JPH0219908B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、水性流体中の成分を分析するための
多層分析素子に関する。更に詳述すれば、生物学
的流体中の成分を分析するための改良された多層
分析素子に関する。 従来、体液中に存在する特定の生化学的物質を
検出する分析素子が開発され、臨床試験等に使用
されている。これらは分析素子に含浸させた試薬
が検出対象となる物質と反応して呈出する現象を
利用するものである。最近、特に紙等に試薬を
含漬させた分析素子が広く使用されている。 例えば米国特許第3050373号または同第3061523
号等に記載されているように紙の如き繊維質多
孔性層に試薬溶液を浸漬し乾燥して作られるもの
がある。更にそれを用いて検出する時に種々の妨
害をさける試みがされている。 例えば特公昭50−39558号公報に記載されてい
るように、紙に試薬溶液を含浸させて乾燥させ
たものをエチルセルロースの如き溶液に浸漬し乾
燥することによつて半透性膜を被覆し、過剰の液
体試料の接着を抑制したり、水保持性をコントロ
ールしたり、或いは更に特公昭53−6551号公報に
記載されているように、試薬を含浸させた紙の
上に織物またはウエブ等の目の細かい網で覆い、
手の接触等による汚染から保護することが行われ
ている。 これらの分析素子は、その取扱いが簡便であり
且、直ちに結果が得られるが、しばしば分析素子
を不均一に呈色させ分析結果にバラツキを生じさ
せるため定量性が劣り、定量性が劣り、定性分析
もしくは半定量分析にとどまつている。これは
紙の如き繊維質の多孔質層においては、まずその
構造上均一なものを得ることが難しく、これに試
薬を含浸させた場合にも均一な試薬の分析が得ら
れないのが普通であり、更には繊維質の紙の如
きものを用いる場合には所謂クロマトグラフ現象
のため、試薬含有層の中で分析サンプル成分また
は反応試薬に過度の非均一泳動が起こり局部的な
高濃度化が起こるためである。 これら従来の分析試験紙の欠点を改善し、かつ
従来のものに比べ、飛躍的にその定量性を向上し
たものとして、例えば特公昭53−21677号公報、
特開昭56−24576号公報等の如き多層分析素子が
知られている。 しかしながら、上記多層分析素子も、この試薬
層中に含まれる各種試薬が貯蔵期間中に重大な劣
化を示し、従つて分析の精度および信頼性に著し
く不利益を与える。これらは多層分析素子を構成
する素材が水性流体に対し透過性を有している為
空気および水の影響を大きくうけ、分析素子に含
まれる、過酸化物が指示組成物を酸化するのに触
媒作用を示すペルオキシダーゼの活性を劣化させ
る事による。 従つて、水性流体の成分の濃度を正確、かつ矛
盾なく比例し検知可能な生成物を生成する事が妨
害される。 更に被検体試料である水性流体を前述の分析素
子に適用した際に単位面積当り多量の水性流体が
親水性コロイド物質から成る試薬層に含有され、
かつ室温以上の温度で該素子がインキユベートさ
れる。このため、多層分析素子の試薬層の水性流
体吸収部分において、該層の親水性コロイド物質
の不望の膨潤または溶解を起こし、これによつて
試薬層内に生成した検知可能な物質の泳動、すな
わちクロマトグラフ現象の著しい増大により均一
な発色が望めないという欠点を有している。 上記欠点を改善するための提案は、特開昭54−
50393号公報に詳述されている。即ちアニオン性
単量体を共重合した水分散性重合体、即ち高分子
ラテツクスを該試薬層に添加することにより試
薬、特にペルオキシダーゼの保存性の著しい改善
を示していることが記載されている。 しかしながら、上記高分子ラテツクスはゼラチ
ンとの相互作用が強く、塗布液調整時にしばしば
凝集を起こすことが知られている。 また、他の欠点としてアニオン性単量体がラテ
ツクス粒子に導入することが難かしく、共重合体
の製造時にも凝集を起こすという製造上の欠点を
有している。 上記欠点を克服するために鋭意研究を行なつて
きた。 本発明の第一の目的は、試薬の保存性を改良し
た多層分析素子を提供することにある。第二の目
的は、定量性を有し、かつ熟練した操作技術を必
要とすることなく簡単に測定できる多層分析素子
を提供することにある。 本発明のかかる目的および以下に述べる目的
は、光透過性の支持体上に、流体試料中の成分と
反応する少なくとも一種の試薬を含みかつ親水性
コロイド物質を含む少なくとも一層の試薬層と、
その上方に多孔質性展開層とを有する多層分析素
子において、前記試薬層のうちの少なくとも一層
の試薬層に、下記一般式〔〕で示される少なく
とも一種の共重合可能な単量体と少なくとも一種
の共重合可能な疎水性単量体とを共重合させた実
質的に水分散性の共重合体を含有することを特徴
とする多層分析素子によつて達成される。 一般式〔〕 式中、R₁，R₂は水素原子またはメチル基、R₃
は水素原子または１価の有機残基であり、詳しく
は低級アルキル基（例えばメチル基、エチル基
等）、アリール基（例えばフエニル基等）等であ
り、Ｘは酸素原子または

【式】で表わされる二 価の有機基であり、ここではR₄は水素原子また
は

【式】またはアルキル基であ る。またｎおよびｍはそれぞれ２乃至100の整数
である。 次に本発明の非イオン解離性単量体の代表的具
体例を以下に示すが、これらに限定されるもので
はない。

【表】

【表】 本発明に用いられる他のビニル単量体は、疎水
性を有しラジカル重合が可能なものであれば、そ
られを単独または二種以上用いることは任意であ
る。また疎水性ビニル単量体にアクリル酸の如き
親水性単量体を共重合させることも可能である。 ビニル単量体としては、共重合可能なエチレン
性不飽和ニトリル類、スチレン類、アクリル酸エ
ステル類、メタアクリル酸エステル類、アクリル
アミド誘導体類、メタアクリルアミド誘導体類、
ビニル異節環化合物、架橋性単量体、ハロゲン化
ビニル類、ハロゲン化ビニリデン類、ビニルエス
テル類、ビニルエーテル類、共役ジエン類を挙げ
ることができる。 共重合可能なエテレン性不飽和ニトリルとして
は、例えばアクリロニトリル、メタアクリロニト
リル、α―クロルアクリロニトリルを挙げること
ができる。 スチレン類としては、例えばスチレ、ｐ―メチ
ルスチレン、α―メチルスチレン、ｐ―クロルス
チレン、クロルメチルスチレンを挙げることがで
きる。 アクリル酸エステル類としては、例えばアクリ
ル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸―ｎ
―ブチル、アクリル酸―ｎ―プロピル、アクリル
酸―iso―ブチル、アクリル酸―sec―ブチル、を
挙げることができる。メタアクリル酸エステル類
としては、例えばメタアクリル酸メチル、メタア
クリル酸エチル、メタアクリル酸―ｎ―ブチル、
を挙げることができる。 アクリルアミド誘導体類としては、例えばジア
セトンアクリルアミド、ベンジルアクリルアミド
を挙げることができる。 メタアクリルアミド誘導体類としては、例えば
ベンジルメタアクリルアミドを挙げることができ
る。 ビニル異節環化合物としては、例えばビニルベ
ンジルイミダゾール、ビニルピリジン類（例えば
４―ビニルピリジン、２―ビニルピリジン等）を
挙げることができる。 架橋性単量体としては、例えばジビニルベンゼ
ン、エチレングリコールジメタアクリレート、ト
リメチロールプロパントリアクリレート、ペンタ
エリトリツトトリメタアクリレートを挙げること
ができる。 ハロゲン化ビニル類としては、例えば塩化ビニ
ル、フツ化ビニル等を挙げることができる。 ハロゲン化ビニリデン類としては、例えば塩化
ビニリデン、フツ化ビニリデン等を挙げることが
できる。 ビニルエステル類としては、例えば酢酸ビニ
ル、酪酸ビニル等を挙げることができる。 ビニルエーテル類としては、例えばビニルメチ
ルケトン、共役ジエン類としては、例えば１，３
―ブタジエン、イソプレン、２，３―ジメチル―
１，３―ブタジエン等を挙げることができる。 前述の如く種々の共重合可能なビニル単量体を
用いることが出来るが、本発明の一般式〔〕で
表わされる非イオン解離性単量体は約0.5乃至約
30重量％用いることが可能であり、好ましくは約
1.0乃至約20重量％用いることが出来る。共重合
可能な疎水性ビニル単量体は約70重量％乃至99.5
重量％、好ましくは約80重量％乃至約99重量％用
いることが可能である。 次に本発明の水分散性共重合体の代表的具体例
を挙げるが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。 例示共重合体例 本発明に係る水分散性共重合体は、前述の如く
本発明の非イオン解離性単量体およびビニル単量
体と界面活性剤を用い水溶性のラジカル重合開始
剤によつて通常の乳化重合法により合成すること
が出来る。 また、更に本発明の非イオン解離性単量体とビ
ニル単量体を用い水溶性ラジカル重合開始剤によ
つて界面活性剤を用いない、いわゆる無乳化剤乳
化重合法を用いて水分散性共重合体を合成するこ
とも可能である。 以下に本発明に係る水分散性共重合体の合成例
を示すが、本発明はこれによつて限定されるもの
ではない。 合成例 １ （例示共重合体例(1)の合成） 撹拌装置、冷却管、温度計、窒素導入管付きの
１−四頭コルベンに脱気した脱イオン水500ml
トラツクスＨ−45（日本油脂(株)、有効成分30％）
5.0ml、単量体例(2)の化合物7.5ｇを入れ窒素気流
下、室温で250rpmの撹拌速度で１時間撹拌した。
この後内温が45℃になるまで上昇させ、アクリル
酸メチル142.5ｇを加え、過硫酸カリウム0.4ｇ、
メタ重亜硫酸ナトリウム0.3ｇを各々20mlの脱気
脱イオン水に溶解した水溶液を同時に加えた。 この後、内温45℃で３時間反応させ、更に内温
を60℃に上昇し同温度で３時間反応を行なつた。
反応終了後内温を室温まで下げ、内容物をとりだ
し過を行ない乳白色のラテツクスを得た。 重合率 99.7％ 粘 度 2.4cp（但し、Ｂ型粘度計による。） 合成例 ２ （例示共重合体例（15）の合成） 撹拌装置、冷却管、温度計、窒素導入管付きの
１―四頭コルベンに脱気した脱イオン水500ml
単量体例(2)の化合物６ｇを加え均一になるまで撹
拌した。この後スチレン132.0ｇ、メタアクリル
酸ｎ―ブチル12ｇを加え窒素気流下、室温で
300rpmの撹拌速度で撹拌した。 次いで内温を60℃まで昇温し、過硫酸カリウム
0.4ｇ、メタ重亜硫酸ナトリウム0.3ｇを各々20ml
の脱気した脱イオン水に溶解した水溶液を同時に
加えた。その後内温60℃、撹拌速度300rpm、窒
素気流下で８時間反応を行なつた。 反応終了後内温を室温まで下げ、内容物をとり
だし過を行ない乳白色のラテツクスを得た。 重合率 99.3％ 粘 度 2.8cp（但し、Ｂ型粘度計による。） このようにして合成された水分散性共重合体は
そのまま用いてもよいし、また透析或いは限外
過等の手段を用いて微量残存している単量体を除
去し、精製して用いることも勿論可能である。 本発明の光透過性支持体（以下本発明の支持体
という。）は、液体不浸透性であればその種類を
問わない。支持体としては、例えば酢酸セルロー
ス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネ
ート、またはポリスチレンのような種々の重合体
材料がこの目的に適す。支持体の厚さは任意であ
るが、代表的には約50ミクロンから250ミクロン
である。 本発明に係る試薬層は直接本発明の支持体に被
覆することは可能であるが、場合によつては光透
過性下塗層を使用して試薬層と支持体との間の接
着性を高めることも可能である。試薬層を設ける
目的は、これに分析すべき成分と検知可能な生成
物を生成する反応を行なわせる試薬を含有させる
ことにある。 １種または２種以上の試薬を、結合剤の親水性
コロイド物質中に分散または溶解させた被覆物が
好ましい。親水性コロイド物質としては天然また
は合成の物質が好ましいが、更に好ましくはゼラ
チン、ゼラチン誘導体、親水性セルロース誘導体
およびデキストラン、アラビヤゴム、アガロース
等のような多糖類および合成の親水性物質、例え
ばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリ
ドンのような水溶性ポリビニル化合物、水溶性ア
クリルアミド重合体等が含まるる。これらの選択
は検知可能な生成物の光学的性質等によつて一部
依存することもあり得る。 本発明の水分散性共重合体は、該試薬層の親水
性コロイド物質に添加あるいは一部置換すること
によつて前述の目的を達成することができる。こ
れら本発明の水分散性共重合体は該試薬層の総結
合剤の約５〜約60％を含有することができ、更に
好ましくは約15〜50％含有することができる。 これによつて前述の目的および他の目的が達成
される。他の目的の１つに塗布膜のカールを軽減
することがあり、更に他の目的の１つに塗布膜の
寸度安定性を向上することがある。 上記目的は写真工業において周知のことではあ
るが、多層分析素子の分野においても、これによ
つてより高い分析の信頼性を付与することができ
る。 更に予期せざる効果として、一定検体濃度間の
発色濃度の差が増大したことが挙げられる。分析
反応における一定検体濃度間の発色濃度の差の増
大は、即ち検出感度の上昇につながり、著しく有
利なものとなることは言うまでもない。 前述該試薬層中の試験試薬を適当に選択するこ
とによりグルコース、アルブミン、尿素、ビリル
ビン、アンモニア、尿酸、コレステロール、トリ
グリセリド、グルタミン酸オキサロ酢酸トランス
アミナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸トランスア
ミナーゼ、乳酸脱水素酵素、乳酸、クレアチニ
ン、アミラーゼ、塩化物、カルシウムのような血
液成分ならびに他の多くの成分の分析に使用しう
るように容易に構成することができる。 これらの試験試薬の保存性向上に対し、本発明
の水分散性共重合体を添加することは有効である
が、特に好ましい例として予かじめ決められた成
分を酸化するのに触媒作用を示す適当な酵素、お
よびペルオキシターゼの存在下で過酸化物と反応
して検知可能な生成物を産成することができる指
示組成物、PHを調整するための化合物等が挙げら
れる。西ドイツ公開公報第2735690号に、その例
が数多く挙げられている。このような具体例の１
つとして、グルコースオキシターゼ、、ペルオキ
シターゼ、７―ヒドロキシ―１―ナフトール、４
―アミノアンチビリン塩酸塩、PH６のリン酸緩衝
液系からなるグルコース分析用試薬が挙げられ
る。 前述試薬層に対して多層分析素子を形成するた
めの多孔性展開層は、米国特許第3929158号およ
び同第4042335号に記載の如く、拡散性、反射層、
遮断層、下塗り層、過層、もしくはレジストレ
ーシヨン層を有することができる。 これらは同上特許記載の如く、種々の白色顔料
に二酢酸セルロースを良溶媒と貧溶媒の共存下に
スラリー状に分散せしめ、前述の試薬層上に塗布
するものであり、これによつて一定の孔径および
高い空隙率を有する層を形成させた非繊維質多孔
質展開層と称せられるものである。これと同種の
ものとして、ミリポアフイルターの商品名で知ら
れるミクロフイルターも有用であることは言うま
でもない。 一方、上述の層と同様に特開昭56−24576号明
細書に記載の如き繊維展開層も用いることが可能
である。更には特開昭57−125847および特開昭57
−197466号公報に記載の繊維展開層も有用であ
る。 これらの層は、 (1) 一定容量の流体試料を単位面積当り一定容量
に試薬層内に均一に配布し (2) 流体試料中の分析反応を阻害する物質または
要因を除去し (3) 分光光度分析を行う際に支持体を経て、透過
する測定光を反射する良好なバツクグラウンド
作用を行う という三つの機能を有する。 これら三つの機能は、場合に応じて別々の層で
行うことも一つの層で全て行うことも任意であ
る。また、例えば前記機能の内、反射バツクグラ
ウンド機能のみ一つの層を用い他の二つの機能を
一つの層にうけもたせるような組合せも可能であ
る。 本発明で用いられる流体試料は、水溶液であれ
ば良いが、生物学的流体試料、例えば血液、リン
パ液、尿、などに適用される。血液は通常全血と
呼ばれる血球成分（赤血球、白血球、血小板等）
を含むものも、これらをのぞいた血漿または血清
を用いることも可能である。 分析に用いられる流体試料の量は目的によつて
選択されるが、通常微量分析で用いられる約５〜
50μが好ましく、更には８〜20μが好ましい
が、通常10μを用いることがよい。 以上述べてきたように本発明の素子は、それら
を分析すべき流体試料と接触させ、かつ前記素子
内に生成された検知可能な生成物の濃度を種々の
分光学的測定方法により測定することから前記流
体試料中の予め定められた成分の濃度を計算する
ことにより使用する。 本発明に従い種々の異なる素子を製造でき、そ
して臨床化学の分野に限ることなく、他の化学的
研究の分野に用いることが可能である。 本発明の具体的態様および従来技術の分析素子
の比較を実施例を用いて述べるが、本発明がこれ
によつて限定されるものではないことは言うまで
もない。 実施例 １ 厚さ180μの透明なポリエチレンテレフタレー
ト支持体上に (1) 試薬層として 脱イオン化ゼラチン 160mg／ｄm² 本発明の例示共重合体(1)または（15）
160mg／ｄm² １，７―ジヒドロキシナフタレン 6.60mg／ｄm² ４―アミノアンチピリン塩酸塩 9.70mg／ｄm² グルコースオキシターゼ
244.1 国際単位／ｄm² ペルオキシターゼ 248 AAP単位／ｄm² ジメトン 2.15mg／ｄm² ３，３―ジメチルグルタル酸 19.6mg／ｄm² を有する乾燥膜厚約30μの試薬層 (2) 非繊維質多孔性展開層として 酢酸セルロース 70.4mg／ｄm² 二酸化チタン 505.9mg／ｄm² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（非イオン界面活性剤） 13.8mg／ｄm² ポリウレタンポリマー 15.5mg／ｄm² から成る乾燥膜厚約140μの非繊維質多孔性層 上記の本発明のグルコース分析用分析素子のう
ち、例示共重合体(1)を用いたものを分析素子(1)、
例示共重合体（15）を用いたものを分析素子
（）とした。 更に上記の分析素子（）および（）で用い
た試薬層上に下記組成の繊維多孔性展開層を積層
し、各々分析素子（）および（）とした。 (2) 繊維多孔性展開層として 粉末紙（東洋紙(株)300メツシユ以上）
910mg／ｄm² コポリ（スチレン―グリシジルメタアクリレー
ト）（重量比90：10） 139mg／ｄm² オクチルフエノキシポリエトキシエタノール
（非イオン界面活性剤） 31.5mg／ｄm² から成る乾燥膜厚約160μの繊維多孔性展開層。 一方、比較分析素子（）として、本発明の水
分散性共重合体をゼラチンで置換したもの、およ
び本発明の水分散性共重合体を特開昭54−50393
号記載の水分散性共重合体（メチルアクリレー
ト／３―アクリロイルオキシプロパンスルホン酸
ナトリウム／２―アセトアセトキシエチルアクリ
レート＝88.75／4.75／6.5）に置換したものを比
較分析素子（）とした。（但し、展開層は非繊
維質多孔性展開層である。） 上記分析素子（）乃至（）および比較分析
素子（）、（）を５℃、暗所および25℃、暗所
で20週間放置した後、540nmで反射濃度を測定
し、放置前の測定値との差から保存後の劣化度 （Δ（％）＝｛（D_R−D_RO）／D_RO｝×100 D_R：20週間放置後の540nmでの反射濃度 D_RO：放置前の540nmでの反射濃度） を求めた。

【表】

【表】 以上、表−１に示した如く本発明の分析要素は
比較分析素子に比べ放置によるカブリ生成が少な
い良好なものであることが判る。 実施例 ２ 実施例１で用いた本発明のグルコース分析用分
析素子（）乃至（）と比較分析素子（）を
用いて、150mg／dl、350mg／dl、500mg／dlのグ
ルコースを含有するコントロール血清10μを用
いて、37℃、７分間インキベーシヨをした後に、
540nmの反射濃度を測定した。 結果を表−２に示す。

【表】 表−２に示した如く本発明の分析素子は、比較
分析素子に比べ発色濃度が高く、かつ傾きが大き
く、感度が高いことが判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 光透過性の支持体上に、流体試料中の成分と
   反応する少なくとも一種の試薬を含み、かつ親水
   性コロイド物質を含む少なくとも一層の試薬層
   と、その上方に多孔質性展開層とを有する多層分
   析素子において、前記試薬層のうちの少なくとも
   一層の試薬層に、下記一般式〔〕で示される少
   なくとも一種の共重合可能な単量体と少なくとも
   一種の共重合可能な疎水性単量体とを共重合させ
   た実質的に水分散性の共重合体を含有することを
   特徴とする多層分析素子。 一般式〔〕 〔式中、R₁，R₂は水素原子またはメチル基、R₃
   は水素原子または１価の有機残基であり、Ｘは酸
   素原子または【式】で表わされる二価の有機基 であり、ここでR₄は水素原子、アルキル基また
   は【式】で表わされる基である。 また、ｎおよびｍはそれぞれ２乃至100の整数で
   ある。〕