JPH0213391A - Hiv中gagプレカーサーの組換え体としての産生、方法及びaids用ワクチンとしての使用 - Google Patents
Hiv中gagプレカーサーの組換え体としての産生、方法及びaids用ワクチンとしての使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
後天性免疫不全症候群(AIDS)とはヒト免疫不全ウ
ィルスのCD4ヘルパーT細胞に対する明らかな感染に
よる臨床症状の出現であり、これまでに報告されている
様にヒトT−リンパ球指向性つィルス■型(HTLV−
III) 、リンパ節腫張を伴なうウィルス(LAV)
、あるいはAIDS−関連ウィルス(ARV)(以後
集合的に“HIV”とする)などがある。AIDSとは
日和見感染や悪性腫瘍形成によって特徴づけられる細胞
性免疫機能の伝染性欠損症状である。類似疾患であるA
IDS関連症候群(ARC)もAIDSに伴なう数多く
の疫学的特徴や免疫異常性を惹起し、場合によってはA
IDSの臨床症状の出現前に発症する。AIDS及び/
あるいはARCに対するワクチンとはHIV感染による
衰弱効果の防止に対する理想的な予防手段である。本出
願人はその様なワクチンとして有効な免疫原を、組換え
体産生物として精製回収する方法と伴に、発見した。本
免疫原とは、組換え体産生物であるgagプレカーサー
ポリペプチドである。
ィルスのCD4ヘルパーT細胞に対する明らかな感染に
よる臨床症状の出現であり、これまでに報告されている
様にヒトT−リンパ球指向性つィルス■型(HTLV−
III) 、リンパ節腫張を伴なうウィルス(LAV)
、あるいはAIDS−関連ウィルス(ARV)(以後
集合的に“HIV”とする)などがある。AIDSとは
日和見感染や悪性腫瘍形成によって特徴づけられる細胞
性免疫機能の伝染性欠損症状である。類似疾患であるA
IDS関連症候群(ARC)もAIDSに伴なう数多く
の疫学的特徴や免疫異常性を惹起し、場合によってはA
IDSの臨床症状の出現前に発症する。AIDS及び/
あるいはARCに対するワクチンとはHIV感染による
衰弱効果の防止に対する理想的な予防手段である。本出
願人はその様なワクチンとして有効な免疫原を、組換え
体産生物として精製回収する方法と伴に、発見した。本
免疫原とは、組換え体産生物であるgagプレカーサー
ポリペプチドである。
HIVの遺伝子的機能及びウィルス粒子の形態などにつ
いては今だに不明の点が多々ある。しかしながらすでに
遺伝子的に解明された部分もあり、総ゲノム約9キロベ
ース(kb)に及ぶある種のRNAウィルスは、その核
酸配列中に7つの主要オーブンリーディングフレーム(
ORFs)を保有し、それぞれ、gag、pol及びe
nv、sor、tat、art/lrs及び3’orf
遺伝子として示されている。核酸配列中に存在する末端
反復配列はHIVも含めて多数のレトロウィルスにおい
て共通であり、ウィルスの増殖及びウィルスが宿主細胞
の染色体中へ組み込まれる際に必要とされる遺伝子であ
ると考えられている。
いては今だに不明の点が多々ある。しかしながらすでに
遺伝子的に解明された部分もあり、総ゲノム約9キロベ
ース(kb)に及ぶある種のRNAウィルスは、その核
酸配列中に7つの主要オーブンリーディングフレーム(
ORFs)を保有し、それぞれ、gag、pol及びe
nv、sor、tat、art/lrs及び3’orf
遺伝子として示されている。核酸配列中に存在する末端
反復配列はHIVも含めて多数のレトロウィルスにおい
て共通であり、ウィルスの増殖及びウィルスが宿主細胞
の染色体中へ組み込まれる際に必要とされる遺伝子であ
ると考えられている。
そしてHIVのゲノム構造、複製及び調節機能に対する
一般的な性質に関する最近の見解が以下の文献中に記載
されている。ラトナー、エル(Ratner。
一般的な性質に関する最近の見解が以下の文献中に記載
されている。ラトナー、エル(Ratner。
L、) 等“ヒユーマンT−リンホトロビックレトロウ
イルス(Human T−Lymphotropic
Retroviruses) ”オプライエン、ニス、
ジエイ、(0’ Br1en、 S、 J、)著、ジエ
ネテ4yクマソプス(Genetic Maps )1
987コールドスプリングハーバー(ColdSpri
ng Harbor ) 1987 、、第124−1
29頁。
イルス(Human T−Lymphotropic
Retroviruses) ”オプライエン、ニス、
ジエイ、(0’ Br1en、 S、 J、)著、ジエ
ネテ4yクマソプス(Genetic Maps )1
987コールドスプリングハーバー(ColdSpri
ng Harbor ) 1987 、、第124−1
29頁。
フランチー二、ジー、 (Franchini、 c、
)等、ネイチ+ −(Nature ) 、第328
巻、第539頁(1987)。及びチェン、アイ、ニス
、ワイ。
)等、ネイチ+ −(Nature ) 、第328
巻、第539頁(1987)。及びチェン、アイ、ニス
、ワイ。
(Chen、 1. S、 Y )セル(Cel1)、
第47巻、第1頁(1986)などである。
第47巻、第1頁(1986)などである。
gag、pot及びenv遺伝子より翻訳されてくるH
I Vタンパク質は最初は融合ポリプロティン産物と
して出現してくる。これらは、次にタンパク分解プロセ
ッシングを経て、ウィルス特有酵素と同様に構造タンパ
ク質としての形態をとるものである。HIVに属する株
の中には、p55gagプレカーサーとして出現して(
るgagポリプロティン融合産物があり、これはウィル
スによってコードされているプロテアーゼの作用を受け
てgagp24、gagp17及びga gp15とし
てそのウィルスのライフサイクルの中で開裂されてくる
。また、翻訳過程中あるいは他の機構により偶発的に起
こるフレームシフトによって巨大なgag−pot融合
ポリプロティン産物が誘導される時もあることが実証さ
れている。またHIV中にはタンパク分解プロセッシン
グを触媒する酵素的部位が、gag遺伝子の翻訳終止コ
ドンの3′末端とpol遺伝子の下流との間に位置して
いる約250−265ヌクレオチド塩基によってコード
されている。
I Vタンパク質は最初は融合ポリプロティン産物と
して出現してくる。これらは、次にタンパク分解プロセ
ッシングを経て、ウィルス特有酵素と同様に構造タンパ
ク質としての形態をとるものである。HIVに属する株
の中には、p55gagプレカーサーとして出現して(
るgagポリプロティン融合産物があり、これはウィル
スによってコードされているプロテアーゼの作用を受け
てgagp24、gagp17及びga gp15とし
てそのウィルスのライフサイクルの中で開裂されてくる
。また、翻訳過程中あるいは他の機構により偶発的に起
こるフレームシフトによって巨大なgag−pot融合
ポリプロティン産物が誘導される時もあることが実証さ
れている。またHIV中にはタンパク分解プロセッシン
グを触媒する酵素的部位が、gag遺伝子の翻訳終止コ
ドンの3′末端とpol遺伝子の下流との間に位置して
いる約250−265ヌクレオチド塩基によってコード
されている。
初期のHIVゲノムのgagsTJ域における研究の興
味は、AIDS抗ウィルス化合物に対するスクリーニン
グアッセイ方法の確立と平行して、その遺伝子からコー
ドされている融合ポリプロティン産物の解析に集中して
いた。大量の基質を合成させる為に出願人はHIVプロ
テアーゼの産生のない組換え体gagプレカーサーを酵
母により発現させた。
味は、AIDS抗ウィルス化合物に対するスクリーニン
グアッセイ方法の確立と平行して、その遺伝子からコー
ドされている融合ポリプロティン産物の解析に集中して
いた。大量の基質を合成させる為に出願人はHIVプロ
テアーゼの産生のない組換え体gagプレカーサーを酵
母により発現させた。
出願人はgagプレカーサータンパクの抗原決定基を免
疫原として有効使用する事に関する発見者でもある。し
かし本発見は病原微生物あるいはウィルスに対して宿主
を免疫する為の唯一有効な部位はその病原、例えばレト
ロウィルス、の表面領域であるという一般的に受は入れ
られている仮説に矛盾するものである。つまりHIVg
agプレカーサーはそのウィルスの内部構成物であり、
HIVの表面にあるエンベロブタンパク質とは異なり、
抗体の作用の受けにくい物であり、出願人自身もAID
Sに対するワクチンとして有効であるとはまったく予期
していなかった。事実、出願人達は本発明におけるga
gプレカーサーを、タンパク分解プロセッシングアッセ
イの為の基質調製が頭初の目的である、本発明とは完全
に異なった目的の為に分離していた。
疫原として有効使用する事に関する発見者でもある。し
かし本発見は病原微生物あるいはウィルスに対して宿主
を免疫する為の唯一有効な部位はその病原、例えばレト
ロウィルス、の表面領域であるという一般的に受は入れ
られている仮説に矛盾するものである。つまりHIVg
agプレカーサーはそのウィルスの内部構成物であり、
HIVの表面にあるエンベロブタンパク質とは異なり、
抗体の作用の受けにくい物であり、出願人自身もAID
Sに対するワクチンとして有効であるとはまったく予期
していなかった。事実、出願人達は本発明におけるga
gプレカーサーを、タンパク分解プロセッシングアッセ
イの為の基質調製が頭初の目的である、本発明とは完全
に異なった目的の為に分離していた。
しかし、今回の発明の本質的な目的は組換え体gagプ
レカーサータンパク質をAIDSワクチンの一つとして
使用する事にある。そして大量なるこの新規な水−可溶
性組換え体タンパク質の調製方法を明記するものである
。更にこれらの方法による産生物は抗ウイルス剤検出の
為のアッセイにおけるスクリーニング因子としても使用
されうるちのである。
レカーサータンパク質をAIDSワクチンの一つとして
使用する事にある。そして大量なるこの新規な水−可溶
性組換え体タンパク質の調製方法を明記するものである
。更にこれらの方法による産生物は抗ウイルス剤検出の
為のアッセイにおけるスクリーニング因子としても使用
されうるちのである。
組換え体産生タンパク質の精製には、時として新規な方
法あるいは新らしい方法と従来の方法との併用が必要と
なる。何故ならば、酵母などの様な組換え体形成におけ
る供給源の構成成分がこれまでの血清を用いた一般的な
供給源の成分とが異なるためである。古典的あるいはそ
の他−殻内供給源からのタンパク質分離に有効な方法の
知識や技術を基礎にして、組換え体細胞培養からのタン
パク質の分離に効果的な精製分離の方法はどれかという
事に関しては誰れも予言できるものではない。ワクチン
調製の為の精製方法は産物に対して並はずれた純度を与
えるものであり、公知の技術では予期し得ない別の表示
が必要である。同様知見として、米国特許第4,624
,918号参照。
法あるいは新らしい方法と従来の方法との併用が必要と
なる。何故ならば、酵母などの様な組換え体形成におけ
る供給源の構成成分がこれまでの血清を用いた一般的な
供給源の成分とが異なるためである。古典的あるいはそ
の他−殻内供給源からのタンパク質分離に有効な方法の
知識や技術を基礎にして、組換え体細胞培養からのタン
パク質の分離に効果的な精製分離の方法はどれかという
事に関しては誰れも予言できるものではない。ワクチン
調製の為の精製方法は産物に対して並はずれた純度を与
えるものであり、公知の技術では予期し得ない別の表示
が必要である。同様知見として、米国特許第4,624
,918号参照。
出願人は95%以上の精製純度を持つ酵母由来組換え体
gagプレカーサータンパク質あるいは同等の純度を有
するそのバリアントタンパク質を提供した。出願人によ
る実施例は、本タンパク質がミリストイル化され、それ
により少なくとも一つの点に関しては大腸菌産生組換え
体gagプレカーサーとは異なっている事を立証してい
る。別の手段として組換え体gagプレカーサーは組換
え休出発現系により発現される事もある。精製gagプ
レカーサーはワクチンとして有効であると伴にAIDS
ウィルス性プロテアーゼアッセイとしても市販されうる
ちのである。
gagプレカーサータンパク質あるいは同等の純度を有
するそのバリアントタンパク質を提供した。出願人によ
る実施例は、本タンパク質がミリストイル化され、それ
により少なくとも一つの点に関しては大腸菌産生組換え
体gagプレカーサーとは異なっている事を立証してい
る。別の手段として組換え体gagプレカーサーは組換
え休出発現系により発現される事もある。精製gagプ
レカーサーはワクチンとして有効であると伴にAIDS
ウィルス性プロテアーゼアッセイとしても市販されうる
ちのである。
また出願人は以下に示す酵母由来組換え体gagプレカ
ーサータンパク質あるいはそのバリアントタンパク質に
対する連続的精製方法を提供する。
ーサータンパク質あるいはそのバリアントタンパク質に
対する連続的精製方法を提供する。
各ステップは次の様になっている。
(a)不純物を除去した特定量の酵母抽出物を供給する
。当該酵母抽出物とは組換え体酵母発現系で発現された
酵母由来組換え体gagプレカーサーあるいはそのバリ
アントを含むものである。
。当該酵母抽出物とは組換え体酵母発現系で発現された
酵母由来組換え体gagプレカーサーあるいはそのバリ
アントを含むものである。
(b)少なくとも約24時間に及ぶ凍結によるgagプ
レカーサーの沈殿物形成。
レカーサーの沈殿物形成。
(c)沈殿物形成したgagプレカーサーの遠心による
沈降化、及び引き続きその沈降物と上清液との分離。
沈降化、及び引き続きその沈降物と上清液との分離。
(d)膜及び不必要な膜結合タンパク質を可溶化するの
に効果的な溶液とその沈降物を混合。
に効果的な溶液とその沈降物を混合。
(e)第二沈降物形成の為の遠心によるgagプレカー
サーの、再沈降化、及び引き続きその第二沈降物と上清
液との分離。
サーの、再沈降化、及び引き続きその第二沈降物と上清
液との分離。
(f)gagプレカーサーを可溶化するのに効果的な溶
液で上記ステップにおける沈降物を溶解、変性沈降物と
して、更に (g)その変性沈降物を疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにかけ、そこからgagプレカーサーを分百分離し
、これにより十分に精製された酵母由来組換え体gag
プレカーサーあるいは精製されたそのバリアントを獲得
する。更にこのgagプレカーサーを逆相高速液体クロ
マトグラフィー(RP−HPLC)あるいは有機溶媒相
によるゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、水−可溶性
調製物とする。本精製gagプレカーサーはワクチンと
して有効であると伴にAIDSウィルス性プロテアーゼ
アッセイとしても市販されうるものである。
液で上記ステップにおける沈降物を溶解、変性沈降物と
して、更に (g)その変性沈降物を疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにかけ、そこからgagプレカーサーを分百分離し
、これにより十分に精製された酵母由来組換え体gag
プレカーサーあるいは精製されたそのバリアントを獲得
する。更にこのgagプレカーサーを逆相高速液体クロ
マトグラフィー(RP−HPLC)あるいは有機溶媒相
によるゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、水−可溶性
調製物とする。本精製gagプレカーサーはワクチンと
して有効であると伴にAIDSウィルス性プロテアーゼ
アッセイとしても市販されうるものである。
略語と用語解説
AIDS 後天性免疫不全症候群ARCAIDS
関連症候群 bp 塩基対 gag p55 p55 gagとしても知られてい
る、ゲル中移動度が約55KDa である血清型New York# 5 HI Vのga
gプレカーサー gagプレカーサー HIVあるいはそのバリアントの gag遺伝子から産生されるタン バク質であり、ウィルス性プロテ アーゼとして作用するアミノ列配 列を含まないものをgagプレカ ーサーとする。
関連症候群 bp 塩基対 gag p55 p55 gagとしても知られてい
る、ゲル中移動度が約55KDa である血清型New York# 5 HI Vのga
gプレカーサー gagプレカーサー HIVあるいはそのバリアントの gag遺伝子から産生されるタン バク質であり、ウィルス性プロテ アーゼとして作用するアミノ列配 列を含まないものをgagプレカ ーサーとする。
HIV AIDSを惹起すると推定される病原
学的因子の総称的用語であり、 HTLV−II[、LAV、及びARV株をも示すもの
である。
学的因子の総称的用語であり、 HTLV−II[、LAV、及びARV株をも示すもの
である。
KDa キロダルトン
Kb キロベース
ORF 転写リーディングフレーム組換え体タ
ンパク質 組換え真核細胞あるいは前核細胞 発現系における外来性DNAの発 現によってもたらされるポリペプ チドあるいはオリゴペプチド。例 えばHIVの酵母由来組換え体 gagプレカーサー 組換え真核細胞発現系 外来性タンパク質あるいは外来性 オリゴペプチドを発現する外来性 DNAを含んだ真核細胞。例えば 本出願中におけるU9#5−1゜ Ga プレカーサー、 55、 びそのバリアント本
発明の説明を目的とした特異的タンパク質とは血清Ne
w York# 5 HI Vの組換え体gagプレカ
ーサーであり、組換え酵母発現系において発現されたも
のである。慣例に従かいタンパク質を変性ゲル中におけ
る明白な移動度によって表示する。
ンパク質 組換え真核細胞あるいは前核細胞 発現系における外来性DNAの発 現によってもたらされるポリペプ チドあるいはオリゴペプチド。例 えばHIVの酵母由来組換え体 gagプレカーサー 組換え真核細胞発現系 外来性タンパク質あるいは外来性 オリゴペプチドを発現する外来性 DNAを含んだ真核細胞。例えば 本出願中におけるU9#5−1゜ Ga プレカーサー、 55、 びそのバリアント本
発明の説明を目的とした特異的タンパク質とは血清Ne
w York# 5 HI Vの組換え体gagプレカ
ーサーであり、組換え酵母発現系において発現されたも
のである。慣例に従かいタンパク質を変性ゲル中におけ
る明白な移動度によって表示する。
本発明においては、特定の組換え体gagプレカーサー
は約55KDaの位置まで移動するのでこのプレカーサ
ーをp55として表示するものであり、下付き”p”と
はタンパク質のことである。
は約55KDaの位置まで移動するのでこのプレカーサ
ーをp55として表示するものであり、下付き”p”と
はタンパク質のことである。
本発明が、gagプレカーサー中に、それ自身をタンパ
ク質分解的開裂を起こす様なウィルス性アミノ酸配列を
含んでいないのならば、HIVのいかなる株のいかなる
gagプレカーサーに対してもたやすく適応しうる方法
であるという事は当業者にとっては明白である。
ク質分解的開裂を起こす様なウィルス性アミノ酸配列を
含んでいないのならば、HIVのいかなる株のいかなる
gagプレカーサーに対してもたやすく適応しうる方法
であるという事は当業者にとっては明白である。
実例として本発明のHIVクローンがgag翻訳終止コ
ドンの下流隣接に導入されているSma1部位で開裂さ
れる事により、いかなるgagプレカーサー発現系にお
いても、タンパク質分解活性を有するHIVアミノ酸配
列配列現しない。同様の原則よりタンパク質分解活性を
有するウィルス性プロテアーゼ配列の存在位置がどのよ
うなIIIV株であってもその核酸配列を解析する事に
より確かめられる。そして、DNAクローンは組換え体
発現系における翻訳後、あらゆる干渉性のタンパク質分
解配列を効率的に排除するために切断されるべきもので
ある。本発明のgagプレカーサーはgag領域とpo
l領域がオーバーラツプ(約2.30bp) していな
いのならば、pol領域あるいはe n v jiJ[
域から誘導されるものではない。
ドンの下流隣接に導入されているSma1部位で開裂さ
れる事により、いかなるgagプレカーサー発現系にお
いても、タンパク質分解活性を有するHIVアミノ酸配
列配列現しない。同様の原則よりタンパク質分解活性を
有するウィルス性プロテアーゼ配列の存在位置がどのよ
うなIIIV株であってもその核酸配列を解析する事に
より確かめられる。そして、DNAクローンは組換え体
発現系における翻訳後、あらゆる干渉性のタンパク質分
解配列を効率的に排除するために切断されるべきもので
ある。本発明のgagプレカーサーはgag領域とpo
l領域がオーバーラツプ(約2.30bp) していな
いのならば、pol領域あるいはe n v jiJ[
域から誘導されるものではない。
本発明に関する新規な方法及び産生物は組換え体gag
プレカーサー発現についての範囲に含まれているものと
する。
プレカーサー発現についての範囲に含まれているものと
する。
本発明に関する方法及び産生物は同様にgagプレカー
サーのバリアントをも含めた迅速かつ効果的なワクチン
調製の方法を提供するために考案されたものである0例
えばそのアミノ酸配列中において保存性置換を持つよう
なバリアント(ティラー、ダブル、エル、 (Tay
lor、 W、 L、 )、ジエイ1モル、パイオル、
(J、 Mo1. Biol、) 、第188巻、
第233頁(1986)の第1表に記載)は本発明の原
則や実施に対する、いかなる本質的あるいは新規性のあ
る改良につながるものではないであろう。また、−船釣
に言ってコード領域中に欠損があったとしても、本明細
書記載のワクチン調製方法には、いかなる改良も必要と
しない。その他、出現してくるバリアントには、翻訳後
の修飾過程において、タンパク分解プロセッシングを含
めて、アデニル化、カルボキシル化、グリコジル化、ヒ
ドロキシル化、メチル化、リン酸化、あるいはミリスト
イル化を受けたものがある。
サーのバリアントをも含めた迅速かつ効果的なワクチン
調製の方法を提供するために考案されたものである0例
えばそのアミノ酸配列中において保存性置換を持つよう
なバリアント(ティラー、ダブル、エル、 (Tay
lor、 W、 L、 )、ジエイ1モル、パイオル、
(J、 Mo1. Biol、) 、第188巻、
第233頁(1986)の第1表に記載)は本発明の原
則や実施に対する、いかなる本質的あるいは新規性のあ
る改良につながるものではないであろう。また、−船釣
に言ってコード領域中に欠損があったとしても、本明細
書記載のワクチン調製方法には、いかなる改良も必要と
しない。その他、出現してくるバリアントには、翻訳後
の修飾過程において、タンパク分解プロセッシングを含
めて、アデニル化、カルボキシル化、グリコジル化、ヒ
ドロキシル化、メチル化、リン酸化、あるいはミリスト
イル化を受けたものがある。
本明細書中におけるgagプレカーサーあるいはそのバ
リアントとは、得られたgagプレカーサーあるいはそ
のバリアントが血清型New York# 5HIVの
gagpssに対する特異的抗体と免疫学的に反応しう
るちのならば、保存性アミノ酸置換、欠損、翻訳後プロ
セッシング、リポソームフレームシフトあるいはその他
のプロセスを受けたとしても、そのgagプレカーサー
、そのバリアントとはアミノ酸配列中にその様な変異を
含んだものである事はよく知られている。
リアントとは、得られたgagプレカーサーあるいはそ
のバリアントが血清型New York# 5HIVの
gagpssに対する特異的抗体と免疫学的に反応しう
るちのならば、保存性アミノ酸置換、欠損、翻訳後プロ
セッシング、リポソームフレームシフトあるいはその他
のプロセスを受けたとしても、そのgagプレカーサー
、そのバリアントとはアミノ酸配列中にその様な変異を
含んだものである事はよく知られている。
真挟皇囚衾里■橿
外来性遺伝子を発現する真核細胞の調製が相対的な率直
な新らしい技術である。その様な真核細胞とは宿主とし
て働き酵母、真菌、植物細胞及び動物細胞を含むもので
ある。これら多数の宿主細胞の発現ベクターは分離同定
され、常法組換えDNA技術を用いて、期待すべき外来
性DNAを有するベクターの構築に際しての出発材料と
して使用される。挿入DNAの発現に用いられる宿主細
胞より自然に誘導されないのならば、そのDNAは外来
性である。挿入外来性DNAは体外染色体であるプラス
ミドあるいはその外来性DNAの全部または一部分を組
み込んだ宿主細胞の染色体中より発現されるものであり
、−分子以上の形成物として宿主細胞中に正しく存在し
ているものである。期待すべき外来性DNA発現用の宿
主細胞及び発現ベクターは、はとんど宿主細胞のを動性
及び取り扱いのむずかしさに依存して選択されるもので
あり、宿主細胞が発現ベクターの複製にいかにサポート
しようと、あるいは当業者によって認められている他の
因子によるものではなく、期待すべき組換え体タンパク
質を精製するにより簡単な様式が用いられる事を目的と
した構造遺伝子上への分泌を促進させる挿入配列のスプ
ライシングやトランスアクティブな配列の発現ベクター
への挿入に依存するものである。
な新らしい技術である。その様な真核細胞とは宿主とし
て働き酵母、真菌、植物細胞及び動物細胞を含むもので
ある。これら多数の宿主細胞の発現ベクターは分離同定
され、常法組換えDNA技術を用いて、期待すべき外来
性DNAを有するベクターの構築に際しての出発材料と
して使用される。挿入DNAの発現に用いられる宿主細
胞より自然に誘導されないのならば、そのDNAは外来
性である。挿入外来性DNAは体外染色体であるプラス
ミドあるいはその外来性DNAの全部または一部分を組
み込んだ宿主細胞の染色体中より発現されるものであり
、−分子以上の形成物として宿主細胞中に正しく存在し
ているものである。期待すべき外来性DNA発現用の宿
主細胞及び発現ベクターは、はとんど宿主細胞のを動性
及び取り扱いのむずかしさに依存して選択されるもので
あり、宿主細胞が発現ベクターの複製にいかにサポート
しようと、あるいは当業者によって認められている他の
因子によるものではなく、期待すべき組換え体タンパク
質を精製するにより簡単な様式が用いられる事を目的と
した構造遺伝子上への分泌を促進させる挿入配列のスプ
ライシングやトランスアクティブな配列の発現ベクター
への挿入に依存するものである。
挿入された期待すべき外来性DNAはgagプレカーサ
ーあるいはそのバリアントをコードしているあらゆるD
NA配列を含み、更にコードする能力をもつ合成配列あ
るいはその様なりローン化された配列、あるいはその両
者を−i伽鼻酪奔奏mあわせ持つ物より成る。例えば完
全合成りNA配列によりコードされ発現してきたgag
プレカーサータンパクも本発明中に含まれている。
ーあるいはそのバリアントをコードしているあらゆるD
NA配列を含み、更にコードする能力をもつ合成配列あ
るいはその様なりローン化された配列、あるいはその両
者を−i伽鼻酪奔奏mあわせ持つ物より成る。例えば完
全合成りNA配列によりコードされ発現してきたgag
プレカーサータンパクも本発明中に含まれている。
GagプレカーサーDNAは現在、有効使用されている
物であり、ATCC受託番号CRL 8543とされて
いる。
物であり、ATCC受託番号CRL 8543とされて
いる。
衾l乏久久二
組換え体gagプレカーサー産生に関しての真核細胞発
現系構築の為に用いられるベクターは、プロモーター及
び/あるいはオペレーターの様な適切な転写活性化DN
A配列を効果的に結合しているgagプレカーサーある
いはそのバリアントに対するDNA配列より成っている
。その信実型的な特徴として適切なリポソーム結合部位
、ターミネイションコドン、エンハンサ−、ターミネー
タあるいはレプリコン因子を含んでいる。これら付加的
特徴は制限酵素による切断やライゲーションなどの一般
的なスプライシング技術により一ケ所とは限らず適切な
部位にベクター中に挿入されるものである。本明細書に
おいて例示されている酵母組換え発現系はその面側さ故
に出願人に選らばれた系である。酵母ベクターpKH1
2−2は酵母発現系ベクターρC1/1− pG A
P (B)tA D H1中へ1.5 k bのBam
HI −3iaI g a g7ラグメントDNAを挿
入する事により構築したものである。Sma1部位とは
サイト−ダイレクト変異法によりgag領域の3′末端
終止コドン及び下流5b+p、の位置に挿入されたもの
である。よってこの特異的に構築された酵母細胞におい
て発現された典型的組換え体タンパク質は完全長を有す
るgagプレカーサーでありその酵母細胞中にHIVプ
ロテアーゼを持っていないので、gagプレカーサーは
プロセッシングを受けずにすむ。しかし、内在性の酵母
由来プロテアーゼの存在によりタンパク分解プロセッシ
ングはもたらされる。またgagプレカーサーが本来の
あるいは自然の状態になっているgagプレカーサーに
特異的な抗体と免疫学的に反応しうる十分な大きを保有
しているのならば、そこに生じている獲得フラグメント
も本発明に含まれている事は明白である。
現系構築の為に用いられるベクターは、プロモーター及
び/あるいはオペレーターの様な適切な転写活性化DN
A配列を効果的に結合しているgagプレカーサーある
いはそのバリアントに対するDNA配列より成っている
。その信実型的な特徴として適切なリポソーム結合部位
、ターミネイションコドン、エンハンサ−、ターミネー
タあるいはレプリコン因子を含んでいる。これら付加的
特徴は制限酵素による切断やライゲーションなどの一般
的なスプライシング技術により一ケ所とは限らず適切な
部位にベクター中に挿入されるものである。本明細書に
おいて例示されている酵母組換え発現系はその面側さ故
に出願人に選らばれた系である。酵母ベクターpKH1
2−2は酵母発現系ベクターρC1/1− pG A
P (B)tA D H1中へ1.5 k bのBam
HI −3iaI g a g7ラグメントDNAを挿
入する事により構築したものである。Sma1部位とは
サイト−ダイレクト変異法によりgag領域の3′末端
終止コドン及び下流5b+p、の位置に挿入されたもの
である。よってこの特異的に構築された酵母細胞におい
て発現された典型的組換え体タンパク質は完全長を有す
るgagプレカーサーでありその酵母細胞中にHIVプ
ロテアーゼを持っていないので、gagプレカーサーは
プロセッシングを受けずにすむ。しかし、内在性の酵母
由来プロテアーゼの存在によりタンパク分解プロセッシ
ングはもたらされる。またgagプレカーサーが本来の
あるいは自然の状態になっているgagプレカーサーに
特異的な抗体と免疫学的に反応しうる十分な大きを保有
しているのならば、そこに生じている獲得フラグメント
も本発明に含まれている事は明白である。
組換え真核細胞発現系の一つである酵母発現系として一
般的に組換え体タンパク発現用に選択された一つの種で
あるサツカロミセスセレビシェが用いられる。しかしな
がらgagプレカーサーの発現の為に、宿主株あるいは
細胞の選択範囲をサツカロミコプシス及びクリプトコツ
カシ工科の他の属の種にまで広げられピヒア、カンジダ
、ハンゼヌラ、トルロプシス、クロイベロマイセス及び
サツカロミコプシスに限定されるものでない事は、当業
者にとっては明白である。同様に宿主株あるいは細胞の
選択範囲をサツカロミセス属の他の種にまで広げられる
。この属の種の・大部分はニス。
般的に組換え体タンパク発現用に選択された一つの種で
あるサツカロミセスセレビシェが用いられる。しかしな
がらgagプレカーサーの発現の為に、宿主株あるいは
細胞の選択範囲をサツカロミコプシス及びクリプトコツ
カシ工科の他の属の種にまで広げられピヒア、カンジダ
、ハンゼヌラ、トルロプシス、クロイベロマイセス及び
サツカロミコプシスに限定されるものでない事は、当業
者にとっては明白である。同様に宿主株あるいは細胞の
選択範囲をサツカロミセス属の他の種にまで広げられる
。この属の種の・大部分はニス。
セレビシェと交配可能であり、ニス、セレビシェが持っ
ているプロモーターと類似あるいは同一のプロモーター
を保有しうるちのであり、GAP491、GALIO1
ADH2及び/あるいはα接合因子プロモーターに限定
されるものではない。
ているプロモーターと類似あるいは同一のプロモーター
を保有しうるちのであり、GAP491、GALIO1
ADH2及び/あるいはα接合因子プロモーターに限定
されるものではない。
よって組換え体gagプレカーサーポリペプチドの発現
には宿主株の選択範囲をサツカロミセス属の他の種にま
で広げられるがカルスベルゲンシス、ラバラム、ローキ
シ、モンタナス、クロイベリー、エロンギスボラス、ノ
ルベンシス、オビホルミス及びシアスタテイカスに限定
されるものではない事は当業者にとっては明白である。
には宿主株の選択範囲をサツカロミセス属の他の種にま
で広げられるがカルスベルゲンシス、ラバラム、ローキ
シ、モンタナス、クロイベリー、エロンギスボラス、ノ
ルベンシス、オビホルミス及びシアスタテイカスに限定
されるものではない事は当業者にとっては明白である。
gagプレカーサーの発現に関する酵母組換え発現系構
築の為の酵母ベクターとはシャトルベクター、ニスミド
プラスミド、キメラプラスミド及び2−ミクロン環状プ
ラスミド由来の配列を含むベクター等に限定されるもの
ではない。
築の為の酵母ベクターとはシャトルベクター、ニスミド
プラスミド、キメラプラスミド及び2−ミクロン環状プ
ラスミド由来の配列を含むベクター等に限定されるもの
ではない。
種々のプロモーターやその他酵母の転写制御配列がga
gプレカーサーをコードしている挿入DNA配列の発現
に用いられ、GAP 491、GALIOlADHIあ
るいはADHII、PH05及びα接合因子などがある
。以下の酵母ベクターのリストは本発明の詳細な説明す
る為の物である。
gプレカーサーをコードしている挿入DNA配列の発現
に用いられ、GAP 491、GALIOlADHIあ
るいはADHII、PH05及びα接合因子などがある
。以下の酵母ベクターのリストは本発明の詳細な説明す
る為の物である。
AAH5
AH5
AAR6
FRPn
pGAL 10−MFα1
Jc197
MA56
pABADE8
pAXα11
AH9
AH10
AH21
9MAc561
LG669
MA91
9MA301
YEHBs
pAM82゜
基本的には適切な宿主中ヘトランスホーメーションある
いは他の方法により挿入されたこれら改良ベクターはg
agプレカーサーあるいはそのバリアントをコードして
いる適切なりNA配列が挿入されているのでgagプレ
カーサーに対する酵母組換え体発現系として有効使用さ
れる。
いは他の方法により挿入されたこれら改良ベクターはg
agプレカーサーあるいはそのバリアントをコードして
いる適切なりNA配列が挿入されているのでgagプレ
カーサーに対する酵母組換え体発現系として有効使用さ
れる。
哺乳動物細胞組換え体発現系は本発明のgagプレカー
サーを他の手段により産生ずる。−殻内に宿主となる哺
乳動物細胞とは細胞培養法により十分にクローン化され
ている細胞である。呻乳動吻細胞の発現ベクターには特
定の抗生物質に対して耐性になるneo遺伝子の様な選
択マーカーが含まれており、これにより細胞中のベクタ
ーの存在が確認される。DNA−介在トランスフェクシ
ョン、トランスアクティブ、あるいはトランスホーメー
ションが細胞に対して、例えばリン酸カルシウム法、エ
レクトロポレーション、あるいはミクロインジェクショ
ンにより行なわれる。トランスアクティブな配列は連続
性発現にとっては必要であり、これら適切なベクター中
への挿入は本発明についての普通の改良点である。哺乳
動物細胞組換え体発現系の構築を行なう為の宿主哺乳動
物細胞とは、Vero細胞、NIH3T3、GH3、C
OS、ネズミC127あるいはマウスL細胞などに限定
されるものではない。
サーを他の手段により産生ずる。−殻内に宿主となる哺
乳動物細胞とは細胞培養法により十分にクローン化され
ている細胞である。呻乳動吻細胞の発現ベクターには特
定の抗生物質に対して耐性になるneo遺伝子の様な選
択マーカーが含まれており、これにより細胞中のベクタ
ーの存在が確認される。DNA−介在トランスフェクシ
ョン、トランスアクティブ、あるいはトランスホーメー
ションが細胞に対して、例えばリン酸カルシウム法、エ
レクトロポレーション、あるいはミクロインジェクショ
ンにより行なわれる。トランスアクティブな配列は連続
性発現にとっては必要であり、これら適切なベクター中
への挿入は本発明についての普通の改良点である。哺乳
動物細胞組換え体発現系の構築を行なう為の宿主哺乳動
物細胞とは、Vero細胞、NIH3T3、GH3、C
OS、ネズミC127あるいはマウスL細胞などに限定
されるものではない。
哺乳動物細胞発現ベクターには基本的にウィルスベクタ
ー、またはSV40.BPVあるいはその他のウィルス
レプリコンを持つプラスミドベクター、あるいは動物細
胞に対するレプリコンを含まないベクターなどがある。
ー、またはSV40.BPVあるいはその他のウィルス
レプリコンを持つプラスミドベクター、あるいは動物細
胞に対するレプリコンを含まないベクターなどがある。
哺乳動物細胞発現ベクターに関する詳細はグルツマン、
ワイ、(Gluzo+an。
ワイ、(Gluzo+an。
Y、)著、゛ユーカリオティックヴアイラルベクター
(Eukariotic Viral Vectors
) ″コールドスプリングハーバーラボラトリ−19
82、ポーウエルス、ビー、エッチ、(Pouwels
、 P、 tl、)等”クローニングベクター、ラボラ
トリ−マニュアル”アルセパ−(Elsevier )
1985、リグビー、ピー、ダヴル、ジエイ、
(Rigby、 P。
(Eukariotic Viral Vectors
) ″コールドスプリングハーバーラボラトリ−19
82、ポーウエルス、ビー、エッチ、(Pouwels
、 P、 tl、)等”クローニングベクター、ラボラ
トリ−マニュアル”アルセパ−(Elsevier )
1985、リグビー、ピー、ダヴル、ジエイ、
(Rigby、 P。
イ、J、)、ジェイ、ジエン、ヴアロル、(、y、 G
en。
en。
Virol、)、第64巻、第255頁(1983)、
サブシマミー。ニス(Subramani、 s、 )
等、アナル、バイオケム(Anal、 Biochem
、 )第135巻、第1頁(1983)、及びグロバー
、デイ−、エム、 (Glover、 D、 M、 )
著” DNAクローニング、プラクティカルアプローチ
”IRL1985、第1及び■巻などにおいて記載され
ている。
サブシマミー。ニス(Subramani、 s、 )
等、アナル、バイオケム(Anal、 Biochem
、 )第135巻、第1頁(1983)、及びグロバー
、デイ−、エム、 (Glover、 D、 M、 )
著” DNAクローニング、プラクティカルアプローチ
”IRL1985、第1及び■巻などにおいて記載され
ている。
Ga プレカーサーのn−!
精製段階におけるgagプレカーサーの安定性の減少及
び崩壊を防ぐ為に、通常、フッ化フェニルメチルスルホ
ニル(PMSF)あるいはEDTAなどの様なプロテア
ーゼインヒビターを緩衝溶液中に添加する。好ましいイ
ンヒビターとしてはベンズアミジン、ペプスタチン、ア
プロチニン、PMSF及びE−64などと併用されるE
DTAである。本発明の方法手順において適切な代表的
プロテアーゼインヒビターとは金属キレート剤、重金属
イオン、SH保護基、プロテアーゼに対する基質様化合
物、プロテアーゼ阻害ポリペプチドなどに限定されるも
のではない。以下に幾つかの有効プロテアーゼインヒビ
ターを示す。
び崩壊を防ぐ為に、通常、フッ化フェニルメチルスルホ
ニル(PMSF)あるいはEDTAなどの様なプロテア
ーゼインヒビターを緩衝溶液中に添加する。好ましいイ
ンヒビターとしてはベンズアミジン、ペプスタチン、ア
プロチニン、PMSF及びE−64などと併用されるE
DTAである。本発明の方法手順において適切な代表的
プロテアーゼインヒビターとは金属キレート剤、重金属
イオン、SH保護基、プロテアーゼに対する基質様化合
物、プロテアーゼ阻害ポリペプチドなどに限定されるも
のではない。以下に幾つかの有効プロテアーゼインヒビ
ターを示す。
Ag−、Hg−、Cu++及び他の重金属イオンアンチ
スロンビン■ アンチスロンビン■−ヘパリン α宜 −アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Na−フロライド4−プロモー
フエナンシルブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸 システィン 4−ジニトロフェノールリン酸ジエチルDFP (ジイ
ソプロピルホスフォフルオリデート) DTT (ジチオスレイトール) E−64(トランス−エポキシスクシニル−L−口イシ
ルアミド−(4−グアニジン)−ブタン、ベーリンガー
マンハイム〕 EDTA及び他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジウムクロライド ヘパリン ヒルジン 4−ヒドロキシ水銀ベンゾエート ヨードアセトアミド ヨード酢酸 ロイペプチン α2−マクログロブリン メルカプトエタノール p−水銀ベンゾエート 塩化水銀(n) α−ミクログロブリン α−N −(p−ニトロベンジル−オキシカルボニル)
−L−アルギニルクロロメチルケトンオキサレート ストレプトミセスを含む種々の供給源からのべブスクチ
ン 1.10−フェナントロリン 2−フェナントロリン フェノチアジン−N−カルボニルクロライドホスフォル
アミトン PMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)ブリロホ
スフエート SH保護剤 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター フッ化p−)ルエンスルホニル TLCK (L−1−700−3−(4−トシルアミド
)−7−アミノ−2−ペプタノンー塩酸塩) トリトンX−100及び他の低濃度界面活性剤TPCK
(L−1−クロロ−3−(4−トシルアミド)−4−
フェニル−2−ブタノン)鶏卵由来トリプシンインヒビ
ター ZPCK (ベンジルオキシカルボニル−し−)工二ル
アラニン) 上記リスト中のインヒビターを数種含む緩衝溶液はga
gプレカーサー精製段階において用いられるものである
。gagプレカーサーの精製における緩衝溶液として好
ましいものにはEDTA。
スロンビン■ アンチスロンビン■−ヘパリン α宜 −アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Na−フロライド4−プロモー
フエナンシルブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸 システィン 4−ジニトロフェノールリン酸ジエチルDFP (ジイ
ソプロピルホスフォフルオリデート) DTT (ジチオスレイトール) E−64(トランス−エポキシスクシニル−L−口イシ
ルアミド−(4−グアニジン)−ブタン、ベーリンガー
マンハイム〕 EDTA及び他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジウムクロライド ヘパリン ヒルジン 4−ヒドロキシ水銀ベンゾエート ヨードアセトアミド ヨード酢酸 ロイペプチン α2−マクログロブリン メルカプトエタノール p−水銀ベンゾエート 塩化水銀(n) α−ミクログロブリン α−N −(p−ニトロベンジル−オキシカルボニル)
−L−アルギニルクロロメチルケトンオキサレート ストレプトミセスを含む種々の供給源からのべブスクチ
ン 1.10−フェナントロリン 2−フェナントロリン フェノチアジン−N−カルボニルクロライドホスフォル
アミトン PMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)ブリロホ
スフエート SH保護剤 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター フッ化p−)ルエンスルホニル TLCK (L−1−700−3−(4−トシルアミド
)−7−アミノ−2−ペプタノンー塩酸塩) トリトンX−100及び他の低濃度界面活性剤TPCK
(L−1−クロロ−3−(4−トシルアミド)−4−
フェニル−2−ブタノン)鶏卵由来トリプシンインヒビ
ター ZPCK (ベンジルオキシカルボニル−し−)工二ル
アラニン) 上記リスト中のインヒビターを数種含む緩衝溶液はga
gプレカーサー精製段階において用いられるものである
。gagプレカーサーの精製における緩衝溶液として好
ましいものにはEDTA。
ベンズアミジン、ペプスタチンA1アプロチニン、PM
SF及びE−64が含まれている。
SF及びE−64が含まれている。
盪企■健l迫良腹
gagプレカーサー、p55あるいはそのバリアントを
コードしている発現ベクターによりトランスホームされ
た酵母細胞を増殖させた後、ハーベストする。細胞を保
存する時には、PBS (リン酸緩衝生理食塩水、1
mM CaC1’z (無水)、2.7mM MCI、
1.47mM KlhPO4,0,5mM MgC1
’z・6HzO5137mM NaC1−8,06mM
NaZIIpo4−7nfo 、)のような緩衝液で
その細胞を洗浄し、細胞をペースト状にする。細胞ペー
ストの保存は、液体窒素中における凍結保存で行なわれ
る。
コードしている発現ベクターによりトランスホームされ
た酵母細胞を増殖させた後、ハーベストする。細胞を保
存する時には、PBS (リン酸緩衝生理食塩水、1
mM CaC1’z (無水)、2.7mM MCI、
1.47mM KlhPO4,0,5mM MgC1
’z・6HzO5137mM NaC1−8,06mM
NaZIIpo4−7nfo 、)のような緩衝液で
その細胞を洗浄し、細胞をペースト状にする。細胞ペー
ストの保存は、液体窒素中における凍結保存で行なわれ
る。
代表的な精製方法を以下に示す。凍結細胞ペーストをタ
ンパク質分解インヒビターを含む緩衝液で融解後、懸濁
する。例えば2mM PMSF含有PBS、高張リン
酸緩衝液、好ましくは試薬3(0,IM HEPES
pH7,5,10mM EDTA。
ンパク質分解インヒビターを含む緩衝液で融解後、懸濁
する。例えば2mM PMSF含有PBS、高張リン
酸緩衝液、好ましくは試薬3(0,IM HEPES
pH7,5,10mM EDTA。
10mM ベンズアミジン、1.0μg/ml!ペプ
スタチンA、0.13)リブシンインヒビターユニット
(T T U)/−アプロチニン、2mM PMSF、
0.1mMトランス−エポキシスクシニル−L−口イシ
ルアミド−(4グアニジノ)−ソタン〕。内在性のタン
パク質分解酵素活性を最小限に抑えるためには、4℃の
様な低温での操作が好ましい。細胞は機械的に破砕した
方がよい。細胞デスラブター及びフルイダイザーなど適
切かつ容易に操作しうる機械が種々市販されている。
スタチンA、0.13)リブシンインヒビターユニット
(T T U)/−アプロチニン、2mM PMSF、
0.1mMトランス−エポキシスクシニル−L−口イシ
ルアミド−(4グアニジノ)−ソタン〕。内在性のタン
パク質分解酵素活性を最小限に抑えるためには、4℃の
様な低温での操作が好ましい。細胞は機械的に破砕した
方がよい。細胞デスラブター及びフルイダイザーなど適
切かつ容易に操作しうる機械が種々市販されている。
酵母細胞破砕の段階で粗抽出物を得る。この時に必要な
事は、それ以後の精製段階における機械的障害を避ける
為に、抽出液中の細胞片を除去し、抽出液を浄化させる
事である。
事は、それ以後の精製段階における機械的障害を避ける
為に、抽出液中の細胞片を除去し、抽出液を浄化させる
事である。
約14,000Xg、45分間、4℃の遠心が適切であ
るけれども、異なった遠心速度、遠心時間、及び温度に
おいても同様の結果が得られ、容易に操作しろる事はよ
く知られている。gagプレカーサーの存在は、イムノ
プロットを併用した変性ゲルにおいて確認される。
るけれども、異なった遠心速度、遠心時間、及び温度に
おいても同様の結果が得られ、容易に操作しろる事はよ
く知られている。gagプレカーサーの存在は、イムノ
プロットを併用した変性ゲルにおいて確認される。
清浄化酵母抽出物として、14.OOOXgの上清液を
更に精製していく。分析チエツクに用いる以外のベレッ
トに関しては除去してよい。清浄化酵母抽出物は一70
℃で凍結。出願人は清浄化抽出物を一70℃における長
期保存、例えば少なくとも24時間、好ましくは少な(
とも72時間保存する事によって全産生物を利用するも
のである9変性ベレツト 出願人は清浄化酵母抽出物を少なくとも24時間凍結す
ることによりgagプレカーサーが自然に沈殿化する事
を発見した。これは簡単な遠心や沈降形式操作により融
解抽出物を十分に精製させるものである。清浄化凍結酵
母抽出物の融解後のベレットに対する連続ステップは界
面活性剤の有無は別として種々の緩衝液でそのベレット
をホモジナイズして沈降形成したgagプレカーサーを
洗浄し、膜、不必要な膜結合タンパク質及びその地膜様
成分の除去を行なう事がある。洗浄後に得られたペレッ
トを可溶化し、更に変性ペレットを形成させる。上記記
載の変性ペレット形成における概略を次に示す。
更に精製していく。分析チエツクに用いる以外のベレッ
トに関しては除去してよい。清浄化酵母抽出物は一70
℃で凍結。出願人は清浄化抽出物を一70℃における長
期保存、例えば少なくとも24時間、好ましくは少な(
とも72時間保存する事によって全産生物を利用するも
のである9変性ベレツト 出願人は清浄化酵母抽出物を少なくとも24時間凍結す
ることによりgagプレカーサーが自然に沈殿化する事
を発見した。これは簡単な遠心や沈降形式操作により融
解抽出物を十分に精製させるものである。清浄化凍結酵
母抽出物の融解後のベレットに対する連続ステップは界
面活性剤の有無は別として種々の緩衝液でそのベレット
をホモジナイズして沈降形成したgagプレカーサーを
洗浄し、膜、不必要な膜結合タンパク質及びその地膜様
成分の除去を行なう事がある。洗浄後に得られたペレッ
トを可溶化し、更に変性ペレットを形成させる。上記記
載の変性ペレット形成における概略を次に示す。
(a)少なくとも24時間凍結した清浄化凍結酵母抽出
物を融解する。
物を融解する。
(b)約10.000Xgから100.000Xg、約
10分から約120分、の範囲内の条件で遠心し、ga
gプレカーサーを沈降下させる。そしてその後ベレット
と上滑を分離する。
10分から約120分、の範囲内の条件で遠心し、ga
gプレカーサーを沈降下させる。そしてその後ベレット
と上滑を分離する。
(c)次に膜及び膜結合タンパク質を可溶化するのに効
果的な緩衝溶液でそのペレットを混合及びホモジナイズ
する。緩衝溶液には界面活性剤を加えておくとよい。
果的な緩衝溶液でそのペレットを混合及びホモジナイズ
する。緩衝溶液には界面活性剤を加えておくとよい。
(d)更に10,000Xgから100.OOOxg。
約10分から約120分、の範囲内の条件での遠心にか
けgagプレカーサーを再沈降させる。
けgagプレカーサーを再沈降させる。
そして、その後ペレットと上清を分離する。
(e)上記ステップ(C)及び(d)における洗浄は同
一溶液あるいは界面活性剤を含む、異なった緩衝液、あ
るいは緩衝液単独、あるいはそれらの組合せにより、3
回繰り返し操作されるものとする。産生物を洗浄済みペ
レットとする。
一溶液あるいは界面活性剤を含む、異なった緩衝液、あ
るいは緩衝液単独、あるいはそれらの組合せにより、3
回繰り返し操作されるものとする。産生物を洗浄済みペ
レットとする。
(f)その洗浄済みペレットを変性剤あるいはカオトロ
ピック因子を含む緩衝液で溶解する。そしてこの得られ
た変性ペレットを疎水性相互作用クロマトグラフィーに
かける。
ピック因子を含む緩衝液で溶解する。そしてこの得られ
た変性ペレットを疎水性相互作用クロマトグラフィーに
かける。
より明確に言うと、第1ステツプである融解〔上記記載
ステップ(a)〕はもっばら室温あるいは37℃中で行
なわれるが、他の温度として4℃−40℃の範囲内でも
実行可能であり、本発明の範囲の中に入れである。
ステップ(a)〕はもっばら室温あるいは37℃中で行
なわれるが、他の温度として4℃−40℃の範囲内でも
実行可能であり、本発明の範囲の中に入れである。
ステップ(b)、(d)あるいは(e)におけるgag
プレカーサーの沈降形成に用いられる遠心力はその回転
時間及び温度同様、種々変更しうるものである。沈降形
成段階における改良の多様性は内凹で判断できるので、
たやすく、遂行しうるものである。
プレカーサーの沈降形成に用いられる遠心力はその回転
時間及び温度同様、種々変更しうるものである。沈降形
成段階における改良の多様性は内凹で判断できるので、
たやすく、遂行しうるものである。
上記記載のステップ(c)における、膜及び膜結合タン
パク賞の可溶化に効果的な、緩衝液に含まれる適切な界
面活性剤としては非イオン性あるいはイオン性界面活性
剤、あるいは適切なそれらの併用などがあり、ノンオキ
シツール系、オクトオキシツール系、ポリオキシエチレ
ンアルコール系、ポリオキシエチレン(20)ソルビタ
ンモノ−オリエート系、デオキシコレートあるいはオク
チルグルコピラノシド等に限定されるものではない。ま
た両極性界面活性剤も有効かつ適切な溶剤である。好ま
しい緩衝液に含まれる界面活性剤とはステップ(c)で
ペレットに添加された時に最終濃度が約1%(W/V)
から約10%(W/V)の範囲内におさまるオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール(トリトンX−100
として市販されている)である。最も好ましい最終濃度
は試薬3に含まれるトリトンX−100の約5%(W/
V)である。
パク賞の可溶化に効果的な、緩衝液に含まれる適切な界
面活性剤としては非イオン性あるいはイオン性界面活性
剤、あるいは適切なそれらの併用などがあり、ノンオキ
シツール系、オクトオキシツール系、ポリオキシエチレ
ンアルコール系、ポリオキシエチレン(20)ソルビタ
ンモノ−オリエート系、デオキシコレートあるいはオク
チルグルコピラノシド等に限定されるものではない。ま
た両極性界面活性剤も有効かつ適切な溶剤である。好ま
しい緩衝液に含まれる界面活性剤とはステップ(c)で
ペレットに添加された時に最終濃度が約1%(W/V)
から約10%(W/V)の範囲内におさまるオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール(トリトンX−100
として市販されている)である。最も好ましい最終濃度
は試薬3に含まれるトリトンX−100の約5%(W/
V)である。
ステップ(d)あるいは(e)において調製された洗浄
済ペレットをステップ(f)において変性剤あるいはカ
オトロピック因子で変性させ、次のステップである疎水
性相互作用クロマトグラフィーにかける。−船釣に構造
式■なる変性剤は、とれも皆、変性の目的においては適
切かつ便利なものである。
済ペレットをステップ(f)において変性剤あるいはカ
オトロピック因子で変性させ、次のステップである疎水
性相互作用クロマトグラフィーにかける。−船釣に構造
式■なる変性剤は、とれも皆、変性の目的においては適
切かつ便利なものである。
式中
Rは アミノ、低級アルキルチオ、低級アルキルオキシ
あるいは硫黄 Xは アミノ、硫黄、あるいは酸素、及びYは 水素あ
るいはア°ミノである。
あるいは硫黄 Xは アミノ、硫黄、あるいは酸素、及びYは 水素あ
るいはア°ミノである。
この構造式にはグアニジン・HClも含まれ、その時、
Rはアミノ、Xはアミノ及びYは水素である。
Rはアミノ、Xはアミノ及びYは水素である。
ステップ(f)における洗浄済みペレットの変性に対す
る好ましい溶剤は試薬3中で約2Mから約8Mの濃度範
囲内にあるグアニジン・HCI’であり、最も好ましく
は6Mである。そして疎水性相互作用クロマトグラフィ
ーにかける直前にこの変性物を希釈する。
る好ましい溶剤は試薬3中で約2Mから約8Mの濃度範
囲内にあるグアニジン・HCI’であり、最も好ましく
は6Mである。そして疎水性相互作用クロマトグラフィ
ーにかける直前にこの変性物を希釈する。
疎水性 互 クロマトグラフィー
変性沈降形成されたgagプレカーサーを疎水性相互作
用を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ更に精製す
る。木目的の為の好ましい樹脂はフェニル−セファロー
ス(ファルマシア)である。
用を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ更に精製す
る。木目的の為の好ましい樹脂はフェニル−セファロー
ス(ファルマシア)である。
もち論その他の樹脂として、オクチル−セファロース(
ファルマシア)、ブチル−セファロース(ファルマシア
)及び同様アガロースの誘導体としてω−アミノアルキ
ルアガロース(マイルスリサーチ)あるいはヘキシル−
アガロースなども用いられる。構造式■なる変性剤が使
用され、中でもグアニジン・1−HJが好ましい。
ファルマシア)、ブチル−セファロース(ファルマシア
)及び同様アガロースの誘導体としてω−アミノアルキ
ルアガロース(マイルスリサーチ)あるいはヘキシル−
アガロースなども用いられる。構造式■なる変性剤が使
用され、中でもグアニジン・1−HJが好ましい。
代表的手順として、ますカラムを緩衝液、好ましくは2
Mグアニジン・HJを含む緩衝液で平衡化する。次に変
性ベレットをカラムにかけ、吸光度がベースラインに下
がるまでそのカラムを緩衝“液で洗浄する。この段階で
ニカラムにはgagプレカーサーが吸着されている。こ
れを変性剤の濃度を上昇させる濃度勾配の緩衝液で展開
させる。
Mグアニジン・HJを含む緩衝液で平衡化する。次に変
性ベレットをカラムにかけ、吸光度がベースラインに下
がるまでそのカラムを緩衝“液で洗浄する。この段階で
ニカラムにはgagプレカーサーが吸着されている。こ
れを変性剤の濃度を上昇させる濃度勾配の緩衝液で展開
させる。
濃度の上昇効果により選択的可溶化が起こる。カラムよ
り溶出して来たフラクションを取り、gagプレカーサ
ーの存在を確認する為に、5DS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動やウェスタンプロットを行なう。そしてg
agプレカーサーを含むフラクション部分を集める。フ
ェニル−セファロースカラムにおいては、約3Mグアニ
ジン・HCZにおいて酵母組換え体gagプレカーサー
が溶出してくる。
り溶出して来たフラクションを取り、gagプレカーサ
ーの存在を確認する為に、5DS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動やウェスタンプロットを行なう。そしてg
agプレカーサーを含むフラクション部分を集める。フ
ェニル−セファロースカラムにおいては、約3Mグアニ
ジン・HCZにおいて酵母組換え体gagプレカーサー
が溶出してくる。
水−可r性 母組換え a プレカーサー出願人によ
る他の発見とはこの段階におけるタンパク質を逆相高速
液体クロマトグラフィー(RP −HP L C)に特
定の条件下でかけ水−可溶性gagプレカーサーを得る
事である。あるいは別法としてゲル濾過方法を用いて水
−可溶性gagプレカーサーを得る事を出願人は発見し
た。
る他の発見とはこの段階におけるタンパク質を逆相高速
液体クロマトグラフィー(RP −HP L C)に特
定の条件下でかけ水−可溶性gagプレカーサーを得る
事である。あるいは別法としてゲル濾過方法を用いて水
−可溶性gagプレカーサーを得る事を出願人は発見し
た。
A、 RP−HPLC
一般的に、非極性静止相として作用するアルキルあるい
はフェニル基などによりコーティングされている適切な
細孔性粒子の充填しであるカラムならば、濃度勾配溶出
により、あらゆる逆相高速液体クロマトグラフィ一方法
が用いられる。本発明の方法においてはC4、Cl1S
CI8あるいはフェニル基が適切である。特にC+aが
好ましい基である。
はフェニル基などによりコーティングされている適切な
細孔性粒子の充填しであるカラムならば、濃度勾配溶出
により、あらゆる逆相高速液体クロマトグラフィ一方法
が用いられる。本発明の方法においてはC4、Cl1S
CI8あるいはフェニル基が適切である。特にC+aが
好ましい基である。
カラムは約0.1%(V/V))リフロロ酢酸(TFA
)を含む20%(V/V)アセトニトリルの水溶1夜で
静止相として平衡化され、RP−1−I P L Cに
とっては代表的な条件である。集められたフラクション
部分を?f4縮し、カラムにのせた後、移動相として、
アセトニトリル濃度を上昇させる濃度勾配を用いて展開
するm gagプレカーサーを含むと同定されたフラク
ション部分を集め、真空下で乾燥し、滅菌蒸留水で再懸
濁する。得られたタンパク質は、水あるいは1M尿素に
可溶なgagプレカーサー(≧95%)であった。
)を含む20%(V/V)アセトニトリルの水溶1夜で
静止相として平衡化され、RP−1−I P L Cに
とっては代表的な条件である。集められたフラクション
部分を?f4縮し、カラムにのせた後、移動相として、
アセトニトリル濃度を上昇させる濃度勾配を用いて展開
するm gagプレカーサーを含むと同定されたフラク
ション部分を集め、真空下で乾燥し、滅菌蒸留水で再懸
濁する。得られたタンパク質は、水あるいは1M尿素に
可溶なgagプレカーサー(≧95%)であった。
その他の適切なる静止相−移動相としての組合わせはリ
ン酸と10−40%勾配アセトニトリル、リン酸あるい
はTFAと勾配イソプロパツール等に限定されるもので
はない、水−可溶性gagプレカーサー調製の為に用い
られるHPLCのその他の改良についてはたやすく当業
者にとっては認められるところのものであり、改良点と
して使用カラム、移動相、有機溶媒相、移動相中の水保
持容量の決定、イオン強度、pl+、 ’11度、及び
イオン対及びイオン交換効果の評価などがあげられる。
ン酸と10−40%勾配アセトニトリル、リン酸あるい
はTFAと勾配イソプロパツール等に限定されるもので
はない、水−可溶性gagプレカーサー調製の為に用い
られるHPLCのその他の改良についてはたやすく当業
者にとっては認められるところのものであり、改良点と
して使用カラム、移動相、有機溶媒相、移動相中の水保
持容量の決定、イオン強度、pl+、 ’11度、及び
イオン対及びイオン交換効果の評価などがあげられる。
例えば、ウォーターフィールド、エム、デー。
(Waterfield、 M、 D、 )、“セバレ
ーションオブミクスチャーズオブプロテインスアンドベ
プチドバイHPLC,’ダープレ、ニー、(Darbr
e、 A、)著、ブラクティカルプロテインケミストリ
ーウィレー(Wiley ) 1986、第181−2
05頁を参照。
ーションオブミクスチャーズオブプロテインスアンドベ
プチドバイHPLC,’ダープレ、ニー、(Darbr
e、 A、)著、ブラクティカルプロテインケミストリ
ーウィレー(Wiley ) 1986、第181−2
05頁を参照。
B、[機溶媒によるゲル濾過
RP−HPLCの代わりに有機溶媒を用いたゲル濾過ク
ロマトグラフィーによっても水−可溶性gagプレカー
サーは得られる。有機溶媒を用いてゲル濾過マトリック
スが使用される。この様な適切なマトリックスの中には
セファロース(ファルマシア)、セファロースCL(フ
ァルマシア)、セファクリルを基にした樹脂(ファルマ
シア)、セファデックスLH(ファルマシア)、セファ
ロースB(ファルマシア)、及びパイオービーズS−X
(パイオーラッド)などがある。好ましい一トリックス
としてはセファデックスLHあるい心:セファクリルを
基にした樹脂でセファクリルS−300あるいはセファ
クリルS−200HRな2があり特に後者はグアニジン
・HCl塩の混入中Jリタンバク質を分離するに十分な
特性を持つも0である。
ロマトグラフィーによっても水−可溶性gagプレカー
サーは得られる。有機溶媒を用いてゲル濾過マトリック
スが使用される。この様な適切なマトリックスの中には
セファロース(ファルマシア)、セファロースCL(フ
ァルマシア)、セファクリルを基にした樹脂(ファルマ
シア)、セファデックスLH(ファルマシア)、セファ
ロースB(ファルマシア)、及びパイオービーズS−X
(パイオーラッド)などがある。好ましい一トリックス
としてはセファデックスLHあるい心:セファクリルを
基にした樹脂でセファクリルS−300あるいはセファ
クリルS−200HRな2があり特に後者はグアニジン
・HCl塩の混入中Jリタンバク質を分離するに十分な
特性を持つも0である。
基本的にはあらゆる有機溶媒が使用される。イ」表側と
しては、アセトニトリル、イソプロパツール、メタノー
ルあるいは塩化メチレンなどの有観溶媒中に低濃度の酸
性溶液たとえばTFAあるしはリン酸を含む溶媒がある
。溶媒系として好ましい濃度範囲は0.1%(V/V)
TFA/≧30%1アセトニトリル/H,Oであり、最
も好ましくは1011%(V/V)TFA/70%アセ
トニトリル/nzoである。
しては、アセトニトリル、イソプロパツール、メタノー
ルあるいは塩化メチレンなどの有観溶媒中に低濃度の酸
性溶液たとえばTFAあるしはリン酸を含む溶媒がある
。溶媒系として好ましい濃度範囲は0.1%(V/V)
TFA/≧30%1アセトニトリル/H,Oであり、最
も好ましくは1011%(V/V)TFA/70%アセ
トニトリル/nzoである。
仕加煎丞土二1
組換え体タンパク質の精製に用いられるその柑−船釣あ
るいはよく知られている方法もこのgagプレカーサー
の精製に付加的方法として用いらゎt る。これら
のステップを以下に示すが、それによt って限定
されるものではない。
るいはよく知られている方法もこのgagプレカーサー
の精製に付加的方法として用いらゎt る。これら
のステップを以下に示すが、それによt って限定
されるものではない。
(a)例えばシリカゲル、リン酸カルシウム活性炭、あ
るいはセライトアルミナなどの固相上における選択的吸
着あるいは分離。
るいはセライトアルミナなどの固相上における選択的吸
着あるいは分離。
)(b)溶媒あるいは試薬を用いた選択的抽出。
他の目的において用いられる、溶媒や試薬による抽出は
別のステップにおいて必要とされる。
別のステップにおいて必要とされる。
(c)gagプレカーサ°−分離には、硫酸アンモニ龜
ラムによる沈殿法あるいは等電点沈殿を用いた
pH勾配による沈殿法も別法の1つとしてあげられる。
ラムによる沈殿法あるいは等電点沈殿を用いた
pH勾配による沈殿法も別法の1つとしてあげられる。
他の方法として
;(d)ペーパー、薄層、分子ふるい、分子排斥、イ1
オン交換、リガンドアフィニティー、イムノア
フィニティー、電気泳動などの標準的操作によるクロマ
トグラフィー。
オン交換、リガンドアフィニティー、イムノア
フィニティー、電気泳動などの標準的操作によるクロマ
トグラフィー。
(e)サイズ排斥、吸着などによる高速液体クロマ1
トゲラフイーあるいは正常相における分配つまり (f)二層分配抽出による溶媒分画、例えばPEGとデ
キストラン(アンダーソン、イー、 (Anderso
nE、)等、アン、エヌ、ワイ、アヵド、サイ。
トゲラフイーあるいは正常相における分配つまり (f)二層分配抽出による溶媒分画、例えばPEGとデ
キストラン(アンダーソン、イー、 (Anderso
nE、)等、アン、エヌ、ワイ、アヵド、サイ。
(Ann、N、 Y、 Acad、 Sci ) 、第
413巻、第115頁(1983))。
413巻、第115頁(1983))。
(g)透析、ウルトラフィルトレージョン、濃縮、ある
いはグイヤフィルトレーション。
いはグイヤフィルトレーション。
(h)密度勾配遠心法。
(i)エレクトロフォーカッシング法。
(j)フリーズドライ、凍結乾燥法。あるいは(k)結
晶化法。
晶化法。
このリストは決してすべての方法を述べたものではなく
、また記載の順番は精製における好ましい順番を示すも
のでもない。gagプレカーサーの精製で好結果を得る
為には、凍結による沈殿、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、及びRP−HPLCあるいは有機溶媒を用いた
ゲル濾過クロマトグラフィーなどの操作と伴に、ステッ
プ(a)−(k)のどれか、あるいはすべてが使用され
る他の精製方法同様、ステップ(a)−(k)は、本精
製のあらゆる過程中に付加的ステップとじて、 導入
されうる方法である。
、また記載の順番は精製における好ましい順番を示すも
のでもない。gagプレカーサーの精製で好結果を得る
為には、凍結による沈殿、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、及びRP−HPLCあるいは有機溶媒を用いた
ゲル濾過クロマトグラフィーなどの操作と伴に、ステッ
プ(a)−(k)のどれか、あるいはすべてが使用され
る他の精製方法同様、ステップ(a)−(k)は、本精
製のあらゆる過程中に付加的ステップとじて、 導入
されうる方法である。
本発明のワクチンは、感染前、後、どの時期であっても
、第1表中のAIDS抗ウィルス剤、イムノモジュレー
タ−1抗生物質あるいはワクチンの有効量と伴に、効果
的に併用投与されるものである。
、第1表中のAIDS抗ウィルス剤、イムノモジュレー
タ−1抗生物質あるいはワクチンの有効量と伴に、効果
的に併用投与されるものである。
〔提供:マーケントレター、11月30日号、1987
、第26−27頁、ジエネテインクエンジニアリングニ
ュース、1月号、1988、第8巻、第23真〕 畑 ○ 〇−α
α QQ o > ロ 〉〉〉工 ロ!! ヱ −
鐸 Σ −−Σ −〇 −<<<
○ く 工O−−く−萩 か
’h cX
”へ≦ ト ム コ も や ム
八 Δ λもコ1へへべ 1111 、 1−1−’−−Rヘ モ ト ロ
X τく Q
○ O−’JO”J示 ム < 、
2ν や コ も
\λ 1ト 11^
λ M M F−ロス E
−へ Hφ
X ! oo ouu の −01: α α α
α の のOa<<(イ) くφ
くφ <XX−” / /’ t’
−/;”: / t tシ ベ
1 11fz へ 皐+l?V1
ト きム !1
セ ql :r−t)VdΔ 亨
Iト@rI〆 K 、き6
拳 ゛く ・役蚕 + 八、h
+h(h か ト i r
\ や そマロ Qm−コ賢 ト弘 11 寸へ 国 国 セ蚕 へ
へ ヘベ0−1:I’fiに 口八 1tΣ ヘ一 エ
α 蚕141八 1へのト 八rrr Jヤ
l:IO−○ Σ Σ 4へ −マ −【く−ト″
″ ≦ n′″′ Q”” −−Y” −”
−”K 区K
走 べ 1女 ダ
全 ダR!
R〜 ) w+lrSVM +’r
K口 tb I
も ・さ 1人 1弄
ト 【 弄 1へ 賢
1トY″″′ V″′+ ″″ Σ−勢−
ロー −ニー ←−χ−1、略 語 AIDS (後天性免疫不全症候群) ARC(AIDS関連症候群) CMV (サイトメガロウィルスAIDS患者中に、日
和見感染を起こし、失明あるいは、死亡)HIV(ヒト
免疫不全ウィルス、これまでLAV、HTLV−III
又はARVと呼ばれていた。)KS(カポジ肉腫) pcp <ニューモシスチスカリニ肺炎、日和見感染の
一種) PGL (持続性全身性リンパ筋腫張)D、ワクチン 本発明におけるワクチンを最近、研究開発されている種
々のAIDSあるいはHIVワクチンと併用してAID
S及びHIVによって惹起される同様の症状を示す疾患
に対して治療及び予防の為に使用した。
、第26−27頁、ジエネテインクエンジニアリングニ
ュース、1月号、1988、第8巻、第23真〕 畑 ○ 〇−α
α QQ o > ロ 〉〉〉工 ロ!! ヱ −
鐸 Σ −−Σ −〇 −<<<
○ く 工O−−く−萩 か
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ロー −ニー ←−χ−1、略 語 AIDS (後天性免疫不全症候群) ARC(AIDS関連症候群) CMV (サイトメガロウィルスAIDS患者中に、日
和見感染を起こし、失明あるいは、死亡)HIV(ヒト
免疫不全ウィルス、これまでLAV、HTLV−III
又はARVと呼ばれていた。)KS(カポジ肉腫) pcp <ニューモシスチスカリニ肺炎、日和見感染の
一種) PGL (持続性全身性リンパ筋腫張)D、ワクチン 本発明におけるワクチンを最近、研究開発されている種
々のAIDSあるいはHIVワクチンと併用してAID
S及びHIVによって惹起される同様の症状を示す疾患
に対して治療及び予防の為に使用した。
本発明のワクチンと併用されるAIDS治療に有用な医
薬組成物としての範囲は基本的にはAIDS抗ウィルス
剤、イムノモデュレーター、抗生物質あるいはワクチン
に限定されるものではなく、あらゆる医薬組成物との併
用にまで広げられる事は明白である。)IIV感染ある
いは疾患の予防あるいは治療の為に、プレあるいはポス
ト手段として用いられるワクチンとなりうる本発明のA
IDSあるいはHIVワクチンはこれを免疫源として特
異的な免疫応答を起こさせうるちのである。ワクチンと
しての免疫源性を示す形態は、種々の分子的構造配置に
より形成されるものであり、かつまた−殻内免疫学的テ
ストや実施に従がい、免疫学的賦形剤としてキャリアー
、ベクターあるいはアジュバントを添加されたものであ
る。例えば本発明の一つの具体例として、アラムアジュ
バントを賦形剤として、免疫源である酵母組換え体ga
gプレカーサー(あるいはそのバリアント)の懸濁液を
患者に対して予防的にワクチン接種が行なわれる。
薬組成物としての範囲は基本的にはAIDS抗ウィルス
剤、イムノモデュレーター、抗生物質あるいはワクチン
に限定されるものではなく、あらゆる医薬組成物との併
用にまで広げられる事は明白である。)IIV感染ある
いは疾患の予防あるいは治療の為に、プレあるいはポス
ト手段として用いられるワクチンとなりうる本発明のA
IDSあるいはHIVワクチンはこれを免疫源として特
異的な免疫応答を起こさせうるちのである。ワクチンと
しての免疫源性を示す形態は、種々の分子的構造配置に
より形成されるものであり、かつまた−殻内免疫学的テ
ストや実施に従がい、免疫学的賦形剤としてキャリアー
、ベクターあるいはアジュバントを添加されたものであ
る。例えば本発明の一つの具体例として、アラムアジュ
バントを賦形剤として、免疫源である酵母組換え体ga
gプレカーサー(あるいはそのバリアント)の懸濁液を
患者に対して予防的にワクチン接種が行なわれる。
免疫源は免疫源性を高めるとされている抗原決定基に対
して共有結合、あるいは非共有結合的に結合したgag
プレカーサー(あるいはそのバリアント)のアミノ酸配
列より成っている。その抗原決定基とはヘルパーT細胞
、細胞溶解性T細胞、B細胞の免疫性を誘発する典型的
なアミノ酸配列をもつものである。もしサプレッサーT
細胞の免疫性を誘発したいのならばアミノ酸配列の削除
が好ましい。これら抗原決定基の一例として、B型肝炎
pre S 2アミノ列配列がヘルパーT細胞及びB細
胞の免疫性を高めるものであると認識されている。
して共有結合、あるいは非共有結合的に結合したgag
プレカーサー(あるいはそのバリアント)のアミノ酸配
列より成っている。その抗原決定基とはヘルパーT細胞
、細胞溶解性T細胞、B細胞の免疫性を誘発する典型的
なアミノ酸配列をもつものである。もしサプレッサーT
細胞の免疫性を誘発したいのならばアミノ酸配列の削除
が好ましい。これら抗原決定基の一例として、B型肝炎
pre S 2アミノ列配列がヘルパーT細胞及びB細
胞の免疫性を高めるものであると認識されている。
そして、−船釣な免疫学的実験により免疫源性を高める
為の抗原決定基が必要であるとされたのなら、その抗原
決定基は抗原(Ag)に対して共有結合的に融合される
べきである0例えばB型肝炎の完全コア抗原あるいはそ
の一部分におけるカルボキシ末端をペプチド結合あるい
はその他の共存結合により組換え体p55あるいは組換
え体酵母Ty:Ag分子の7ミノ末端に連結し融合する
。
為の抗原決定基が必要であるとされたのなら、その抗原
決定基は抗原(Ag)に対して共有結合的に融合される
べきである0例えばB型肝炎の完全コア抗原あるいはそ
の一部分におけるカルボキシ末端をペプチド結合あるい
はその他の共存結合により組換え体p55あるいは組換
え体酵母Ty:Ag分子の7ミノ末端に連結し融合する
。
これら融合体の構築は該当する構造タンパク質をコード
しているDNAのスプライシング、そのスプライシング
を受けたDNAの発現及び融合タンパク質産物の分離に
より、簡単に調製されるものである。別法あるは付加的
方法として、その様な抗原決定基に結合する抗原が非共
有結合による相互作用によっても免疫源性を高める為に
有効な種々のサイズを有する粒状の形態物や、単純な凝
集物が産生される。これは他のワクチン形態についても
言及されるべき事であり、ペプチドカクテルは幅広いM
HC拘束性ペプチドを含み、DNA組換え体はAgに対
するDNA配列とワタシニアベクターを保有する。
しているDNAのスプライシング、そのスプライシング
を受けたDNAの発現及び融合タンパク質産物の分離に
より、簡単に調製されるものである。別法あるは付加的
方法として、その様な抗原決定基に結合する抗原が非共
有結合による相互作用によっても免疫源性を高める為に
有効な種々のサイズを有する粒状の形態物や、単純な凝
集物が産生される。これは他のワクチン形態についても
言及されるべき事であり、ペプチドカクテルは幅広いM
HC拘束性ペプチドを含み、DNA組換え体はAgに対
するDNA配列とワタシニアベクターを保有する。
本発明のワクチン調製の際に、アジュバントは添加され
ても、されなくてもよい。ヒト用ワクチンにはアラムが
代表的かつ良好なアジュバントである。他にフロイド不
完全アジュバントやリポソームなどを含むワクチンもあ
る。
ても、されなくてもよい。ヒト用ワクチンにはアラムが
代表的かつ良好なアジュバントである。他にフロイド不
完全アジュバントやリポソームなどを含むワクチンもあ
る。
T細胞免疫性、細胞溶解性T細胞、B細胞免疫性を誘発
する抗原決定基の使用により特異的免疫性の出現能力を
高められたこれらワクチンの調製、形態化、及びテスト
には、免疫学、組換えDNA及び関連分野における一般
的かつ日常的技法が必要とされる。実施例における次の
物質は市販されている。グアニジン・HCI’、インタ
ーナショナルバイオテクノロジーズ、インク、トリトン
X−100、ベーリンガーマンハイム。
する抗原決定基の使用により特異的免疫性の出現能力を
高められたこれらワクチンの調製、形態化、及びテスト
には、免疫学、組換えDNA及び関連分野における一般
的かつ日常的技法が必要とされる。実施例における次の
物質は市販されている。グアニジン・HCI’、インタ
ーナショナルバイオテクノロジーズ、インク、トリトン
X−100、ベーリンガーマンハイム。
本出願において、gagプレカーサーあるいはHIVp
55は、SDSポリアクリルアミドゲルなどの変性ゲル
及びウェスタンプロット〔バーネットダブル、エヌ、
(Burnette、 W、 N、 )、アナル、バ
イオケム、 (’Anna1. Biochem )
、第112巻、第192頁(1981))、あるいは
その併用によりモニターされる。
55は、SDSポリアクリルアミドゲルなどの変性ゲル
及びウェスタンプロット〔バーネットダブル、エヌ、
(Burnette、 W、 N、 )、アナル、バ
イオケム、 (’Anna1. Biochem )
、第112巻、第192頁(1981))、あるいは
その併用によりモニターされる。
実濾拠よ
Gagプレカーサー終止コドンの下流直近部位に終止コ
ドンが挿入されているHIVgagプレカーサーに対す
る酵母発現ベクターの構築プラスミドpBL4−3−2
(あるいはpNL4−3)は、約22kbの挿入を持
ったpUclBであり、New YorkHr V分離
株#5の5′側の半分と、LAV分離株の3′側の半分
とを融合した9、 7 k bのHIVDNAより成っ
ている〔ニー。
ドンが挿入されているHIVgagプレカーサーに対す
る酵母発現ベクターの構築プラスミドpBL4−3−2
(あるいはpNL4−3)は、約22kbの挿入を持
ったpUclBであり、New YorkHr V分離
株#5の5′側の半分と、LAV分離株の3′側の半分
とを融合した9、 7 k bのHIVDNAより成っ
ている〔ニー。
アダナ(A、 Adacht )等、ジエイ、ヴイロル
。
。
(J、 Virol ) 、第59巻、第284−29
1頁(1986))、HIVgagプレカーサーに対す
る酵母発現ベクターの構築に関する本方法において、A
IDSウィルスの配列を含む他の種々のプラスミドはp
BL4−3−2(あるいはpNL4−3)の代りに用い
られ、しかもその様なプラスミドに対する適切な遺伝子
工学操作法の選択は分子生産学者の技術の中にある。
1頁(1986))、HIVgagプレカーサーに対す
る酵母発現ベクターの構築に関する本方法において、A
IDSウィルスの配列を含む他の種々のプラスミドはp
BL4−3−2(あるいはpNL4−3)の代りに用い
られ、しかもその様なプラスミドに対する適切な遺伝子
工学操作法の選択は分子生産学者の技術の中にある。
プラスミドp B L 4−3−2(あるいはpNL4
−3)をHindn[で部分的切断を行ない、gag−
polコード領域を保有する5、 7 k bのHin
d■フラグメントを得た。このフラグメントをpUc1
3でサブクローニングし、出現してきた2個の同一プラ
スミドを、Pl及びP2と表示する。両プラスミドを以
下に示す様式で別々に同一操作を行なう、プラスミドP
i(あるいはP2)をHgalとNdelで切断する。
−3)をHindn[で部分的切断を行ない、gag−
polコード領域を保有する5、 7 k bのHin
d■フラグメントを得た。このフラグメントをpUc1
3でサブクローニングし、出現してきた2個の同一プラ
スミドを、Pl及びP2と表示する。両プラスミドを以
下に示す様式で別々に同一操作を行なう、プラスミドP
i(あるいはP2)をHgalとNdelで切断する。
得られた4、 4 k bHgaI−NdeI ga
g−po17ラグメントをDNAポリメレースIのクレ
ノーフラグメントにより平滑末端とする。(gagコー
ド配列中の+3部位においてHgalサイトの充填が行
なわれ平滑末端になる。)4.4kbの平滑末端フラグ
メントを以下の構造を有する合成オリゴヌクレオチドア
ダプターとライゲーションする。
g−po17ラグメントをDNAポリメレースIのクレ
ノーフラグメントにより平滑末端とする。(gagコー
ド配列中の+3部位においてHgalサイトの充填が行
なわれ平滑末端になる。)4.4kbの平滑末端フラグ
メントを以下の構造を有する合成オリゴヌクレオチドア
ダプターとライゲーションする。
5 ’ −AGCTTGGATCCACAAAAC
AAAAT −3’3’−ACCTAGGTGTTT
TGTTTTA−5’アダプターを平滑末端であるHg
alサイトにライゲーションしてgag遺伝子に対する
ATG開始コドンを付着させ、更に酵母様非翻訳mRN
Aリーダー及びHindn[、BamHIクローニング
サイトを添加した。本アダプターを平滑末端Ndelサ
イトとライゲーションし、本来のpol翻訳終止コドン
の下流27bpに翻訳終止コドン及びBamHI、Hi
ndI[Iクローニングサイトを組入れた。このライゲ
ーションミクスチャーをHindnlで切断し、得られ
たgag−polコード領域を持つ4.4 k bのH
indlI[フラグメントをゲル精製して、pAAH5
のHindlIIサイトへクローン化した〔ジー、アメ
レル(G、 Ammerer)−、メソッズインエンサ
イモロジ−(Methods in Enzymolo
gy)。
AAAAT −3’3’−ACCTAGGTGTTT
TGTTTTA−5’アダプターを平滑末端であるHg
alサイトにライゲーションしてgag遺伝子に対する
ATG開始コドンを付着させ、更に酵母様非翻訳mRN
Aリーダー及びHindn[、BamHIクローニング
サイトを添加した。本アダプターを平滑末端Ndelサ
イトとライゲーションし、本来のpol翻訳終止コドン
の下流27bpに翻訳終止コドン及びBamHI、Hi
ndI[Iクローニングサイトを組入れた。このライゲ
ーションミクスチャーをHindnlで切断し、得られ
たgag−polコード領域を持つ4.4 k bのH
indlI[フラグメントをゲル精製して、pAAH5
のHindlIIサイトへクローン化した〔ジー、アメ
レル(G、 Ammerer)−、メソッズインエンサ
イモロジ−(Methods in Enzymolo
gy)。
第101巻、第192−201頁、(1983))。
次に大腸菌をトランスホームさせ、プラスミドp64−
30をプラスミドP1より獲得した。またp50−81
とはプラスミドP2由来である。
30をプラスミドP1より獲得した。またp50−81
とはプラスミドP2由来である。
プラスミドp64−30をBamHIとHinc I[
で切断し、得られた1760bpのBamHI−ト1i
nc■フラグメント(gagコード領域保有)をゲル精
製し、あらかじめBan+HIとHinc I[で切断
しておいたM13mp18でサブクローニングする。
で切断し、得られた1760bpのBamHI−ト1i
nc■フラグメント(gagコード領域保有)をゲル精
製し、あらかじめBan+HIとHinc I[で切断
しておいたM13mp18でサブクローニングする。
オリゴヌクレオチド−ダイレクト変異法により〔エム、
ジエイ、ゾーレル(M、 J、 Zoller)等、メ
ソッズインエンサイモロジー、第100巻、第468−
500頁(1983))、gag翻訳終止コドンの下流
5bpにSn+alサイトが導入された。
ジエイ、ゾーレル(M、 J、 Zoller)等、メ
ソッズインエンサイモロジー、第100巻、第468−
500頁(1983))、gag翻訳終止コドンの下流
5bpにSn+alサイトが導入された。
変異法で用いられたオリゴヌクレオチドは次の構造を持
つ。
つ。
5 ’ −CCCCCCGGGCTTTATTGT
GAC−3’この変異プラスミドをBglnとHinc
IIで切断し、得られたgagコード領域の3′末端を
含む0、44 k bのBglU−HincIIフラグ
メントをゲル精製する。プラスミドp50−81をBa
mHIとBglUで切断し、得られたgagコード領域
の5′末端を含むl、 3 k bのBamHI−Bg
l IIフラグメントをゲル精製する。前述0.44
kbフラグメントとこの1. ’a kbフラグメント
をあらかじめBamHIとHinc IIで切断してお
いたベクターpGEM−4と伴にライゲーションする。
GAC−3’この変異プラスミドをBglnとHinc
IIで切断し、得られたgagコード領域の3′末端を
含む0、44 k bのBglU−HincIIフラグ
メントをゲル精製する。プラスミドp50−81をBa
mHIとBglUで切断し、得られたgagコード領域
の5′末端を含むl、 3 k bのBamHI−Bg
l IIフラグメントをゲル精製する。前述0.44
kbフラグメントとこの1. ’a kbフラグメント
をあらかじめBamHIとHinc IIで切断してお
いたベクターpGEM−4と伴にライゲーションする。
得られたプラスミド、pKH−GAG (4,6k b
) 、は翻訳終止コドンの下流5bpにSmalサイト
、及び酵母様5′非翻訳リ一ダー配列を持つ再構築され
たgag遺伝子を含むものである。
) 、は翻訳終止コドンの下流5bpにSmalサイト
、及び酵母様5′非翻訳リ一ダー配列を持つ再構築され
たgag遺伝子を含むものである。
pKH−GAGをBamHIとSmalで切断する。
得られた1、 5 k bのBaa+HT−3IIIa
l g a gフラグメントをDNAポリメレースlの
クレノーフラグメントにより平滑末端とし、ゲルで精製
する。
l g a gフラグメントをDNAポリメレースlの
クレノーフラグメントにより平滑末端とし、ゲルで精製
する。
酵母発現ベクターpc1/ 1−pG A P (B)
tA D H1は酵母グリセルアルデヒド−3−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(GAP491)に対す
る構成プロモーター及び酵母ADHI遺伝子の転写ター
ミネータ−を含んでいる。ユニークBamHIサイトは
プロモーター及びターミネータ−因子の間に位置してい
る。本ベクターは既に報告されているとおりGAP49
1発現ベクターと機能的に同じである〔ビー、クニスケ
ルン(P、 Kniskern)等、ジーン(Gene
) 、第46巻、第135−141頁(1986)。
tA D H1は酵母グリセルアルデヒド−3−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(GAP491)に対す
る構成プロモーター及び酵母ADHI遺伝子の転写ター
ミネータ−を含んでいる。ユニークBamHIサイトは
プロモーター及びターミネータ−因子の間に位置してい
る。本ベクターは既に報告されているとおりGAP49
1発現ベクターと機能的に同じである〔ビー、クニスケ
ルン(P、 Kniskern)等、ジーン(Gene
) 、第46巻、第135−141頁(1986)。
pct/1−pGAP(B) tADHlをBamHI
で切断し次にDNAポリメレースIのクレノーフラグメ
ントで平滑末端とする。このベクターフラグメントと先
の1.5kb gagフラグメントを伴にライゲーシ
ョンしてpKH12−2を作成する。この組換え体プラ
スミドをサツカロミセスセレビシェU9株でトランスホ
ームする(MATa、1eu2 04、adel、ur
a3、c i r ’)。09株はニス、セレビシェ2
150−2−3株(MATa、1eu2−04、ade
l、cir”)より自然に誘導されてきたura3分離
株である。トランスホームされたクローンを選択し複製
する。細胞溶解物を調製し、ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動及びニトロセルロースによるウェスタンプ
ロットを行なった。HIV−陽性ヒト血清を用いたイム
ノプロットにより、このトランスホーマントの中にHI
V−特異的55キロダルトンのタンパク質の存在が実証
された。またRIAにより抗−p24抗体と反応するこ
の55−KDaタンパク賞がHIVgag1)55であ
ると同定確認された。
で切断し次にDNAポリメレースIのクレノーフラグメ
ントで平滑末端とする。このベクターフラグメントと先
の1.5kb gagフラグメントを伴にライゲーシ
ョンしてpKH12−2を作成する。この組換え体プラ
スミドをサツカロミセスセレビシェU9株でトランスホ
ームする(MATa、1eu2 04、adel、ur
a3、c i r ’)。09株はニス、セレビシェ2
150−2−3株(MATa、1eu2−04、ade
l、cir”)より自然に誘導されてきたura3分離
株である。トランスホームされたクローンを選択し複製
する。細胞溶解物を調製し、ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動及びニトロセルロースによるウェスタンプ
ロットを行なった。HIV−陽性ヒト血清を用いたイム
ノプロットにより、このトランスホーマントの中にHI
V−特異的55キロダルトンのタンパク質の存在が実証
された。またRIAにより抗−p24抗体と反応するこ
の55−KDaタンパク賞がHIVgag1)55であ
ると同定確認された。
クローン分離した菌をU9#5−1として選択し、更に
発酵及びタンパク質の精製実験の為のマスターシード(
PF413)として調製した。このマスターシードを1
7%(v/V)グリセロールの存在下で−60から一8
0℃において凍結保存する。
発酵及びタンパク質の精製実験の為のマスターシード(
PF413)として調製した。このマスターシードを1
7%(v/V)グリセロールの存在下で−60から一8
0℃において凍結保存する。
試料09#5−1.PI及びP2は本願出願臼又はその
前にアメリカンタイプカルチャーコレクション、(12
301パークローンドライブ、ロックヴイル、エムデイ
−20852)に寄託し、それぞれ受託番号が2087
6.67669、及び67670となった。
前にアメリカンタイプカルチャーコレクション、(12
301パークローンドライブ、ロックヴイル、エムデイ
−20852)に寄託し、それぞれ受託番号が2087
6.67669、及び67670となった。
実施例−?−
・ごパ ヒ の3 −
+1実施例1における凍結組換え体酵母細胞を融解する
。細胞破壊緩衝液(0,1M HEPES pH7,
5,10mM EDTA、10mMヘンズアミジン、1
Mg/ml”=ブスタチンA、0.13 TIU/dア
プロチニン、2mMPMSF、0.1 mM )ランス
−エポキシスクシニル−2−ロイシルアミド〜(4−グ
アニジノ)−ブタン〕を加えて約25%(W/V)の細
胞懸濁液を作る。細胞を4℃で圧力をかけて溶解する。
+1実施例1における凍結組換え体酵母細胞を融解する
。細胞破壊緩衝液(0,1M HEPES pH7,
5,10mM EDTA、10mMヘンズアミジン、1
Mg/ml”=ブスタチンA、0.13 TIU/dア
プロチニン、2mMPMSF、0.1 mM )ランス
−エポキシスクシニル−2−ロイシルアミド〜(4−グ
アニジノ)−ブタン〕を加えて約25%(W/V)の細
胞懸濁液を作る。細胞を4℃で圧力をかけて溶解する。
14.OOOXg、45分、4°Cの遠心後、ペレット
を除去する。上清を清浄化酵母抽出物として、それを少
な(とも72時間、−70℃で凍結する。
を除去する。上清を清浄化酵母抽出物として、それを少
な(とも72時間、−70℃で凍結する。
実施例3
′コ′ ヒ酵 の リ、 、1バリエーシ
ョンA、変性ペレット 実施例2における凍結された清浄化酵母抽出物800−
を室温水浴中で融解し、30.00 Orpm(105
,000Xg) 、60分、4℃の遠心にかける。上清
を除去し、ベレットはそのまま、それぞれの遠心管中に
入れておく。この各チューブ中のペレットに5−の5%
(W/■)トリトンX−100(ベーリンガーマンハイ
ム) ヲ含ムm薬3(0,1M HE P E S (
pH7,5)、10mM EDTA、10ug/mR
ヘプスタチンA、 0.137IU/−アプロチニン、
lQmMベンズアミジン・Hα、25μHトランスエポ
キシスクシニル−し−口イシルアミド−(4−グアニジ
ノ)−ブタン、0.1%(−ハ)2−メルカプトエタノ
ール〕を加えて、膜及び付随的な膜結合ペレットを可溶
化する。ベレー/ )をホモジナイズして、約2.5%
(W/V)l−リドンX−100の懸濁液とする。懸濁
液を30.00Orpm、30分、4℃の遠心にかけ、
トリトン上清Iを除去し、ペレットは各遠心管中で放置
する。
ョンA、変性ペレット 実施例2における凍結された清浄化酵母抽出物800−
を室温水浴中で融解し、30.00 Orpm(105
,000Xg) 、60分、4℃の遠心にかける。上清
を除去し、ベレットはそのまま、それぞれの遠心管中に
入れておく。この各チューブ中のペレットに5−の5%
(W/■)トリトンX−100(ベーリンガーマンハイ
ム) ヲ含ムm薬3(0,1M HE P E S (
pH7,5)、10mM EDTA、10ug/mR
ヘプスタチンA、 0.137IU/−アプロチニン、
lQmMベンズアミジン・Hα、25μHトランスエポ
キシスクシニル−し−口イシルアミド−(4−グアニジ
ノ)−ブタン、0.1%(−ハ)2−メルカプトエタノ
ール〕を加えて、膜及び付随的な膜結合ペレットを可溶
化する。ベレー/ )をホモジナイズして、約2.5%
(W/V)l−リドンX−100の懸濁液とする。懸濁
液を30.00Orpm、30分、4℃の遠心にかけ、
トリトン上清Iを除去し、ペレットは各遠心管中で放置
する。
各ペレットに5−の試薬4〔6M−グアニジン・HCJ
!、0.1M HEPES (pH7,5) 、10m
MEDTA、10μg7m2ヘプスタチンA、0.13
TIU/−アプロチニン、10nIMベンズアミジン・
HCJ!、25μHトランス−エポキシスクシニル−L
−ロイシルアミド(4−グアニジノ)−ブタン、及び0
.1%(W/V)2−メルカプトエタノール〕を加え可
溶化を再度行ない、その後ホモシネ−ジョン及び、冷却
下で、−晩エンドーオーバーーエンドミキサーで最終的
に混合する。得られた混合液が変性ペレットであり、試
薬4で15倍に希釈した後−20℃あるいは一70℃で
保存する。
!、0.1M HEPES (pH7,5) 、10m
MEDTA、10μg7m2ヘプスタチンA、0.13
TIU/−アプロチニン、10nIMベンズアミジン・
HCJ!、25μHトランス−エポキシスクシニル−L
−ロイシルアミド(4−グアニジノ)−ブタン、及び0
.1%(W/V)2−メルカプトエタノール〕を加え可
溶化を再度行ない、その後ホモシネ−ジョン及び、冷却
下で、−晩エンドーオーバーーエンドミキサーで最終的
に混合する。得られた混合液が変性ペレットであり、試
薬4で15倍に希釈した後−20℃あるいは一70℃で
保存する。
B、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを試薬3
とフェニル−セファロース(ファルマシア)で調製する
。変性ペレットをのせた後、カラムを試薬3で展開する
。280nm吸光度において巾広いピークを持つ素通り
画分を集め除去する。試薬3から試薬4への直線勾配法
を用いて溶出させる。グアニジン・HClfll、度の
上昇効果に伴なって、選択的可溶化がカラム中で起こる
。
とフェニル−セファロース(ファルマシア)で調製する
。変性ペレットをのせた後、カラムを試薬3で展開する
。280nm吸光度において巾広いピークを持つ素通り
画分を集め除去する。試薬3から試薬4への直線勾配法
を用いて溶出させる。グアニジン・HClfll、度の
上昇効果に伴なって、選択的可溶化がカラム中で起こる
。
分画した溶出液に対して組換え体p55 g a gプ
レカーサーの含有(約3Mグアニジン・HCi’部分で
溶出してくる)をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いて確認し、フェニル−セファロ−スプールとし
て回収する。分析用サンプルはキャリヤーBSAの存在
下でMeOH沈:R決により変性剤グアニジン・Hαを
除去し、電気泳動用サンプルとして調製する。グアニジ
ン・HCJ!濃度を電気伝導度の測定により追跡試験を
行なう。フェニル−セファロ−スプールはこの時点で1
0mMHEPESに対して透析し、ρ55 (85−9
0%純度)を沈殿させる。この沈殿物を6Mグアニジン
・HCl及び6%β−メルカプトエタノール溶液で可溶
化する。
レカーサーの含有(約3Mグアニジン・HCi’部分で
溶出してくる)をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いて確認し、フェニル−セファロ−スプールとし
て回収する。分析用サンプルはキャリヤーBSAの存在
下でMeOH沈:R決により変性剤グアニジン・Hαを
除去し、電気泳動用サンプルとして調製する。グアニジ
ン・HCJ!濃度を電気伝導度の測定により追跡試験を
行なう。フェニル−セファロ−スプールはこの時点で1
0mMHEPESに対して透析し、ρ55 (85−9
0%純度)を沈殿させる。この沈殿物を6Mグアニジン
・HCl及び6%β−メルカプトエタノール溶液で可溶
化する。
C0水−可溶性酵母組換え体gagプレカーサータンパ
ク質 フェニルーセファロースプールヲ?l= 縮シc +
s 逆相HPLC(高速液体クロマトグラフィー)系を
用いて水可溶性物とする。HPLCカラムを1容量の試
薬5(1,0dl−リフロロ酢酸、999−アセトニト
リル〕と4容量の試薬6(1,0−トリフロロ酢酸、9
99−水〕からなるミクスチャ−1によって平衡化する
。濃縮フェニル−セファロ−スプールは95℃加熱、1
0分後、14.000Xg、10分の遠心にかけ残存デ
ブリを除去して調製される。gagプレカーサーを含む
上清サンプルを試薬4で溶解し、平衡化しであるHPL
Cにかける。ミクスチャ−1で連続的洗浄ステップで溶
媒輸送システムよりカラムを洗浄しミクスチャ−1から
ミクスチャ−2〔4容量の試薬5と1容量の試薬6〕へ
の勾配緩衝液で溶出を行なう。最終洗浄はミクスチャ−
3〔9容量の試薬5と1容量の試薬6〕で行なう。26
0nmにおける主要ピーク吸光により十分に精製された
(≧95%)、水−可溶性酵母組換え体gagプレカー
サーが存在している事を見い出しSDSゲル電気泳動後
の銀染色やウェスタンプロットにより判定した。溶媒を
回転エバポレーターで除去し、そこへ滅菌蒸留水を加え
る。このHPLC−精製gagプレカーサーは水あるい
は1M尿素によく溶ける。それは細胞溶解後の凝集物質
が強度性剤でのみ可溶である事とは対照的である。各2
0%の細胞懸濁液50m2からHPLC後の回収総タン
パク質量は2から4■の範囲にある。
ク質 フェニルーセファロースプールヲ?l= 縮シc +
s 逆相HPLC(高速液体クロマトグラフィー)系を
用いて水可溶性物とする。HPLCカラムを1容量の試
薬5(1,0dl−リフロロ酢酸、999−アセトニト
リル〕と4容量の試薬6(1,0−トリフロロ酢酸、9
99−水〕からなるミクスチャ−1によって平衡化する
。濃縮フェニル−セファロ−スプールは95℃加熱、1
0分後、14.000Xg、10分の遠心にかけ残存デ
ブリを除去して調製される。gagプレカーサーを含む
上清サンプルを試薬4で溶解し、平衡化しであるHPL
Cにかける。ミクスチャ−1で連続的洗浄ステップで溶
媒輸送システムよりカラムを洗浄しミクスチャ−1から
ミクスチャ−2〔4容量の試薬5と1容量の試薬6〕へ
の勾配緩衝液で溶出を行なう。最終洗浄はミクスチャ−
3〔9容量の試薬5と1容量の試薬6〕で行なう。26
0nmにおける主要ピーク吸光により十分に精製された
(≧95%)、水−可溶性酵母組換え体gagプレカー
サーが存在している事を見い出しSDSゲル電気泳動後
の銀染色やウェスタンプロットにより判定した。溶媒を
回転エバポレーターで除去し、そこへ滅菌蒸留水を加え
る。このHPLC−精製gagプレカーサーは水あるい
は1M尿素によく溶ける。それは細胞溶解後の凝集物質
が強度性剤でのみ可溶である事とは対照的である。各2
0%の細胞懸濁液50m2からHPLC後の回収総タン
パク質量は2から4■の範囲にある。
滅菌濾過及びアラム吸着は適切なワクチン調製において
は一般的な方法である。
は一般的な方法である。
大施桝↓
A、変性ペレット
実施例2における凍結清浄化酵母抽出物の800−を室
温水浴中で融解し、試薬3で1600−に希釈し、望ま
しくない沈殿形成をおさえる。得られた混合液を14.
OOOrpm(30,000x g)、30分、4℃
の遠心にかける。上清を一20℃で凍結(上清1)し、
ペレットは各遠心チューブ中に保持しておく。5%(W
/V) トリトンX−100(ベーリンガーマンハイ
ム)を含む試薬310111を各遠心チューブ中のペレ
ットに加えて膜及び付随的な膜結合タンパク質ベレット
を可溶化させる。ペレットをホモジナイズして約5%(
W/V)トリトンX−100の懸濁液とする。そしてこ
の懸濁液を一20℃で凍結する(凍結ペレット)。
温水浴中で融解し、試薬3で1600−に希釈し、望ま
しくない沈殿形成をおさえる。得られた混合液を14.
OOOrpm(30,000x g)、30分、4℃
の遠心にかける。上清を一20℃で凍結(上清1)し、
ペレットは各遠心チューブ中に保持しておく。5%(W
/V) トリトンX−100(ベーリンガーマンハイ
ム)を含む試薬310111を各遠心チューブ中のペレ
ットに加えて膜及び付随的な膜結合タンパク質ベレット
を可溶化させる。ペレットをホモジナイズして約5%(
W/V)トリトンX−100の懸濁液とする。そしてこ
の懸濁液を一20℃で凍結する(凍結ペレット)。
以下に示す′様に、凍結上清■に対する大量用操作とし
ての付加的方法は約50%回収率を増大させるものであ
る。つまり凍結上清Iを室温水浴中で融解し、14.0
0 Orpm (30,000X g)、30分、4
”cの遠心にかけ、それらのペレットを5%(W/V
))リドンx−iooを含む試薬310m1でそれぞれ
処理し、ホモジナイズして、ホモジナイズ残留ペレット
とする。先の凍結ペレットを室温水浴中で融解し、この
残留ペレフ【・と一つの容器内で混合する。混合ペレッ
トを5%(W/V)トリトンX−100を含む試薬3を
用いて200dにする。そしてこの混合物をホモジナイ
ズして14.00 Orpm 、30分、4℃の遠心に
かける。
ての付加的方法は約50%回収率を増大させるものであ
る。つまり凍結上清Iを室温水浴中で融解し、14.0
0 Orpm (30,000X g)、30分、4
”cの遠心にかけ、それらのペレットを5%(W/V
))リドンx−iooを含む試薬310m1でそれぞれ
処理し、ホモジナイズして、ホモジナイズ残留ペレット
とする。先の凍結ペレットを室温水浴中で融解し、この
残留ペレフ【・と一つの容器内で混合する。混合ペレッ
トを5%(W/V)トリトンX−100を含む試薬3を
用いて200dにする。そしてこの混合物をホモジナイ
ズして14.00 Orpm 、30分、4℃の遠心に
かける。
この時のトリトン上清Iは除去し更に5%(W/V)ト
リトンX−100を含む試薬3 20tl!を加え、ホ
モジナイズを繰り返す。この混合物に5%(W/v)ト
リトンX−100を含む試薬3を加えて200dにする
。ホモジナイズ終了後、再び14、OOOXg、30分
、4℃の遠心にかける。
リトンX−100を含む試薬3 20tl!を加え、ホ
モジナイズを繰り返す。この混合物に5%(W/v)ト
リトンX−100を含む試薬3を加えて200dにする
。ホモジナイズ終了後、再び14、OOOXg、30分
、4℃の遠心にかける。
同様にトリトン上清■を除去し、ペレットは試薬425
−で処理する。ホモジナイズして、冷却下で一晩、エン
ド−オーバーエンド(end −over −end)
ミキサーで混合する。そして得られた混合物が変性ペレ
ットであり、試薬4で15倍希釈した後、−20℃ある
いは一70℃で保存する。
−で処理する。ホモジナイズして、冷却下で一晩、エン
ド−オーバーエンド(end −over −end)
ミキサーで混合する。そして得られた混合物が変性ペレ
ットであり、試薬4で15倍希釈した後、−20℃ある
いは一70℃で保存する。
B、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムをカラム
用緩衝液〔2容量の試薬3と1容itの試薬4〕とフェ
ニル−セファロースで調製する。このカラムを実施例3
で用いた緩衝液のかわりに2Mグアニジン・I(αを含
む緩衝液で平衡化する。変性ペレットはカラムにのせる
前に30、OOOrpm (105,000xg)
、30分、4℃の遠心にかけ残留デブリーを除去してお
く。
用緩衝液〔2容量の試薬3と1容itの試薬4〕とフェ
ニル−セファロースで調製する。このカラムを実施例3
で用いた緩衝液のかわりに2Mグアニジン・I(αを含
む緩衝液で平衡化する。変性ペレットはカラムにのせる
前に30、OOOrpm (105,000xg)
、30分、4℃の遠心にかけ残留デブリーを除去してお
く。
この上清液に計算上2MグアニジンHαになる様に試薬
3を加える。試料をのせた後、カラムをカラム緩衝液、
2Mグアニジン・HCff緩衝液で展開する。260n
m吸光度において巾広いピークを持つ素通りした両分を
集め除去する。カラム緩衝液から試薬4への直線勾配法
つまり2Mから6Mグアニジン・H(1!勾配を用いて
溶出させる。グアニジン・H(1’濃度の上昇効果に伴
なって選択的可溶化がカラム中で起こる。排除容量であ
る2Mグアニジン・HCJ!ではgagプレカーサータ
ンパク質の溶出は行なわれない事からタンパク質のフェ
ニル−セファロースへの結合という疎水性相互作用が説
明される。
3を加える。試料をのせた後、カラムをカラム緩衝液、
2Mグアニジン・HCff緩衝液で展開する。260n
m吸光度において巾広いピークを持つ素通りした両分を
集め除去する。カラム緩衝液から試薬4への直線勾配法
つまり2Mから6Mグアニジン・H(1!勾配を用いて
溶出させる。グアニジン・H(1’濃度の上昇効果に伴
なって選択的可溶化がカラム中で起こる。排除容量であ
る2Mグアニジン・HCJ!ではgagプレカーサータ
ンパク質の溶出は行なわれない事からタンパク質のフェ
ニル−セファロースへの結合という疎水性相互作用が説
明される。
カラムより溶出されてくるフラクション部分について、
gagプレカーサータンパク質の存在とSDSポリアク
リルアミドゲルにより同定し、フェニル−セファロ−ス
プールとして回収する。
gagプレカーサータンパク質の存在とSDSポリアク
リルアミドゲルにより同定し、フェニル−セファロ−ス
プールとして回収する。
Gagプレカーサーは約3MグアニジンH(J部分にお
いて溶出してくる。グアニジンHCl7濃度と電気伝導
度の測定により追跡試験を行なう。
いて溶出してくる。グアニジンHCl7濃度と電気伝導
度の測定により追跡試験を行なう。
C0水−可溶性酵母組換え体pssgagプレカーサー
タンパク賞 フェニル−セファロ−スプールを濃縮し、実施例3Cの
HPLC方法を繰り返し行ない水可溶性物とする。
タンパク賞 フェニル−セファロ−スプールを濃縮し、実施例3Cの
HPLC方法を繰り返し行ない水可溶性物とする。
大旌槻l
清浄化酵母抽出 の本−1、第3バリエーシヨン。
最終ステップとしてのゲルクロマトグラフィー実施例4
Bにおけるフェニル−セファロ−スプールを?層線し7
0%C)l+cN/ 0.1%TFA/H20で平衡化
したセファクリルS−200HRのカラムにかける。カ
ラムを同一溶媒で展開し、フラクション部分を取り出し
真空下で乾燥させて、水に懸濁する。Gagプレカーサ
ーを含むフラクションをポリアクリルアミドゲルの電気
泳動により同定する。得られたgagプレカーサー調製
物は≧95%純度を持ち、水に対する可溶性については
RP−HPLC精製物質と区別がつかない物である。
Bにおけるフェニル−セファロ−スプールを?層線し7
0%C)l+cN/ 0.1%TFA/H20で平衡化
したセファクリルS−200HRのカラムにかける。カ
ラムを同一溶媒で展開し、フラクション部分を取り出し
真空下で乾燥させて、水に懸濁する。Gagプレカーサ
ーを含むフラクションをポリアクリルアミドゲルの電気
泳動により同定する。得られたgagプレカーサー調製
物は≧95%純度を持ち、水に対する可溶性については
RP−HPLC精製物質と区別がつかない物である。
実施例6
インビボにおける 疫源性
A、アフリカミドリザル
実施例2において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
gagプレカーサーを、数種の用量レベルでアフリカミ
ドリザル中へ接種する。各用量を0ケ月、1ケ月として
、筋肉内投与する。用量レベルは0.1.0.10.0
、及び100. Omcgで各用量レベルに対して3匹
使用。2回目の投与後2週間目にサルから採血し、抗g
agプレカーサー抗体の発現を特異的酵素免疫測定法(
ELISA)でアッセイした。10.Omcgあるいは
100. Omcgをそれぞれ2回投与されたサルはす
べて十分なレベルでの抗gagプレカーサー抗体を発現
した。
gagプレカーサーを、数種の用量レベルでアフリカミ
ドリザル中へ接種する。各用量を0ケ月、1ケ月として
、筋肉内投与する。用量レベルは0.1.0.10.0
、及び100. Omcgで各用量レベルに対して3匹
使用。2回目の投与後2週間目にサルから採血し、抗g
agプレカーサー抗体の発現を特異的酵素免疫測定法(
ELISA)でアッセイした。10.Omcgあるいは
100. Omcgをそれぞれ2回投与されたサルはす
べて十分なレベルでの抗gagプレカーサー抗体を発現
した。
1、 Q mcgを2回投与されたサルも、2.3匹は
、陽性を示す。しかしOmcg (アラムブラシボー
)群に関してはいずれも抗gagプレカーサー力価を示
さなかった。第■表参照 第■表 1 100.0 1:62.500 2 100.0 1:62,500 3 100.0 1:62.500 4 10.0 1:12.500 5 10、OL:62,500 6 10.0 1:12,500 7 1.0 1:500 8 1.0 <tri。
、陽性を示す。しかしOmcg (アラムブラシボー
)群に関してはいずれも抗gagプレカーサー力価を示
さなかった。第■表参照 第■表 1 100.0 1:62.500 2 100.0 1:62,500 3 100.0 1:62.500 4 10.0 1:12.500 5 10、OL:62,500 6 10.0 1:12,500 7 1.0 1:500 8 1.0 <tri。
9 1.0 zz。
100(アラムブラシト) <1:1011
0 (アラムブラシボー) 〈 1
: 10B、マウス 実施例2において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
gagプレカーサーを数種の用量レベルでマウス(I
CR株)に接種する。各用量は1同腹腔内投与とする。
0 (アラムブラシボー) 〈 1
: 10B、マウス 実施例2において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
gagプレカーサーを数種の用量レベルでマウス(I
CR株)に接種する。各用量は1同腹腔内投与とする。
用量レベルは0.1,1.0.10.0及び100.0
mcgで各用量レベルに対して10匹使用。投与後28
日目に採血し、抗gagプレカーサーの発現を特異的酵
素免疫測定法(ELISA)でアッセイする。各用量に
対する個々の抗体陽性マウスの数値を抗原に対する50
%効果! (E D 5゜)によって計算する。この数
値は抗gagプレカーサー抗体の出現により、投与マウ
スの半数が、血清陽転すると期待される用量レベルであ
り、gagプレカーサーに対してのEDS。は1.5
mcgである。
mcgで各用量レベルに対して10匹使用。投与後28
日目に採血し、抗gagプレカーサーの発現を特異的酵
素免疫測定法(ELISA)でアッセイする。各用量に
対する個々の抗体陽性マウスの数値を抗原に対する50
%効果! (E D 5゜)によって計算する。この数
値は抗gagプレカーサー抗体の出現により、投与マウ
スの半数が、血清陽転すると期待される用量レベルであ
り、gagプレカーサーに対してのEDS。は1.5
mcgである。
C,チンパンジー
実施例2において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
gagプレカーサーを2匹のチンパンジーに、0ケ月、
1ケ月及び6ケ月目にそれぞれ100、0mcg筋肉内
接種する。更に別な一匹に対してはアラムブラシポーを
同様に接種する。抗gagプレカーサー抗体の発現を採
血日程に従かいEL I SA法により評価する。また
免疫異常性の発生に対する検査により評価される。最終
投与後4週間目に3匹すべてのチンパンジーをインタク
トHIVのタイトレージョン用量を用いてチャレンジす
る。25.0チンパンジ一感染力価をもつものを静脈内
接種する。チャレンジ後、特異抗体及び免疫異常性同様
HIVの持続感染に対する評価を行なう。
gagプレカーサーを2匹のチンパンジーに、0ケ月、
1ケ月及び6ケ月目にそれぞれ100、0mcg筋肉内
接種する。更に別な一匹に対してはアラムブラシポーを
同様に接種する。抗gagプレカーサー抗体の発現を採
血日程に従かいEL I SA法により評価する。また
免疫異常性の発生に対する検査により評価される。最終
投与後4週間目に3匹すべてのチンパンジーをインタク
トHIVのタイトレージョン用量を用いてチャレンジす
る。25.0チンパンジ一感染力価をもつものを静脈内
接種する。チャレンジ後、特異抗体及び免疫異常性同様
HIVの持続感染に対する評価を行なう。
D、付加的マウス試験
インタクトHIVによりチャレンジした感作動物中にお
いてそのgagプレカーサータンパク賞が迅速にHIV
エンベロープタンパク質に対して応答する免疫系を惹起
する事を示す為に、以下の実験計画を立てた。実施例2
において精製されたアラムー吸着組換え体酵母gagプ
レカーサーの10、 Q mcg用量をマウスに日を変
えて数回、腹腔内接種する。各マウスを単一サブ−免疫
源用量のインタクトHIVでチャレンジする。アラムプ
ラシボーではなんの反応もみられなかったが、gagプ
レカーサー投与マウスが特異的抗エンベロープ抗体を発
現するかどうかを調べる為に各マウスのHIVエンベロ
ープタンパク質に対する特異的抗体の発現を評価するも
のである。
いてそのgagプレカーサータンパク賞が迅速にHIV
エンベロープタンパク質に対して応答する免疫系を惹起
する事を示す為に、以下の実験計画を立てた。実施例2
において精製されたアラムー吸着組換え体酵母gagプ
レカーサーの10、 Q mcg用量をマウスに日を変
えて数回、腹腔内接種する。各マウスを単一サブ−免疫
源用量のインタクトHIVでチャレンジする。アラムプ
ラシボーではなんの反応もみられなかったが、gagプ
レカーサー投与マウスが特異的抗エンベロープ抗体を発
現するかどうかを調べる為に各マウスのHIVエンベロ
ープタンパク質に対する特異的抗体の発現を評価するも
のである。
実施例1におけるgagプレカーサー発現酵母細胞を、
非発現系酵母細胞と、伴にそれぞれトーウレル、デイ−
1(Towler、 o、)等、ブロク、ナトル、アカ
ド、サイ、 (Proc、 Nat’l^cad、Sc
i、)、第83惑、第2812−2816頁(1986
)の方法に従がい3H−ミリスチン酸にニーイングラン
ドヌクレアー)でラベルする。ラベル細胞ベレットをH
EPES pt17.5 (100mM)、EDTA
(10mM) 、ペプスタチンA(10,czM)、
ベンズアミジン(10mM) 、アプロチニン(0,1
3TIU/m) 、E−64(25μM) 、NaCt
’ (150mM) 、NP−40(1%)、ナデオキ
シコレート(1%)及び5DS(0,1%)でガラスピ
ーズ(0,5Hm)を用いて溶解し、ポルテックスにか
ける。壊われずに残った細胞片を除去する為に遠心をか
け、次にp55に対して特異的なモノクローナル抗体を
両袖出物に加え4℃で一晩インキユベートする。抗体結
合物をヤギ抗−マウスIgG1抗体が付いているセファ
ロースを添加する事によりハーベストする。抗体結合物
をセファロースより0.5 M酢酸を用いて溶出させる
。真空下で乾燥させ5DS−PAGE及びオートラジオ
グラフィーによって分析する。HPLC−精製gagプ
レカーサー及び付加的41KDaバンドと共に移動する
鮮明なバンドはラベル特異的に観察されるものだけであ
る。ゲル中コントロールレーンにはいかなるラベルバン
ドも検出されなかった。
非発現系酵母細胞と、伴にそれぞれトーウレル、デイ−
1(Towler、 o、)等、ブロク、ナトル、アカ
ド、サイ、 (Proc、 Nat’l^cad、Sc
i、)、第83惑、第2812−2816頁(1986
)の方法に従がい3H−ミリスチン酸にニーイングラン
ドヌクレアー)でラベルする。ラベル細胞ベレットをH
EPES pt17.5 (100mM)、EDTA
(10mM) 、ペプスタチンA(10,czM)、
ベンズアミジン(10mM) 、アプロチニン(0,1
3TIU/m) 、E−64(25μM) 、NaCt
’ (150mM) 、NP−40(1%)、ナデオキ
シコレート(1%)及び5DS(0,1%)でガラスピ
ーズ(0,5Hm)を用いて溶解し、ポルテックスにか
ける。壊われずに残った細胞片を除去する為に遠心をか
け、次にp55に対して特異的なモノクローナル抗体を
両袖出物に加え4℃で一晩インキユベートする。抗体結
合物をヤギ抗−マウスIgG1抗体が付いているセファ
ロースを添加する事によりハーベストする。抗体結合物
をセファロースより0.5 M酢酸を用いて溶出させる
。真空下で乾燥させ5DS−PAGE及びオートラジオ
グラフィーによって分析する。HPLC−精製gagプ
レカーサー及び付加的41KDaバンドと共に移動する
鮮明なバンドはラベル特異的に観察されるものだけであ
る。ゲル中コントロールレーンにはいかなるラベルバン
ドも検出されなかった。
失践開1
HIVgagプレカーサーの為の昆虫発現ベクターの構
築 バキュロウィルス遺伝子発現系〔サマース、エム、デイ
+、 (Summers、 M、 D、)等、ニー、マ
ニュアルオブメソッズフオーバキュロウイルスベクター
ズアンドインセクトセルカルチャーブロセデュアース、
テキサスアグリカルテャルエクスベリメントステーショ
ン、プレチン番号1555.5月1987(^Manu
al of Methods for Baculov
irusVectors and In5ect Ce
1l Cu1ture Procedures+Tea
xs Agricultural Experimen
t 5tation、Bulletin!to、 15
55. May 1987)が以下に示す様にHIVg
ag−pol遺伝子の発現に用いられる。実施例1のプ
ラスミドクローンP1よりgag−pol遺伝子を含む
4.4kbHgal−Ndelフラグメントを切り出し
この4.4 k bデュプレックスの末端をクレノーD
NAフラグメントで充填する。そして以下に示す合成オ
リゴヌクレオチドデュプレックスとライゲーションさせ
て平滑末端を得る。
築 バキュロウィルス遺伝子発現系〔サマース、エム、デイ
+、 (Summers、 M、 D、)等、ニー、マ
ニュアルオブメソッズフオーバキュロウイルスベクター
ズアンドインセクトセルカルチャーブロセデュアース、
テキサスアグリカルテャルエクスベリメントステーショ
ン、プレチン番号1555.5月1987(^Manu
al of Methods for Baculov
irusVectors and In5ect Ce
1l Cu1ture Procedures+Tea
xs Agricultural Experimen
t 5tation、Bulletin!to、 15
55. May 1987)が以下に示す様にHIVg
ag−pol遺伝子の発現に用いられる。実施例1のプ
ラスミドクローンP1よりgag−pol遺伝子を含む
4.4kbHgal−Ndelフラグメントを切り出し
この4.4 k bデュプレックスの末端をクレノーD
NAフラグメントで充填する。そして以下に示す合成オ
リゴヌクレオチドデュプレックスとライゲーションさせ
て平滑末端を得る。
5 ’ −GATCCACAAAACAAAATG−3
’3’−GTGTTTTGTTTTAC−5’この様に
考案された”スティッキー”末端はBamI制限酵素認
識部位を構築するものであり、ライゲートされた残りの
配列は酵母翻訳認識配列を含むものである。相称的リン
カー−改良4.4 k bフラグメントをプラスミドA
H5でサブクローンし、そこよりBamHIフラグメン
トとして回収される。
’3’−GTGTTTTGTTTTAC−5’この様に
考案された”スティッキー”末端はBamI制限酵素認
識部位を構築するものであり、ライゲートされた残りの
配列は酵母翻訳認識配列を含むものである。相称的リン
カー−改良4.4 k bフラグメントをプラスミドA
H5でサブクローンし、そこよりBamHIフラグメン
トとして回収される。
この回収されたBamHIフラグメントをバキュロウィ
ルス発現プラスミドpAc373 (サマース。
ルス発現プラスミドpAc373 (サマース。
エム、デイ−3等、上述〕のユニークBamHIサイト
に挿入する。pAc 373のバキュロウィルスポリヘ
トリンプロモーターに相関する方向性を持って挿入され
た遺伝子を有するクローンは、制限酵素による分析で同
定される。本来のgag−polpAc373発現ベク
ターに加えて、第2pAc 373クローン、gag−
pol配列が、その内部BglUサイトでのクレノーD
NAポリメラーゼ充填反応によりフレームシフト変異を
持つ様に改良されているpAc 373クローンが調製
される。これら2種のベクターをそれぞれ同時トランス
フェクションの選別の為に、スボドプテラフルギペルダ
(Spodoptera frugiperda)細胞
系Sf9のオートグラファ力ルホルニ力ヌクレアーポリ
へドロシス(Autographa californ
ica NuclearPolyhedrosis)ウ
ィルスDNAに対して用いられるものであり、サマース
、エム、デイ−0等、上述の方法に従がうものである。
に挿入する。pAc 373のバキュロウィルスポリヘ
トリンプロモーターに相関する方向性を持って挿入され
た遺伝子を有するクローンは、制限酵素による分析で同
定される。本来のgag−polpAc373発現ベク
ターに加えて、第2pAc 373クローン、gag−
pol配列が、その内部BglUサイトでのクレノーD
NAポリメラーゼ充填反応によりフレームシフト変異を
持つ様に改良されているpAc 373クローンが調製
される。これら2種のベクターをそれぞれ同時トランス
フェクションの選別の為に、スボドプテラフルギペルダ
(Spodoptera frugiperda)細胞
系Sf9のオートグラファ力ルホルニ力ヌクレアーポリ
へドロシス(Autographa californ
ica NuclearPolyhedrosis)ウ
ィルスDNAに対して用いられるものであり、サマース
、エム、デイ−0等、上述の方法に従がうものである。
ホモローガスな組換えにより、後期ウィルスポリヘトリ
ンプロモーターの転写制御下にあるgag−pol遺伝
子を含む様に改良されたウィルスであるところの、各ベ
クターの組換えウィルスプラークは、そのプラーク形態
により同定され、対応しうるウィルスを含む切り出され
たアガロースプラグ(プラーク形成プレートより)を発
育培地中へ一晩かけて溶出させ、Sf9細胞のミクロタ
イタープレート培養の感染に用いる。次に、感染細胞を
HIV−陽性抗体を用いたイムノドツトプロット法によ
りgagの発現を調べる。その方法はハング、ワイ。
ンプロモーターの転写制御下にあるgag−pol遺伝
子を含む様に改良されたウィルスであるところの、各ベ
クターの組換えウィルスプラークは、そのプラーク形態
により同定され、対応しうるウィルスを含む切り出され
たアガロースプラグ(プラーク形成プレートより)を発
育培地中へ一晩かけて溶出させ、Sf9細胞のミクロタ
イタープレート培養の感染に用いる。次に、感染細胞を
HIV−陽性抗体を用いたイムノドツトプロット法によ
りgagの発現を調べる。その方法はハング、ワイ。
(Whang、Y、)等、ジェイ、ヴイロル、(J、ν
1ro1)、第61巻、第1796頁(1987)に従
かう。
1ro1)、第61巻、第1796頁(1987)に従
かう。
陽性ウィルスストックを”プラーク−精製物”として発
現に関しては再度、ウェスタンプロットによりチエツク
する。本来のgag−polウィルスベクター発現系(
AcGAG−A−15−3)は大部分が約55KDaの
免疫反応性ポリペプチド及び少量の約40KDaポリペ
プチドを発現した。フレームシフトgag−polウィ
ルスベクター発現系(AcGAG−B−1−3)は約4
0kdのポリペプチドをおもに発現する。これらの結果
は2つのオーブンリーディングフレームを有する酵母に
おける発現により得られた物と同様の性質を持っていた
。
現に関しては再度、ウェスタンプロットによりチエツク
する。本来のgag−polウィルスベクター発現系(
AcGAG−A−15−3)は大部分が約55KDaの
免疫反応性ポリペプチド及び少量の約40KDaポリペ
プチドを発現した。フレームシフトgag−polウィ
ルスベクター発現系(AcGAG−B−1−3)は約4
0kdのポリペプチドをおもに発現する。これらの結果
は2つのオーブンリーディングフレームを有する酵母に
おける発現により得られた物と同様の性質を持っていた
。
大施桝工
Ga プレカーサー配置1
実施例1のpKH12−2の塩基配列を改良T7ボリメ
ラーゼを用いたグイデオキシターミネーション法により
決定した。そこから推定しうるアミノ酸配列を以下の第
■表に示す。
ラーゼを用いたグイデオキシターミネーション法により
決定した。そこから推定しうるアミノ酸配列を以下の第
■表に示す。
qコ Cq
=−〉×リ (1:81g+←
本発明の原則にのっとり、発明の目的を例示する為の実
施例において用いられる先述特異的方法は、本発明の実
行において、すべての−殻内変法、適応、改良、省略、
付加などが、本発明の明細書中における操作手順におい
て行なわれても、それは本発明の範囲に含まれ、特許請
求の範囲内にあり、等価である。
施例において用いられる先述特異的方法は、本発明の実
行において、すべての−殻内変法、適応、改良、省略、
付加などが、本発明の明細書中における操作手順におい
て行なわれても、それは本発明の範囲に含まれ、特許請
求の範囲内にあり、等価である。
第1図は逆相高速液体クロマトグラフィーによる組換え
体gagプレカーサーの精製手順である。 第2図は有機相におけるゲル濾過クロマトグラフィーに
よる組換え体gagプレカーサーの精製手順である。 し面の浄書(内容に変更なし) 第 1 図 酵 母 ベレット(上清除去) 変性ペレット AIDSワクチン 第 2 図 酵 母 変様ペレット 水口可溶性GAGプレカーサー AIDSワクチン 0発 明 者 ロナルド ダブリュ、 アエリス
ブ。 0発 明 者 エミリオ ニー、エミ アニ
ア 0発 明 者 ロバート ジエー、ギ アエレテイ
ユ メリカ合衆国、 19151 ペンシルヴアニア、オ
ーヴアールツク ヒルズ、エッジヴエイル ロード 1
40アメリ力合衆国、 19301 ペンシルヴアニ
ア、パオリ、フッゲス マノ−レーン 6 メリカ合衆国、 19002 ペンシルヴアニア、ロ
アー ギイネツド、ストーンブリッジ ロード 100
3手続補正書 平に1i、1年6月28日
体gagプレカーサーの精製手順である。 第2図は有機相におけるゲル濾過クロマトグラフィーに
よる組換え体gagプレカーサーの精製手順である。 し面の浄書(内容に変更なし) 第 1 図 酵 母 ベレット(上清除去) 変性ペレット AIDSワクチン 第 2 図 酵 母 変様ペレット 水口可溶性GAGプレカーサー AIDSワクチン 0発 明 者 ロナルド ダブリュ、 アエリス
ブ。 0発 明 者 エミリオ ニー、エミ アニ
ア 0発 明 者 ロバート ジエー、ギ アエレテイ
ユ メリカ合衆国、 19151 ペンシルヴアニア、オ
ーヴアールツク ヒルズ、エッジヴエイル ロード 1
40アメリ力合衆国、 19301 ペンシルヴアニ
ア、パオリ、フッゲス マノ−レーン 6 メリカ合衆国、 19002 ペンシルヴアニア、ロ
アー ギイネツド、ストーンブリッジ ロード 100
3手続補正書 平に1i、1年6月28日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、95%以上の精製純度を持つ酵母組換え体gagプ
レカーサー及び同等の純度を有するそのバリアント。 2、当該プレカーサーがミリストイル化されている請求
項1記載のgagプレカーサー。3、虫による組換え体
gagプレカーサー。 4、実施例9の第III表で示されている配列を有する請
求項1、2、あるいは3記載のgagプレカーサー。 5、第1表中に示されている数種の抗ウィルス剤、イム
ノモデュレーター、抗生物質質あるいはワクチンなどと
併用される請求項1、2、あるいは3記載のgagプレ
カーサー。6、第1表中に示されている数種の抗ウィル
ス剤、イムノモデュレーター、抗生物質、あるいはワク
チンなどと併用される当該gagプレカーサーが実施例
9の第III表で示されている配列を有する請求項1、2
、あるいは3記載のgagプレカーサー。 7、95%以上の精製純度を持つ酵母由来組換え体ga
gプレカーサー、あるいは同等の純度を有するそのバリ
アント及び適切な免疫学的アジュバントより成るAID
Sワクチンであり、当該ワクチンはgagプレカーサー
に対する特異的抗体を産生しうるものであるAIDSワ
クチン。 8、AIDSに対して有効である酵母由来組換え体ga
gプレカーサー、あるいはそのバリアント。 9、虫由来組換え体gagプレカーサー、あるいはその
バリアント及び適切な免疫学的アジュバントより成るA
IDSワクチンであり、当該ワクチンはgagプレカー
サーに対する特異的抗体を産生しうるものであるAID
Sワクチン。 10、AIDSに対して有用である昆虫由来組換え体g
agプレカーサー、あるいはそのバリアント。 11、95%以上の精製純度をもつ組換え体gagプレ
カーサー、あるいは同等の純度を有するそのバリアント
及び適切な賦形剤より成る AIDSワクチンであり、当該ワクチンは HIV感染あるいは疾患に対して予防あるいは治療の為
にプレあるいはポスト的な手段として用いられるもので
あり、gagプレカーサーに対する特異的抗体を産生し
うるものであるAIDSワクチン。 12、組換え体gagプレカーサーが酵母の発現系にお
いて産生される請求項11記載のAIDSワクチン。 13、酵母の発現系とはU9#1−5である請求項12
記載のAIDSワクチン。 14、組換え体gagプレカーサーが虫の発現系におい
て産生される請求項11記載のAIDSワクチン。 15、当該ワクチンがgagプレカーサーの免疫原性を
高めるために一つ以上の抗原決定基を含む請求項11記
載のAIDSワクチン。 16、当該抗原決定基が本質的にT−細胞のアミノ酸配
列より成る請求項15記載のAIDSワクチン。 17、当該賦形剤がアジュバントより成る請求項11記
載のAIDSワクチン。 18、当該gagプレカーサーあるいはそのバリアント
が粒状あるいは凝集形成している請求項11記載のAI
DSワクチン。 19、適切なアジュバントと伴に95%以上の精製純度
を持つ酵母由来組換え体gagプレカーサーよりなるA
IDSワクチンであり、当該gagプレカーサーは酵母
発現系U9#1−5より産生され、当該ワクチンはHI
V感染あるいは疾患に対して予防あるいは治療の為にプ
レあるいはポスト的な手段として用いられ、血清型Ne
wYork#5のHIVのgagp55に対して抗異的
な抗体を産生しうるものであるAIDSワクチン。 20、第1表中に示されている数種の抗ウィルス剤、イ
ムノモデュレーター、抗生物質あるいはワクチンなどと
併用投与される請求項7、9、11、12、13、14
、15、16、17、18、あるいは19記載のAID
Sワクチン。 21、95%以上の精製純度を持つ酵母由来組換え体g
agプレカーサータンパク質あるいはそのバリアントタ
ンパク質を得る為の精製方法であり、 (a)不純物を除去した凍結酵母抽出物の融解、当該酵
母抽出物とは、組換え体酵母発現系において発現された
酵母由来組換え体gagプレカーサータンパク質あるい
はそのバリアントタンパク質を含むもの、 (b)少なくとも約24時間に及ぶ凍結によるgagプ
レカーサーの沈殿物形成。 (c)沈殿物形成したgagプレカーサーの遠心による
沈降化、及び引き続きその沈降物と上清液との分離。 (d)膜及び不必要な膜結合タンパク質を可溶化するの
に効果的な溶液とその沈降物を混合、 (e)第二沈降物形成の為の遠心によるgagプレカー
サーの再沈降化、及び引き続きその第二沈降物と上清液
との分離、 (f)gagプレカーサータンパク質を可溶化するのに
効果的な溶液で上記ステップにおける沈降物を溶解、変
性沈降物とし、及び (g)その変性沈降物を疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにかけ、そこからgagプレカーサーを分画分離し
、これにより95%以上の精製純度を持つ酵母由来組換
え体gagプレカーサーあるいは同等の純度を有するそ
のバリアントを獲得するというステップよりなる精製方
法。 22、更に請求項21記載中のステップ(e)及びステ
ップ(f)の間で洗浄過程を加えるところの請求項21
記載の方法で、 (e1)第二沈降物を緩衝溶液あるいは膜及び不必要な
膜結合タンパク質を可溶化するのに効果的な溶液と混合
、及び (e2)第三沈降物形成の為の遠心によるgagプレカ
ーサーの再沈降化、及び引き続きその第三沈降物と上清
液との分離よりなる精製方法。 23、酵母由来組換え体gagプレカーサーあるいはそ
のバリアントの水−可溶性調製物としての精製方法であ
り、 (a)十分に精製された凝集gagタンパク質あるいは
そのバリアントのタンパク質部分を集め、そして (b)そのタンパク質を逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、十分に精製された水−可溶性の酵母由来組換
え体gagプレカーサーあるいは同等の精製純度を持つ
その水−可溶性バリアントを得るステップよりなる精製
方法。 24、更に請求項21記載中のステップ(g)の後に、
以下のステップを加える請求項21記載の方法であり、 (h)ステップ(g)における分画、物を集め、そして (i)その集めた分画物を逆相高速液体クロマトグラフ
ィーにかけ、95%以上の精製純度を持つ水−可溶性の
酵母由来組換え体gagプレカーサーあるいは同等の純
度を有するその水−可溶性バリアントを得るステップを
加える精製方法。 25、酵母由来組換え体gagプレカーサーあるいはそ
のバリアントの水−可溶性調製物としての精製方法であ
り、 (a)十分に精製された凝集gagタンパク質あるいは
そのバリアントのタンパク質部分を集め、そして (b)そのタンパク質を有機溶媒相におけるゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけ、十分に精製された水−可溶性
の酵母由来組換え体gagプレカーサーあるいは同等の
精製純度を持つその水−可溶性バリアントを得るステッ
プより成る精製方法。 26、更に請求項21記載中のステップ(g)の後に、
以下のステップを加えるところの請求項21記載の方法
であり、 (h)ステップ(g)における分画物を集め、そして (i)その集めた分画物を有機溶媒相におけるゲル濾過
クロマトグラフィーにかけ、95%以上の精製純度を持
つ水−可溶性の酵母由来組換え体gagプレカーサーあ
るいは同等の純度を有するその水−可溶性バリアントを
得るステップを加えることよりなる精製方法。 27、95%以上の精製純度を持つ、請求項21、22
、23、24、25、あるいは26記載の方法により精
製された、酵母由来の精製組換え体gagプレカーサー
あるいは同等の純度を有するそのバリアント。 28、95%以上の精製純度を持ち、実施例9の第III
表で示されるアミノ酸配列を有する、請求項21−26
記載の方法で精製された、酵母由来の精製組換え体ga
gプレカーサーあるいはそのフラグメント。
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