JPH02150751A

JPH02150751A - 液体試料中の特定成分を分析するための用具および方法

Info

Publication number: JPH02150751A
Application number: JP63306435A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Sakamoto; 久坂本; Shigeki Yamada; 繁樹山田; Hiroshi Taniguchi; 谷口　弘志
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1988-12-01
Publication date: 1990-06-11
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: EP0371513A3; DE68914411T2; EP0371513A2; JPH0721455B2; EP0371513B1; DE68914411D1; US5227310A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、液体試料、とりわけ全血、血清、血漿、尿お
よび髄液のような体液中の特定成分を迅速かつ簡便に分
析するための用具および方法に関する。

［従来の技術］液体試料中の特定成分の分析には、穏やかな条件下に行
なうことのできる酵素的分析法が従来から広範に用いら
れている。臨床検査においては、例えば、特定成分を酸
化する酸化酵素、色素前駆体および要すればバーオキシ
ダーゼを含む試薬溶液を用いる体液分析が行なわれてき
た。このような酵素的分析法においては、酸化酵素作用
下の特定成分の酸化によって生成する過酸化水素が、被
酸化型色素前駆体を直接酸化するか、またはバーオキシ
ダーゼ作用下に色素前駆体を酸化カップリングすること
により、色素が生成する。この色素を、吸光光度法、蛍
光法、発光法などによって比色的に測定することによっ
て、特定成分を間接的ζこ測定することができる。

臨床検査上特に重要な酸化酵素は、グルコースオキシダ
ーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ、コリンオキシダー
ゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、各種アミノ酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダー
ゼ、ラクテートオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ
、ピルビン酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ
、グリセロールオキシダーゼなどである。

色素前駆体としては、いわゆるトリンダーの試薬［アナ
ルズ・オブ・クリニカル・バイオケミストリー（八ｎｎ
、　Ｃｌ１ｎ、　ｎ１ｏｃｈｅｓ、）、６巻、２４頁、
１９６０年］や、０−アニシジン、ベンジジン、Ｏ−ト
リジン、テトラメチルベンジジンなどの被酸化型色素前
駆体がよく知られている。

このような酵素的分析法の大きな利点は、分析の対象と
なる成分が変わっても、酸化酵素の種類を変えさえすれ
ば同じ発色系を用いることができる点にあり、各種分析
項目への応用が検討されている。

近年、分析を迅速かつ簡便に行なうために、上記の分析
用試薬溶液の代わりに、固体支持体に固定した試薬を用
いることが有用視されてきた。

例えば、前記のような酸化酵素および過酸化水素を含む
検出系をポリマー中に分散させてプラスデックフィルム
に塗布した耐水性の試験フィルムが、特公昭４９−３３
８００号明細書に開示されている。この試験フィルムを
用いる分析においては、生成した色素をフィルムの試料
供給側から測定するので、試料（全血、血清等）を、試
薬層と一定時間接触後に脱脂綿等で拭き取り除去する必
要がある。さらに試料の拭き取り後、酸素を充分に供給
して発色させるために、空気中に一定時間放１２−Ｌな
ければならない。

特公昭５３−２１６７７号明細書には、液体不浸透性光
透過性支持体上に、試薬層および展開層を設けた多層試
験フィルムが開示されている。このフィルムの展開層に
試料を点着すると、試料は展開層で広がった後、試薬層
に移行する。試薬層において試料中の成分と試薬とが反
応して生成した色素を、光透過性支持体側より測定する
。従って、点着した試料を除去する必要がない。しかし
、試薬層は支持体と展開層とに挟まれているため、大気
が試薬層に達しにくく、特に試薬層に酸化酵素が含まれ
ている場合、酸素不足により充分な反応を行わせること
ができなかった。

この欠点を解決するために、特開昭６０−８２８５９号
に、一体型多層化学分析要素が開示された。この分析要
素は、展開層と試薬層との間に、酸素透過性蛋白質不透
過性光遮蔽層を有しており、大気と試薬Ｍとの接触を向
上させている。しかし、試薬層の支持体側は大気と接触
できないので、試薬層への酸素の供給は充分とは言えな
かった。

本出願人による特開昭６０−２０５３６４号に開示され
ている分析用具は、試薬層と支持体との間に多孔質疎水
性の酸素供給層を有するので、酸化酵素を含有する試薬
層の反応性を著しく向上させることができる。しかし、
この酸素供給層は、充分量の酸素を保有するための厚み
を有しているため、支持体側からの光透過性が得られず
、試料を除去して・試料供給側から生成した色素を測定
しなければならなかった。

［発明が解決しようとする課題］本発明の目的は；前記のような従来技術の問題点を解決
し、迅速かつ簡便に精度良く特定成分を分析するための
用具および方法を提供することである。

［課題を解決するための手段］本発明は、成体試料中の特定成分を分析するための用具
であって、直径２〜１０ｍａ＋の貫通穴を有する支持体、貫通穴を
覆うように支持体上に固定した光透過性多孔性フィルム
、多孔性フィルムの支持体に接していない側の面上に固着
した試薬層、および試薬層を覆うように支持体上に固定した試料保持層から成る用具に関する。

更に、本発明は、本発明の分析用具を用いて液体試料中
の特定成分を分析する方法であって、液体試料を試料保
持層に滴下することによって試薬層に浸透さけ、試薬層
中で生成した色素を、支持体のＶｔ連通穴通して多孔性
フィルム側から、例えば反射率計を用いて比色測定する
ことを含んで成る方法にも関する。

本発明の分析用具は、試薬液を塗布および乾燥した多孔
性フィルムを、支持体の貫通穴を覆うように配置して支
持体上に固定し、次いで試料保持層を、試薬層を覆うよ
うに配置して、支持体上に固定することによって製造し
得る。多孔性フィルｌ、および試料保持層の支持体上へ
の固定は、例えば熱可塑性樹脂を用いて熱圧着するか、
または両面テープを用いて行うことができる。

支持体の試薬保持層のみに覆われている部分に、貫通穴
を更に１個設けてもよい。これにより、血液などの試料
が試料保持層に滴下されたことを測定側から確認するこ
とができるので、例えば試料滴下から測定までの時間を
一定にして自動測定するために有利である。

試料保持層の上に、貫通穴を有する支持体を更に設けて
１．その貫通穴から試料を滴下してもよい。

本発明に使用する多孔性フィルムの空孔率は２〜７０％
、孔サイズは０．０１〜２０μｍ１厚さは５〜３０μ−
である。このような多孔性フィルムは、空気透過性であ
るので、酸化反応に要する酸素を空気中から試薬層に充
分供給することができる。より空孔率が高く、および／
またはより厚い多孔性フィルムは、空気透過性ではあっ
ても透明度が低いので、そのような多孔性フィルムを用
いると、多孔性フィルム側からの色素の測定が不可能ま
たは困難となる。従って、本発明に使用する光透過性多
孔性フィルムの透明度は３０％以上、好ましくは６０％
以上である。本発明に適当な多孔性フィルムは、例えば
ニュークリボアにュークリボア社製）およびジュラガー
ド（ポリプラスデック社製）の商品名で市販されている
。しかし、本発明に使用する多孔性フィルムは、光透過
性および酸素透過性であればどのようなものであっても
よい。

試薬は、特定成分に対する酸化酵素、バーオキシダーゼ
および色素前駆体を含有する。

本発明において、試薬は、光を遮蔽する光反射性不溶性
粒子を更に含イｆする。それにより、例えば血液のよう
な着色試料の分析においても、４色成分による妨害が少
なく、多孔性フィルム側からより正確な測定を行うこと
が可能となる。光反射性不溶性粒子は、例えば血液試料
の分析において、試薬層に血球が浸透するのを防止する
機能をら有することが好ましい。光反射性不溶性粒子と
しては、二酸化チタン、酸化亜鉛、硫酸バリウムお上び
酸化マグネシウムなどの白色顔料が適当であるが、液体
試料に溶解せず光を遮蔽する物質であればどのようなし
のでもよい。例えば、フルオロカーボン、ポリスチレン
ラテックス粒子、炭酸カルシウム、タルク、アルミ粉末
、デキストラン、アクリル系ポリマー粒子、ポリスチレ
ン系ラテックス粒子などが挙げられる。

試薬液の塗布性能を高めるために、試薬液に親水性高分
子をも添加し得る。親水性高分子としては、ヒドロキシ
プロピルセルロース、メチルセルロース、ア、ルギン酸
ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリ
ドン、ゼラチン、修飾ゼラチン、寒天等が適当である。

更に、これら親水性高分子に乳化エマルジョン系接若剤
やラテックス粒子を添加すると、浸透性が向上する。

試薬液に、非イオン性界面活性剤、可塑剤および／また
は安定化剤を加えることによっても、塗布性能および反
応性を向上させることができる。

試薬層を酵素発色剤層と白色顔料などの光反射性水不溶
性粒子層の２層に分けることも可能であ試料保持層は、
滴下された液体試料を試料保持層全面に広げ、かつその
試料が振動などにより流出するのを防ぐという機能を有
する。このような試料保持層の材料としては、繊維性多
孔質材料が好ましく、例えば濾紙、織物、不織布、メツ
シュ等が適当である。試料保持層に、抗凝固剤、アスコ
ルビン酸オキシダーゼ（共存し得るアスコルビン酸の酸
化による測定妨害を除く）、コレステロールエステラー
ゼ（トータルコレステロールを測定する場合に、エステ
ル型のコレステロールを遊離型に変える）等を予め保持
させておくことも可能である。

［作用］以下、本発明の分析用具について図面を参照しながら説
明する。

第璽図は、貫通穴を有する支持体ｌ上に、貫通穴を覆う
ように固定した多孔性フィルム２、多孔性フィルム上に
固着した試薬層３、および試薬層を覆うように支持体に
固定した試料保持ｒ！Ｊ４を有する分析用具の断面図で
ある。多孔性フィルムおよび試料保持層は、熱可塑性樹
脂または両面テープ（図示せず）でベースフィルム上に
固定されている。

第２図は、第１図に示す分析用具の、支持体１の試料保
持層４のみに覆われている部分に、貫通穴を更に１個設
けた態様を示す。例えば自動測定において、血液などの
試料が滴下されたことを矢印への位置において検出し、
検出後一定時間後に矢印Ｂの位置において試薬層２の反
射率を測定することかで・きる。

第３図は、多孔性フィルム２、多孔性フィルム上に固着
した試薬層３、および試料保持層４をマウント５内に有
す゛る分析用具の断面図である。マウントは、多孔性フ
ィルム側および試料保持層側のいずれにも貫通穴を有す
る。

なお、第１〜３図は、わかり易くするために上下方向を
拡大しである。

［実施例］Ｘ巣鮭り血中グルコースの定量厚さｌＯμ負の光透過性多孔性フィルムにュークリボア
）に、下記の組成の試薬液を１００μｍの厚さに塗布し
、４０℃で１時間乾燥後、７ｍ１１幅に切断した。

試薬液組成ニゲルコースオキシダーゼ　　　　　　１Ｏｋａバーオキ
シダーゼ　　　　　　　　　２０ｋｕ４−アミノアンチ
ピリン　　　　　１５０ｇｙＮ−エヂルート（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメヂルアニ
リン　２００ｘｙＯ，１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）　　　　２ｇ１２重％ヒドロキシプロピルセルロース
　　３ｇ５０重（イ）％二酸化ヂタン溶液　　　　　１
ｇ熱可塑性樹脂でコーティングされ、直径４ｍ―の貫通
穴の列を有する支持体上に、貫通穴の列を覆うように、
前記多孔性フィルム片を試薬層を上にして重ね、熱圧着
した。その上に１０ｇ＋−幅の濾紙を重ね、サイドで支
持体に熱圧着した。最後に、１貫通穴毎に貫通穴の列に
対して垂直に支持体を切断して分析用具を作成した。

対照として、前記光透過性多孔性フィルムの代わりに、
光透過性非多孔性ポリエステルフィルムを用いて、同様
に分析用具を作成した。

ｆｌｒｉ記のように作成した分析用具の試料保持層に、
種々のグルコース濃度の全血を２０μσずつ滴下し、１
分後に、支持体の貫通穴を通して多孔性フィルム側から
積分球式反射率計で６３０ｒｕｓにおける反射率を測定
した。反射率から、クベルカームンク（Ｋ　ｕｂｅｌｋ
ａ　−Ｍｕｎｋ）の式の簡略型：に／Ｓ＝、（鳳　−Ｒ
）”／２ＸｒｌＫ：定数Ｓ：散乱係数に従ってに／Ｓ値を求めた。Ｋ／Ｓ値は、モル濃度に一
次的に比例する。［グスタフーコルトゥム（Ｇ　ｕｓｔ
ａｖ　−ＫｏｒＬｕｓ）、「リフレクタンス・スペクト
ロスコービー（Ｉｌｅｒｌｅｃｔａｎｃｅ　５ｐｅｃｔ
ｒｏｓｃｏｐｙ）上ｔｏｅ−ｔｔｔ頁、シュプリンガー
・フェルラーり（Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖ　ｅｒｌａ
ｇ）、１９６９年］測定結果を第１表に示す。

第１表本発明の分析用具（光透過性多孔性フィルムを有する）
を用いて測定した場合は、グルコース濃度に比例してに
／Ｓ値が高くなった。しかし、対照の分析用具（光透過
性非多孔性フィルムを有する）を用いると、試料中のグ
ルコース濃度が約ｌ５０ｘｙ／ｄＩ２を越えると、発色
の増強は認められなくなった。

Ｋ嵐鯉ｌ血中乳酸の定量厚さ２５μｍの光透過性多孔性フィルム（ジニラガード
）に、下記の組成の試薬液を２００μｍの厚さに幌布し
、４０℃で１時間送風乾燥し、実施例１と同様に分析用
具を作成した。対照の分析用具は、前記光透過性多孔性
フィルムの代わりに、光透過性非多孔性ポリエステルフ
ィルムを用いて同様に作成した。

試薬液組成：乳酸オキシダーゼ　　　　　　　９９０ｕバーオキシダ
ーゼ　　　　　　　　２３ｋｕ４−アミノアンチピリン
　　　　　５０１９Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）１−トルイジン　２００ｘｙ４
％ヒドロキシプロピルセルロース　３．７ｇ５０％二酸
化チタン溶液　　　　　　１．２ｇ０．３Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）　　　　ＺｍＱ非イオン性界面活性剤
（１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００）　　　　０．
５ｍ１２前記のように作成した分析用具の試料保持層に
種々の乳酸濃度の全血を２０μσずつ滴下し、１分後に
多孔性フィルム側から積分球式反射率計で５６０ｎｍに
おける反射率を測定し、Ｋ／Ｓ値を求めた。

全血を遠心分離して得た血漿についてら同様に測定を行
った。

結果を第２表に示す。

第２表本発明の分析用具（光透過性多孔性フィルムを打する）
を用いて測定した場合は、試料が全血であっても血漿で
あっても、乳酸濃度に比例してに／　Ｓ　ｉｌｉが高く
なった。しかし、対照の分析用具（光透過性非多孔性フ
ィルムを存する）を用いると、試料中の乳酸濃度が約７
５ｉ＋ｙ／ｄＩ２を越えると、発色の増強は認められな
くなった。

以上、本発明の好適な実施例について述べたが１、本発
明の技術思想の範囲内で種々の変更が可能である。

［発明の効果］以上、詳述したように、本発明の分析用具を用いると、
体液中の特定成分を迅速かつ簡便に測定することができ
るので、臨床検査に絶大な効果をもたらすことができる
。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は、それぞれ本発明の液体試料分析用具の態
様の断面図である。！・・・支持体、２・・・多孔性フィルム、３・・・試
薬層、４・・・試料保持層、５・・・マウント。特許出願人株式会社京都第一科学代理　人　弁理士　青　山　葆　はか電名第１図第２図第３図

Claims

【特許請求の範囲】１、液体試料中の特定成分を分析するための用具であっ
て、直径２〜１０ｍｍの貫通穴を有する支持体、貫通穴を覆
うように支持体上に固定した光透過性多孔性フィルム、多孔性フィルムの支持体に接していない側の面上に固着
した試薬層、および試薬層を覆うように支持体上に固定した試料保持層から成る用具。２、多孔性フィルムの空孔率は２〜７０％、孔サイズは
０．０１〜２０μｍ、厚さは５〜３０μｍである特許請
求の範囲第１項記載の用具。３、試薬が、特定成分を酸化する酸化酵素、バーオキシ
ダーゼおよび色素前駆体を含有する特許請求の範囲第１
項または第２項記載の用具。４、試薬が、光反射性不溶性粒子を更に含有する特許請
求の範囲第３項記載の用具。５、特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の用具
を用いて液体試料中の特定成分を分析する方法であって
、液体試料を試料保持層に滴下することによって試薬層
に浸透させ、試薬層中で生成した色素を、支持体の貫通
穴を通して多孔性フィルム側から測定することを含んで
成る方法。