CN116063485A - p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用,p16蛋白单克隆抗体的制备方法包括以下步骤:将p16蛋白抗原免疫动物,并收集免疫效价合格动物的新鲜脾脏和骨髓,以提取总RNA;将所述总RNA进行反转录,PCR扩增抗体重链和轻链的可变区基因;将所述抗体重链和轻链的可变区基因拼接后,连入噬菌粒载体并电转化,复苏扩增获得抗体库;从所述抗体库中筛选出单克隆阳性噬菌体,并采用双抗夹心法从所述单克隆阳性噬菌体中筛选出可以配对的单克隆阳性噬菌体;对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序获得抗体序列,即为p16蛋白单克隆抗体。制得的p16蛋白单克隆抗体特异性和灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用。
背景技术
随着液基细胞学和HPV(人乳头瘤病毒)检测的普及,宫颈癌早期发现率也在逐步提高,然而这些技术需要专业机构和专业人员进行检测,传统液基细胞学有赖于医生的专业性,需要通过显微镜在大量的细胞中凭肉眼观察,判断细胞形态是否有异型性,这存在很大的人为因素,也受制片水平及显微镜等条件制约,所以导致不同医疗机构之间液基细胞学的结果判读水平良莠不齐,重复性差;高危型HPV检测目前可用于宫颈癌初筛,但只有持续感染高危型HPV才会造成宫颈癌变,绝大部分女性一生中都感染过HPV,大部分能依靠自身免疫力清除病毒,所以高危型HPV阳性者绝大部分并无宫颈病变,且HPV检测价格较高,加重了患者经济负担。且存在相当大比例的宫颈癌与HPV感染无关或HPV检测阴性。
现有产品主要表现出以下不足:一、医生的人为因素,如工作经验、工作强度、工作条件等,影响液基细胞学的判读结果;二、高危型HPV检测成本较高,且有赖于复杂的设备,在一些医疗资源有限的地区实施困难;另外HPV筛查特异性相对较低,筛查阳性后续还需要进行较为长期的随访。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用,旨在制备一种特异性和灵敏度高的p16蛋白单克隆抗体。
为实现上述目的,本发明提出一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:
S10、将p16蛋白抗原免疫动物,并收集免疫效价合格动物的新鲜脾脏和骨髓,以提取总RNA;
S20、将所述总RNA进行反转录,PCR扩增抗体重链和轻链的可变区基因;
S30、将所述抗体重链和轻链的可变区基因拼接后,连入噬菌粒载体并电转化,复苏扩增获得抗体库;
S40、从所述抗体库中筛选出单克隆阳性噬菌体,并采用双抗夹心法从所述单克隆阳性噬菌体中筛选出可以配对的单克隆阳性噬菌体;
S50、对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序获得抗体序列,即为p16蛋白单克隆抗体。
可选地,步骤S50包括:
S51、对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序正确后,得第一抗体;
S52、将荧光微球与第一抗体进行震荡偶联,得p16蛋白单克隆抗体。
本发明进一步提出一种免疫试纸条,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白,所述免疫试纸条包括p16蛋白单克隆抗体,所述p16蛋白单克隆抗体通过如上所述的p16蛋白单克隆抗体的制备方法制得。
本发明进一步提出一种试剂盒,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量,所述试剂盒包括如上所述的免疫试纸条。
可选地,所述试剂盒还包括人体宫颈脱落细胞裂解液,所述人体宫颈脱落细胞裂解液包括:体积分数为0.05%~1%的表面活性剂、10mM~1M的缓冲液以及1mM~10mM的蛋白酶抑制剂。
可选地,所述试剂盒还包括p16蛋白标准品。
本发明进一步提出一种检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,采用如上所述的试剂盒,所述检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法包括以下步骤:
S1、将待测人体宫颈脱落细胞加入人体宫颈脱落细胞裂解液中,第一次震荡后,冷冻并进行第二次震荡,离心并收集上清;
S2、将所述上清滴加至试纸条上,检测待测的发光值;
S3、以p16蛋白标准品的浓度为横坐标,发光值为纵坐标,拟合得到标准曲线方程;
S4、根据待测的发光值和标准曲线方程,计算人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量。
可选地,在步骤S1中,第一次震荡时间为2~10min。
可选地,在步骤S1中,第二次震荡时间为2~10min。
可选地,在步骤S1中,离心时间为10~30min。
本发明提供的技术方案中,采用噬菌体展示技术,筛选出p16蛋白单克隆抗体,该p16蛋白单克隆抗体具有高特异性、高灵敏度及高亲和力的优点,用该p16蛋白单克隆抗体进行宫颈癌筛查,可以增加细胞学检测的敏感性,且同样具有较高的特异性,使用更简便且成本更低。同时,对一些宫颈癌早筛网络不能覆盖的地区或者有一些特殊原因不能及时筛查的人群,使用该p16蛋白单克隆抗体,可以进一步扩大宫颈癌筛查的范围,降低妇女患宫颈癌的风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例4得到的标准曲线图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例及附图,做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外,全文中出现的“和/或”的含义,包括三个并列的方案,以“A和/或B”为例,包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外,各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
现有产品主要表现出以下不足:一、医生的人为因素,如工作经验、工作强度、工作条件等,影响液基细胞学的判读结果;二、高危型HPV检测成本较高,且有赖于复杂的设备,在一些医疗资源有限的地区实施困难;另外HPV筛查特异性相对较低,筛查阳性后续还需要进行较为长期的随访。
鉴于此,本发明提出的一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法,旨在制备一种特异性和灵敏度高的p16蛋白单克隆抗体。
为实现上述目的,本发明提出一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:
S10、将p16蛋白抗原免疫动物,并收集免疫效价合格动物的新鲜脾脏和骨髓,以提取总RNA;
S20、将所述总RNA进行反转录,PCR扩增抗体重链和轻链的可变区基因;
S30、将所述抗体重链和轻链的可变区基因拼接后,连入噬菌粒载体并电转化,复苏扩增获得抗体库;
S40、从所述抗体库中筛选出单克隆阳性噬菌体,并采用双抗夹心法从所述单克隆阳性噬菌体中筛选出可以配对的单克隆阳性噬菌体;
S50、对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序获得抗体序列,即为p16蛋白单克隆抗体。
可选地,步骤S50包括:
S51、对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序正确后,得第一抗体;
S52、将荧光微球与第一抗体进行震荡偶联,得p16蛋白单克隆抗体。
本发明提供的技术方案中,采用噬菌体展示技术,筛选出p16蛋白单克隆抗体,该p16蛋白单克隆抗体具有高特异性、高灵敏度及高亲和力的优点,用该p16蛋白单克隆抗体进行宫颈癌筛查,可以增加细胞学检测的敏感性,且同样具有较高的特异性,使用更简便且成本更低。同时,对一些宫颈癌早筛网络不能覆盖的地区或者有一些特殊原因不能及时筛查的人群,使用该p16蛋白单克隆抗体,可以进一步扩大宫颈癌筛查的范围,降低妇女患宫颈癌的风险。
p16蛋白是一种细胞周期调控蛋白,表达失调可导致细胞周期调控紊乱,引发多种恶性肿瘤。2014版TBS(The Bethesda system)、2017年我国《子宫颈癌综合防控指南》和2014年第4版WHO《女性生殖器官分类》均推荐使用p16蛋白检测,辅助细胞学诊断,从而提高宫颈癌诊断的准确性。
本发明实施例中,所述p16蛋白的氨基酸序列为:
kggaaaaelg pgggenmvrr flvtlrirra cgpprvrvfv vhiswftgew aapgapaavalvlmllrsqr lgqqplprrp ghddgqrpsg gaaaaprrga qlrrprhshp trarrcpggl pghaggaapgrgaagrarcl gpsargpg。
具体操作时,所述p16蛋白单克隆抗体的制备流程如下:
p16蛋白抗原的制备:根据上述蛋白序列信息,经过密码子优化,全基因合成序列,将目的基因构建在合适的载体上,200ml小规模培养293细胞,瞬时转染表达与纯化,在小试摸索实验基础上扩大培养细胞,进行蛋白表达及纯化,得p16蛋白抗原。
将质控合格p16蛋白抗原与佐剂乳化后免疫兔子,一般2只兔子。经3-4次免疫血清效价检测合格后,进行加强免疫,免疫效价合格动物收集新鲜脾脏和骨髓,提取总RNA,并进行质控定量,使用质控合格的RNA进行反转录,PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因,并进行拼接后连入噬菌粒载体并电转化,复苏扩增获得抗体库,同时计算扩增前后库容大小。采取针对性措施设计多个方案进行抗体文库的筛选和检测阳性库单克隆化并phage表达进行Elisa检测,获得单克隆样性phage,应用双抗夹心的ELISA方法对阳性克隆进一步筛选,筛选出可以配对的抗体对,对可以配对的单克隆阳性phage进行二次特异性功能检测并测序获得抗体序列。将荧光微球和EDC用活化缓冲液进行一步法活化或将荧光微球与EDC、NHS用活化缓冲液进行二步法活化,然后在复溶缓冲液中沉淀,加入p16单克隆抗体进行震荡偶联,离心,在复溶缓冲液中沉淀,加入封闭液封闭,在2-8℃、优选4℃下保存备用。
本发明进一步提出一种免疫试纸条,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白,所述免疫试纸条包括p16蛋白单克隆抗体,所述p16蛋白单克隆抗体通过如上所述的p16蛋白单克隆抗体的制备方法制得。
采用如上所述的p16蛋白单克隆抗体的制备方法,筛选出高特异性、高灵敏度及高亲和力的p16蛋白单克隆抗体,制备成免疫试纸条,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白,直接检测p16蛋白的表达与否以及表达量,从而对于宫颈病变的程度有了明确的判断,方便了后续的治疗。
具体地,所述免疫试纸条的结构可以和本领域常见的试纸条如验孕棒结构类似,包括底板、加样区、样本垫、结合垫、吸收垫,结合垫和吸收垫之间设置硝酸纤维膜(NC膜)垫。
所述免疫试纸条的制备方法如下:
(1)将荧光微球标记p16蛋白单克隆抗体按10-40ul/ml的量喷涂至玻璃纤维膜上的结合区或铺至所述结合垫上,在20-45℃、优选30-37℃干燥0.5-24h,获得样品垫;(2)用稀释液分别对p16蛋白单克隆抗体、以及羊抗鼠IgG多克隆抗体进行稀释,将所得的p16蛋白单克隆抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线形成检测线(T线);将所得的羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线形成质控线(C线),检测线和质控线相隔3-15mm,在20-45℃烘干0.5-24h,获得处理的硝酸纤维素膜;(3)将步骤(2)的处理的硝酸纤维素膜粘贴在底板上,一端压有吸水纸,重叠接触1-4mm,另一端压有步骤(1)获得的样品垫的结合区,重叠接触1-4mm,组装后剪切成3-8mm的宽度,制成免疫试纸条。
此外,所述免疫试纸条还包含卡壳,卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的检测线、质控线位置设有观察窗,卡壳壳面上对应于样品垫的加样区设有加样孔。
本发明进一步提出一种试剂盒,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量,所述试剂盒包括如上所述的免疫试纸条。
可选地,所述试剂盒还包括人体宫颈脱落细胞裂解液,所述人体宫颈脱落细胞裂解液包括:体积分数为0.05%~1%的表面活性剂、10mM~1M的缓冲液以及1mM~10mM的蛋白酶抑制剂。
可选地,所述试剂盒还包括p16蛋白标准品。
本发明提出的试剂盒,将荧光微球标记的p16蛋白单克隆抗体按10-40ul/ml的量喷涂至所述玻璃纤维膜上的结合区或铺至所述结合垫上。检测人体宫颈脱落细胞中的p16蛋白。先将宫颈脱落细胞裂解后,直接加入样本垫中,经层析作用,p16蛋白先后与荧光微球标记的p16蛋白单克隆抗体和检测抗体结合,最后用配套的荧光检测仪检测荧光信号。荧光信号与p16蛋白含量呈正相关,由此实现对人体宫颈脱落细胞中的p16蛋白的定量检测,特异性强,灵敏度高。
本发明进一步提出一种检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,采用如上所述的试剂盒,所述检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法包括以下步骤:
S1、将待测人体宫颈脱落细胞加入人体宫颈脱落细胞裂解液中,第一次震荡后,冷冻并进行第二次震荡,离心并收集上清;
S2、将所述上清滴加至试纸条上,检测待测的发光值;
S3、以p16蛋白标准品的浓度为横坐标,发光值为纵坐标,拟合得到标准曲线方程;
S4、根据待测的发光值和标准曲线方程,计算人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量。
可选地,在步骤S1中,第一次震荡时间为2~10min。
可选地,在步骤S1中,第二次震荡时间为2~10min。
可选地,在步骤S1中,离心时间为10~30min。上述条件下,能够使待测人体宫颈脱落细胞中的p16蛋白充分进入到上清液中。
本申请提出的检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,将荧光微球标记的p16蛋白单克隆抗体按10-40ul/ml的量喷涂至所述玻璃纤维膜上的结合区或铺至所述结合垫上。检测人体宫颈脱落细胞中的p16蛋白。先将宫颈脱落细胞裂解后,直接加入样本垫中,经层析作用,p16蛋白先后与荧光微球标记的p16蛋白单克隆抗体和检测抗体结合,最后用配套的荧光检测仪检测荧光信号。荧光信号与p16蛋白含量呈正相关,由此实现对人体宫颈脱落细胞中的p16蛋白的定量检测,特异性强,灵敏度高。
通过上述定量检测,还可以根据检测出的p16蛋白的量,筛查出是否换宫颈癌,具体地,若宫颈脱落细胞样本中p16蛋白含量<10.2ng/ml,则为阴性,若宫颈脱落细胞样本中p16蛋白含量>10.2ng/ml,则为阳性。如此,将p16蛋白浓度与宫颈病变的严重程度结合起来,p16蛋白检测浓度高提示宫颈高级别病变或癌变可能性大。
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解,以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1p16蛋白单克隆抗体的制备
p16蛋白抗原的制备:根据上述蛋白序列信息,经过密码子优化,全基因合成序列,将目的基因构建在合适的载体上,200ml小规模培养293细胞,瞬时转染表达与纯化,在小试摸索实验基础上扩大培养细胞,进行蛋白表达及纯化,得p16蛋白抗原。
将质控合格p16蛋白抗原与佐剂乳化后免疫兔子,一般2只兔子。经3-4次免疫血清效价检测合格后,进行加强免疫,免疫效价合格动物收集新鲜脾脏和骨髓,提取总RNA,并进行质控定量,使用质控合格的RNA进行反转录,PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因,并进行拼接后连入噬菌粒载体并电转化,复苏扩增获得抗体库,同时计算扩增前后库容大小。采取针对性措施设计多个方案进行抗体文库的筛选和检测阳性库单克隆化并phage表达进行Elisa检测,获得单克隆样性phage,应用双抗夹心的ELISA方法对阳性克隆进一步筛选,筛选出可以配对的抗体对,对可以配对的单克隆阳性phage进行二次特异性功能检测并测序获得抗体序列。将荧光微球和EDC用活化缓冲液进行一步法活化或将荧光微球与EDC、NHS用活化缓冲液进行二步法活化,然后在复溶缓冲液中沉淀,加入p16单克隆抗体进行震荡偶联,离心,在复溶缓冲液中沉淀,加入封闭液封闭,在2-8℃、优选4℃下保存备用。
实施例2免疫试纸条
(1)将实施例1中制备的p16蛋白单克隆抗体按10-40ul/ml的量喷涂至玻璃纤维膜上的结合区或铺至所述结合垫上,在20-45℃、优选30-37℃干燥0.5-24h,获得样品垫;(2)用稀释液分别对p16蛋白单克隆抗体、以及羊抗鼠IgG多克隆抗体进行稀释,将所得的p16蛋白单克隆抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线形成检测线(T线);将所得的羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释液在硝酸纤维素膜上划线形成质控线(C线),检测线和质控线相隔3-15mm,在20-45℃烘干0.5-24h,获得处理的硝酸纤维素膜;(3)将步骤(2)的处理的硝酸纤维素膜粘贴在底板上,一端压有吸水纸,重叠接触1-4mm,另一端压有步骤(1)获得的样品垫的结合区,重叠接触1-4mm,组装后剪切成3-8mm的宽度,制成免疫试纸条。
此外,所述免疫试纸条还包含卡壳,卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的检测线、质控线位置设有观察窗,卡壳壳面上对应于样品垫的加样区设有加样孔。
实施例3试剂盒
实施例2的免疫试纸条;
人体宫颈脱落细胞裂解液:体积分数为0.05%~1%的表面活性剂、10mM~1M的缓冲液以及1mM~10mM的蛋白酶抑制剂;
p16蛋白标准品:浓度分别为0ug/L、3ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L、150ug/L、200ug/L的p16蛋白溶液。
实施例4检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量
采用实施例3的试剂盒,获取足量的人体宫颈脱落细胞,加入人体宫颈脱落细胞裂解液中,涡旋震荡2~10min,放入-20℃冰箱冻融1~3次,再次震荡2~10min,离心10~30min(13000rpm),收集上清,直接进行检测;
①取出免疫试纸条,室温放置15min;②每孔加入100ul校准品/质控品/样本,置于荧光检测仪孵育仓;③15min后,仪器自动检测,读取发光值。以校准品浓度为横坐标,发光值为纵坐标,采用四参数逻辑拟合法得到标准曲线方程,根据标准曲线方程计算待检样本中p16蛋白含量。分别将100例正常人宫颈脱落细胞检测结果取平均数,并计算标准方差SD,本试剂盒在确定Cutoff值时选择正常人平均值加上两倍的标准方差作为p16蛋白表达阴阳性的判断标准。
结果判读,若宫颈脱落细胞样本中p16蛋白含量<10.2ng/ml,则为阴性,若宫颈脱落细胞样本中p16蛋白含量>10.2ng/ml,则为阳性。
得到的标准曲线方程如图1所示,拟合获得标准曲线方程为:Y=0.37X+0.052,Spearman检验r=1,线性度良好,将该数据和对应的标准质控线荧光强度保存在荧光分析仪中。
临床样本:100例正常宫颈脱落细胞,45例宫颈上皮内瘤变患者脱落细胞(24例低级别病变,21例高级别病变),40例宫颈癌脱落细胞(含鳞癌和腺癌)。分别用现有的HPV检测方法和本发明的检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,判断准确性,得表1,进一步对不同程度病变的脱落细胞p16蛋白浓度进行分析,判断差异性,得表2,并检测同批次免疫试纸条的精密度,得表3。
表1临床样本中检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量检测结果
在这些样本中,正常组中有14%呈阳性,低级别病变中79.2%呈阳性,高级别病变中有100%呈阳性,宫颈癌中87.5%呈阳性,p16对宫颈病变的诊断准确性高,达到88.2%(见表1)。
表2不同程度宫颈病变的p16蛋白含量检测浓度差异
通过进一步对不同程度病变的脱落细胞p16蛋白浓度进行分析,随着宫颈病变加重,p16蛋白的检测浓度也逐渐增加,宫颈高级别上皮内病变及宫颈癌样本中p16蛋白检测浓度明显高于宫颈低级别上皮内病变及正常细胞,宫颈病变细胞中p16蛋白检测浓度均高于正常细胞(见表2,差异有统计学意义,p<0.001)。
表3免疫试纸条批内精密性
对于p16蛋白的免疫试纸条批内精密性检测提示,批内CV变异系数)均小于5%,说明该免疫试纸条精密性良好(见表3)。此外,本免疫试纸条检测p16的线性范围宽、灵敏度好。
综上所述,本发明提供的p16蛋白单克隆抗体的制备方法、免疫试纸条、试剂盒及其应用,筛选出p16蛋白单克隆抗体,该p16蛋白单克隆抗体具有高特异性、高灵敏度及高亲和力的优点,用该p16蛋白单克隆抗体进行宫颈癌筛查,可以增加细胞学检测的敏感性,且同样具有较高的特异性,使用更简便且成本更低。同时,对一些宫颈癌早筛网络不能覆盖的地区或者有一些特殊原因不能及时筛查的人群,使用该p16蛋白单克隆抗体,可以进一步扩大宫颈癌筛查的范围,降低妇女患宫颈癌的风险。
以上所述仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是在本发明的发明构思下,利用本发明说明书内容所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种p16蛋白单克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S10、将p16蛋白抗原免疫动物,并收集免疫效价合格动物的新鲜脾脏和骨髓,以提取总RNA;
S20、将所述总RNA进行反转录,PCR扩增抗体重链和轻链的可变区基因;
S30、将所述抗体重链和轻链的可变区基因拼接后,连入噬菌粒载体并电转化,复苏扩增获得抗体库;
S40、从所述抗体库中筛选出单克隆阳性噬菌体,并采用双抗夹心法从所述单克隆阳性噬菌体中筛选出可以配对的单克隆阳性噬菌体;
S50、对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序获得抗体序列,即为p16蛋白单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的蛋白单克隆抗体的制备方法,其特征在于,步骤S50包括:
S51、对可以配对的单克隆阳性噬菌体进行二次特异性功能检测,并测序正确后,得第一抗体;
S52、将荧光微球与第一抗体进行震荡偶联,得p16蛋白单克隆抗体。
3.一种免疫试纸条,其特征在于,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白,所述免疫试纸条包括p16蛋白单克隆抗体,所述p16蛋白单克隆抗体通过如权利要求1或2的p16蛋白单克隆抗体的制备方法制得。
4.一种试剂盒,其特征在于,用于检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量,所述试剂盒包括如权利要求3所述的免疫试纸条。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括人体宫颈脱落细胞裂解液,所述人体宫颈脱落细胞裂解液包括:体积分数为0.05%~1%的表面活性剂、10mM~1M的缓冲液以及1mM~10mM的蛋白酶抑制剂。
6.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括p16蛋白标准品。
7.一种检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,其特征在于,采用如权利要求4至6任意一项所述的试剂盒,所述检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法包括以下步骤:
S1、将待测人体宫颈脱落细胞加入人体宫颈脱落细胞裂解液中,第一次震荡后,冷冻并进行第二次震荡,离心并收集上清;
S2、将所述上清滴加至试纸条上,检测待测的发光值;
S3、以p16蛋白标准品的浓度为横坐标,发光值为纵坐标,拟合得到标准曲线方程;
S4、根据待测的发光值和标准曲线方程,计算人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量。
8.如权利要求7所述的检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,其特征在于,在步骤S1中,第一次震荡时间为2~10min。
9.如权利要求7所述的检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,其特征在于,在步骤S1中,第二次震荡时间为2~10min。
10.如权利要求7所述的检测人宫颈脱落细胞中的p16蛋白的含量的方法,其特征在于,在步骤S1中,离心时间为10~30min。
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