CN101305100A - 液相半乳糖氧化酶希夫测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用氧化剂如半乳糖氧化酶和醛检测剂如希夫试剂来检测癌或癌前病变的改良方法,该方法不需要将样品固定到固体载体上。本发明还提供了包含执行本发明的方法所需部件的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用氧化剂和醛检测试剂如半乳糖氧化酶和希夫(schiff)试剂来检测癌或癌前病变的改良的检测方法。本发明还关于包含执行本发明的方法所需部件的试剂盒。
技术背景
半乳糖氧化酶希夫(GOS)试验用来检测表达在癌或癌前病变中的糖蛋白的糖类标记物(如D-半乳糖[Gal],或N-乙酰-D-半乳糖胺[GalNAc],或D-Gal-β-[1→3]-N-乙酰-D-半乳糖胺[GalGalNAc]二糖[T或Thomsen-Friedenreich(TF)抗原])。这些标记物可能发现位于直肠粘液(结肠癌)、唾液或痰(口腔癌、肺癌)、乳头溢液(乳腺癌)、其他粘液分泌物(阴道分泌液[宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌]),精液[前列腺癌])和血液(多种癌症)。Shamsuddin(美国专利第5,348,860号)公开了一种检测标记物的方法,包括用GOS处理之前将粘液样品吸附到一种俘获蛋白质且不溶于水的底物上(如薄膜滤器)。用GOS处理之前的样品固定这一先决条件有几个缺陷:1)使临床样品固定的烘干阶段2)半乳糖氧化酶(GO)孵育后的漂洗和希夫试剂孵育后更大量的冲洗,以减少非特异性反应产物产生的背景,同时分别去除多余的酶和显色剂3)吸附的样品的手工处理4)对结果主观视觉上的解释。现有技术的另一个缺陷是,为了检测糖蛋白和验证样品在固相上的存在,GOS程序之后使用了过碘酸-希夫试剂。
第10/877,737号的美国专利申请书公开了一种以颜色属性如色彩和/或色度为根据,产生定量和半定量结果的方法,该方法部分地减少视觉评分的主要缺点,即需要一个熟练的、经验丰富的分析者。然而这个程序是以分光光度计的反射比以及在可见光谱范围内多重读数得到的信息进行计算的算法为根据。分析需要一个专门的仪器,在诊断社区一般是没有的。
因此,本领域需要改进使用GOS测定法检测肿瘤的方法。
发明概述
本发明提供一种使用氧化剂和醛检测剂如半乳糖氧化酶和希夫试剂检测受试者癌或癌前病变的改良的方法,该方法不需要将受试者样品固定到固相载体上。代替的是,本发明提供一种改良的方法,其中样品可以直接在液相系统中与氧化剂和醛检测剂反应而不需要固定到固相上。另外,程序中结合了一个阳性对照如半乳甘露聚糖(guar)以确保氧化剂和醛检测剂的活性。
本发明具有优于现有技术的一些优点。本发明容许直接在液相系统中处理样品和氧化剂和醛检测剂如半乳糖氧化酶和希夫试剂。例如,本发明容许胶状样品如痰的化学分裂或分散,以确保和氧化剂如半乳糖氧化酶的可混合性。本发明比以薄膜为基础的测定法有试验时间明显减少的优点。因此,本发明有分析出报告时间减少的优点。另外,和视觉的、非客观的结果解释相比,本发明的方法基于用标准实验室分光光度计或微板读数仪测到的预定波长处的吸收,提供一个客观的、半定量的测量结果。本发明的优点在于,能够实现容高通量筛选的自动操作和批量处理。这点对于群体筛选特别有利。例如,使用本发明的方法能很容易筛选全部人群或部分人群的癌或癌前病变。另外,本发明方法容许预先测定样品,以消除由于缺少样品固定导致的有关潜在的假阴性的不确定性,并避免了为验证样品存在的试验后处理的需要(如高碘酸盐氧化,然后是希夫试剂)。本发明的方法有更好的临床性能的潜力。
因此,本发明一方面检测受试者癌或癌前病变的方法,其中,测定受试者样品以确定在癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在,所述方法包括以下步骤:
(a)提供受试者样品;
(b)混合样品和氧化剂,所述氧化剂能将糖类标记物上的敏感C-6羟基氧化为醛;
(c)添加醛检测剂到混合物中,在醛的存在下混合物产生比色变化;和
(d)检测液相系统中的比色变化,其中,醛检测剂产生的比色变化指示了癌或癌前细胞相关糖类标记物的存在。
本发明另一方面是检测受试者癌或癌前病变的方法,其中,测定受试者样品以确定癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在,所述方法包括以下步骤:
(a)混合样品和氧化剂,所述氧化剂能将糖类标记物上的敏感C-6羟基氧化为醛;
(b)添加醛检测剂到混合物中,在醛的存在下混合物产生比色变化;和
(c)检测液相系统中的比色变化,其中,醛检测剂产生的比色变化指示了癌或癌前细胞相关糖类标记物的存在。
一个具体实施例中,氧化剂是半乳糖氧化酶。另一个具体实施例中,醛检测剂是希夫试剂。此外的一个实施例中,氧化剂是半乳糖氧化酶,醛检测剂是希夫试剂。
本发明另一方面是用于检测癌或癌前病变的试剂盒,所述试剂盒包括:氧化剂如半乳糖氧化酶、醛检测剂如希夫试剂以及依照本发明方法的使用说明。
通过以下的详细说明,本发明的其它特点和优点将显而易见。然而,应理解,指示本发明优选实施方式的详细描述和具体实施例仅仅以示例性的方式给出,正如本领域技术人员通过这些详细描述能够明白本发明精神和范围内的各种改变和改进。
附图说明
现在将描述与附图有关的内容,其中:
图1是膜(色度:上图)和液相(A550:下图)GOS测定法的接受者-操作特性曲线(ROC),用来自癌症患者(12例)与非癌症(8例;没有病状、健康的吸烟者、良性的肺部疾病)的肺痰来说明各个截止处各试验的临床性能(灵敏度和特异性)。曲线下面积(AUC)和统计学意义(p值)已标明。
图2说明从各个受试者获得的肺痰用薄膜和液相GOS模式测试的分布图。虚线表明产生零假阳性结果的截止处。
发明详述
本发明提供了一种使用氧化剂和醛检测剂如半乳糖氧化酶和希夫试剂来检测对象癌或癌前病变的改良的方法。具体地说,本发明提供了一种改良方法,其中,样品可以直接在液相系统中与氧化剂和醛检测剂反应而不需要将样品固定到固相上。
发明者将改良的液相系统法与将样品固定在固相载体上的现有技术方法进行比较。指出液相系统识别癌和非癌样品的能力超过基于薄膜的测定法。
本发明一方面是检测受试者癌或癌前病变的方法,其中,测定受试者样品以确定癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在,所述方法包括以下步骤:
(a)提供受试者样品;
(b)混合样品和氧化剂,所述氧化剂能将糖类标记物上的敏感C-6羟基氧化为醛;
(c)添加醛检测剂到混合物中,在醛的存在下混合物产生比色变化;
(d)检测液相中的比色变化,其中,醛检测剂产生的比色变化指示癌或癌前细胞相关糖类标记物的存在。
本发明另一方面是检测受试者癌或癌前病变的方法,其中,测定受试者样品以确定癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在,所述方法包括以下步骤:
(a)混合样品和氧化剂,所述氧化剂能将糖类标记物上的敏感C-6羟基氧化为醛;
(b)添加醛检测剂到混合物中,在醛的存在下混合物产生比色变化;
(c)检测液相中的比色变化,其中,醛检测剂产生的比色变化指示癌或癌前细胞相关糖类标记物的存在。
此处使用的术语“受试者”包括动物界的所有成员。受试者优选是人。
此处使用的短语“在液体系统中”表示测定,尤其是比色变化的检测是在液相而不是在固相载体如薄膜上进行的。
此处使用的术语“样品”涉及受试者的液体样品,包括但不限于直肠粘液、唾液、肺部痰液、乳头溢液、宫颈粘液、精液、血浆、血清和淋巴液。从受试者获取样品可采用本领域技术人员已知的方法进行。例如,直肠粘液和宫颈粘液可以用润滑的戴手套的手指指诊或合适的采样装置来获取。然后从手套或装置上回收粘液,例如在增溶剂的帮助下,优选少量以使样品稀释减到最少。样品也可以从采样装置上提取。例如,粘液样品也可以收集到试子(如棉花、聚酯、聚酰胺、泡沫和藻酸盐)上。在一个实施例中,样品是从试子上提取的。由于试子纤维在一些试剂中的溶剂化作用,藻酸钙构成的试子特别适合回收样品,以形成澄清的凝胶或溶液,所述试剂包括柠檬酸钠、磷酸甘油、聚偏磷酸钠、乙二醇双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸钠(EGTA)和乙二胺四醋酸(EDTA),磷酸甘油较好。在另一个实施例中,样品不是从试子上提取的。代替的是,试子样品直接和氧化剂反应,然后和足够量的醛检测试剂反应,以便液体能转移到容器如微孔板中,用分光光度计和微板读数仪进行分析。
另一个例子里,通过深吸气和强烈的咳嗽来收集肺痰,但是可能需要高渗生理盐水,如≥3%的NaCl的诱导。
使用本发明的方法前,样品可能需要处理。例如,痰通常与水性试剂不相混溶,因此不能与半乳糖氧化酶及希夫试剂直接反应,除非先破坏胶状基质和液化凝胶。使用不同的方法和各种试剂能容易地液化痰样品,包括机械降解和高频震荡、还原剂、带电荷的低聚糖(右旋糖酐、肝素)、氯化钠或酶(DNA酶、凝溶胶蛋白)。常用的还原剂如N-乙酰半胱氨酸(NAC)、β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)和膦可使双硫键断裂,是特别有效的粘液溶解剂。一个特别有效的二硫键断裂剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP),从而在用本发明的方法测定之前先液化痰。TCEP是膦的烷基衍生物,且高度特异性的。它既稳定又没有气味。
因此,在本发明的一个实施例中,样品在与氧化剂混合之前先液化。
还优选在混合样品和氧化剂之前先将细胞物质和颗粒从样品中除去。例如,可将样品离心或过滤以去除细胞物质和颗粒。
本发明的方法旨在测定受试者的癌或癌前病变,该方法测定样品中与癌或癌前细胞相关的糖类标记物的存在。相应地,此处使用的术语“癌或癌前细胞”包括表达能够用氧化剂如半乳糖氧化酶和醛检测剂如希夫试剂检测到的糖类标记物的任何癌症或癌前细胞。与癌或癌前细胞相关的糖类标记物可能位于细胞表面或以可溶解形式由细胞产生。本发明的方法不要求样品中存在癌或癌前细胞。例如,本发明的方法能检测无细胞、溶解的或膜相关的糖类标记物。
此处使用的短语“与癌或癌前细胞相关”意思是和非癌或非癌前细胞相比,糖类标记物以较高的数量被表达或出现在癌或癌前细胞上。因此,与没有癌或癌前病变的受试者相比,癌或癌前病变受试者的样品有较高数量的糖类标记物。
在本发明的一个实施例中,癌症包括但不限于:宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头颈癌、胃肠癌、乳腺癌(例如导管的、小叶的、乳头的癌瘤)、前列腺癌、睾丸癌、口腔癌、肺癌、非小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非白血性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、脑癌、神经母细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。首选的实施例中,癌症包括但不限于结肠癌、直肠癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌和血液学的癌症。
本发明的方法检测与癌或癌前病变相关的糖蛋白上的糖类标记物。糖类标记物包括但不限于:D-半乳糖(Gal)、N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)、D-Gal-β-[1→3]-N-乙酰-D-半乳糖胺(GalGalNAc),也称为Thomsen-Friedenreich[TF]或T抗原)、Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc、Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc-β-(1→3)-Gal-β-(1→4)-GlcNAc和Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1->3-GlcNAc-β-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc。
根据本发明的方法,将受试者的样品与能氧化糖类标记物上敏感的羟基(C6伯醇)的氧化剂混合。在本发明的一个实施例中,氧化剂是半乳糖氧化酶。
本发明的方法还需要使用醛检测剂。具体地说,将醛检测剂加到样品和氧化剂的混合物中,在醛的存在下发生比色变化。醛检测剂包括但不限于:碱性品红如希夫试剂,以及糖蛋白检测剂,产品代码23262(Pierce Biotechnology公司),在醛基的存在下它形成紫红色。如第5,348,860号美国专利中所述,醛检测剂优选储存稳定。
为了知道试剂是工作的并使由于该方法中部件失活或过早变质所引起的假阴性结果的可能性减到最少,可以使用一个阳性对照。阳性对照包括但不限于:和本发明中的氧化剂和醛检测剂反应的糖类,如半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-Gal-β-[1→3]-N-乙酰-D-半乳糖胺、Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc、Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc-β-(1→3)-Gal-β-(1→4)-GlcNAc、和Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc-β-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc。这样,阳性对照包括但不限于糖蛋白或高分子量粘蛋白(如猪的胃粘液素)和多糖(如半乳甘露聚糖)。
在一个例子里,半乳甘露聚糖用作阳性对照。半乳甘露聚糖是水溶性的、高分子量糖类聚合物(半乳甘露聚糖),包括甘露糖主链和随机分布的半乳糖侧链。半乳糖的分子组成是30%,半乳糖与甘露聚糖的平均比率是1∶2。不像一些蛋白质,包括粘蛋白如猪的胃粘液素,半乳甘露聚糖是不和希夫试剂反应的,除非先被半乳糖氧化酶氧化。因此,背景噪声可以忽视,信噪比在各种浓度下都高。半乳甘露聚糖可用作半乳糖氧化剂和希夫试剂理想的阳性对照。形成的醛如乙醛、甲醛或戊二醛,可以用来监测希夫试剂或其他醛检测剂的活性。
本发明的方法具有超过现有技术的优点,它不依靠主观的目测法或复杂的仪器来定量颜色属性,以评价用氧化剂(例如半乳糖氧化剂)和醛检测剂如希夫试剂处理后样品中形成的颜色。相反的是,本发明的方法容许客观的测量,使用标准实验室光谱测声器和微板读数仪在预定波长处测定简单吸收。本领域技术人员将理解,测量吸收值的预义波长取决于被分析的样品的组成,包括样品的类型,氧化剂的类型,醛检测剂的类型以及任何其他用来储存或处理样品的试剂,如增溶剂、液化剂或溶媒。例如,使用半乳糖氧化酶和希夫试剂,使用光谱测声器或微板读数仪可在530-570nm处相对定量颜色变化。通常,光谱测声器或微板读数仪能够在可见光范围内可以读数,即440-700nm。因而,可采用550nm或检测剂-醛复合物的最大吸40
收值处或附近的合适的波长来检测比色变化。本发明方法的优点还在于,使用液态处理系统,进行自动操作和高通量批量处理。
本发明还包括一种检测受试者的癌或癌前病变的试剂盒,包括氧化剂和醛检测剂以及执行本发明的方法的说明书。
在一个实施例中,氧化剂是半乳糖氧化酶,醛检测剂是碱性品红如希夫试剂。优选地,碱性品红储存稳定。
试剂盒还可以包括液化样品的还原剂,如NAC、β-ME、DTT或TCEP。另外,试剂盒可以包括去处样品中的细胞物质和颗粒的滤器。试剂盒还可以包括阳性对照,如半乳甘露聚糖。
以下非限制性实施例用作本发明的说明:
实施例
实施例1:直肠粘液
直肠粘液由润滑的、戴手套的手指指诊获得。为了评价上述粘液与GOS的反应性,先需要把粘液固定到不溶于水的底物上(如膜滤器,载玻片)。对于液相GOS测定法,粘液在增溶剂的帮助下从手套回收,增溶剂优选少量以使样品稀释减少到最小。或者,粘液样品可以收集到试子上(棉花、聚酯、聚酰胺、泡沫、藻酸盐),提取,接着在溶液中用GOS测试。由于试子纤维在一些试剂(柠檬酸钠,磷酸甘油,聚偏磷酸钠,EGTA或EDTA)中的溶剂化作用,藻酸钙构成试子特别适合样品的回收,以形成澄清的凝胶或溶液。可以用以下GOS测定释放到凝胶/溶液中的粘液:
1)孵育包含直肠粘液样品(一些交联的粘液样品可能需要二硫化物分裂剂的处理和/或用稀释剂调节浓度)的溶解的藻酸盐试子试样与GO,以使糖上敏感的C6羟基氧化成醛基。
2)孵育上面的反应混合物和希夫试剂,以形成有色醛加成产物。
3)在550nm处读取上述反应产物的吸光度。
实施例2:唾液和肺部痰液
将唾液收集在杯子里,无需增溶或溶粘蛋白剂预处理就是足以吸液的流体。吸液分析之前先离心,以去除唾液中的宿主口腔细胞和细菌细胞。咳出的痰中得到的唾液可以离心分离。唾液可以直接用GOS处理。
痰是一种稠的、胶样的呼吸器官分泌物,除正常和异常的肺细胞之外,它还包含有粘蛋白大分子(高分子量糖蛋白)、细菌多糖和遗传物质、宿主白细胞DNA和肌动纤丝。痰经常和唾液一起咳出,可以经离心分离。通常,深吸气和强烈咳嗽后收集痰,但是可能需要高张盐水(如,≥3%NaCl)的诱导。痰的稠度导致它和水性试剂不混溶。这就排除了与GOS直接反应,除非胶样基质先断裂,凝胶液化,变成溶液。使用熟练本技术的人所知道的方法,很容易将痰和其他粘液样品液化。形成粘稠凝胶的三维结构是由于分子的相互作用,包括各种类型的连接键(共价键、离子键、氢键、范德华力)。结果,不同的方法和各类试剂都用来液化粘液凝胶:机械降解和高频振荡、还原剂、带电荷的低聚糖(右旋糖酐,肝素)、氯化钠、酶(DNA酶,凝胶溶蛋白)。通常使用的还原剂如NAC、β-ME、DTT和膦可裂解二硫键,是特别有效的粘液溶解剂。在用GOS测定之前,使痰液化的一种特别有效的二硫物分裂剂是TCEP。TCEP是膦的烷基衍生物,是高度特异性的。它既稳定又无气味。GOS测定法执行如下:
1.离心后从唾液中分离出痰。
2.倒出唾液,一部分痰用TCEP处理,环境温度下孵育。
3.唾液和液化的痰分别用GO孵育,以使糖上敏感的C6羟基氧化成醛。
4.在每个混合物中加入与醛基形成有色加成产物的希夫试剂。
5.在550nm处检测溶液的吸收值。
颜色的强度与样本上表达的肿瘤标记物的数量成比例。从明显健康的个体(没有肺部病状)和良性肺部疾病的患者获取的唾液或痰的反应性得到截止值,用来限定阴性试验结果,从而实现肺癌和癌前病变的检测。
实施例3:乳头溢液
乳头溢液(NAF)可能是澄清的、轻微混浊的和/或褪色的。其便于吸液,因此NAF可以直接用GOS程序测试,而无需二硫化物还原剂预处理。大体而言,该方法和直肠粘液、唾液和肺部的痰基本上相同,只是根据样本和试剂体积进行调整。
实施例4:其他分泌物
阴道(子宫内膜和子宫颈)和前列腺(精液)的粘液分泌物也是液相GOS测试的候选物质。收集到试子上的子宫内膜或宫颈粘液可以直接测试或可能需要在GOS测试前先提取。精液、宫颈或子宫内膜粘液可能首先需要处理(离心),以去除细胞成分(精子、前列腺、宫颈或子宫内膜的细胞)和/或用粘液溶解剂预处理。GOS的过程和所述直肠粘液、唾液、肺部的痰和NAF的GOS过程完全相同。
实施例5:血液
分为血浆(没有细胞的部分)和血清(除去凝固因子或蛋白质的没有细胞的部分)的血液,给包括GOS反应性的标志物在内的各种分析物的测量提供一个水性环境。适当稀释的血浆或血清,可以用GO处理,然后是品红试剂处理,无需与二硫化物还原剂预孵育。
实施例6:试剂的阳性对照
已知测定时,优选试剂在规定或说明范围内如预期地起作用,以保证有足够的效能测定低水平的分析物或标记物,并使由于成分失活或过早变质引起的假阴性结果的可能性减到最小。半乳甘露聚糖是水溶性的高分子量糖类聚合物(半乳甘露聚糖),包含一个甘露糖主链和随机分布的半乳糖侧链。半乳糖的分子组成是30%,半乳糖和甘露聚糖的平均比率是1∶2。与一些蛋白质,包括粘蛋白如猪的胃粘液素不同,半乳甘露聚糖不和品红反应,除非先被半乳糖氧化酶氧化。因此,背景噪声可以忽视,信噪比在各种浓度下都高。半乳甘露聚糖可用作两种GOS试剂的阳性对照。
实施例7:液相GOS测定法与薄膜GOS测定法的比较
A研究样品
在从地方医院获得的冷冻、积累的肺痰中,比较薄膜和液相GOS测定法。20个样品,包括5个来自正常受试者(没有肺部病变),1个来自明显健康地吸烟者,2个来自鉴定为有良性肺部疾病的患者,和12个来自诊断为早期肺癌(8个I期,4个II期)的患者。
B.痰的处理
解冻一份无唾液的痰(大约0.25g),在1.5mL微离心管里将其和相同体积重量比的50mM二硫化物还原剂磷酸三氯乙酯(TCEP)混合。强力涡旋15秒(S/P涡旋混合仪,Baxter Diagnostics公司,设置10)后,使混合物在振动台(gelJiggler,InterfaceSystems公司;最大速度)上孵育60分钟。涡旋液化的痰,以10,000转/分的速率离心10分钟(Eppendorf 5415C离心管,Brinkmann Instruments公司),分离上清液和沉淀。
C.薄膜GOS测定法
将处理的(液化的)痰(20μl)点双份在经3M 9877双面胶粘着在聚丙烯载体(TapeTest Device,IMI International Medical Innovations公司)上的玻璃纤维薄膜(954-AH,Whatman公司)上,环境温度下过夜风干。使用前,先将GOS试剂平衡到室温。痰斑和相同体积的100U/mL的GO孵育10分钟。将装置转移到到染色缸里,用去离子水漂洗1分钟。用过量的水冲洗薄膜,用1ml希夫试剂孵育1分钟,然后用自来水10分钟冲洗4次。薄膜风干过夜,用反射分光光度计(X-Rite公司)读取颜色。
D.液相GOS测定法
环境温度下,振动台上,在微管中孵育两份处理后的(液化的)痰(50μl)和相同体积的GO(100U/mL)30分钟。加入希夫试剂(50μL),边震荡,边进一步孵育混合物。取100μL最终反应混合物的样品,转移到圆底微孔板(VWR International公司)中,用微板读数仪(Bio-Tek EL800)在550nm处读取吸光度。
结果
通过检测色度和色调两个颜色属性来分析痰的薄膜GOS测试的反应产物。色调显示可感知的颜色,并用数字(度)描述为色盘(一种理解颜色交流的说明,X-Rite公司)上可见光谱颜色位置。色度或饱和度是对色调明亮或暗淡的度量。低色度值指示的是后者(表现较灰),而高色度值表明色调更接近纯色。当有色产物呈现窄范围的色调时,色度包含更多信息,更有识别力。薄膜GOS测定中色度的ROC(接受者-操作特征曲线)分析(临床试验性能的度量)表明,曲线下面积(AUC)等于0.57(0.50表示试验具有相等的灵敏度和特异性,1.00表示没有假阳性和假阴性的完美试验)而没有统计学显著性(p=0.59),表明在该研究样品中,色调很少或没有能力区分癌症和非癌病例(正常人,BLDs和吸烟者)。色度的ROC曲线更好(图1,上图),AUC等于0.76,接近统计学显著性(p=0.05,p<0.05通常认为无显著性)。然而,在一旨在排除无临床癌症迹象(即>22.5;图2,上图)的截止值,薄膜GOS在12例癌症中仅检测到了3例(25%的灵敏度)。相反,液相GOS测定的ROC曲线有不同的形状,产生与薄膜测定中的色度AUC类似的AUC(0.78),具有统计学显著性(p=0.04),提示在患病和非患病个体间具有一些辨别能力(图1,下图)。截止值=0.125吸收单位时,该测定准确地鉴别6/12(即灵敏度提高了2倍)肺癌患者的痰,没有假阳性(图2,下图)。然而,在这20个痰样品的研究中,液相GOS测定超过基于薄膜的测定。通过调整一种或多种分析参数来修改或改善溶液测定法将引起液相GOS测定法进一步的提高。
虽然参考上述考虑的优选实施例描述了本发明,应理解本发明不限于所述实施例。相反,本发明旨在涵盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等同形式。
所有出版物、专利和专利申请在此处都以相同程度完整地结合在本文中,如同每个单独的出版物、专利或专利申请都明确的、各自表明以参考方式结合在本说明书中。
Claims (25)
1.一种检测受试者癌或癌前病变的方法,其中,测定受试者的样品以确定与癌或癌前细胞相关样品中糖类标记物的存在,所述方法包括以下步骤:
(a)混合样品与氧化剂,所述氧化剂能将糖类标记物上敏感的C-6羟基氧化为醛;
(b)添加醛检测剂到混合物中,在醛的存在下发生比色变化;
(c)检测液相系统中的比色变化,其中,所述醛检测剂引起的比色变化指示了与癌或癌前细胞相关的糖类标记物的存在。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氧化剂是半乳糖氧化酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述糖类标记物包括:D-半乳糖[Gal]、N-乙酰-D-半乳糖胺[GalNAc]、D-Gal-β-[1→3]-N-乙酰-D-半乳糖胺[GalGalNAc]、Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc、Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc-β-(1→3)-Gal-β-(1→4)-GlcNAc、和Fuc-α-1→2-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc-β-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Fuc-α-1→3-GlcNAc。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,所述醛检测剂是碱性品红。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述碱性品红是希夫试剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,通过确定约530-570nm波长下样品的吸光度,分光光度法定量比色变化。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,通过确定约550nm波长下样品的吸光度,分光光度法定量比色变化。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其特征在于,所述样品与氧化剂混合之前先被液化。
9.根据权利要求8中所述的方法,其特征在于,用还原剂液化样品。
10.根据权利要求9中所述方法,其特征在于,所述还原剂是N-乙酰基半胱氨酸、β-巯基乙醇,二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
11.根据权利要求8中所述方法,其特征在于,用机械降解或高频振动的方法液化样品。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其特征在于,所述样品与氧化剂混合之前,先将细胞物质和颗粒从样品中除去。
13.根据权利要求12中所述的方法,其特征在于,通过离心和过滤的方法将细胞物质和颗粒从样品中除去。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其特征在于,样品从样本采集装置中提取。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其特征在于,使用阳性对照。
16.根据权利要求15中所述的方法,其特征在于,所述阳性对照是半乳甘露聚糖。
17.一种检测受试者癌或癌前病变的试剂盒,所述试剂盒包括氧化剂和醛检测剂,以及执行根据权利要求1-16中任一项所述方法的说明书。
18.根据权利要求17所述的试剂盒,其特征在于,所述氧化剂是半乳糖氧化酶。
19.根据权利要求17或18所述的试剂盒,其特征在于,所述醛检测剂是存储稳定的碱性品红。
20.根据权利要求19所述的试剂盒,其特征在于,所述碱性品红是希夫试剂。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括滤器,以从样品中去除细胞物质和颗粒。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括液化样品的还原剂。
23.根据权利要求22所述的试剂盒,其特征在于,所述还原剂是N-乙酰基半胱氨酸、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的试剂盒,所述试剂盒还包括阳性对照。
25.根据权利要求24中所述的试剂盒,其特征在于,所述阳性对照是半乳甘露聚糖。
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