adequado de acordo com a presente invenção écomo segue.A uma solução agitada de terc-butil éster de um peptídeo emuma mistura de um solvente orgânico adequado (ou mistura de solventesorgânicos) e um tampão, a subtilisina é adicionada [por exemplo: a 0,1 mmolde um terc-butil éster de um peptídeo em uma mistura de 2,5 ml de DMF e2,5 ml de tampão de fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0, 40°C), 5 mg desubtilisina são adicionados]. Quando a conversão de substrato atingiu umnível desejado, por exemplo, maior do que 95% (como determinado porHPLC), uma quantidade de acetato de etila é adicionada. Após a separação dafase aquosa, a fase orgânica é extraída duas vezes com solução de cloreto desódio e concentrado a vácuo. O peptídeo desprotegido de terminal C ou ofragmento de polipeptídeo é isolado pela precipitação com um éter dietílico,éter metil terc-butílico ou heptano semelhante não solvente. No caso de umaenzima imobilizada, a enzima é removida pela filtração antes doprocedimento de trabalho descrito.
A protease subtilisina (EC 3.4.21.62) pode ser usada noprocesso da invenção em qualquer forma, desta maneira esta pode ser usadana forma solúvel e/ou cristalizada, mas também na forma imobilizada ououtra forma insolúvel, por exemplo, na forma de agregados de enzimareticulados (CLEA) ou cristais de enzima reticulados (CLEC).
O termo 'substrato' aqui, significa uma entidade que éconvertida a um produto pela protease subtilisina em qualquer forma. Esteproduto pode ser um produto de peptídeo final, desse modo, se presenteapenas os grupos secundários protegidos, ainda devem ser desprotegidos.
Alternativamente, este produto também pode ser um fragmento de peptídeoque é subseqüentemente reagido com outros fragmentos de peptídeo em umasíntese convergente para obter um peptídeo mais longo com o número finalrequerido de aminoácidos.
Uma pessoa habilitada na técnica pode identificar facilmenteos substratos adequados, por exemplo, pela realização de uma hidrólise deteste simples de um peptídeo selecionado que compreende umafuncionalidade de terc-butil éster C-terminal sob condições adequadas comodescrito anteriormente e seguindo a conversão, por exemplo, pelas técnicas deHPLC. Isto foi observado pela hidrólise de dipeptídeos modelo da estruturageral Z-Val-X-OBut na presença de Alcalase CLEA e 50% v/v de DMF (paradetalhes, ver o Exemplo 3) cuja reatividade para estes substratos modelo quecompreendem uma funcionalidade de terc-butil éster C-terminal pode serdividida em quatro categorias:
<table>table see original document page 10</column></row><table>
Se a reatividade for indicada ser "não responsiva", tambémapós a otimização, o peptídeo selecionado não é um substrato de acordo coma invenção.
Com base na estrutura destes substratos de peptídeo modelo osresultados são considerados indicativos da reatividade do derivado deaminoácido X selecionado com relação à protease subtilisina em qualquerforma adequada. Isto é confirmado pelo Exemplo 5 em que foi testado quecombinações de aminoácido são suscetíveis à atividade de endopeptidase daprotease subtilisina. Mais particularmente, os substratos de tetrapeptídeomodelo da estrutura geral Z-Val-Val-X-Leu-OBut foram hidrolisados napresença de Alcalase CLEA e 50% v/v de DMF (para detalhes, ver Exemplo5). Além disso, o Exemplo 5 demonstra que a atividade de esterase emrelação com o derivado de aminoácido X é indicativo da atividade deendopeptidase com relação àquele derivado de aminoácido X. Entretanto, éenfatizado que sob as condições otimizadas do processo da presente invenção,a atividade de endopeptidase é significantemente menor do que a atividade deesterase.
É estabelecido que o processo é muito adequado para apreparação de peptídeos curtos, tais como dipeptídeos, tripeptídeos etetrapeptídeos. Além disso, com base nos argumentos mencionados acima nabase dos Exemplos 3 e 5 um homem habilitado também é capaz de prepararpeptídeos mais longos que compreendem derivados de aminoácido que sãoesperados ter reatividade ruim ou medíocre em qualquer mas a posição doterminal C do peptídeo. Neste sentido, os derivados de aminoácido D podemser considerados como derivados de aminoácido não responsivos e, destamaneira, os peptídeos também podem ser preparados com aminoácidos D emqualquer, mas na posição de terminal C.
O termo 'protegido' significa que os grupos funcionais (dentrodo peptídeo) são protegidos com os grupos de proteção adequados. Umapessoa habilitada na técnica conhecerá qual tipo de proteção selecionar paraaquele tipo de grupo funcional. Por exemplo, funções amina presentes noscompostos podem ser protegidas durante o procedimento sintético por umgrupo de proteção N, que significa um grupo comumente usado na química depeptídeo para a proteção de um grupo α-amino, como o grupo terc-butiloxicarbonila (Boc), o grupo benziloxicarbonila (Z) ou o grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Visões gerais de grupos de proteção aminoe métodos para a sua remoção são dados em Geiger R. and Konig W. (1981)em Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol 3, Gross E. and Meienhofer,J., eds, Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-99, e Peptides: Chemistry andBiology, Sewald N. and Jakubke H.-D., eds, Wiley-VCH, Weinheim, 2002,pp. 143 - 154. As funções do tipo terc-butila ou funções de instabilidadesimilar são preferidas para a proteção de outros grupos funcionais nas cadeiassecundárias; estes incluem - mas não são limitados a - terc-butila (But) para aproteção das cadeias secundárias de Asp, Glu, Ser, Thr e Tyr, terc-butoxicarbonila (Boc) para a proteção das cadeias secundárias Lys e Trp,tritila (Trt) para a desproteção das cadeias secundárias Asn5 Gln e His e2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonila (Pmc) ou 2,2,4,6,7-pentametildiidrobenzofurano-5-sulfonila (Pbf) para a proteção da cadeiasecundária Arg [Barany, G. and Merrifield, R.B. (1980) em: 'The Peptides',vol. 2 (Gross, E. and Meienhofer, J., eds.) Academic Press, Nova Iorque, pp.1-284; para Trp(Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem.Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) e Gln(Trt): Sieber, P. and Riniker, B.(1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. and Riniker,B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; para Pmc: Ramage, R. and Green,J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al.(1993) TetrahedronLett. 34, 7829-7832].
A invenção ainda é ilustrada pelos seguintes exemplos, quenão devem ser interpretados como uma limitação desta invenção.
EXEMPLOS
O tetrapeptídeo do Exemplo 2 e o tetrapeptídeo do Exemplo 5em que X = Met foi preparado de acordo com DioRaSSP® (EP-A-1.291.356;US 6.864.357; Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J.Pept. Sei. 2005, 11, 633-641), visto que os dipeptídeos, tripeptídeos, e otetrapeptídeo do Exemplo 5 em que X = Arg foram produzidos de acordo commétodos de fase de solução convencional para síntese de peptídeo. Os outrostetrapeptídeos do Exemplo 5 são preparados de acordo com os métodos defase de solução convencional aplicando-se um protocolo de divisão e mistura.
O protocolo de divisão e mistura foi aplicado a fim de reduzir a quantidade detrabalho preparativo.
A enzima subtilisina A livre (S. Carlsberg) usando noExemplo 1 foi adquirida de Sigma Aldrich.
A enzima subtilisina A livre usando nos outros exemplos foiadquirida de Novozymes. Alcalase CLEA foi obtido de CLEA TechnologiesB.V., Delft, The Netherlands.Exemplo 1
Subtilisina livre
Procedimento geral Subtilisina A:
0,1 mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em umamistura termoestabelecida de 2,5 ml de DMF e 2,5 ml de tampão de fosfato0,1 M pH 7, 5 mg de enzima foram adicionados à solução de peptídeo. Amistura de reação foi incubada a 40°C para um total de duas horas. Asmisturas de reação foram analisadas após 2 horas usando HPLC.
(Alguns resultados selecionados de substratos de subtilisinabons são mostrados.)
Tabela 1
<table>table see original document page 13</column></row><table>
Exemplo 2
0,05 mmol de Boc-Gly-Phe-Phe-Leu-OBut foi dissolvido emuma mistura termoestabelecida de 2,5 ml de NMP e 2,5 ml de tampão defosfato 0,1 M pH 8. Para esta solução 5 mg de Alcalase CLEA foramadicionados. A mistura de reação foi incubada a 40°C para um total de 17horas. A conversão de substrato é determinada pelo HPLC. A reação resultou,após 17 horas, em > 95% de rendimento de Boc-Gly-Phe-Phe-Leu-OH.
Exemplo 3
Desproteção de dipeptídeos modelos por Alcalase CLEA e subtilisina AProcedimento geral Subtilisina A:
0,1 mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em 2,5 mlde DMF. 5 mg de enzima foram dissolvidos em 2,5 ml de tampão de fosfato0,1 M pH 7 e foram adicionados à solução de peptídeo. A mistura de reaçãofoi incubada a 40°C para um total de seis horas. As misturas de reação foramanalisadas após 6 horas usando HPLC e LC/MS.
Procedimento geral Alcalase CLEA:
0,1 mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em 2,5 mlde DMF. Para esta solução 5 mg de enzima foram adicionados junto com 2,5ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7. A mistura de reação foi incubada a 40°Cpara um total de seis horas. As misturas de reação foram analisadas após 6horas usando HPLC e LC/MS.
Tabela 2
<table>table see original document page 14</column></row><table><table>table see original document page 15</column></row><table>
Exemplo 4
Otimização da quantidade de enzima para um substrato de peptídeo bom e ummedíocre
Procedimento geral
0,1 mmol de cada um dos peptídeos foi dissolvido em 2,5 mlde DMF. A subtilisina A foi dissolvida em 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 MpH 7 e adicionado à solução de peptídeo. A mistura de reação foi incubada a40°C. As misturas de reação foram submetidas a amostragem no período dereação indicada e analisada por HPLC. Quando necessário porções extras deenzima foram adicionadas em intervalos de 2 horas.Tabela 3
<table>table see original document page 16</column></row><table>
Exemplo 5
Identificação de substratos de peptídeo susceptíveis a clivagem endopeptídica.Procedimento geral Alcalase CLEA:
0,1 mmol de cada um dos tetrapeptídeos (ou misturas detetrapeptídeos) foram dissolvidos em 2,5 ml de DMF. Para esta solução 5 mgde enzima foram adicionados junto com 2,5 ml de tampão de fosfato 0,1 MpH 7 e foram adicionados à solução prévia. A mistura de reação foi incubadaa 40°C. As misturas de reação foram analisadas após 2 horas e 6 horas porHPLC. No caso da reação não atingir a finalização, porções adicionais deenzima [5 mg cada] foram adicionadas no final de seis horas e durante a noite(aproximadamente 24 horas de reação). A última alíquota foi analisada porLC/MS para verificar a presença do composto desejado e de quaisquerimpurezas sendo Z-Val-Val-X-OH e/ou H-XLeu-OH.Tabela 4
<table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table>
1) traços de substrato detectado em LC/MS;
2) Tempo de retenção de substrato igual àquele de Z-Val-Val-Arg(Pbf)-Leu-OH;
3) Tempo de retenção de substrato igual àquele de Z-Val-Val-Tyr(But)-Leu-OH.
n.d. = nenhuma impureza de endopeptidase detectada
Exemplo 6
Escalonamento do procedimento
Para uma solução agitada de 606 mg (1 mmol) Z-Val-Trp-Leu-OBut em 25 ml de DMF 25 mg de Alcalase CLEA foram adicionados juntocom 25 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 7. A mistura foi agitada a 40°C. Oprogresso da reação foi monitorada por HPLC. As porções extras de enzima(25 mg de cada Alcalase CLEA) foram adicionados após 24 horas e após 48horas. Após 6 dias a reação foi interrompida. A mistura de reação foiacidificada a pH 2 e DMF foi evaporado. O produto foi extraído com acetatode etila. A camada orgânica foi secada usando sulfato de sódio, concentrado àvácuo e o produto final precipitado a partir de heptano. Nenhuma impurezarelacionada com a endopeptidase foi identificada durante a análise docomposto final tanto por HPLC quanto por LC/MS.
Rendimento: 96,2%
Pureza de HPLC: 96,5% a/a (o composto final também continha 2,5% a/a domaterial de partida).
Claims (24)
1. Processo para a hidrólise enzimática seletiva de terc-butilésteres C-terminais de substratos de peptídeo, caracterizado pelo fato de serna síntese de peptídeos, compreendendo hidrolisar um ou mais substratos depeptídeo compreendem terc-butil ésteres C-terminais usando-se a proteasesubtilisina em qualquer forma adequada.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o substrato de peptídeo que compreende o terc-butil éster C-terminal compreende resíduo de acila C-terminal que é um resíduo de α-amino acila de origem natural ou sintética.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o resíduo de α-amino acila é selecionado de Ala, Cysprotegido, Asp protegido, Glu protegido, Phe, Gly, His5 Lys (protegido), Leu,Met, Asn, Gln, Arg (protegido), Ser (protegido), Thr, Vai, Trp (protegido) eTyr (protegido).
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o substrato de peptídeo é um di-, tri- outetrapeptídeo.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o substrato de peptídeo é preparado pelasíntese na fase de solução.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o substrato de peptídeo é preparado de acordo com umprocesso para a síntese em solução rápida de um peptídeo em um solventeorgânico ou uma mistura de solventes orgânicos, o processo compreendendociclos repetitivos das etapas (a) a (d):a) uma etapa de copulação, usando um excesso de umcomponente carboxílico ativado para acilar um componente amino,b) uma etapa de extinção em que um removedor é usado para aremoção de funções carboxílicas ativadas residuais, em que o removedortambém pode ser usado para a desproteção do peptídeo de desenvolvimento,c) uma ou mais extrações aquosas eopcionalmente, (d) uma etapa de desproteção separada,seguida por uma ou mais extrações aquosas,desse modo em pelo menos um ciclo na etapa de processo buma amina que compreende um ânion livre ou um ânion latente é usado comoum removedor de funções carboxílicas ativadas residuais.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 6, caracterizado pelo fato de que a protease subtilisina é da família EC-3.4.21.62.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 7, caracterizado pelo fato de que a protease subtilisina é subtilisina livre.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 7, caracterizado pelo fato de que a protease subtilisina é subtilisinaagregada de enzima reticulada (CLEA).
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a hidrólise é realizada em uma misturade um tampão aquoso e um solvente orgânico.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o solvente orgânico é um solvente polar.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o solvente orgânico é selecionado de 7V,iV-dimetilformamida(DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, A^TV-dimetilacetamida(DMA), diclorometano (DCM), tetraidrofurano (THF), acetonitrila e terc-butanol.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o solvente orgânico é DMF.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a porcentagem do solvente orgânicona mistura é de 50 a 60%.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o pH em que a reação é realizada éselecionado da faixa de 6,5 a 10.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o pH é selecionado da faixa de 6,5 a 8.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o pH é 7.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a temperatura de reação para ahidrólise é de 20 a 60°C.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a temperatura de reação para a hidrólise é de 40°C.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a quantidade de enzima varia de 1 a 50% em peso com relação ao substrato de peptídeo.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a hidrólise é realizada adicionando-se as porções por etapas da protease subtilisina na mistura de reação quecompreende um ou mais substratos de peptídeo que compreende terc-butilésteres C-terminal.
22. Processo para a síntese convergente de um peptídeo dedois ou mais fragmentos de peptídeo, caracterizado pelo fato de que pelomenos um dos fragmentos de peptídeo é preparado de acordo com umprocesso como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 21.
23. Processo para a síntese enzimática por etapas de umpeptídeo na direção do terminal C, caracterizado pelo fato de estar de acordocom um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a- 21.
24. Processo para a síntese de peptídeo, caracterizado pelo fatode que compreende a ciclização de peptídeo que envolve o terminal C doprecursor linear de acordo com um processo como definido em qualquer umadas reivindicações de 1 a 21.
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