JPH0213391A - Ｈｉｖ中ｇａｇプレカーサーの組換え体としての産生、方法及びａｉｄｓ用ワクチンとしての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）とはヒト免疫不全ウ
ィルスのＣＤ４ヘルパーＴ細胞に対する明らかな感染に
よる臨床症状の出現であり、これまでに報告されている
様にヒトＴ−リンパ球指向性つィルス■型（ＨＴＬＶ−
ＩＩＩ）　、リンパ節腫張を伴なうウィルス（ＬＡＶ）
　、あるいはＡＩＤＳ−関連ウィルス（ＡＲＶ）（以後
集合的に“ＨＩＶ”とする）などがある。ＡＩＤＳとは
日和見感染や悪性腫瘍形成によって特徴づけられる細胞
性免疫機能の伝染性欠損症状である。類似疾患であるＡ
ＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）もＡＩＤＳに伴なう数多く
の疫学的特徴や免疫異常性を惹起し、場合によってはＡ
ＩＤＳの臨床症状の出現前に発症する。ＡＩＤＳ及び／
あるいはＡＲＣに対するワクチンとはＨＩＶ感染による
衰弱効果の防止に対する理想的な予防手段である。本出
願人はその様なワクチンとして有効な免疫原を、組換え
体産生物として精製回収する方法と伴に、発見した。本
免疫原とは、組換え体産生物であるｇａｇプレカーサー
ポリペプチドである。

ＨＩＶの遺伝子的機能及びウィルス粒子の形態などにつ
いては今だに不明の点が多々ある。しかしながらすでに
遺伝子的に解明された部分もあり、総ゲノム約９キロベ
ース（ｋｂ）に及ぶある種のＲＮＡウィルスは、その核
酸配列中に７つの主要オーブンリーディングフレーム（
ＯＲＦｓ）を保有し、それぞれ、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅ
ｎｖ、ｓｏｒ、ｔａｔ、ａｒｔ／ｌｒｓ及び３’ｏｒｆ
遺伝子として示されている。核酸配列中に存在する末端
反復配列はＨＩＶも含めて多数のレトロウィルスにおい
て共通であり、ウィルスの増殖及びウィルスが宿主細胞
の染色体中へ組み込まれる際に必要とされる遺伝子であ
ると考えられている。

そしてＨＩＶのゲノム構造、複製及び調節機能に対する
一般的な性質に関する最近の見解が以下の文献中に記載
されている。ラトナー、エル（Ｒａｔｎｅｒ。

Ｌ、）　等“ヒユーマンＴ−リンホトロビックレトロウ
イルス（Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）　”オプライエン、ニス、
ジエイ、（０’　Ｂｒ１ｅｎ、　Ｓ、　Ｊ、）著、ジエ
ネテ４ｙクマソプス（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ　）１
９８７コールドスプリングハーバー（ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）　１９８７　、、第１２４−１
２９頁。

フランチー二、ジー、　（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ、　ｃ、
　）等、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ　）　、第３２８
巻、第５３９頁（１９８７）。及びチェン、アイ、ニス
、ワイ。

（Ｃｈｅｎ、　１．　Ｓ、　Ｙ　）セル（Ｃｅｌ１）、
第４７巻、第１頁（１９８６）などである。

ｇａｇ、ｐｏｔ及びｅｎｖ遺伝子より翻訳されてくるＨ
　Ｉ　Ｖタンパク質は最初は融合ポリプロティン産物と
して出現してくる。これらは、次にタンパク分解プロセ
ッシングを経て、ウィルス特有酵素と同様に構造タンパ
ク質としての形態をとるものである。ＨＩＶに属する株
の中には、ｐ５５ｇａｇプレカーサーとして出現して（
るｇａｇポリプロティン融合産物があり、これはウィル
スによってコードされているプロテアーゼの作用を受け
てｇａｇｐ２４、ｇａｇｐ１７及びｇａ　ｇｐ１５とし
てそのウィルスのライフサイクルの中で開裂されてくる
。また、翻訳過程中あるいは他の機構により偶発的に起
こるフレームシフトによって巨大なｇａｇ−ｐｏｔ融合
ポリプロティン産物が誘導される時もあることが実証さ
れている。またＨＩＶ中にはタンパク分解プロセッシン
グを触媒する酵素的部位が、ｇａｇ遺伝子の翻訳終止コ
ドンの３′末端とｐｏｌ遺伝子の下流との間に位置して
いる約２５０−２６５ヌクレオチド塩基によってコード
されている。

初期のＨＩＶゲノムのｇａｇｓＴＪ域における研究の興
味は、ＡＩＤＳ抗ウィルス化合物に対するスクリーニン
グアッセイ方法の確立と平行して、その遺伝子からコー
ドされている融合ポリプロティン産物の解析に集中して
いた。大量の基質を合成させる為に出願人はＨＩＶプロ
テアーゼの産生のない組換え体ｇａｇプレカーサーを酵
母により発現させた。

出願人はｇａｇプレカーサータンパクの抗原決定基を免
疫原として有効使用する事に関する発見者でもある。し
かし本発見は病原微生物あるいはウィルスに対して宿主
を免疫する為の唯一有効な部位はその病原、例えばレト
ロウィルス、の表面領域であるという一般的に受は入れ
られている仮説に矛盾するものである。つまりＨＩＶｇ
ａｇプレカーサーはそのウィルスの内部構成物であり、
ＨＩＶの表面にあるエンベロブタンパク質とは異なり、
抗体の作用の受けにくい物であり、出願人自身もＡＩＤ
Ｓに対するワクチンとして有効であるとはまったく予期
していなかった。事実、出願人達は本発明におけるｇａ
ｇプレカーサーを、タンパク分解プロセッシングアッセ
イの為の基質調製が頭初の目的である、本発明とは完全
に異なった目的の為に分離していた。

しかし、今回の発明の本質的な目的は組換え体ｇａｇプ
レカーサータンパク質をＡＩＤＳワクチンの一つとして
使用する事にある。そして大量なるこの新規な水−可溶
性組換え体タンパク質の調製方法を明記するものである
。更にこれらの方法による産生物は抗ウイルス剤検出の
為のアッセイにおけるスクリーニング因子としても使用
されうるちのである。

組換え体産生タンパク質の精製には、時として新規な方
法あるいは新らしい方法と従来の方法との併用が必要と
なる。何故ならば、酵母などの様な組換え体形成におけ
る供給源の構成成分がこれまでの血清を用いた一般的な
供給源の成分とが異なるためである。古典的あるいはそ
の他−殻内供給源からのタンパク質分離に有効な方法の
知識や技術を基礎にして、組換え体細胞培養からのタン
パク質の分離に効果的な精製分離の方法はどれかという
事に関しては誰れも予言できるものではない。ワクチン
調製の為の精製方法は産物に対して並はずれた純度を与
えるものであり、公知の技術では予期し得ない別の表示
が必要である。同様知見として、米国特許第４，６２４
，９１８号参照。

出願人は９５％以上の精製純度を持つ酵母由来組換え体
ｇａｇプレカーサータンパク質あるいは同等の純度を有
するそのバリアントタンパク質を提供した。出願人によ
る実施例は、本タンパク質がミリストイル化され、それ
により少なくとも一つの点に関しては大腸菌産生組換え
体ｇａｇプレカーサーとは異なっている事を立証してい
る。別の手段として組換え体ｇａｇプレカーサーは組換
え休出発現系により発現される事もある。精製ｇａｇプ
レカーサーはワクチンとして有効であると伴にＡＩＤＳ
ウィルス性プロテアーゼアッセイとしても市販されうる
ちのである。

また出願人は以下に示す酵母由来組換え体ｇａｇプレカ
ーサータンパク質あるいはそのバリアントタンパク質に
対する連続的精製方法を提供する。

各ステップは次の様になっている。

（ａ）不純物を除去した特定量の酵母抽出物を供給する
。当該酵母抽出物とは組換え体酵母発現系で発現された
酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーあるいはそのバリ
アントを含むものである。

（ｂ）少なくとも約２４時間に及ぶ凍結によるｇａｇプ
レカーサーの沈殿物形成。

（ｃ）沈殿物形成したｇａｇプレカーサーの遠心による
沈降化、及び引き続きその沈降物と上清液との分離。

（ｄ）膜及び不必要な膜結合タンパク質を可溶化するの
に効果的な溶液とその沈降物を混合。

（ｅ）第二沈降物形成の為の遠心によるｇａｇプレカー
サーの、再沈降化、及び引き続きその第二沈降物と上清
液との分離。

（ｆ）ｇａｇプレカーサーを可溶化するのに効果的な溶
液で上記ステップにおける沈降物を溶解、変性沈降物と
して、更に （ｇ）その変性沈降物を疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにかけ、そこからｇａｇプレカーサーを分百分離し
、これにより十分に精製された酵母由来組換え体ｇａｇ
プレカーサーあるいは精製されたそのバリアントを獲得
する。更にこのｇａｇプレカーサーを逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）あるいは有機溶媒相
によるゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、水−可溶性
調製物とする。本精製ｇａｇプレカーサーはワクチンと
して有効であると伴にＡＩＤＳウィルス性プロテアーゼ
アッセイとしても市販されうるものである。

略語と用語解説 ＡＩＤＳ　　　　後天性免疫不全症候群ＡＲＣＡＩＤＳ
関連症候群 ｂｐ　　　　　　塩基対 ｇａｇ　ｐ５５　　ｐ５５　ｇａｇとしても知られてい
る、ゲル中移動度が約５５ＫＤａ である血清型Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＃　５　ＨＩ　Ｖのｇａ
ｇプレカーサー ｇａｇプレカーサー ＨＩＶあるいはそのバリアントの ｇａｇ遺伝子から産生されるタン バク質であり、ウィルス性プロテ アーゼとして作用するアミノ列配 列を含まないものをｇａｇプレカ ーサーとする。

ＨＩＶ　　　　　ＡＩＤＳを惹起すると推定される病原
学的因子の総称的用語であり、 ＨＴＬＶ−ＩＩ［、ＬＡＶ、及びＡＲＶ株をも示すもの
である。

ＫＤａ　　　　　キロダルトン Ｋｂ　　　　　　キロベース ＯＲＦ　　　　　転写リーディングフレーム組換え体タ
ンパク質 組換え真核細胞あるいは前核細胞 発現系における外来性ＤＮＡの発 現によってもたらされるポリペプ チドあるいはオリゴペプチド。例 えばＨＩＶの酵母由来組換え体 ｇａｇプレカーサー 組換え真核細胞発現系 外来性タンパク質あるいは外来性 オリゴペプチドを発現する外来性 ＤＮＡを含んだ真核細胞。例えば 本出願中におけるＵ９＃５−１゜ Ｇａ　　プレカーサー、　５５、　びそのバリアント本
発明の説明を目的とした特異的タンパク質とは血清Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ＃　５　ＨＩ　Ｖの組換え体ｇａｇプレカ
ーサーであり、組換え酵母発現系において発現されたも
のである。慣例に従かいタンパク質を変性ゲル中におけ
る明白な移動度によって表示する。

本発明においては、特定の組換え体ｇａｇプレカーサー
は約５５ＫＤａの位置まで移動するのでこのプレカーサ
ーをｐ５５として表示するものであり、下付き”ｐ”と
はタンパク質のことである。

本発明が、ｇａｇプレカーサー中に、それ自身をタンパ
ク質分解的開裂を起こす様なウィルス性アミノ酸配列を
含んでいないのならば、ＨＩＶのいかなる株のいかなる
ｇａｇプレカーサーに対してもたやすく適応しうる方法
であるという事は当業者にとっては明白である。

実例として本発明のＨＩＶクローンがｇａｇ翻訳終止コ
ドンの下流隣接に導入されているＳｍａ１部位で開裂さ
れる事により、いかなるｇａｇプレカーサー発現系にお
いても、タンパク質分解活性を有するＨＩＶアミノ酸配
列配列現しない。同様の原則よりタンパク質分解活性を
有するウィルス性プロテアーゼ配列の存在位置がどのよ
うなＩＩＩＶ株であってもその核酸配列を解析する事に
より確かめられる。そして、ＤＮＡクローンは組換え体
発現系における翻訳後、あらゆる干渉性のタンパク質分
解配列を効率的に排除するために切断されるべきもので
ある。本発明のｇａｇプレカーサーはｇａｇ領域とｐｏ
ｌ領域がオーバーラツプ（約２．３０ｂｐ）　していな
いのならば、ｐｏｌ領域あるいはｅ　ｎ　ｖ　ｊｉＪ［
域から誘導されるものではない。

本発明に関する新規な方法及び産生物は組換え体ｇａｇ
プレカーサー発現についての範囲に含まれているものと
する。

本発明に関する方法及び産生物は同様にｇａｇプレカー
サーのバリアントをも含めた迅速かつ効果的なワクチン
調製の方法を提供するために考案されたものである０例
えばそのアミノ酸配列中において保存性置換を持つよう
なバリアント（ティラー、ダブル、エル、　　（Ｔａｙ
ｌｏｒ、　Ｗ、　Ｌ、　）、ジエイ１モル、パイオル、
　　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、第１８８巻、
第２３３頁（１９８６）の第１表に記載）は本発明の原
則や実施に対する、いかなる本質的あるいは新規性のあ
る改良につながるものではないであろう。また、−船釣
に言ってコード領域中に欠損があったとしても、本明細
書記載のワクチン調製方法には、いかなる改良も必要と
しない。その他、出現してくるバリアントには、翻訳後
の修飾過程において、タンパク分解プロセッシングを含
めて、アデニル化、カルボキシル化、グリコジル化、ヒ
ドロキシル化、メチル化、リン酸化、あるいはミリスト
イル化を受けたものがある。

本明細書中におけるｇａｇプレカーサーあるいはそのバ
リアントとは、得られたｇａｇプレカーサーあるいはそ
のバリアントが血清型Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＃　５ＨＩＶの
ｇａｇｐｓｓに対する特異的抗体と免疫学的に反応しう
るちのならば、保存性アミノ酸置換、欠損、翻訳後プロ
セッシング、リポソームフレームシフトあるいはその他
のプロセスを受けたとしても、そのｇａｇプレカーサー
、そのバリアントとはアミノ酸配列中にその様な変異を
含んだものである事はよく知られている。

真挟皇囚衾里■橿 外来性遺伝子を発現する真核細胞の調製が相対的な率直
な新らしい技術である。その様な真核細胞とは宿主とし
て働き酵母、真菌、植物細胞及び動物細胞を含むもので
ある。これら多数の宿主細胞の発現ベクターは分離同定
され、常法組換えＤＮＡ技術を用いて、期待すべき外来
性ＤＮＡを有するベクターの構築に際しての出発材料と
して使用される。挿入ＤＮＡの発現に用いられる宿主細
胞より自然に誘導されないのならば、そのＤＮＡは外来
性である。挿入外来性ＤＮＡは体外染色体であるプラス
ミドあるいはその外来性ＤＮＡの全部または一部分を組
み込んだ宿主細胞の染色体中より発現されるものであり
、−分子以上の形成物として宿主細胞中に正しく存在し
ているものである。期待すべき外来性ＤＮＡ発現用の宿
主細胞及び発現ベクターは、はとんど宿主細胞のを動性
及び取り扱いのむずかしさに依存して選択されるもので
あり、宿主細胞が発現ベクターの複製にいかにサポート
しようと、あるいは当業者によって認められている他の
因子によるものではなく、期待すべき組換え体タンパク
質を精製するにより簡単な様式が用いられる事を目的と
した構造遺伝子上への分泌を促進させる挿入配列のスプ
ライシングやトランスアクティブな配列の発現ベクター
への挿入に依存するものである。

挿入された期待すべき外来性ＤＮＡはｇａｇプレカーサ
ーあるいはそのバリアントをコードしているあらゆるＤ
ＮＡ配列を含み、更にコードする能力をもつ合成配列あ
るいはその様なりローン化された配列、あるいはその両
者を−ｉ伽鼻酪奔奏ｍあわせ持つ物より成る。例えば完
全合成りＮＡ配列によりコードされ発現してきたｇａｇ
プレカーサータンパクも本発明中に含まれている。

ＧａｇプレカーサーＤＮＡは現在、有効使用されている
物であり、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ　８５４３とされて
いる。

衾ｌ乏久久二 組換え体ｇａｇプレカーサー産生に関しての真核細胞発
現系構築の為に用いられるベクターは、プロモーター及
び／あるいはオペレーターの様な適切な転写活性化ＤＮ
Ａ配列を効果的に結合しているｇａｇプレカーサーある
いはそのバリアントに対するＤＮＡ配列より成っている
。その信実型的な特徴として適切なリポソーム結合部位
、ターミネイションコドン、エンハンサ−、ターミネー
タあるいはレプリコン因子を含んでいる。これら付加的
特徴は制限酵素による切断やライゲーションなどの一般
的なスプライシング技術により一ケ所とは限らず適切な
部位にベクター中に挿入されるものである。本明細書に
おいて例示されている酵母組換え発現系はその面側さ故
に出願人に選らばれた系である。酵母ベクターｐＫＨ１
２−２は酵母発現系ベクターρＣ１／１−　ｐＧ　Ａ　
Ｐ　（Ｂ）ｔＡ　Ｄ　Ｈ１中へ１．５　ｋ　ｂのＢａｍ
ＨＩ　−３ｉａＩ　ｇ　ａ　ｇ７ラグメントＤＮＡを挿
入する事により構築したものである。Ｓｍａ１部位とは
サイト−ダイレクト変異法によりｇａｇ領域の３′末端
終止コドン及び下流５ｂ＋ｐ、の位置に挿入されたもの
である。よってこの特異的に構築された酵母細胞におい
て発現された典型的組換え体タンパク質は完全長を有す
るｇａｇプレカーサーでありその酵母細胞中にＨＩＶプ
ロテアーゼを持っていないので、ｇａｇプレカーサーは
プロセッシングを受けずにすむ。しかし、内在性の酵母
由来プロテアーゼの存在によりタンパク分解プロセッシ
ングはもたらされる。またｇａｇプレカーサーが本来の
あるいは自然の状態になっているｇａｇプレカーサーに
特異的な抗体と免疫学的に反応しうる十分な大きを保有
しているのならば、そこに生じている獲得フラグメント
も本発明に含まれている事は明白である。

組換え真核細胞発現系の一つである酵母発現系として一
般的に組換え体タンパク発現用に選択された一つの種で
あるサツカロミセスセレビシェが用いられる。しかしな
がらｇａｇプレカーサーの発現の為に、宿主株あるいは
細胞の選択範囲をサツカロミコプシス及びクリプトコツ
カシ工科の他の属の種にまで広げられピヒア、カンジダ
、ハンゼヌラ、トルロプシス、クロイベロマイセス及び
サツカロミコプシスに限定されるものでない事は、当業
者にとっては明白である。同様に宿主株あるいは細胞の
選択範囲をサツカロミセス属の他の種にまで広げられる
。この属の種の・大部分はニス。

セレビシェと交配可能であり、ニス、セレビシェが持っ
ているプロモーターと類似あるいは同一のプロモーター
を保有しうるちのであり、ＧＡＰ４９１、ＧＡＬＩＯ１
ＡＤＨ２及び／あるいはα接合因子プロモーターに限定
されるものではない。

よって組換え体ｇａｇプレカーサーポリペプチドの発現
には宿主株の選択範囲をサツカロミセス属の他の種にま
で広げられるがカルスベルゲンシス、ラバラム、ローキ
シ、モンタナス、クロイベリー、エロンギスボラス、ノ
ルベンシス、オビホルミス及びシアスタテイカスに限定
されるものではない事は当業者にとっては明白である。

ｇａｇプレカーサーの発現に関する酵母組換え発現系構
築の為の酵母ベクターとはシャトルベクター、ニスミド
プラスミド、キメラプラスミド及び２−ミクロン環状プ
ラスミド由来の配列を含むベクター等に限定されるもの
ではない。

種々のプロモーターやその他酵母の転写制御配列がｇａ
ｇプレカーサーをコードしている挿入ＤＮＡ配列の発現
に用いられ、ＧＡＰ　４９１、ＧＡＬＩＯｌＡＤＨＩあ
るいはＡＤＨＩＩ、ＰＨ０５及びα接合因子などがある
。以下の酵母ベクターのリストは本発明の詳細な説明す
る為の物である。

ＡＡＨ５ ＡＨ５ ＡＡＲ６ ＦＲＰｎ ｐＧＡＬ　１０−ＭＦα１ Ｊｃ１９７ ＭＡ５６ ｐＡＢＡＤＥ８ ｐＡＸα１１ ＡＨ９ ＡＨ１０ ＡＨ２１ ９ＭＡｃ５６１ ＬＧ６６９ ＭＡ９１ ９ＭＡ３０１ ＹＥＨＢｓ ｐＡＭ８２゜ 基本的には適切な宿主中ヘトランスホーメーションある
いは他の方法により挿入されたこれら改良ベクターはｇ
ａｇプレカーサーあるいはそのバリアントをコードして
いる適切なりＮＡ配列が挿入されているのでｇａｇプレ
カーサーに対する酵母組換え体発現系として有効使用さ
れる。

哺乳動物細胞組換え体発現系は本発明のｇａｇプレカー
サーを他の手段により産生ずる。−殻内に宿主となる哺
乳動物細胞とは細胞培養法により十分にクローン化され
ている細胞である。呻乳動吻細胞の発現ベクターには特
定の抗生物質に対して耐性になるｎｅｏ遺伝子の様な選
択マーカーが含まれており、これにより細胞中のベクタ
ーの存在が確認される。ＤＮＡ−介在トランスフェクシ
ョン、トランスアクティブ、あるいはトランスホーメー
ションが細胞に対して、例えばリン酸カルシウム法、エ
レクトロポレーション、あるいはミクロインジェクショ
ンにより行なわれる。トランスアクティブな配列は連続
性発現にとっては必要であり、これら適切なベクター中
への挿入は本発明についての普通の改良点である。哺乳
動物細胞組換え体発現系の構築を行なう為の宿主哺乳動
物細胞とは、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＧＨ３、Ｃ
ＯＳ、ネズミＣ１２７あるいはマウスＬ細胞などに限定
されるものではない。

哺乳動物細胞発現ベクターには基本的にウィルスベクタ
ー、またはＳＶ４０．ＢＰＶあるいはその他のウィルス
レプリコンを持つプラスミドベクター、あるいは動物細
胞に対するレプリコンを含まないベクターなどがある。

哺乳動物細胞発現ベクターに関する詳細はグルツマン、
ワイ、（Ｇｌｕｚｏ＋ａｎ。

Ｙ、）著、゛ユーカリオティックヴアイラルベクター　
（Ｅｕｋａｒｉｏｔｉｃ　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ
）　　″コールドスプリングハーバーラボラトリ−１９
８２、ポーウエルス、ビー、エッチ、（Ｐｏｕｗｅｌｓ
、　Ｐ、　ｔｌ、）等”クローニングベクター、ラボラ
トリ−マニュアル”アルセパ−（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　）
　　１９８５、リグビー、ピー、ダヴル、ジエイ、　　
（Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ。

イ、Ｊ、）、ジェイ、ジエン、ヴアロル、（、ｙ、　Ｇ
ｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、）、第６４巻、第２５５頁（１９８３）、
サブシマミー。ニス（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、　ｓ、　）
等、アナル、バイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　）第１３５巻、第１頁（１９８３）、及びグロバー
、デイ−、エム、　（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｍ、　）
著”　ＤＮＡクローニング、プラクティカルアプローチ
”ＩＲＬ１９８５、第１及び■巻などにおいて記載され
ている。

Ｇａ　　プレカーサーのｎ−！ 精製段階におけるｇａｇプレカーサーの安定性の減少及
び崩壊を防ぐ為に、通常、フッ化フェニルメチルスルホ
ニル（ＰＭＳＦ）あるいはＥＤＴＡなどの様なプロテア
ーゼインヒビターを緩衝溶液中に添加する。好ましいイ
ンヒビターとしてはベンズアミジン、ペプスタチン、ア
プロチニン、ＰＭＳＦ及びＥ−６４などと併用されるＥ
ＤＴＡである。本発明の方法手順において適切な代表的
プロテアーゼインヒビターとは金属キレート剤、重金属
イオン、ＳＨ保護基、プロテアーゼに対する基質様化合
物、プロテアーゼ阻害ポリペプチドなどに限定されるも
のではない。以下に幾つかの有効プロテアーゼインヒビ
ターを示す。

Ａｇ−、Ｈｇ−、Ｃｕ＋＋及び他の重金属イオンアンチ
スロンビン■ アンチスロンビン■−ヘパリン α宜　−アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α′−ビピリジル、Ｎａ−フロライド４−プロモー
フエナンシルブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸 システィン ４−ジニトロフェノールリン酸ジエチルＤＦＰ　（ジイ
ソプロピルホスフォフルオリデート） ＤＴＴ　（ジチオスレイトール） Ｅ−６４（トランス−エポキシスクシニル−Ｌ−口イシ
ルアミド−（４−グアニジン）−ブタン、ベーリンガー
マンハイム〕 ＥＤＴＡ及び他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジウムクロライド ヘパリン ヒルジン ４−ヒドロキシ水銀ベンゾエート ヨードアセトアミド ヨード酢酸 ロイペプチン α２−マクログロブリン メルカプトエタノール ｐ−水銀ベンゾエート 塩化水銀（ｎ） α−ミクログロブリン α−Ｎ　−（ｐ−ニトロベンジル−オキシカルボニル）
−Ｌ−アルギニルクロロメチルケトンオキサレート ストレプトミセスを含む種々の供給源からのべブスクチ
ン １．１０−フェナントロリン ２−フェナントロリン フェノチアジン−Ｎ−カルボニルクロライドホスフォル
アミトン ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）ブリロホ
スフエート ＳＨ保護剤 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター フッ化ｐ−）ルエンスルホニル ＴＬＣＫ　（Ｌ−１−７００−３−（４−トシルアミド
）−７−アミノ−２−ペプタノンー塩酸塩） トリトンＸ−１００及び他の低濃度界面活性剤ＴＰＣＫ
　（Ｌ−１−クロロ−３−（４−トシルアミド）−４−
フェニル−２−ブタノン）鶏卵由来トリプシンインヒビ
ター ＺＰＣＫ　（ベンジルオキシカルボニル−し−）工二ル
アラニン） 上記リスト中のインヒビターを数種含む緩衝溶液はｇａ
ｇプレカーサー精製段階において用いられるものである
。ｇａｇプレカーサーの精製における緩衝溶液として好
ましいものにはＥＤＴＡ。

ベンズアミジン、ペプスタチンＡ１アプロチニン、ＰＭ
ＳＦ及びＥ−６４が含まれている。

盪企■健ｌ迫良腹 ｇａｇプレカーサー、ｐ５５あるいはそのバリアントを
コードしている発現ベクターによりトランスホームされ
た酵母細胞を増殖させた後、ハーベストする。細胞を保
存する時には、ＰＢＳ　（リン酸緩衝生理食塩水、１　
ｍＭ　ＣａＣ１’ｚ　（無水）、２．７ｍＭ　ＭＣＩ、
　１．４７ｍＭ　ＫｌｈＰＯ４，０，５ｍＭ　ＭｇＣ１
’ｚ・６ＨｚＯ５１３７ｍＭ　ＮａＣ１−８，０６ｍＭ
　ＮａＺＩＩｐｏ４−７ｎｆｏ　、）のような緩衝液で
その細胞を洗浄し、細胞をペースト状にする。細胞ペー
ストの保存は、液体窒素中における凍結保存で行なわれ
る。

代表的な精製方法を以下に示す。凍結細胞ペーストをタ
ンパク質分解インヒビターを含む緩衝液で融解後、懸濁
する。例えば２ｍＭ　　ＰＭＳＦ含有ＰＢＳ、高張リン
酸緩衝液、好ましくは試薬３（０，ＩＭ　ＨＥＰＥＳ　
ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭ　　ベンズアミジン、１．０μｇ／ｍｌ！ペプ
スタチンＡ、０．１３）リブシンインヒビターユニット
（Ｔ　Ｔ　Ｕ）／−アプロチニン、２ｍＭ　ＰＭＳＦ、
０．１ｍＭトランス−エポキシスクシニル−Ｌ−口イシ
ルアミド−（４グアニジノ）−ソタン〕。内在性のタン
パク質分解酵素活性を最小限に抑えるためには、４℃の
様な低温での操作が好ましい。細胞は機械的に破砕した
方がよい。細胞デスラブター及びフルイダイザーなど適
切かつ容易に操作しうる機械が種々市販されている。

酵母細胞破砕の段階で粗抽出物を得る。この時に必要な
事は、それ以後の精製段階における機械的障害を避ける
為に、抽出液中の細胞片を除去し、抽出液を浄化させる
事である。

約１４，０００Ｘｇ、４５分間、４℃の遠心が適切であ
るけれども、異なった遠心速度、遠心時間、及び温度に
おいても同様の結果が得られ、容易に操作しろる事はよ
く知られている。ｇａｇプレカーサーの存在は、イムノ
プロットを併用した変性ゲルにおいて確認される。

清浄化酵母抽出物として、１４．ＯＯＯＸｇの上清液を
更に精製していく。分析チエツクに用いる以外のベレッ
トに関しては除去してよい。清浄化酵母抽出物は一７０
℃で凍結。出願人は清浄化抽出物を一７０℃における長
期保存、例えば少なくとも２４時間、好ましくは少な（
とも７２時間保存する事によって全産生物を利用するも
のである９変性ベレツト 出願人は清浄化酵母抽出物を少なくとも２４時間凍結す
ることによりｇａｇプレカーサーが自然に沈殿化する事
を発見した。これは簡単な遠心や沈降形式操作により融
解抽出物を十分に精製させるものである。清浄化凍結酵
母抽出物の融解後のベレットに対する連続ステップは界
面活性剤の有無は別として種々の緩衝液でそのベレット
をホモジナイズして沈降形成したｇａｇプレカーサーを
洗浄し、膜、不必要な膜結合タンパク質及びその地膜様
成分の除去を行なう事がある。洗浄後に得られたペレッ
トを可溶化し、更に変性ペレットを形成させる。上記記
載の変性ペレット形成における概略を次に示す。

（ａ）少なくとも２４時間凍結した清浄化凍結酵母抽出
物を融解する。

（ｂ）約１０．０００Ｘｇから１００．０００Ｘｇ、約
１０分から約１２０分、の範囲内の条件で遠心し、ｇａ
ｇプレカーサーを沈降下させる。そしてその後ベレット
と上滑を分離する。

（ｃ）次に膜及び膜結合タンパク質を可溶化するのに効
果的な緩衝溶液でそのペレットを混合及びホモジナイズ
する。緩衝溶液には界面活性剤を加えておくとよい。

（ｄ）更に１０，０００Ｘｇから１００．ＯＯＯｘｇ。

約１０分から約１２０分、の範囲内の条件での遠心にか
けｇａｇプレカーサーを再沈降させる。

そして、その後ペレットと上清を分離する。

（ｅ）上記ステップ（Ｃ）及び（ｄ）における洗浄は同
一溶液あるいは界面活性剤を含む、異なった緩衝液、あ
るいは緩衝液単独、あるいはそれらの組合せにより、３
回繰り返し操作されるものとする。産生物を洗浄済みペ
レットとする。

（ｆ）その洗浄済みペレットを変性剤あるいはカオトロ
ピック因子を含む緩衝液で溶解する。そしてこの得られ
た変性ペレットを疎水性相互作用クロマトグラフィーに
かける。

より明確に言うと、第１ステツプである融解〔上記記載
ステップ（ａ）〕はもっばら室温あるいは３７℃中で行
なわれるが、他の温度として４℃−４０℃の範囲内でも
実行可能であり、本発明の範囲の中に入れである。

ステップ（ｂ）、（ｄ）あるいは（ｅ）におけるｇａｇ
プレカーサーの沈降形成に用いられる遠心力はその回転
時間及び温度同様、種々変更しうるものである。沈降形
成段階における改良の多様性は内凹で判断できるので、
たやすく、遂行しうるものである。

上記記載のステップ（ｃ）における、膜及び膜結合タン
パク賞の可溶化に効果的な、緩衝液に含まれる適切な界
面活性剤としては非イオン性あるいはイオン性界面活性
剤、あるいは適切なそれらの併用などがあり、ノンオキ
シツール系、オクトオキシツール系、ポリオキシエチレ
ンアルコール系、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタ
ンモノ−オリエート系、デオキシコレートあるいはオク
チルグルコピラノシド等に限定されるものではない。ま
た両極性界面活性剤も有効かつ適切な溶剤である。好ま
しい緩衝液に含まれる界面活性剤とはステップ（ｃ）で
ペレットに添加された時に最終濃度が約１％（Ｗ／Ｖ）
から約１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内におさまるオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００
として市販されている）である。最も好ましい最終濃度
は試薬３に含まれるトリトンＸ−１００の約５％（Ｗ／
Ｖ）である。

ステップ（ｄ）あるいは（ｅ）において調製された洗浄
済ペレットをステップ（ｆ）において変性剤あるいはカ
オトロピック因子で変性させ、次のステップである疎水
性相互作用クロマトグラフィーにかける。−船釣に構造
式■なる変性剤は、とれも皆、変性の目的においては適
切かつ便利なものである。

式中 Ｒは　アミノ、低級アルキルチオ、低級アルキルオキシ
あるいは硫黄 Ｘは　アミノ、硫黄、あるいは酸素、及びＹは　水素あ
るいはア°ミノである。

この構造式にはグアニジン・ＨＣｌも含まれ、その時、
Ｒはアミノ、Ｘはアミノ及びＹは水素である。

ステップ（ｆ）における洗浄済みペレットの変性に対す
る好ましい溶剤は試薬３中で約２Ｍから約８Ｍの濃度範
囲内にあるグアニジン・ＨＣＩ’であり、最も好ましく
は６Ｍである。そして疎水性相互作用クロマトグラフィ
ーにかける直前にこの変性物を希釈する。

疎水性　互　　クロマトグラフィー 変性沈降形成されたｇａｇプレカーサーを疎水性相互作
用を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ更に精製す
る。木目的の為の好ましい樹脂はフェニル−セファロー
ス（ファルマシア）である。

もち論その他の樹脂として、オクチル−セファロース（
ファルマシア）、ブチル−セファロース（ファルマシア
）及び同様アガロースの誘導体としてω−アミノアルキ
ルアガロース（マイルスリサーチ）あるいはヘキシル−
アガロースなども用いられる。構造式■なる変性剤が使
用され、中でもグアニジン・１−ＨＪが好ましい。

代表的手順として、ますカラムを緩衝液、好ましくは２
Ｍグアニジン・ＨＪを含む緩衝液で平衡化する。次に変
性ベレットをカラムにかけ、吸光度がベースラインに下
がるまでそのカラムを緩衝“液で洗浄する。この段階で
ニカラムにはｇａｇプレカーサーが吸着されている。こ
れを変性剤の濃度を上昇させる濃度勾配の緩衝液で展開
させる。

濃度の上昇効果により選択的可溶化が起こる。カラムよ
り溶出して来たフラクションを取り、ｇａｇプレカーサ
ーの存在を確認する為に、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動やウェスタンプロットを行なう。そしてｇ
ａｇプレカーサーを含むフラクション部分を集める。フ
ェニル−セファロースカラムにおいては、約３Ｍグアニ
ジン・ＨＣＺにおいて酵母組換え体ｇａｇプレカーサー
が溶出してくる。

水−可ｒ性　母組換え　　ａ　プレカーサー出願人によ
る他の発見とはこの段階におけるタンパク質を逆相高速
液体クロマトグラフィー（ＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃ）に特
定の条件下でかけ水−可溶性ｇａｇプレカーサーを得る
事である。あるいは別法としてゲル濾過方法を用いて水
−可溶性ｇａｇプレカーサーを得る事を出願人は発見し
た。

Ａ、　　ＲＰ−ＨＰＬＣ 一般的に、非極性静止相として作用するアルキルあるい
はフェニル基などによりコーティングされている適切な
細孔性粒子の充填しであるカラムならば、濃度勾配溶出
により、あらゆる逆相高速液体クロマトグラフィ一方法
が用いられる。本発明の方法においてはＣ４、Ｃｌ１Ｓ
ＣＩ８あるいはフェニル基が適切である。特にＣ＋ａが
好ましい基である。

カラムは約０．１％（Ｖ／Ｖ））リフロロ酢酸（ＴＦＡ
）を含む２０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルの水溶１夜で
静止相として平衡化され、ＲＰ−１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃに
とっては代表的な条件である。集められたフラクション
部分を？ｆ４縮し、カラムにのせた後、移動相として、
アセトニトリル濃度を上昇させる濃度勾配を用いて展開
するｍ　ｇａｇプレカーサーを含むと同定されたフラク
ション部分を集め、真空下で乾燥し、滅菌蒸留水で再懸
濁する。得られたタンパク質は、水あるいは１Ｍ尿素に
可溶なｇａｇプレカーサー（≧９５％）であった。

その他の適切なる静止相−移動相としての組合わせはリ
ン酸と１０−４０％勾配アセトニトリル、リン酸あるい
はＴＦＡと勾配イソプロパツール等に限定されるもので
はない、水−可溶性ｇａｇプレカーサー調製の為に用い
られるＨＰＬＣのその他の改良についてはたやすく当業
者にとっては認められるところのものであり、改良点と
して使用カラム、移動相、有機溶媒相、移動相中の水保
持容量の決定、イオン強度、ｐｌ＋、　’１１度、及び
イオン対及びイオン交換効果の評価などがあげられる。

例えば、ウォーターフィールド、エム、デー。

（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ、　Ｍ、　Ｄ、　）、“セバレ
ーションオブミクスチャーズオブプロテインスアンドベ
プチドバイＨＰＬＣ，’ダープレ、ニー、（Ｄａｒｂｒ
ｅ、　Ａ、）著、ブラクティカルプロテインケミストリ
ーウィレー（Ｗｉｌｅｙ　）　１９８６、第１８１−２
０５頁を参照。

Ｂ、［機溶媒によるゲル濾過 ＲＰ−ＨＰＬＣの代わりに有機溶媒を用いたゲル濾過ク
ロマトグラフィーによっても水−可溶性ｇａｇプレカー
サーは得られる。有機溶媒を用いてゲル濾過マトリック
スが使用される。この様な適切なマトリックスの中には
セファロース（ファルマシア）、セファロースＣＬ（フ
ァルマシア）、セファクリルを基にした樹脂（ファルマ
シア）、セファデックスＬＨ（ファルマシア）、セファ
ロースＢ（ファルマシア）、及びパイオービーズＳ−Ｘ
（パイオーラッド）などがある。好ましい一トリックス
としてはセファデックスＬＨあるい心：セファクリルを
基にした樹脂でセファクリルＳ−３００あるいはセファ
クリルＳ−２００ＨＲな２があり特に後者はグアニジン
・ＨＣｌ塩の混入中Ｊリタンバク質を分離するに十分な
特性を持つも０である。

基本的にはあらゆる有機溶媒が使用される。イ」表側と
しては、アセトニトリル、イソプロパツール、メタノー
ルあるいは塩化メチレンなどの有観溶媒中に低濃度の酸
性溶液たとえばＴＦＡあるしはリン酸を含む溶媒がある
。溶媒系として好ましい濃度範囲は０．１％（Ｖ／Ｖ）
ＴＦＡ／≧３０％１アセトニトリル／Ｈ，Ｏであり、最
も好ましくは１０１１％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡ／７０％アセ
トニトリル／ｎｚｏである。

仕加煎丞土二１ 組換え体タンパク質の精製に用いられるその柑−船釣あ
るいはよく知られている方法もこのｇａｇプレカーサー
の精製に付加的方法として用いらゎｔ　　　る。これら
のステップを以下に示すが、それによｔ　　　って限定
されるものではない。

（ａ）例えばシリカゲル、リン酸カルシウム活性炭、あ
るいはセライトアルミナなどの固相上における選択的吸
着あるいは分離。

）（ｂ）溶媒あるいは試薬を用いた選択的抽出。

他の目的において用いられる、溶媒や試薬による抽出は
別のステップにおいて必要とされる。

（ｃ）ｇａｇプレカーサ°−分離には、硫酸アンモニ龜
　　　　ラムによる沈殿法あるいは等電点沈殿を用いた
ｐＨ勾配による沈殿法も別法の１つとしてあげられる。

他の方法として ；（ｄ）ペーパー、薄層、分子ふるい、分子排斥、イ１
　　　　オン交換、リガンドアフィニティー、イムノア
フィニティー、電気泳動などの標準的操作によるクロマ
トグラフィー。

（ｅ）サイズ排斥、吸着などによる高速液体クロマ１　
　　　トゲラフイーあるいは正常相における分配つまり （ｆ）二層分配抽出による溶媒分画、例えばＰＥＧとデ
キストラン（アンダーソン、イー、　（Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎＥ、）等、アン、エヌ、ワイ、アヵド、サイ。

（Ａｎｎ、Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　）　、第
４１３巻、第１１５頁（１９８３））。

（ｇ）透析、ウルトラフィルトレージョン、濃縮、ある
いはグイヤフィルトレーション。

（ｈ）密度勾配遠心法。

（ｉ）エレクトロフォーカッシング法。

（ｊ）フリーズドライ、凍結乾燥法。あるいは（ｋ）結
晶化法。

このリストは決してすべての方法を述べたものではなく
、また記載の順番は精製における好ましい順番を示すも
のでもない。ｇａｇプレカーサーの精製で好結果を得る
為には、凍結による沈殿、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、及びＲＰ−ＨＰＬＣあるいは有機溶媒を用いた
ゲル濾過クロマトグラフィーなどの操作と伴に、ステッ
プ（ａ）−（ｋ）のどれか、あるいはすべてが使用され
る他の精製方法同様、ステップ（ａ）−（ｋ）は、本精
製のあらゆる過程中に付加的ステップとじて、　　導入
されうる方法である。

本発明のワクチンは、感染前、後、どの時期であっても
、第１表中のＡＩＤＳ抗ウィルス剤、イムノモジュレー
タ−１抗生物質あるいはワクチンの有効量と伴に、効果
的に併用投与されるものである。

〔提供：マーケントレター、１１月３０日号、１９８７
、第２６−２７頁、ジエネテインクエンジニアリングニ
ュース、１月号、１９８８、第８巻、第２３真〕 畑　　　　○　　　　　　　　　　　〇−α　　　　　
　　　　　　　　　α ＱＱ　　ｏ　　＞　　ロ　〉〉〉工　ロ！！　ヱ　−　
　　鐸　　　Σ　　　−−Σ　　　−〇　　　−＜＜＜
　　　　○　　　く　　　工Ｏ−−く−萩　　　　か　
　’ｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　ｃＸ　　　
　　”へ≦　ト　ム　　　コ　　　も　　　や　　　ム
　　　　八　　Δ　　　λもコ１へへべ　１１１１ 、　１−１−’−−Ｒヘ　　　モ　　　ト　　　　　ロ
　　Ｘ　　　τく Ｑ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　○　　　　Ｏ−’ＪＯ”Ｊ示 ム　　　　＜　　　　　　　　　　　　　　　　　、　
　　２ν　　　　や　　　　　　　　　　コ　　　も　
＼λ　１ト　　　１１＾　　　　　　　　　　　　　　
λ Ｍ　　　　Ｍ　　　　　　　　　　　Ｆ−ロス　　　Ｅ
−へ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈφ　　　　　
　　　　　Ｘ ！ ｏｏ　　　　　　　　　ｏｕｕ の　　　−０１：　　　　α　　　　　　　α　　　α
　　　α　　　の　　　のＯａ＜＜（イ）　　　　くφ
　くφ　＜ＸＸ−”　　　／　　　／’　　　　　ｔ’
−／；”：　　／　　　ｔ　　　ｔシ　　ベ　　　　　
　　　　　　　１ １１ｆｚ　　　へ　　　　　　　　　　　皐＋ｌ？Ｖ１
ト　　　きム　　　　　　　　　　！１　　　　　　　
セ　　ｑｌ　　：ｒ−ｔ）ＶｄΔ　　　　　　　亨　　
Ｉト＠ｒＩ〆　　　　　　　　Ｋ　　　　　、き６　　
　　　拳　゛く　　・役蚕　＋　　　　　　　　八、ｈ
＋ｈ（ｈ　　　　か　　　　ト　　　　ｉ　　　ｒ　　
　　＼　　　　や　　　そマロ Ｑｍ−コ賢　ト弘　１１　寸へ　国　　国　　セ蚕　へ
へ　ヘベ０−１：Ｉ’ｆｉに　口八　１ｔΣ　ヘ一　エ
　　α　　蚕１４１八　１へのト　八ｒｒｒ　　Ｊヤ　
ｌ：ＩＯ−○　Σ　　Σ　　４へ　−マ　−【く−ト″
″　≦　　ｎ′″′　Ｑ””　　−−Ｙ”　　−”　　
−”Ｋ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　区Ｋ
　　　走　　　　　　　べ　　　　　　　１女　　　ダ
　　　　　　　全　　　　　　　ダＲ！　　　　　　　
　　Ｒ〜 ）　　　　　　ｗ＋ｌｒＳＶＭ　　　　　＋’ｒ　　　
　　　　　　　　Ｋ口　　　　　ｔｂ　　　　Ｉ　　　
　　　　　も　　・さ　　　　　１人　　　　１弄　　
　ト　　【　　　　　弄　　１へ　　　　　賢　　　　
　　１トＹ″″′　　Ｖ″′＋　″″　　　　Σ−勢−
ロー　−ニー　　←−χ−１、略　語 ＡＩＤＳ　（後天性免疫不全症候群） ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群） ＣＭＶ　（サイトメガロウィルスＡＩＤＳ患者中に、日
和見感染を起こし、失明あるいは、死亡）ＨＩＶ（ヒト
免疫不全ウィルス、これまでＬＡＶ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
又はＡＲＶと呼ばれていた。）ＫＳ（カポジ肉腫） ｐｃｐ　＜ニューモシスチスカリニ肺炎、日和見感染の
一種） ＰＧＬ　（持続性全身性リンパ筋腫張）Ｄ、ワクチン 本発明におけるワクチンを最近、研究開発されている種
々のＡＩＤＳあるいはＨＩＶワクチンと併用してＡＩＤ
Ｓ及びＨＩＶによって惹起される同様の症状を示す疾患
に対して治療及び予防の為に使用した。

本発明のワクチンと併用されるＡＩＤＳ治療に有用な医
薬組成物としての範囲は基本的にはＡＩＤＳ抗ウィルス
剤、イムノモデュレーター、抗生物質あるいはワクチン
に限定されるものではなく、あらゆる医薬組成物との併
用にまで広げられる事は明白である。）ＩＩＶ感染ある
いは疾患の予防あるいは治療の為に、プレあるいはポス
ト手段として用いられるワクチンとなりうる本発明のＡ
ＩＤＳあるいはＨＩＶワクチンはこれを免疫源として特
異的な免疫応答を起こさせうるちのである。ワクチンと
しての免疫源性を示す形態は、種々の分子的構造配置に
より形成されるものであり、かつまた−殻内免疫学的テ
ストや実施に従がい、免疫学的賦形剤としてキャリアー
、ベクターあるいはアジュバントを添加されたものであ
る。例えば本発明の一つの具体例として、アラムアジュ
バントを賦形剤として、免疫源である酵母組換え体ｇａ
ｇプレカーサー（あるいはそのバリアント）の懸濁液を
患者に対して予防的にワクチン接種が行なわれる。

免疫源は免疫源性を高めるとされている抗原決定基に対
して共有結合、あるいは非共有結合的に結合したｇａｇ
プレカーサー（あるいはそのバリアント）のアミノ酸配
列より成っている。その抗原決定基とはヘルパーＴ細胞
、細胞溶解性Ｔ細胞、Ｂ細胞の免疫性を誘発する典型的
なアミノ酸配列をもつものである。もしサプレッサーＴ
細胞の免疫性を誘発したいのならばアミノ酸配列の削除
が好ましい。これら抗原決定基の一例として、Ｂ型肝炎
ｐｒｅ　Ｓ　２アミノ列配列がヘルパーＴ細胞及びＢ細
胞の免疫性を高めるものであると認識されている。

そして、−船釣な免疫学的実験により免疫源性を高める
為の抗原決定基が必要であるとされたのなら、その抗原
決定基は抗原（Ａｇ）に対して共有結合的に融合される
べきである０例えばＢ型肝炎の完全コア抗原あるいはそ
の一部分におけるカルボキシ末端をペプチド結合あるい
はその他の共存結合により組換え体ｐ５５あるいは組換
え体酵母Ｔｙ：Ａｇ分子の７ミノ末端に連結し融合する
。

これら融合体の構築は該当する構造タンパク質をコード
しているＤＮＡのスプライシング、そのスプライシング
を受けたＤＮＡの発現及び融合タンパク質産物の分離に
より、簡単に調製されるものである。別法あるは付加的
方法として、その様な抗原決定基に結合する抗原が非共
有結合による相互作用によっても免疫源性を高める為に
有効な種々のサイズを有する粒状の形態物や、単純な凝
集物が産生される。これは他のワクチン形態についても
言及されるべき事であり、ペプチドカクテルは幅広いＭ
ＨＣ拘束性ペプチドを含み、ＤＮＡ組換え体はＡｇに対
するＤＮＡ配列とワタシニアベクターを保有する。

本発明のワクチン調製の際に、アジュバントは添加され
ても、されなくてもよい。ヒト用ワクチンにはアラムが
代表的かつ良好なアジュバントである。他にフロイド不
完全アジュバントやリポソームなどを含むワクチンもあ
る。

Ｔ細胞免疫性、細胞溶解性Ｔ細胞、Ｂ細胞免疫性を誘発
する抗原決定基の使用により特異的免疫性の出現能力を
高められたこれらワクチンの調製、形態化、及びテスト
には、免疫学、組換えＤＮＡ及び関連分野における一般
的かつ日常的技法が必要とされる。実施例における次の
物質は市販されている。グアニジン・ＨＣＩ’、インタ
ーナショナルバイオテクノロジーズ、インク、トリトン
Ｘ−１００、ベーリンガーマンハイム。

本出願において、ｇａｇプレカーサーあるいはＨＩＶｐ
５５は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルなどの変性ゲル
及びウェスタンプロット〔バーネットダブル、エヌ、　
　（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、　Ｎ、　）、アナル、バ
イオケム、　　（’Ａｎｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　）
　、第１１２巻、第１９２頁（１９８１））、あるいは
その併用によりモニターされる。

実濾拠よ Ｇａｇプレカーサー終止コドンの下流直近部位に終止コ
ドンが挿入されているＨＩＶｇａｇプレカーサーに対す
る酵母発現ベクターの構築プラスミドｐＢＬ４−３−２
　（あるいはｐＮＬ４−３）は、約２２ｋｂの挿入を持
ったｐＵｃｌＢであり、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＨｒ　Ｖ分離
株＃５の５′側の半分と、ＬＡＶ分離株の３′側の半分
とを融合した９、　７　ｋ　ｂのＨＩＶＤＮＡより成っ
ている〔ニー。

アダナ（Ａ、　Ａｄａｃｈｔ　）等、ジエイ、ヴイロル
。

（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ　）　、第５９巻、第２８４−２９
１頁（１９８６））、ＨＩＶｇａｇプレカーサーに対す
る酵母発現ベクターの構築に関する本方法において、Ａ
ＩＤＳウィルスの配列を含む他の種々のプラスミドはｐ
ＢＬ４−３−２（あるいはｐＮＬ４−３）の代りに用い
られ、しかもその様なプラスミドに対する適切な遺伝子
工学操作法の選択は分子生産学者の技術の中にある。

プラスミドｐ　Ｂ　Ｌ　４−３−２（あるいはｐＮＬ４
−３）をＨｉｎｄｎ［で部分的切断を行ない、ｇａｇ−
ｐｏｌコード領域を保有する５、　７　ｋ　ｂのＨｉｎ
ｄ■フラグメントを得た。このフラグメントをｐＵｃ１
３でサブクローニングし、出現してきた２個の同一プラ
スミドを、Ｐｌ及びＰ２と表示する。両プラスミドを以
下に示す様式で別々に同一操作を行なう、プラスミドＰ
ｉ（あるいはＰ２）をＨｇａｌとＮｄｅｌで切断する。

得られた４、　４　ｋ　ｂＨｇａＩ−ＮｄｅＩ　　ｇａ
ｇ−ｐｏ１７ラグメントをＤＮＡポリメレースＩのクレ
ノーフラグメントにより平滑末端とする。（ｇａｇコー
ド配列中の＋３部位においてＨｇａｌサイトの充填が行
なわれ平滑末端になる。）４．４ｋｂの平滑末端フラグ
メントを以下の構造を有する合成オリゴヌクレオチドア
ダプターとライゲーションする。

５　　’　　−ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＣ
ＡＡＡＡＴ　　−３’３’−ＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＴＴ
ＴＧＴＴＴＴＡ−５’アダプターを平滑末端であるＨｇ
ａｌサイトにライゲーションしてｇａｇ遺伝子に対する
ＡＴＧ開始コドンを付着させ、更に酵母様非翻訳ｍＲＮ
Ａリーダー及びＨｉｎｄｎ［、ＢａｍＨＩクローニング
サイトを添加した。本アダプターを平滑末端Ｎｄｅｌサ
イトとライゲーションし、本来のｐｏｌ翻訳終止コドン
の下流２７ｂｐに翻訳終止コドン及びＢａｍＨＩ、Ｈｉ
ｎｄＩ［Ｉクローニングサイトを組入れた。このライゲ
ーションミクスチャーをＨｉｎｄｎｌで切断し、得られ
たｇａｇ−ｐｏｌコード領域を持つ４．４　ｋ　ｂのＨ
ｉｎｄｌＩ［フラグメントをゲル精製して、ｐＡＡＨ５
のＨｉｎｄｌＩＩサイトへクローン化した〔ジー、アメ
レル（Ｇ、　Ａｍｍｅｒｅｒ）−、メソッズインエンサ
イモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）。

第１０１巻、第１９２−２０１頁、（１９８３））。

次に大腸菌をトランスホームさせ、プラスミドｐ６４−
３０をプラスミドＰ１より獲得した。またｐ５０−８１
とはプラスミドＰ２由来である。

プラスミドｐ６４−３０をＢａｍＨＩとＨｉｎｃ　Ｉ［
で切断し、得られた１７６０ｂｐのＢａｍＨＩ−ト１ｉ
ｎｃ■フラグメント（ｇａｇコード領域保有）をゲル精
製し、あらかじめＢａｎ＋ＨＩとＨｉｎｃ　Ｉ［で切断
しておいたＭ１３ｍｐ１８でサブクローニングする。

オリゴヌクレオチド−ダイレクト変異法により〔エム、
ジエイ、ゾーレル（Ｍ、　Ｊ、　Ｚｏｌｌｅｒ）等、メ
ソッズインエンサイモロジー、第１００巻、第４６８−
５００頁（１９８３））、ｇａｇ翻訳終止コドンの下流
５ｂｐにＳｎ＋ａｌサイトが導入された。

変異法で用いられたオリゴヌクレオチドは次の構造を持
つ。

５　　’　　−ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＴ
ＧＡＣ−３’この変異プラスミドをＢｇｌｎとＨｉｎｃ
ＩＩで切断し、得られたｇａｇコード領域の３′末端を
含む０、４４　ｋ　ｂのＢｇｌＵ−ＨｉｎｃＩＩフラグ
メントをゲル精製する。プラスミドｐ５０−８１をＢａ
ｍＨＩとＢｇｌＵで切断し、得られたｇａｇコード領域
の５′末端を含むｌ、　３　ｋ　ｂのＢａｍＨＩ−Ｂｇ
　ｌ　ＩＩフラグメントをゲル精製する。前述０．４４
ｋｂフラグメントとこの１．　’ａ　ｋｂフラグメント
をあらかじめＢａｍＨＩとＨｉｎｃ　ＩＩで切断してお
いたベクターｐＧＥＭ−４と伴にライゲーションする。

得られたプラスミド、ｐＫＨ−ＧＡＧ　（４，６ｋ　ｂ
）　、は翻訳終止コドンの下流５ｂｐにＳｍａｌサイト
、及び酵母様５′非翻訳リ一ダー配列を持つ再構築され
たｇａｇ遺伝子を含むものである。

ｐＫＨ−ＧＡＧをＢａｍＨＩとＳｍａｌで切断する。

得られた１、　５　ｋ　ｂのＢａａ＋ＨＴ−３ＩＩＩａ
ｌ　ｇ　ａ　ｇフラグメントをＤＮＡポリメレースｌの
クレノーフラグメントにより平滑末端とし、ゲルで精製
する。

酵母発現ベクターｐｃ１／　１−ｐＧ　Ａ　Ｐ　（Ｂ）
ｔＡ　Ｄ　Ｈ１は酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ４９１）に対す
る構成プロモーター及び酵母ＡＤＨＩ遺伝子の転写ター
ミネータ−を含んでいる。ユニークＢａｍＨＩサイトは
プロモーター及びターミネータ−因子の間に位置してい
る。本ベクターは既に報告されているとおりＧＡＰ４９
１発現ベクターと機能的に同じである〔ビー、クニスケ
ルン（Ｐ、　Ｋｎｉｓｋｅｒｎ）等、ジーン（Ｇｅｎｅ
　）　、第４６巻、第１３５−１４１頁（１９８６）。

ｐｃｔ／１−ｐＧＡＰ（Ｂ）　ｔＡＤＨｌをＢａｍＨＩ
で切断し次にＤＮＡポリメレースＩのクレノーフラグメ
ントで平滑末端とする。このベクターフラグメントと先
の１．５ｋｂ　　ｇａｇフラグメントを伴にライゲーシ
ョンしてｐＫＨ１２−２を作成する。この組換え体プラ
スミドをサツカロミセスセレビシェＵ９株でトランスホ
ームする（ＭＡＴａ、１ｅｕ２　０４、ａｄｅｌ、ｕｒ
ａ３、ｃ　ｉ　ｒ　’）。０９株はニス、セレビシェ２
１５０−２−３株（ＭＡＴａ、１ｅｕ２−０４、ａｄｅ
ｌ、ｃｉｒ”）より自然に誘導されてきたｕｒａ３分離
株である。トランスホームされたクローンを選択し複製
する。細胞溶解物を調製し、ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動及びニトロセルロースによるウェスタンプ
ロットを行なった。ＨＩＶ−陽性ヒト血清を用いたイム
ノプロットにより、このトランスホーマントの中にＨＩ
Ｖ−特異的５５キロダルトンのタンパク質の存在が実証
された。またＲＩＡにより抗−ｐ２４抗体と反応するこ
の５５−ＫＤａタンパク賞がＨＩＶｇａｇ１）５５であ
ると同定確認された。

クローン分離した菌をＵ９＃５−１として選択し、更に
発酵及びタンパク質の精製実験の為のマスターシード（
ＰＦ４１３）として調製した。このマスターシードを１
７％（ｖ／Ｖ）グリセロールの存在下で−６０から一８
０℃において凍結保存する。

試料０９＃５−１．ＰＩ及びＰ２は本願出願臼又はその
前にアメリカンタイプカルチャーコレクション、（１２
３０１パークローンドライブ、ロックヴイル、エムデイ
−２０８５２）に寄託し、それぞれ受託番号が２０８７
６．６７６６９、及び６７６７０となった。

実施例−？− ・ごパ　　　ヒ　　　　　　　　　　　　　　の３　−
＋１実施例１における凍結組換え体酵母細胞を融解する
。細胞破壊緩衝液（０，１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　　ｐＨ７，
５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭヘンズアミジン、１
Ｍｇ／ｍｌ”＝ブスタチンＡ、０．１３　ＴＩＵ／ｄア
プロチニン、２ｍＭＰＭＳＦ、０．１　ｍＭ　）ランス
−エポキシスクシニル−２−ロイシルアミド〜（４−グ
アニジノ）−ブタン〕を加えて約２５％（Ｗ／Ｖ）の細
胞懸濁液を作る。細胞を４℃で圧力をかけて溶解する。

１４．ＯＯＯＸｇ、４５分、４°Ｃの遠心後、ペレット
を除去する。上清を清浄化酵母抽出物として、それを少
な（とも７２時間、−７０℃で凍結する。

実施例３ ′コ′　　ヒ酵　　　　　の　　リ、　、１バリエーシ
ョンＡ、変性ペレット 実施例２における凍結された清浄化酵母抽出物８００−
を室温水浴中で融解し、３０．００　Ｏｒｐｍ（１０５
，０００Ｘｇ）　、６０分、４℃の遠心にかける。上清
を除去し、ベレットはそのまま、それぞれの遠心管中に
入れておく。この各チューブ中のペレットに５−の５％
（Ｗ／■）トリトンＸ−１００（ベーリンガーマンハイ
ム）　ヲ含ムｍ薬３（０，１Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（
ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０ｕｇ／ｍＲ
ヘプスタチンＡ、　０．１３７ＩＵ／−アプロチニン、
ｌＱｍＭベンズアミジン・Ｈα、２５μＨトランスエポ
キシスクシニル−し−口イシルアミド−（４−グアニジ
ノ）−ブタン、０．１％（−ハ）２−メルカプトエタノ
ール〕を加えて、膜及び付随的な膜結合ペレットを可溶
化する。ベレー／　）をホモジナイズして、約２．５％
（Ｗ／Ｖ）ｌ−リドンＸ−１００の懸濁液とする。懸濁
液を３０．００Ｏｒｐｍ、３０分、４℃の遠心にかけ、
トリトン上清Ｉを除去し、ペレットは各遠心管中で放置
する。

各ペレットに５−の試薬４〔６Ｍ−グアニジン・ＨＣＪ
！、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０μｇ７ｍ２ヘプスタチンＡ、０．１３
ＴＩＵ／−アプロチニン、１０ｎＩＭベンズアミジン・
ＨＣＪ！、２５μＨトランス−エポキシスクシニル−Ｌ
−ロイシルアミド（４−グアニジノ）−ブタン、及び０
．１％（Ｗ／Ｖ）２−メルカプトエタノール〕を加え可
溶化を再度行ない、その後ホモシネ−ジョン及び、冷却
下で、−晩エンドーオーバーーエンドミキサーで最終的
に混合する。得られた混合液が変性ペレットであり、試
薬４で１５倍に希釈した後−２０℃あるいは一７０℃で
保存する。

Ｂ、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを試薬３
とフェニル−セファロース（ファルマシア）で調製する
。変性ペレットをのせた後、カラムを試薬３で展開する
。２８０ｎｍ吸光度において巾広いピークを持つ素通り
画分を集め除去する。試薬３から試薬４への直線勾配法
を用いて溶出させる。グアニジン・ＨＣｌｆｌｌ、度の
上昇効果に伴なって、選択的可溶化がカラム中で起こる
。

分画した溶出液に対して組換え体ｐ５５　ｇ　ａ　ｇプ
レカーサーの含有（約３Ｍグアニジン・ＨＣｉ’部分で
溶出してくる）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いて確認し、フェニル−セファロ−スプールとし
て回収する。分析用サンプルはキャリヤーＢＳＡの存在
下でＭｅＯＨ沈：Ｒ決により変性剤グアニジン・Ｈαを
除去し、電気泳動用サンプルとして調製する。グアニジ
ン・ＨＣＪ！濃度を電気伝導度の測定により追跡試験を
行なう。フェニル−セファロ−スプールはこの時点で１
０ｍＭＨＥＰＥＳに対して透析し、ρ５５　（８５−９
０％純度）を沈殿させる。この沈殿物を６Ｍグアニジン
・ＨＣｌ及び６％β−メルカプトエタノール溶液で可溶
化する。

Ｃ０水−可溶性酵母組換え体ｇａｇプレカーサータンパ
ク質 フェニルーセファロースプールヲ？ｌ＝　縮シｃ　＋　
ｓ　逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）系を
用いて水可溶性物とする。ＨＰＬＣカラムを１容量の試
薬５（１，０ｄｌ−リフロロ酢酸、９９９−アセトニト
リル〕と４容量の試薬６（１，０−トリフロロ酢酸、９
９９−水〕からなるミクスチャ−１によって平衡化する
。濃縮フェニル−セファロ−スプールは９５℃加熱、１
０分後、１４．０００Ｘｇ、１０分の遠心にかけ残存デ
ブリを除去して調製される。ｇａｇプレカーサーを含む
上清サンプルを試薬４で溶解し、平衡化しであるＨＰＬ
Ｃにかける。ミクスチャ−１で連続的洗浄ステップで溶
媒輸送システムよりカラムを洗浄しミクスチャ−１から
ミクスチャ−２〔４容量の試薬５と１容量の試薬６〕へ
の勾配緩衝液で溶出を行なう。最終洗浄はミクスチャ−
３〔９容量の試薬５と１容量の試薬６〕で行なう。２６
０ｎｍにおける主要ピーク吸光により十分に精製された
（≧９５％）、水−可溶性酵母組換え体ｇａｇプレカー
サーが存在している事を見い出しＳＤＳゲル電気泳動後
の銀染色やウェスタンプロットにより判定した。溶媒を
回転エバポレーターで除去し、そこへ滅菌蒸留水を加え
る。このＨＰＬＣ−精製ｇａｇプレカーサーは水あるい
は１Ｍ尿素によく溶ける。それは細胞溶解後の凝集物質
が強度性剤でのみ可溶である事とは対照的である。各２
０％の細胞懸濁液５０ｍ２からＨＰＬＣ後の回収総タン
パク質量は２から４■の範囲にある。

滅菌濾過及びアラム吸着は適切なワクチン調製において
は一般的な方法である。

大施桝↓ Ａ、変性ペレット 実施例２における凍結清浄化酵母抽出物の８００−を室
温水浴中で融解し、試薬３で１６００−に希釈し、望ま
しくない沈殿形成をおさえる。得られた混合液を１４．
　ＯＯＯｒｐｍ（３０，０００ｘ　ｇ）、３０分、４℃
の遠心にかける。上清を一２０℃で凍結（上清１）し、
ペレットは各遠心チューブ中に保持しておく。５％（Ｗ
／Ｖ）　　トリトンＸ−１００（ベーリンガーマンハイ
ム）を含む試薬３１０１１１を各遠心チューブ中のペレ
ットに加えて膜及び付随的な膜結合タンパク質ベレット
を可溶化させる。ペレットをホモジナイズして約５％（
Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００の懸濁液とする。そしてこ
の懸濁液を一２０℃で凍結する（凍結ペレット）。

以下に示す′様に、凍結上清■に対する大量用操作とし
ての付加的方法は約５０％回収率を増大させるものであ
る。つまり凍結上清Ｉを室温水浴中で融解し、１４．０
０　Ｏｒｐｍ　　（３０，０００Ｘ　ｇ）、３０分、４
　”ｃの遠心にかけ、それらのペレットを５％（Ｗ／Ｖ
））リドンｘ−ｉｏｏを含む試薬３１０ｍ１でそれぞれ
処理し、ホモジナイズして、ホモジナイズ残留ペレット
とする。先の凍結ペレットを室温水浴中で融解し、この
残留ペレフ【・と一つの容器内で混合する。混合ペレッ
トを５％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００を含む試薬３を
用いて２００ｄにする。そしてこの混合物をホモジナイ
ズして１４．００　Ｏｒｐｍ　、３０分、４℃の遠心に
かける。

この時のトリトン上清Ｉは除去し更に５％（Ｗ／Ｖ）ト
リトンＸ−１００を含む試薬３　２０ｔｌ！を加え、ホ
モジナイズを繰り返す。この混合物に５％（Ｗ／ｖ）ト
リトンＸ−１００を含む試薬３を加えて２００ｄにする
。ホモジナイズ終了後、再び１４、ＯＯＯＸｇ、３０分
、４℃の遠心にかける。

同様にトリトン上清■を除去し、ペレットは試薬４２５
−で処理する。ホモジナイズして、冷却下で一晩、エン
ド−オーバーエンド（ｅｎｄ　−ｏｖｅｒ　−ｅｎｄ）
ミキサーで混合する。そして得られた混合物が変性ペレ
ットであり、試薬４で１５倍希釈した後、−２０℃ある
いは一７０℃で保存する。

Ｂ、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムをカラム
用緩衝液〔２容量の試薬３と１容ｉｔの試薬４〕とフェ
ニル−セファロースで調製する。このカラムを実施例３
で用いた緩衝液のかわりに２Ｍグアニジン・Ｉ（αを含
む緩衝液で平衡化する。変性ペレットはカラムにのせる
前に３０、ＯＯＯｒｐｍ　　（１０５，０００ｘｇ）　
、３０分、４℃の遠心にかけ残留デブリーを除去してお
く。

この上清液に計算上２ＭグアニジンＨαになる様に試薬
３を加える。試料をのせた後、カラムをカラム緩衝液、
２Ｍグアニジン・ＨＣｆｆ緩衝液で展開する。２６０ｎ
ｍ吸光度において巾広いピークを持つ素通りした両分を
集め除去する。カラム緩衝液から試薬４への直線勾配法
つまり２Ｍから６Ｍグアニジン・Ｈ（１！勾配を用いて
溶出させる。グアニジン・Ｈ（１’濃度の上昇効果に伴
なって選択的可溶化がカラム中で起こる。排除容量であ
る２Ｍグアニジン・ＨＣＪ！ではｇａｇプレカーサータ
ンパク質の溶出は行なわれない事からタンパク質のフェ
ニル−セファロースへの結合という疎水性相互作用が説
明される。

カラムより溶出されてくるフラクション部分について、
ｇａｇプレカーサータンパク質の存在とＳＤＳポリアク
リルアミドゲルにより同定し、フェニル−セファロ−ス
プールとして回収する。

Ｇａｇプレカーサーは約３ＭグアニジンＨ（Ｊ部分にお
いて溶出してくる。グアニジンＨＣｌ７濃度と電気伝導
度の測定により追跡試験を行なう。

Ｃ０水−可溶性酵母組換え体ｐｓｓｇａｇプレカーサー
タンパク賞 フェニル−セファロ−スプールを濃縮し、実施例３Ｃの
ＨＰＬＣ方法を繰り返し行ない水可溶性物とする。

大旌槻ｌ 清浄化酵母抽出　の本−１、第３バリエーシヨン。

最終ステップとしてのゲルクロマトグラフィー実施例４
Ｂにおけるフェニル−セファロ−スプールを？層線し７
０％Ｃ）ｌ＋ｃＮ／　０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０で平衡化
したセファクリルＳ−２００ＨＲのカラムにかける。カ
ラムを同一溶媒で展開し、フラクション部分を取り出し
真空下で乾燥させて、水に懸濁する。Ｇａｇプレカーサ
ーを含むフラクションをポリアクリルアミドゲルの電気
泳動により同定する。得られたｇａｇプレカーサー調製
物は≧９５％純度を持ち、水に対する可溶性については
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製物質と区別がつかない物である。

実施例６ インビボにおける　疫源性 Ａ、アフリカミドリザル 実施例２において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
ｇａｇプレカーサーを、数種の用量レベルでアフリカミ
ドリザル中へ接種する。各用量を０ケ月、１ケ月として
、筋肉内投与する。用量レベルは０．１．０．１０．０
、及び１００．　Ｏｍｃｇで各用量レベルに対して３匹
使用。２回目の投与後２週間目にサルから採血し、抗ｇ
ａｇプレカーサー抗体の発現を特異的酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳＡ）でアッセイした。１０．Ｏｍｃｇあるいは
１００．　Ｏｍｃｇをそれぞれ２回投与されたサルはす
べて十分なレベルでの抗ｇａｇプレカーサー抗体を発現
した。

１、　Ｑ　ｍｃｇを２回投与されたサルも、２．３匹は
、陽性を示す。しかしＯｍｃｇ　　（アラムブラシボー
）群に関してはいずれも抗ｇａｇプレカーサー力価を示
さなかった。第■表参照 第■表 １　１００．０　　１：６２．５００ ２　１００．０　　１：６２，５００ ３　１００．０　　１：６２．５００ ４　　１０．０　　１：１２．５００ ５　　１０、ＯＬ：６２，５００ ６　　１０．０　　１：１２，５００ ７　　１．０　　１：５００ ８　　　　１．０　　　　＜ｔｒｉ。

９　　１．０　　　ｚｚ。

１００（アラムブラシト）　　　　＜１：１０１１　　
　　　　０　　（アラムブラシボー）　　　　〈　１　
：　１０Ｂ、マウス 実施例２において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
ｇａｇプレカーサーを数種の用量レベルでマウス（Ｉ　
ＣＲ株）に接種する。各用量は１同腹腔内投与とする。

用量レベルは０．１，１．０．１０．０及び１００．０
ｍｃｇで各用量レベルに対して１０匹使用。投与後２８
日目に採血し、抗ｇａｇプレカーサーの発現を特異的酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でアッセイする。各用量に
対する個々の抗体陽性マウスの数値を抗原に対する５０
％効果！　（Ｅ　Ｄ　５゜）によって計算する。この数
値は抗ｇａｇプレカーサー抗体の出現により、投与マウ
スの半数が、血清陽転すると期待される用量レベルであ
り、ｇａｇプレカーサーに対してのＥＤＳ。は１．５　
ｍｃｇである。

Ｃ，チンパンジー 実施例２において精製されたアラムー吸着組換え体酵母
ｇａｇプレカーサーを２匹のチンパンジーに、０ケ月、
１ケ月及び６ケ月目にそれぞれ１００、０ｍｃｇ筋肉内
接種する。更に別な一匹に対してはアラムブラシポーを
同様に接種する。抗ｇａｇプレカーサー抗体の発現を採
血日程に従かいＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により評価する。また
免疫異常性の発生に対する検査により評価される。最終
投与後４週間目に３匹すべてのチンパンジーをインタク
トＨＩＶのタイトレージョン用量を用いてチャレンジす
る。２５．０チンパンジ一感染力価をもつものを静脈内
接種する。チャレンジ後、特異抗体及び免疫異常性同様
ＨＩＶの持続感染に対する評価を行なう。

Ｄ、付加的マウス試験 インタクトＨＩＶによりチャレンジした感作動物中にお
いてそのｇａｇプレカーサータンパク賞が迅速にＨＩＶ
エンベロープタンパク質に対して応答する免疫系を惹起
する事を示す為に、以下の実験計画を立てた。実施例２
において精製されたアラムー吸着組換え体酵母ｇａｇプ
レカーサーの１０、　Ｑ　ｍｃｇ用量をマウスに日を変
えて数回、腹腔内接種する。各マウスを単一サブ−免疫
源用量のインタクトＨＩＶでチャレンジする。アラムプ
ラシボーではなんの反応もみられなかったが、ｇａｇプ
レカーサー投与マウスが特異的抗エンベロープ抗体を発
現するかどうかを調べる為に各マウスのＨＩＶエンベロ
ープタンパク質に対する特異的抗体の発現を評価するも
のである。

実施例１におけるｇａｇプレカーサー発現酵母細胞を、
非発現系酵母細胞と、伴にそれぞれトーウレル、デイ−
１（Ｔｏｗｌｅｒ、　ｏ、）等、ブロク、ナトル、アカ
ド、サイ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ＾ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、）、第８３惑、第２８１２−２８１６頁（１９８６
）の方法に従がい３Ｈ−ミリスチン酸にニーイングラン
ドヌクレアー）でラベルする。ラベル細胞ベレットをＨ
ＥＰＥＳ　　ｐｔ１７．５　（１００ｍＭ）、ＥＤＴＡ
　（１０ｍＭ）　、ペプスタチンＡ（１０，ｃｚＭ）、
ベンズアミジン（１０ｍＭ）　、アプロチニン（０，１
３ＴＩＵ／ｍ）　、Ｅ−６４（２５μＭ）　、ＮａＣｔ
’　（１５０ｍＭ）　、ＮＰ−４０（１％）、ナデオキ
シコレート（１％）及び５ＤＳ（０，１％）でガラスピ
ーズ（０，５Ｈｍ）を用いて溶解し、ポルテックスにか
ける。壊われずに残った細胞片を除去する為に遠心をか
け、次にｐ５５に対して特異的なモノクローナル抗体を
両袖出物に加え４℃で一晩インキユベートする。抗体結
合物をヤギ抗−マウスＩｇＧ１抗体が付いているセファ
ロースを添加する事によりハーベストする。抗体結合物
をセファロースより０．５　Ｍ酢酸を用いて溶出させる
。真空下で乾燥させ５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオ
グラフィーによって分析する。ＨＰＬＣ−精製ｇａｇプ
レカーサー及び付加的４１ＫＤａバンドと共に移動する
鮮明なバンドはラベル特異的に観察されるものだけであ
る。ゲル中コントロールレーンにはいかなるラベルバン
ドも検出されなかった。

失践開１ ＨＩＶｇａｇプレカーサーの為の昆虫発現ベクターの構
築 バキュロウィルス遺伝子発現系〔サマース、エム、デイ
＋、　（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、　Ｄ、）等、ニー、マ
ニュアルオブメソッズフオーバキュロウイルスベクター
ズアンドインセクトセルカルチャーブロセデュアース、
テキサスアグリカルテャルエクスベリメントステーショ
ン、プレチン番号１５５５．５月１９８７（＾Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ
１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ＋Ｔｅａ
ｘｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔ　５ｔａｔｉｏｎ、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ！ｔｏ、　１５
５５．　Ｍａｙ　１９８７）が以下に示す様にＨＩＶｇ
ａｇ−ｐｏｌ遺伝子の発現に用いられる。実施例１のプ
ラスミドクローンＰ１よりｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含む
４．４ｋｂＨｇａｌ−Ｎｄｅｌフラグメントを切り出し
この４．４　ｋ　ｂデュプレックスの末端をクレノーＤ
ＮＡフラグメントで充填する。そして以下に示す合成オ
リゴヌクレオチドデュプレックスとライゲーションさせ
て平滑末端を得る。

５　’　−ＧＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧ−３
’３’−ＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣ−５’この様に
考案された”スティッキー”末端はＢａｍＩ制限酵素認
識部位を構築するものであり、ライゲートされた残りの
配列は酵母翻訳認識配列を含むものである。相称的リン
カー−改良４．４　ｋ　ｂフラグメントをプラスミドＡ
Ｈ５でサブクローンし、そこよりＢａｍＨＩフラグメン
トとして回収される。

この回収されたＢａｍＨＩフラグメントをバキュロウィ
ルス発現プラスミドｐＡｃ３７３　（サマース。

エム、デイ−３等、上述〕のユニークＢａｍＨＩサイト
に挿入する。ｐＡｃ　３７３のバキュロウィルスポリヘ
トリンプロモーターに相関する方向性を持って挿入され
た遺伝子を有するクローンは、制限酵素による分析で同
定される。本来のｇａｇ−ｐｏｌｐＡｃ３７３発現ベク
ターに加えて、第２ｐＡｃ　３７３クローン、ｇａｇ−
ｐｏｌ配列が、その内部ＢｇｌＵサイトでのクレノーＤ
ＮＡポリメラーゼ充填反応によりフレームシフト変異を
持つ様に改良されているｐＡｃ　３７３クローンが調製
される。これら２種のベクターをそれぞれ同時トランス
フェクションの選別の為に、スボドプテラフルギペルダ
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞
系Ｓｆ９のオートグラファ力ルホルニ力ヌクレアーポリ
へドロシス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ　ＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウ
ィルスＤＮＡに対して用いられるものであり、サマース
、エム、デイ−０等、上述の方法に従がうものである。

ホモローガスな組換えにより、後期ウィルスポリヘトリ
ンプロモーターの転写制御下にあるｇａｇ−ｐｏｌ遺伝
子を含む様に改良されたウィルスであるところの、各ベ
クターの組換えウィルスプラークは、そのプラーク形態
により同定され、対応しうるウィルスを含む切り出され
たアガロースプラグ（プラーク形成プレートより）を発
育培地中へ一晩かけて溶出させ、Ｓｆ９細胞のミクロタ
イタープレート培養の感染に用いる。次に、感染細胞を
ＨＩＶ−陽性抗体を用いたイムノドツトプロット法によ
りｇａｇの発現を調べる。その方法はハング、ワイ。

（Ｗｈａｎｇ、Ｙ、）等、ジェイ、ヴイロル、（Ｊ、ν
１ｒｏ１）、第６１巻、第１７９６頁（１９８７）に従
かう。

陽性ウィルスストックを”プラーク−精製物”として発
現に関しては再度、ウェスタンプロットによりチエツク
する。本来のｇａｇ−ｐｏｌウィルスベクター発現系（
ＡｃＧＡＧ−Ａ−１５−３）は大部分が約５５ＫＤａの
免疫反応性ポリペプチド及び少量の約４０ＫＤａポリペ
プチドを発現した。フレームシフトｇａｇ−ｐｏｌウィ
ルスベクター発現系（ＡｃＧＡＧ−Ｂ−１−３）は約４
０ｋｄのポリペプチドをおもに発現する。これらの結果
は２つのオーブンリーディングフレームを有する酵母に
おける発現により得られた物と同様の性質を持っていた
。

大施桝工 Ｇａ　　プレカーサー配置１ 実施例１のｐＫＨ１２−２の塩基配列を改良Ｔ７ボリメ
ラーゼを用いたグイデオキシターミネーション法により
決定した。そこから推定しうるアミノ酸配列を以下の第
■表に示す。

ｑコ　　Ｃｑ ＝−〉×リ　（１：８１ｇ＋← 本発明の原則にのっとり、発明の目的を例示する為の実
施例において用いられる先述特異的方法は、本発明の実
行において、すべての−殻内変法、適応、改良、省略、
付加などが、本発明の明細書中における操作手順におい
て行なわれても、それは本発明の範囲に含まれ、特許請
求の範囲内にあり、等価である。

【図面の簡単な説明】

第１図は逆相高速液体クロマトグラフィーによる組換え
体ｇａｇプレカーサーの精製手順である。 第２図は有機相におけるゲル濾過クロマトグラフィーに
よる組換え体ｇａｇプレカーサーの精製手順である。 し面の浄書（内容に変更なし） 第　　　１　　　図 酵　　　母 ベレット（上清除去） 変性ペレット ＡＩＤＳワクチン 第　　　２　　　図 酵　　母 変様ペレット 水口可溶性ＧＡＧプレカーサー ＡＩＤＳワクチン ０発　明　者　　ロナルド　ダブリュ、　　アエリス　
　　　　　　　　ブ。 ０発　明　者　　エミリオ　ニー、エミ　　アニ　　　
　　　　　　　　　　ア ０発　明　者　　ロバート　ジエー、ギ　　アエレテイ
　　　　　　　　　ユ メリカ合衆国、　１９１５１　　ペンシルヴアニア、オ
ーヴアールツク　ヒルズ、エッジヴエイル　ロード　１
４０アメリ力合衆国、　１９３０１　　ペンシルヴアニ
ア、パオリ、フッゲス　マノ−レーン　６ メリカ合衆国、　１９００２　　ペンシルヴアニア、ロ
アー　ギイネツド、ストーンブリッジ　ロード　１００
３手続補正書 平に１ｉ、１年６月２８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、９５％以上の精製純度を持つ酵母組換え体ｇａｇプ
   レカーサー及び同等の純度を有するそのバリアント。 ２、当該プレカーサーがミリストイル化されている請求
   項１記載のｇａｇプレカーサー。３、虫による組換え体
   ｇａｇプレカーサー。 ４、実施例９の第III表で示されている配列を有する請
   求項１、２、あるいは３記載のｇａｇプレカーサー。 ５、第１表中に示されている数種の抗ウィルス剤、イム
   ノモデュレーター、抗生物質質あるいはワクチンなどと
   併用される請求項１、２、あるいは３記載のｇａｇプレ
   カーサー。６、第１表中に示されている数種の抗ウィル
   ス剤、イムノモデュレーター、抗生物質、あるいはワク
   チンなどと併用される当該ｇａｇプレカーサーが実施例
   ９の第III表で示されている配列を有する請求項１、２
   、あるいは３記載のｇａｇプレカーサー。 ７、９５％以上の精製純度を持つ酵母由来組換え体ｇａ
   ｇプレカーサー、あるいは同等の純度を有するそのバリ
   アント及び適切な免疫学的アジュバントより成るＡＩＤ
   Ｓワクチンであり、当該ワクチンはｇａｇプレカーサー
   に対する特異的抗体を産生しうるものであるＡＩＤＳワ
   クチン。 ８、ＡＩＤＳに対して有効である酵母由来組換え体ｇａ
   ｇプレカーサー、あるいはそのバリアント。 ９、虫由来組換え体ｇａｇプレカーサー、あるいはその
   バリアント及び適切な免疫学的アジュバントより成るＡ
   ＩＤＳワクチンであり、当該ワクチンはｇａｇプレカー
   サーに対する特異的抗体を産生しうるものであるＡＩＤ
   Ｓワクチン。 １０、ＡＩＤＳに対して有用である昆虫由来組換え体ｇ
   ａｇプレカーサー、あるいはそのバリアント。 １１、９５％以上の精製純度をもつ組換え体ｇａｇプレ
   カーサー、あるいは同等の純度を有するそのバリアント
   及び適切な賦形剤より成る ＡＩＤＳワクチンであり、当該ワクチンは ＨＩＶ感染あるいは疾患に対して予防あるいは治療の為
   にプレあるいはポスト的な手段として用いられるもので
   あり、ｇａｇプレカーサーに対する特異的抗体を産生し
   うるものであるＡＩＤＳワクチン。 １２、組換え体ｇａｇプレカーサーが酵母の発現系にお
   いて産生される請求項１１記載のＡＩＤＳワクチン。 １３、酵母の発現系とはＵ９＃１−５である請求項１２
   記載のＡＩＤＳワクチン。 １４、組換え体ｇａｇプレカーサーが虫の発現系におい
   て産生される請求項１１記載のＡＩＤＳワクチン。 １５、当該ワクチンがｇａｇプレカーサーの免疫原性を
   高めるために一つ以上の抗原決定基を含む請求項１１記
   載のＡＩＤＳワクチン。 １６、当該抗原決定基が本質的にＴ−細胞のアミノ酸配
   列より成る請求項１５記載のＡＩＤＳワクチン。 １７、当該賦形剤がアジュバントより成る請求項１１記
   載のＡＩＤＳワクチン。 １８、当該ｇａｇプレカーサーあるいはそのバリアント
   が粒状あるいは凝集形成している請求項１１記載のＡＩ
   ＤＳワクチン。 １９、適切なアジュバントと伴に９５％以上の精製純度
   を持つ酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーよりなるＡ
   ＩＤＳワクチンであり、当該ｇａｇプレカーサーは酵母
   発現系Ｕ９＃１−５より産生され、当該ワクチンはＨＩ
   Ｖ感染あるいは疾患に対して予防あるいは治療の為にプ
   レあるいはポスト的な手段として用いられ、血清型Ｎｅ
   ｗＹｏｒｋ＃５のＨＩＶのｇａｇｐ５５に対して抗異的
   な抗体を産生しうるものであるＡＩＤＳワクチン。 ２０、第１表中に示されている数種の抗ウィルス剤、イ
   ムノモデュレーター、抗生物質あるいはワクチンなどと
   併用投与される請求項７、９、１１、１２、１３、１４
   、１５、１６、１７、１８、あるいは１９記載のＡＩＤ
   Ｓワクチン。 ２１、９５％以上の精製純度を持つ酵母由来組換え体ｇ
   ａｇプレカーサータンパク質あるいはそのバリアントタ
   ンパク質を得る為の精製方法であり、 （ａ）不純物を除去した凍結酵母抽出物の融解、当該酵
   母抽出物とは、組換え体酵母発現系において発現された
   酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサータンパク質あるい
   はそのバリアントタンパク質を含むもの、 （ｂ）少なくとも約２４時間に及ぶ凍結によるｇａｇプ
   レカーサーの沈殿物形成。 （ｃ）沈殿物形成したｇａｇプレカーサーの遠心による
   沈降化、及び引き続きその沈降物と上清液との分離。 （ｄ）膜及び不必要な膜結合タンパク質を可溶化するの
   に効果的な溶液とその沈降物を混合、 （ｅ）第二沈降物形成の為の遠心によるｇａｇプレカー
   サーの再沈降化、及び引き続きその第二沈降物と上清液
   との分離、 （ｆ）ｇａｇプレカーサータンパク質を可溶化するのに
   効果的な溶液で上記ステップにおける沈降物を溶解、変
   性沈降物とし、及び （ｇ）その変性沈降物を疎水性相互作用クロマトグラフ
   ィーにかけ、そこからｇａｇプレカーサーを分画分離し
   、これにより９５％以上の精製純度を持つ酵母由来組換
   え体ｇａｇプレカーサーあるいは同等の純度を有するそ
   のバリアントを獲得するというステップよりなる精製方
   法。 ２２、更に請求項２１記載中のステップ（ｅ）及びステ
   ップ（ｆ）の間で洗浄過程を加えるところの請求項２１
   記載の方法で、 （ｅ１）第二沈降物を緩衝溶液あるいは膜及び不必要な
   膜結合タンパク質を可溶化するのに効果的な溶液と混合
   、及び （ｅ２）第三沈降物形成の為の遠心によるｇａｇプレカ
   ーサーの再沈降化、及び引き続きその第三沈降物と上清
   液との分離よりなる精製方法。 ２３、酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーあるいはそ
   のバリアントの水−可溶性調製物としての精製方法であ
   り、 （ａ）十分に精製された凝集ｇａｇタンパク質あるいは
   そのバリアントのタンパク質部分を集め、そして （ｂ）そのタンパク質を逆相高速液体クロマトグラフィ
   ーにかけ、十分に精製された水−可溶性の酵母由来組換
   え体ｇａｇプレカーサーあるいは同等の精製純度を持つ
   その水−可溶性バリアントを得るステップよりなる精製
   方法。 ２４、更に請求項２１記載中のステップ（ｇ）の後に、
   以下のステップを加える請求項２１記載の方法であり、 （ｈ）ステップ（ｇ）における分画、物を集め、そして （ｉ）その集めた分画物を逆相高速液体クロマトグラフ
   ィーにかけ、９５％以上の精製純度を持つ水−可溶性の
   酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーあるいは同等の純
   度を有するその水−可溶性バリアントを得るステップを
   加える精製方法。 ２５、酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーあるいはそ
   のバリアントの水−可溶性調製物としての精製方法であ
   り、 （ａ）十分に精製された凝集ｇａｇタンパク質あるいは
   そのバリアントのタンパク質部分を集め、そして （ｂ）そのタンパク質を有機溶媒相におけるゲル濾過ク
   ロマトグラフィーにかけ、十分に精製された水−可溶性
   の酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーあるいは同等の
   精製純度を持つその水−可溶性バリアントを得るステッ
   プより成る精製方法。 ２６、更に請求項２１記載中のステップ（ｇ）の後に、
   以下のステップを加えるところの請求項２１記載の方法
   であり、 （ｈ）ステップ（ｇ）における分画物を集め、そして （ｉ）その集めた分画物を有機溶媒相におけるゲル濾過
   クロマトグラフィーにかけ、９５％以上の精製純度を持
   つ水−可溶性の酵母由来組換え体ｇａｇプレカーサーあ
   るいは同等の純度を有するその水−可溶性バリアントを
   得るステップを加えることよりなる精製方法。 ２７、９５％以上の精製純度を持つ、請求項２１、２２
   、２３、２４、２５、あるいは２６記載の方法により精
   製された、酵母由来の精製組換え体ｇａｇプレカーサー
   あるいは同等の純度を有するそのバリアント。 ２８、９５％以上の精製純度を持ち、実施例９の第III
   表で示されるアミノ酸配列を有する、請求項２１−２６
   記載の方法で精製された、酵母由来の精製組換え体ｇａ
   ｇプレカーサーあるいはそのフラグメント。