JPH02195877A - レトロウイルスの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、レトロウィルスの精製方法に間し、さらに詳
しくは、レトロウィルスまたはその構成成分を含有する
液を特定のゲルに接触せしめ、レトロウィルス（または
その構成成分）を吸着させた後、溶出させることから成
るレトロウィルスのＩＩ製製法法間する。

の　　　　　　　　　　　　　　　の レトロウィルスは、遺伝子としてリボ核１１（ＲＮＡ）
を持つウィルスであり、オンコウイルス、レンチウィル
ス、スブーマウイルスの３つの亜科に分かれる。

オンコウイルスは、ＲＮＡ踵瘍ウィルスと呼ばれ、鳥類
、は乳類の種々の動物を宿主とし、肉腫、白血病、ガン
踵の原因になる０代表的には、成人Ｔ細胞白血病ウィル
ス（ＨＴＬＶｉ）が知られている。

レンチウィルスには、ウマ伝染性貧血症ウィルス、エイ
ズの原因ウィルスであるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　
Ｖ）などがある。

スブーマウイルスは、病原性が不明である。

この中で、欧米をはじめ各国でヒトのレトロウィルスの
感染によって起こる多くの疾病が問題となっている。特
に、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であるＨ
ＩＶの感染者は世界各国で、およそ数百万人とも推定さ
れている。また、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の原因ウ
ィルスであるＨＴＬＶ−１の感染者は、日本において九
州西南部を中心に広く全国に見られている。

これらのウィルスの感染拡散の防止や治療剤の開発に当
たっては、ウィルスを効率よく精製することが重要であ
る。すなわち、該ウィルスの精製は、感染を防ぐワクチ
ン、感染者を判別し感染の拡散防止を行う抗体検査用の
材料として、あるいは、治療薬の効果判定ウィルスまた
は抗原を得る手段として重要な意味を持っている。

１棗且Ｉ レトロウィルスの調製には、原材料として主に、レトロ
ウィルス感染動物血液または＆［ＩＩｌ！あるいは、感
染細胞環！ｉ細胞を用いてレトロウィルスを増殖させた
培養物材料が用いられる。

このとき、従来の精製方法としては、Ｓ縮した材料を使
用し、ショ糖密度勾配超遠心分離法を用いてウィルスの
精製を行うことが知られている。

［Ｃｈｉｋａ　Ａｔｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｓｅｎｔａｌ　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３９．５４−５７（＋９８０）
：　［１ｕｅｓｂｅｒｇ。

Ｐ、　Ｈ，、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３６．７３・８６（１
９６８）］　Ｌ／かじながら、このような従来法では多
大の工程および高価で大型の機器が必要となり、操作が
煩雑かつヒトレトロウィルスにおいては大きな危険性を
伴うため、工業的な製造には充分ではなかった。

１匪立［ 本発明者らは、従来における煩雑な工程を避はバッチ法
またはカラムクロマトグラフィーにて、より簡単にかつ
より安価にレトロウィルスを精製する方法を見いだすた
めに研究を重ねた結果、セルロースまたは架橋ポリサッ
カライドを硫酸エステル化して得られるセルロース硫酸
エステルまたは、架橋ポリサッカライド硫酸エステルの
ゲルがレトロウィルスと特異的に親和性を有することを
見出した。かくして、本発明者は、この知見に基づき、
レトロウィルスまたはレトロウィルスの構成成分を含有
する液をセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカ
ライド硫酸エステルのゲルに接触せしめ、吸着させたの
ち該ゲルから溶出することにより、高純度のレトロウィ
ルスが極めて簡単に、しかも高い収率で得られることを
発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の目的は、レトロウィルス、特に、ヒト
レトロウィルスを高収率でかつ高純度にまで安全に精製
する方法を提供することにある。

ｎの 本発明は、レトロウィルスまたは該ウィルスの構成成分
を含有する液をセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリ
サッカライド硫酸エステルのゲルに接触せしめレトロウ
ィルスまたはその構成成分を吸着させた後、該ゲルから
レトロウィルスまたはその構成成分を溶出する精製方法
である。

本発明において、出発材料として用いられるレトロウィ
ルスを含有する液としては、動物の血液から得られたも
の、あるいは、組繊細胞培養によって得られたウィルス
浮遊液、さらには、これらの液を限外進退、硫酸アンモ
ニウム、あるいはポリエチレングリコールなどにより濃
縮した溶液が挙げられる。また、本発明は、レトロウィ
ルスそのものを含有する漬のみならず、レトロウィルス
の構成成分を含有する液にも適用できる。すなわち、上
記のようにして得られたレトロウィルスから、界面活性
剤を用いる等の適当な処理によって分離された当該ウィ
ルスの特定の構成成分を含有する液を出発材料として用
いることにより、レトロウィルスをその構成成分として
精製す４こともできる。さらに、レトロウィルス材料が
遺伝子組換え体を利用して得られたものであってもよい
。

この場合においても、遺伝子組換え技術によりレトロウ
ィルスの特定の構成成分のみを産生させ、該構成成分を
本発明の方法により精製することもできる。

本発明で用いられるセルロース硫酸エステルは、セルロ
ースを硫酸エステル化して得られるのであり、好ましく
は結晶セルロース、あるいは、結晶領域と非結晶領域か
らなるセルロースを硫酸エステル化したものである。こ
のセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持し、物理
的安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用ゲルまたは吸
着用ゲルとして好適である。原料となるセルロース類は
すでに市販されており、例えばセルロファインＧＣ−１
５、同ＣＩ＋　−２５、同ＧＣ−１００，同ＧＣ−２０
０（チッソ社！り、アビセル（旭化成工業社製）などが
ある、これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の
存在下クロルスルホン酸、無水ＷＲＭなどを作用させる
ことにより所望のセルロース硫酸エステルが得られる。

また、本発明で用いられる架橋ポリサッカライド５Ｒ酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、アガロー
スなどのポリサッカライドを、例えばエピクロルヒドリ
ン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレング
リコールビスエボキシブロビルエーテル等の架橋剤で架
橋して得られる架橋ポリサッカライドを硫酸エステル化
して得られるものである。架橋ポリサッカライドはすで
に市販されており、例えば架橋デキストランとしてセフ
ァデックスＧ−１０，Ｇ−怒、Ｇ−５０，Ｇ−１ｏｏ　
（ファルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとし
てセファロースＣＬ−２８，ＣＬ−４８，ＣＬ−６８（
ファルマシア社製）などがあり、架橋セルロースとして
セルロファインＧＣＬ−２５、ＧＣＬ・９０（チッソ社
！りなどがある。これらのゲルを例えばピリジンなどの
有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作
用させることにより所望の架橋ポリサッカライド硫酸エ
ステルが得られる。

本発明において用いるこのようなセルロース硫酸エステ
ルまたは架橋ポリサッカライド５１Ｍエステルの製法の
詳細については、本発明の出願人と同一人の出願による
特願昭５９−１１７３４７号（特開昭６１−５４４５０
号）および特願昭５９−１７７３４８号（特開昭６１−
５４４５１号）に記載されており、参考のために引用す
る。ゲルの安定性の点からは、セルロース硫酸エステル
と架橋ポリサッカライド硫酸エステルのうち、セルロー
ス＠酸エステルの方が好ましい。

本発明に従い、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリ
サッカライド硫酸エステルのゲルを用いてレトロウィル
スを精製採取するにあたっては、例えば、次のような方
法で行われる。原材料溶液となるレトロウィルスまたは
その構成成分を含有するｉαを、所望により蒸留水また
は緩衝液で比電導度が０．．５〜５．０ｍｓ／ｃ省とな
るように希釈した後、セルロース硫酸エステルまたは架
橋ポリサッカライド硫酸エステルのゲルによる吸着操作
に付す。

ゲルへのレトロウィルスの吸着、ゲルの洗浄、ウィルス
（ウィルス構成成分）の溶出等、−一連の精製操作はバ
ッチ法及びカラム法等の工業的に通常用いられる操作方
法で行うことができるが、カラム法の方が操作が簡単で
あり、好都合である。

カラム法の場合、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポ
リサッカライド＠酸エステルのゲルをカラムに充填し、
あらかじめ温度θ〜３０℃にて、例えば、０．０２Ｍマ
ツキルベン（Ｍｃｉｌｖａｉｎ’ｓ）緩衝液等の比電導
度５．０〜２５．０ｍｓ／ｃｍでｐＨが７．０〜８．０
程度である適当な緩衝液を通して平衡化を行った後に、
レトロウィルスまたはウィルス構成成分の吸着操作に移
る。

吸着に際しては、レトロウィルスまたはレトロウィルス
構成成分を含有する液をｐＨが７．０〜８．０、比電導
度が５．０〜２５．０ｍｓ／ｃｍになるように適宜調整
して、硫酸エステルゲル充填カラムに通液し、ゲルを洗
浄し夾雑物質を洗い出す。

レトロウィルスまたはその構成成分の溶出に際しては、
ｐＨ５，０〜９．０比電導度が５．０以上である適当な
緩？ｇｊ液を通液し溶出を行うが、好ましくは、段階溶
出または塩濃度勾配溶出を行う。

本発明の精製方法によれば精製度は、数十倍に達し、し
かも回収率は、８０１以上に達する。

上記の通り、本発明の方法によれば、出発材料のレトロ
ウィルスまたはレトロウィルス構成成分含有液から所望
のウィルスまたはウィルス構成成分を高収率、高純度に
採取することができ、その操作も極めて簡単でまた、そ
の精製用クロマトグラフィー吸着体は、繰り返し使用し
ても劣化が全くなく、極めて経済的に優れている。

従って、本発明は、高純度のレトロウィルスまたはその
構成成分を得る工業的精製方法として極めて優れた方法
である。かくして、本発明の方法で得られるレトロウィ
ルスまたはレトロウィルス構成成分は、ワクチンあるい
は、診断試薬等に用いられる抗原を調製するのに非常に
有用である。

以下、参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。

セルロー　　　エ　−ル　ルの ０℃以下の温度においてピリジン６００１に無水値！１
２０ｇを滴下し、混合した０滴下終了後、混液を６０℃
に保持した。この中に含水率！Ｘ以下に乾燥したセルロ
ファインＧＨ−２５（チッソ社１り８０ｇを加え、攪拌
下６０℃にて３時間反応させた０反応終了後、冷却し、
５Ｘ水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和した。

ゲルを濾過分離し、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液で充分
に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルな得た。

大Ｗ 参考例で得たセルロース硫酸エステルゲル５０＋ｉｌを
カラムに充填し、これに蒸留水５００１を通液する。

つぎに、Ｏ，１４Ｍ　ＮａＣｌ添加０．０１Ｍリンｍ　
１１　？Ｈ液５００ｍ１にてゲルを平衡化した後、この
方ラムにショ機密度勾配連続超遠心分離法を用いて濃縮
し、Ｏ，１４ＭＮａＣＩ添加０．０１Ｍリン酸緩衝液に
透析したＴ細胞株（ＣＥＭ）の培養より得られたヒト免
疫不全ウィルスＨＩＶ浮遊液１０１を通液する。Ｏ，１
４Ｍ　ＮａＣｌ添加０．０ＩＭリン酸緩衝参αにてゲル
を充分洗浄した後、０゜５Ｍ　ＮａＣｌ添ｍｏ、０１Ｍ
リン酸緩衝液（比電導度的６０−５／ＣＩ１％　ｐＨ７
，２）　１００ｍ１を用いて溶出を行い、５１ずつ分画
分取したのちレトロウィルスを含有する画分２５１をプ
ールする。

原材料液およびＩＩレトロウィルス画分の分析結果およ
び実験成績を第１表と第１図に示す。

第１表 容量　　　　ウィルス量（総ドットフ゛０ブト価）　　
　　　回収率材料液　　画分プール ｏｎ ８．１９Ｘ　１０’倍　７．８７Ｘ　１０５倍９６χ 犬１目１２ 上記実施例１において、出発材料として０．２５Ｘのβ
−プロとオラクトンで不活化したヒト免疫不全ウィルス
Ｉ（Ｉ　Ｖ培ＩＩ液を蒸留水で１６ｍ５／ｃｍにあわせ
たウィルス浮遊７４）２Ｌを用いる以外は同様にして、
ヒト免疫不全ウィルス含有画分を得る。その結果を第２
表および第２図に示す。

第２表 材料液　　画分プール ２Ｌ　　　３．２０Ｘ　１０’倍　２．９７Ｘ　１０’
倍　　９３１実施例３ 上記実施例１において、出発材料としてＴ−細胞株（Ｍ
Ｔ−２）の培ｌＩ液からショ糖密度勾配超遠心分離法を
用いて得られたヒト成人白血病ウィルス浮遊液を５０沼
１を用いている以外は同様にして、ヒト成人白血病ウィ
ルス含有画分を得る。その結果を第３表に示す。

第３表 容量 ウィルスｆｌ（総）−ットフ゛０ット価）回収率 材料液　　画分プール ０ｆｆｉ１ ２．５６Ｘ　１０’倍　２．０９Ｘ　１０’倍上記実施
例１．２．３において得られたウィルス画分と、従来法
で高純度に精製した各ウィルスとをトランスプロット法
にて比較したところ各ウィルス成分になんら変化は見受
けられなかった。

なお、本発明におけるウィルス精製時に用いたドツトプ
ロットアッセイ及びトランスプロットアッセイは、常法
に従い、次の広く用いられている方法で行った。

すなわち、ドツトプロットアッセイでは、２倍段階希釈
していったウィルスをニトロセルロース膜にそれぞれ保
持させ、　トランスプロットでは、ラウリル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルを気泳動で分
離したウィルス成分をニトロセルロース膜に移動させ１
次抗体にウィルスに対する抗血清、２次抗体に西洋ワサ
ビパーオキシダーゼを結合させ、かつ先の１次抗体に反
応するポリクローナル抗体と反応させ、最後にジアミノ
ベンジジンの入った基質によって発色を見る方法をとる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＩＶ浮遊液を本発明に従いセルロース硫酸
エステルゲルを用いて本発明に従いセルロース硫酸エス
テルゲルを用いて精製した場合の結果を示すグラフであ
る。　　第２図は、不活化ＨＩＶ浮遊液を本発明に従い
セルロース硫酸エステノ？ゲルを用いて精製した場合の
結果を示すグラフである。 第１図 第２図 フラクション番号 フラクション番号

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）レトロウイルスまたはレトロウイルスの構成成分
   を含有する液をセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリ
   サッカライド硫酸エステルのゲルに接触させ、レトロウ
   イルスまたはその構成成分を吸着させた後、前記ゲルよ
   りレトロウイルスまたはモの構成成分を溶出することを
   特徴とするレトロウイルスの精製方法。
2. （２）レトロウイルスまたはその構成成分が、感染した
   動物の血液または感染組織より得られたものである前記
   第１項記載の方法。
3. （３）レトロウイルスまたはその構成成分が、感染組織
   細胞培養の培養物材料より得られたものである前記第１
   項記載の方法。
4. （４）レトロウイルスまたはその構成成分が、遺伝子組
   換え技術を利用して得られたものである前記第１項記載
   の方法。
5. （５）ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を不活化処理し
   た後、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカラ
   イド硫酸エステルのゲルに接触させる前記第１項記載の
   方法。
6. （６）セルロース硫酸エステルが、結晶セルロース、ま
   たは、結晶領域と非結晶領域からなるセルロースの硫酸
   エステルである前記第１項から第５項のいずれかに記載
   の方法。
7. （７）架橋ポリサッカライド硫酸エステルが、架橋セル
   ロース硫酸エステル、架橋アガロース硫酸エステル、ま
   たは、架橋デキストラン硫酸エステルである前記第１項
   から第５項いずれかに記載の方法。
8. （８）該吸着処理を温度０〜３０℃、比電導度５．０〜
   ２５．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液であらかじめ処理して平衡
   化した後、吸着処理に付す前記第１項〜第７項のいずれ
   か１つに記載の方法。
9. （９）レトロウイルスを吸着したゲルから溶出を、比電
   導度０．５〜５．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液を用いて行う前
   記第８項記載の方法。
10. （１０）該溶出処理に先だって吸着ゲルを比電導度０．
    ５〜５．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液で洗浄する前記第８項記
    載の方法。