JPH02195882A - 生理活性物質を固定化した膜の製造方法およびそれによつて得られる膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は、生理活性物質を固定化した膜の製造方法とそ
れによって得られる固定化生理活性物質の膜に関する。

（従来の技術） 酵素、補酵素、ホルモン、レセプター、阻害剤等の生理
活性物質を不溶性担体に固定化して得た固定化生理活性
物質は、バイオリアクター　バイオセンサー、アフィニ
ティークロマトグラフィー用材料などとして化学薬品・
食品・医薬品の製造、臨床診断、治僚等に広く用いられ
ている。これらの場合に於て、用いられている固定化生
理活性物質の形態としては粒子状のものと膜状のものと
があシ、両者ともいくつかのグループによって研究され
ている。

多孔質の粒子状の担体を用いた固定化生理活性物質につ
いては最も良く研究されているが、粒子内および粒子周
囲の非攪拌層に基く拡散制限によシ固定化生理活性物質
の効率が低下し、場合によっては、潜在活性のごく一部
しか利用されないことが指摘されている（例えば特公昭
ｊＩ−３１４７３号）。

この問題点に対する対策として微孔性の膜に例えば酵素
を固定化し、基質水溶液を圧力を用いて膜中に透過させ
る反応方法が開発されている。

この様な膜固定化生理活性物質をバイオリアクター　バ
イオセンサー、アフィニティー分離用材料、臨床診断等
に巾広く応用するためには、膜担体は蛋白質との非特異
的相互作用が極力小さいことが重要で、そのためには親
水性が高く、荷電を持たないセルロース等の多抛類が材
質として好ましい。

多孔質セルロース膜に酵素その他の生理活性物質を化学
結合により固定化する方法については既にいくつかの方
法が知られている。例えば特開昭！６−タ７λ３！号、
特公昭よｔ−≠４ＬＪ！７号、特公昭ｔ２−Ｊ２りｌり
号にはセルロース膜に酸化剤を作用させて活性化した後
に酵素を固定化する方法が開示されている。又、英国特
許第７．／ざ３，２６０号にはセルロース等の膜にトリ
アジン誘導体を作用させて活性化した後に酵素を固定化
する方法が開示されている。

（発明が解決しようとする課題） これらの既知の方法によって生理活性物質を固定化した
セルロース膜を得ることができるが、これらの方法には
まだ問題点があり、実用的には満足できるものではない
。すなわち、酸化剤を用いる活性化法では、担体上に生
成したアルデヒド基が生理活性物質中の主にアミン基と
反応して７ツフベースを形成することによシ固定化され
ると考えられているが、シッフベースは不安定であるた
めに固定化生理活性物質の脱離が起りやすい。父、脱離
を防ぐためにＮ　ａ　ＢＨ’？Ｎ　ａ　ＢＨａ　ＣＮ等
で還元する方法を用いると、その処理により更に生理活
性が低下する。生理活性物質を固定化したあとで還元の
ような二段階目の反応を要しない方法としてトリアジン
誘導体による生理活性物質の固定化法が開発されたが、
この方法では固定化反応の速度が遅いために固定化に比
較的長い時間を必要とし、不安定な生理活性物質の場合
にはその間の失活が問題となることがある。

又、英国特許第７．ｉｔ３．ｉｔｏ号にはトリアジン誘
導体による膜の活性化に際して膜（濾紙やコツトン布）
をアルカリに浸漬することが示されているが、セルロー
ス製の非対称膜（例えばミクロフィルター）の様に細い
繊維から成る膜にこの方法を応用するとセルロースの加
水分解のためか膜がかなシ変形し、又強度も劣化すると
いう問題点がある。

そこで、活性化によってセルロース膜の膜物性を悪くす
ることなしに、しかも蛋白質に対して高い反応性を持つ
活性化手段を用いた固定化方法の開発が望まれていた。

本発明の目的はしたがって、セルロースを主成分とする
膜に対し、膜の変形や収縮を起こさずに生理活性を極力
維持したままで安定な化学結合によシ生理活性物質を固
定化する方法を提供することにある。

（Ｉｔ！ｌ！題を解決するための手段）本発明のこれら
の目的はセルロースを主成分とする膜を下記一般式（Ｉ
）で表わされる化合物と反応させて活性化した後、生理
活性物質を化学結合によＱ固定化することによって達成
された。

一般式（Ｉ） ％式％ 式中、Ｒは離脱基を表わす。

本発明で用いられる膜は、セルロースを主成分とするも
のであれば何でもよく、特に限定される２ものではない
が膜の一方の側に緻密な表面層を持ち、反対側の弐面に
比較的粗な多孔質層を待つ、平膜または中空系の形状の
非対称膜が特に好ましい。孔径が０．／μ〜ｉｏμの範
囲にある多孔質膜（例えばミクロフィルター）や、更に
孔径が小さく、分画分子量で表わして１ｏｏｏ−ｉ、ｏ
。

ｏ　、ｏｏｏであるいわゆる限外口過膜が好ましく使用
できる。これらの膜の製造法については例えハ％公［ｐ
　、ｒ−ｐ　ｔ　３３号、特公昭ｔコーノ！ｔ≠１、特
公昭４２−Ｊ弘ｔ≠！に開示されている。

膜の厚さ（中空系の場合は壁部分の厚さ）としてＦｉＩ
Ｄμ以上のものが好ましく使用できるが、ＩＱμ〜３０
０μが更に好ましい。

一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、より具体的には、
下記の一般式（ＩＩ）および一般式（ＩＩＩ）で表わさ
れる。

一般式（ｎ） 一般式（ＩＩＩ） 一般式（Ｉ）で表わされる化合物のＲは、各々置換基を
有してもよい、アルキル基、アリール基またはへテロ環
残基全表わす。

Ｒ１のアルキル基として好ましくは、炭素数が／乃至コ
０１より好ましくは／乃至１３を表わし、７級、２級も
しくは３級であってもよく、縮合環を含む環を形成して
いてもよい。その置換基の好ましい例としては、フェニ
ル基、ハロゲン原子が挙げられる。

Ｒ１のアリール基は好ましくは置換基を有してもよいフ
ェニル基を表わし、置換基としては、好ましくはニトロ
基、シアノ基、スルファモイル基、カルバモイル基、ア
ルキルオキシカルボニル基、アシル基、スルホニル基、
フッ素原子、クロル原子を表わし、これらの基が２個以
上置換していてもよい。置換基を有してもよいフェニル
基としてより好ましくは、フェニル基およびニトロ基、
シアノ基、アシル基、スルホニル基、フッ素原子または
クロル原子が置換したフェニル基が挙げられる。

Ｒ１のへテロ環残基として好ましくは、各々置換基を有
していてもよい、コハク酸イミド残基、フタル酸イミド
残基、トリアゾール残基、ベンゾトリアゾール残基、テ
トラゾール残基全表わし、より好ましくは、コハク酸イ
ずド残基、フタル酸イミド残基又はベンゾトリアゾール
残基を表わす。

一般式（ＩＩ）の窒素原子とＸで形成される！員環乃至
６ｊ！ｉ、環は具体的には、置換基を有していてもよい
、ビロール残基、ピロリジン残基、コハク酸イミド残基
、イミダゾール残基、ピラゾール残基、トリアゾール残
基、テトラゾール残基、ベンツイミダゾール残基、ベン
ゾトリアゾール残基、オキサゾリン−λ−オ／残基、チ
アゾリン−２−チオン残基、ピはリジン残基、ウラシル
残基、λ−ピリドン残基、≠−ピリドン残基等が挙げら
れる。Ｘはより好ましくは、！員環を形成する非金属原
子団を表わし、窒素原子とＸで形成されるよシ好ましい
！員環としては、ピロリジン残基、ビシゾール残基、イ
ミダゾール残基、チアゾリン−コーチオン残基が挙げら
れる。

以下に一般式（Ｉｆ）または一般式（Ｉ［ｌ）で表わさ
れる化合物の具体例を示すが、これらに限定されるもの
ではない。

例示化合物 弘（７りを−）６コタ〜ｔ３りであり、その内容は微小
なアガロースおよびセルロース粒子に次に、セルロース
を主成分とする膜を前記一般式（Ｉ）で表わされる化合
物と反応させて活性化する方法について述べる。

粒子に対して同様な機構に基づく活性化反応を行うこと
は一部公知（Ｍ、Ｗｉｌｃｈｅｋら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　ＶＯＩ。

をｐｏｃの低温下で作用させて活性化するものであるが
、膜については知られていない。

セルロース膜に対して本発明者らは上記文献に記載の反
応条件で活性化を試みたがほとんど活性化されなかった
。そこで反応条件を種々探索した結果、次の反応条件で
セルロース膜を活性化できることを見出し友。すなわち
、セルロース膜／ｇに対して前記一般式（Ｉ）で表わさ
れる化合物を／　０−ｒＯｍｍｏｌおよび溶媒約２０〜
！０＊ｌを加えた後、塩基、例えばピリジン又はトリエ
チルアミンを加える。塩基の量は、一般式（Ｉ）で表わ
される化合物の７〜３倍モルさらに好ましくはｌ！〜３
倍モル使用する。次に１００〜ｔＯ°Ｃ好ましくはｐｏ
〜ｔｏ０ｃで７ｊ〜りＯ分間反応させることにより活性
化が行なわれた。ここで用いる溶媒としては、アセトニ
トリル、ピリジン、アセトン、ジオキサン、トルエン、
酢酸エチル、クロロホルム等を挙げることができる。こ
こで見出した反応方法は、反応温度の点で特に公知例と
大きく異な夛、又、反応溶媒も一部異なっている。

活性化反応によって導入された活性基の量は、アルカＩ
Ｊ　を作用させて脱離する基を定量することによって測
定することができ、セルロースｊｌ構成する全グルコー
スに対して０，７〜ｌＯモルチ、よシ好ましくは０．ｊ
−ｊモルチ導入されていることが生理活性物質の固定化
には望ましい。

次に活性化され九セルロース膜への生理活性物質の固定
化法について述べる。まずｐＨ７〜り。

ｊの範囲のバッファーに固定化されるべき生理活性物質
を溶解する。この時用いるバッファーはリン酸バッファ
ー、ホウ酸バッファー、モルフォリノエタンスルホン酸
（ＭＥＳ）バッファー　ヒドロキシエチルピペラジンエ
タンスルホン＆（ＨＥＰＥＳ　）バッファーなど７級ア
ミン基を有しないものが好ましい。又、必要によシ生理
活性物質の安定化剤をさらに加えても良い。圧力によっ
てセルロース膜中にこの溶液を送り込み、＄−ｐｏ０ｃ
で／−１２時間循環させ反応させる。固定化反応終了後
、膜中にバッファー液を通過させ、膜を洗浄する。さら
にアルカリ又はエタノールアミン等のアミンの水溶液を
通過させることにより、膜に残存する活性基と反応させ
て不活性化し、最後に再びバッファー液で洗浄する。

以上に述べた方法により、生理活性物質をセルロース膜
に固定化することができる。

本発明によって固定化される生理活性物質は、酵素、補
酵素、抗体、ホルモン、レセプター、レクテ／、阻害剤
等である。酵素としては、例えばトリプシン、キモトリ
プシン、サーモライシン、ノミパイン、アスパラギナー
ゼ、リノーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、
ウレアーゼなどの加水分解酵素、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシ
ｆ−ゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキ
シドデイムスターゼなどの酸化環元酵素、ヘキソキナー
ゼ、クレアチンキナーゼ、アラエントランスアミナーゼ
などの転移酵素、フマラーゼ、７　ス／ｅルテートアン
モニアリアーゼ、スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸
デカルボキシラーゼなどのリアーゼ、グルコースリン酸
イソメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼなどの異
性化酵素、グルタミンシンセターゼ、アセチルＣｏＡカ
ルボキシラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼ等をあ
げることができる。その他の生理活性物質としてハＮ　
　−（Ａ−アミノヘキシル）−人ＭＰなどの補酵素誘導
体、免疫グロブリンおよびそのＦａｂフラグメント、プ
ロティンＡ等のバクチリアルＦｃレセプター、コンカナ
バリンＡや小麦胚芽アグルチニンなどのレクチン、大豆
トリデシ／インヒビターなどの絹害剤、フェニルアラニ
ン、トリプトファンヒスチリ／などのアミノ酸などがめ
げられる。

（発明の効果） 活性化した担体に生理活性物質を固定化する段階で失活
が少なく、又、経時で生理活性物質が脱離しないことは
固定化生理活性物質にとって極めて重要である。この点
に於てセルロース膜に関して公知の方法、即ち、酸化剤
による活性化法およびトリアジン誘導体による活性化法
にはまだ改良がなされなければならない。本発明に従っ
て活性化されたセルロース膜は生理活性物質との反応性
が高く、又、ポンプを用いて生理活性物質を膜内に送り
込むため拡散に要する時間も必要ない。その結果多くの
生理活性物質の場合、！　’Ｃで／〜数時間で固定化が
完了し、安定な化学結合が構成される。これは前記の公
知の方法での同定化が参００で１２時間から≠ｏ　’Ｃ
で一昼夜の条件で行なわれるのに対して、短時間で済む
ため生理活性の低下が少ない。

また、セルロース膜および生理活性物質との結合部位が
親水的かつ非イオン性であるため、蛋白質等の非特異吸
着が無く、センサーやアフィニティ分離用材料への応用
にも適している。

さらに、セルロース膜はほとんどの有機溶媒にも耐える
ため、有機溶媒系で本発明の固定化生理活性物質を使用
することもできる。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例／、トリプシン固定化膜の製造 活性化 セルロース製ミクロフィルターＦＲ−≠ＯＣＭ士写真フ
ィルム■製、孔径Ｏ０参μ）ｌλｏｏｃｍ２に、Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミドクロロ７オルメート３０ｇとア
セトニトリル１００ｔｓｌを加える。

水冷下で攪拌しながらピリジンＪＯｒｄｆ滴下し、続い
て弘００Ｃで３Ｑ分間振とりする。その後膜をメタノー
ル及びアセトンでよく洗浄し、乾燥して活性化セルロー
ス膜を得た。

トリプシン固定化 トリプシンｊＯ〜を、ｊ　ｍ　Ｍ　Ｃａα２を含む、ｐ
Ｈ７，１のＨＥＰＥＳバッファーｊＱ−に溶解する。濾
過剤フィルターホルダーにセットした活性化セルロース
膜にトリプシン溶液をポンプを用いて弘０Ｃで透過させ
、７分間に約／ｌｄの速度でよ時間循環させることによ
シ固定化した。次に、残った活性基を除くために０，１
Ｍエタールアミン水溶液をグ０Ｃで５時間循環させ、最
後にバッファー液を透過させて十分膜を洗浄した。酵素
の固定化量は溶液中に残った酵素をニンヒドリン反応に
よシ定量し友。

活性測定 基質としてはＬ−ペンゾイルアルギニンーパ２ニトロア
ニリド（Ｌ−ＢＡＰＡ）を１０　　　Ｍの濃度で、ｉｏ
ｍＭのＣａα２を含むｐＨＪ’、ＪのＱ。

ｏｒＭト’）スパッファーに溶解したものを用いた。

トリプシン固定化膜を濾過剤フィルターホルダーにセッ
トし２！０Ｃで基質溶液を透過させて透過液中の生成物
濃度を定量した。結果を第１表に示す。

比較例／、酸化剤を用いた活性化法によるトリプシン固
定化膜の製造 ＦＲ弘Ｑ膜を０　、　ｊＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウム
に浸漬し≠００Ｃで１時間反応させた。この膜を純水で
洗浄した後、実施例１と同様のトリプシン溶液を参〇〇
で５時間循環させることによシ固定化した。

次にその酵素溶液にｌｙｓｇ／ｌｔの濃度の水素化ホウ
素ナトリウムを加え参〇Ｃで２時間循環した。

結果を第１表に示す。

爽施例コ、　　ＩｇＧ固定化膜の製造 活性化　　セルロース製ミクロフィルターＦＲ−’１０
　１００１００ｏにｐ　−ｎ　ｉ　ｔ　ｒｏｐｈｅｎｙ
　１ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ　　Ｊ　Ｏｇとアセト
ニトリル１００ｘｌを加える。水冷下で攪拌しながらピ
リジン３ｏｔｘｌを滴下し、４ｔＯ０Ｃで３０分間振と
うして反応させる。その後膜をメタノール及びアセトン
でよく洗浄し、乾燥して活性化セルロース膜を得た。

ＩｇＧの固定化　ウサギ抗ヒトＩｇＧ！ｏｗを、０．０
！Ｍリン酸バッファーｐＨ’；ｒ　、弘、ｊＯｍｌに溶
解する。これを実施例１の場合と同じ方法で固定化およ
び定量した。

活性測定　ヒトＩｇＧ、ｚｔ■を０．０！Ｍリン酸バッ
ファーｐＨ７，０／　００ｙｔｌに溶解し、ポンプを用
いて固定化膜中に送り込む。次にバッファーを送り込み
膜を洗浄した後、０１２Ｎ酢酸を送シ込んで吸着してい
たヒ）ＩｇＧを脱着させる。

脱着したヒトエｇＧの量は０Ｄ２８゜で定量した。

結果を第２表に示す。

ウシ血清アルブミンを用いて同じ様に吸着量を求めたが
、ｏ３ダ／ｇ膜以下であった。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社手続補正書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）セルロースを主成分とする膜を下記一般式（ I ）
   で表わされる化合物と反応させて活性化した後、生理活
   性物質を化学結合により固定化することを特徴とする、
   生理活性物質を固定化した膜の製造方法。 一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中Ｒは離脱基を表わす。 ２）第１項の固定化法によつて得られる、生理活性物質
   を固定化した膜。