NO891691L - Rekombinant gag-forloeper for hiv. - Google Patents

Rekombinant gag-forloeper for hiv.

Info

Publication number
NO891691L
NO891691L NO89891691A NO891691A NO891691L NO 891691 L NO891691 L NO 891691L NO 89891691 A NO89891691 A NO 89891691A NO 891691 A NO891691 A NO 891691A NO 891691 L NO891691 L NO 891691L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
gag precursor
gag
yeast
precursor
recombinant
Prior art date
Application number
NO89891691A
Other languages
English (en)
Other versions
NO891691D0 (no
Inventor
George P Vlasuk
Mark A Polokoff
Richard A F Dixon
Kathryn J Hofmann
Loren D Schultz
Melvin Silberklang
Ronald W Ellis
Emilio A Emini
Robert J Gerety
Original Assignee
Merck & Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck & Co Inc filed Critical Merck & Co Inc
Publication of NO891691D0 publication Critical patent/NO891691D0/no
Publication of NO891691L publication Critical patent/NO891691L/no

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

AIDS-vaksine omfattende gjær-rekombinant gag-forl*per ned en renhet over 95% i en egnet adjuvans, hvilken gag-forløper er blitt produsert fra gjær-ekspresjonssystea U9 nr. 5-1, hvilken vaksine skal anvendes for pre-eiler post-eksponering for å forhindre eller behandle HIV-infeksjon eller sykdom, hvilken vaksine er i stand til å produsere antistoffer spesifikke for gag p55 av HIV, serotype Hev York nr. 5.

Description

Ervervet immunsvekkende syndrom (AIDS) er den kliniske manifestasjon av den tilsynelatende infeksjon av CD4-hjelper-T-celler med humant immunsvekkende virus (HIV), også tidligere angitt som humant T-lymfotropisk virus type III (HTLV-III), lymfadenopati-assosiert virus (LAV) eller AIDS-beslektet virus (ARV) (heretter kollektivt angitt "HIV"). AIDS er en overførbar mangel på cellulær immunitetkarakterisertved opportunistiske infeksjoner og visse ondartetheter. En lign-
ende sykdom, AIDS-beslektet kompleks (ARC), deler mange av de epidemiologiske trekk og immun-unormaliteter med AIDS, og går ofte forut for de kliniske manifestasjoner av AIDS.
En vaksine mot AIDS og/eller ARC er en ideell profyl-aktisk behandling for å forhindre de nedbrytende effekter av infeksjon med HIV. Det er funnet et immunogen som er anvendbart for en slik vaksine såvel som metoder for rensing av rekombinante former av immunogenet. Immunogenet er gag-forløperpolypeptidet i rekombinant form.
Mange av detaljene ved den genetiske funksjon og virione struktur av HIV er ennå ikke blitt kartlagt. Imidlertid har visse generelle trekk kommet til syne. Et RNA-virus med et genom totalt på ca. 9 kilobaser (kb), og dets nucleo-tidsekvens inneholder syv hoved åpne leserammer (ORF) svar-ende til gag-, pol- og env-, sor-, tat-, art/ trs- og 3' orf-genene. Terminale gjentagelser i nucleotidsekvensen er vanlige for mange retrovirus som HIV, og er nødvendige for viral replikasjon og integrering i vertkromosomet. Mer nylige diskusjoner vedrørende den generelle art av HIV genomisk struktur, replikasjon og regulering finnes i Råtner, L. et al., "Human T-Lymphotropic Retroviruses", i 0'Brien, S;J. (red.), Genetic Maps 1987, Cold Spring Harbor 1987, s. 124-129; Franchini, G. et al., Nature 328, 539 (1987) og Chen, I.S.Y., Cell 47, 1 (1986).
HIV-proteinene som opprinnelig translateres fra
genene gag, pol og env, fremkommer som polyproteinfusjons-produkter. Etter følgende proteolytisk bearbeidelse resulterer i strukturelle proteiner av viruset såvel som virale enzymer. I visse stammer av HIV fremkommer gag-polyprotein-
fusjonsproduktet som en p55 gag-forløper som deretter proteolytisk spaltes med en virus-kodet protease i gag p24, gag pl7 og gag pl5 under virusets livssyklus. Det finnes bevis for at leilighetsvis rammeskifting under translasjon eller en annen mekanisme enkelte ganger fører til et gigantisk gag-pol-polyproteinfusjonsprodukt. I HIV koder det enzymatiske sete som katalyserer proteolytisk bearbeidelse av et strekk av nucleotider beliggende ca. 250-265 nucleotidbaser innen pol, nedstrøms og 3<1>av translasjonsstoppkodonet for gag-genet.
Tidlig interesse vedrørende gag-regionen av HIV-genomet ble sentrert om analyse av polyproteinfusjonsproduktet kodet derfra, såvel som konstruksjonen av en screenings-bestemmelse for AIDS antivirale forbindelser. For å syn-tetisere store mengder av substrat ble rekombinant gag-forløper uttrykt av foreliggende søkere i gjær uten produksjon av HIV-protease.
Foreliggende søkere er oppdagere av anvendelsen av gag-forløperproteindeterminanter som anvendbare immunogener. Denne oppdagelse står i motsetning til den vanlige oppfat-ning at overflateregioner av et patogen slik som et retrovirus, er det eneste sete som er effektivt for immunisering av verten mot en patogen mikroorganisme eller virus. HIV-gag-forløperen inneholder indre komponenter av viruset, og disse er ikke tilgjengelige for antistoff i motsetning til f.eks. omhyllingsproteinet på overflaten av HIV. Det var ikke forventet at gag-forløperdeterminanter i seg selv er anvendbare som en vaksine mot AIDS. Foreliggende søkere isolerte opprinnelig gag-forløperen ifølge oppfinnelsen for det fullstendig forskjellige formål å fremstille et substrat for en proteolytisk bearbeidelsesbestemmelse.
Hovedmålet med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av rekombinant gag-forløperprotein som en AIDS-vaksine. Metoder er beskrevet for fremstilling av en ny, vannløselig form av det rekombinante protein i store mengder. Produktet av disse metoder er også anvendbart som et screenings-
middel i bestemmelser for antivirale midler.
Rensing av rekombinante proteiner krever hyppig nye metoder eller nye kombinasjoner av gamle metoder, da sammen-setningen av kilden for rekombinante former, f.eks. gjær,
er forskjellig fra konvensjonelle kilder, f.eks. serum. Man kan ikke forutsi hvilke metoder som er anvendbare for isolering av proteiner fra rekombinante cellekulturer på basis av kjennskap og know-how til metoder som er anvendbare for isolering av proteiner fra klassiske eller på annen måte konvensjonelle kilder. Renseprosesser konstruert for fremstilling av vaksiner, krever uvanlig renhet i produktet, en annen indikasjon på uforutsigeligheten innen faget. Se U.S. patentskrift 4.624.918 med hensyn til et lignende syns-punkt.
Oppfinnelsen angår gjærprotein-rekombinant gag-forløper med mer enn 95% renhet eller like ren variant derav. Forsøk viser at dette protein er myristoylert og derfor forskjellig i minst ett henseende fra E. coli-produsert rekombinant gag-forløper. Rekombinant gag-forløper uttrykkes alternativt i et rekombinant insekt-ekspresjonssystem. Den rensede gag-forløper er anvendbar som en vaksine og i kommersielle bestemmelser av AIDS viral protease.
Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for rensing av gjærprotein-rekombinant gag-forløper eller variant derav, omfattende trinnene
(a) tilveiebringelse av en mengde av klaret gjærekstrakt, hvilken gjærekstrakt inneholder gjær-rekombinant gag-forløper eller variant derav, uttrykt i et rekombinant gjærekspresjonssytem, (b) utfelling av gag-forløperen ved frysing i en periode på minst 24 timer; (c) pelletisering ved sentrifugering av den dannede utfelte gag-forløper og deretter separering av pelleten fra supernatanten; (d) blanding av pelleten med en løsning som er effektiv for oppløseliggjøring av membraner og uønskede membranbundne proteiner; (e) repelletisering av gag-forløperen ved sentrifugering under dannelse av en andre pellet og deretter separering av den andre pellet fra supernatanten;
(f) oppløsning av pelleten fra det foregående trinn
i en løsning som er effektiv for å oppløse gag-forløperen, under dannelse av en denaturert pellet; og (g) den denaturerte pellet underkastes hydrofob interaksjonskromatografi og fraksjoner med gag-forløper deri isoleres, under dannelse av hovedsakelig renset gjær rekombinant gag-forløper eller renset variant derav. Gag-forløperen gjøres deretter vannløselig ved omvendt fase-høytrykksvæskekromatografi (RP-HPLC) eller gelfiltreringskromatografi i en organisk fase. Den rensede gag-forløper er anvendbar som en vaksine og i kommersielle bestemmelser av AIDS viral protease.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1: Renseskjema for rekombinant gag-forløper med omvendt
fase-høytrykksvæskekromatografi.
Fig. 2: Renseskjema for rekombinant gag-forløper med gelfiltreringskromatografi i den organiske fase.
Forkortelser og definisjoner
AIDS Ervervet immunsvekkende syndrom
ARC AIDS-beslektet kompleks
bp basepar
gag p55 Gag-forløperen av HIV, serotype
New York nr. 5, med en mobilitet på geler på ca. 55 KDa, også kjent som p55 gag.
gag-forløper Ethvert proteinprodukt av gag-genet av HIV, eller varianter derav. Som definert, inneholder gag-forløperen aldri den aminosyresekvens som virker
som en viral protease.
HIV Generisk uttrykk for det antatte etio-logiske middel av AIDS, også angitt
som stammer HTLV-III, LAV og ARV.
kDa Kilodalton
kb Kilobaser
ORF Åpen leseramme
Rekombinant
protein: Et polypeptid eller oligopeptid uttrykt av fremmed DNA i et rekombinant eukaryotisk eller prokaryotisk eks-presjonssytem, eksempelvis gjær-rekombinant gag-forløper av HIV. Rekombinant eukary-
otisk ekspresjons-
system: En eukaryotisk celle inneholdende et fremmed DNA som uttrykker et fremmed protein eller et fremmed oligopeptid, f.eks. U9 nr. 5-1 i foreliggende søknad.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Gag- forløper, p55, og dens varianter
Det spesifikke protein anvendt for illustrative formål ved foreliggende oppfinnelse, er den rekombinante gag-forløper av HIV, serotype New York, nr. 5, uttrykt i et rekombinant gjærekspresjonssytem. Ifølge konvensjonelle regler er proteiner også angitt ved tilsynelatende mobilitet på denaturerende geler. I dette tilfelle vandrer den bestemte rekombinante gag-forløper til en posisjon tilnærmet lik 55 kDA slik at dens alternative betegnelse er p55, hvori "p" indikerer protein.
Det vil fremgå for fagmannen at foreliggende oppfinn-elses lære er lett å tilpasse til enhver gag-forløper av enhver stamme av HIV forutsatt at gag-forløperen ikke inneholder virale aminosyresekvenser som proteolytisk splitter seg selv.
Eksempelvis ble HIV-klonet ifølge oppfinnelsen splittet ved et innført Smal-sete umiddelbart nedstrøms gag-translasjonsstoppkodonet slik at HIV-aminosyresekvensene med proteolytisk aktivitet aldri fremkom i noen gag-forløper-ekspresjonssytem. Ved hjelp av samme prinsipp kan lokaliser-ingen av de virale proteasesekvenser som har proteolytisk aktivitet, fastslås ved analyse av nucleotidsekvensen av enhver HIV-stamme. DNA-klonet kan deretter kuttes for effektivt å eliminere enhver interfererende proteolytisk sekvens etter dens translasjon i et rekombinant ekspresjonssystem. Gag-forløperen ifølge oppfinnelsen er ikke avledet fra pol-eller env-regionene, bortsett fra for overlappingsregionen mellom gag og pol (ca. 230 bp).
Det skal forstås at de nye fremgangsmåter og prod-ukter ifølge oppfinnelsen omfatter et område av uttrykte, rekombinante gag-forløpere. Fremgangsmåtene og produktene ifølge foreliggende oppfinnelse er også konstruert til å tilveiebringe hurtige og effektive metoder for fremstilling av vaksiner inneholdende varianter av gag-forløper. Eksempelvis vil variasjoner med konservativ substitusjon i aminosyresekvensen [definert som angitt i tabell 1 i Taylor, W.R., J. Mol. Biol. 188, 233 (1986)] generelt ikke resultere i noen vesentlig eller ny modifikasjon av prinsipper og praksis ved foreliggende oppfinnelse. Alternativt vil ute-latelser innen de kodende regioner ikke generelt kreve noen modifikasjoner av fremgangsmåtene for fremstilling av vaksiner som diskutert her. Ytterligere andre variasjoner oppstår via post-translasjonelle modifikasjoner, og innbefatter proteolytisk bearbeidelse, adenylering, carboxyler-ing, glycosylering, hydroxylering, methylering, fosforylering eller myristoylering. Det skal forstås at gag-forløper eller variant derav ifølge oppfinnelsen innbefatter hvilke som helst slike variasjoner eller deler av aminosyresekvensen, enten denne er foretatt ved konservativ aminosyresubstitusjon, utelatelse, post-translasjonell bearbeidelse, ribosom-rammeskiftning eller andre prosesser, forutsatt at den resulterende gag-forløper eller variant derav er immunokjemisk reaktiv med antistoffer spesifikke for gag p55 av HIV, serotype New York nr. 5.
Eukaryotiske ekspresjonssystemer
Det er nå en relativt enkel teknologi å fremstille eukaryotiske celler som uttrykker et fremmed gen. Slike eukaryotiske celler virker som verter og innbefatter gjær, fungi, planteceller og dyreceller. Ekspresjonsvektorer for mange av disse vertceller er blitt isolert ogkarakterisertog anvendes som utgangsmaterialer ved konstruksjonen, via konvensjonelle rekombinante DNA-teknikker, av vektorer med et fremmed DNA-innskudd av interesse. Ethvert DNA er fremmed hvis det ikke naturlig er avledet fra vertcellene anvendt for å uttrykke DNA-innskuddet. Det fremmede DNA-innskudd kan uttrykkes på ekstrakromosomale plasmider eller etter integrering helt eller delvis i vertcellekromosomene, eller kan virkelig eksistere i vertcellen som en kombinasjon av mer enn én molekylær form. Valget av vertcelle og ekspresjonsvektor for ekspresjonen av et ønsket fremmed DNA avhenger i stor grad av tilgjengeligheten av vertcellen og hvor kresen den er, hvorvidt vertcellen vil understøtte replikasjonen av ekspresjonsvektoren, og andre faktorer velkjente av fagmannen, slik som spleising av sekretoriske sekvenser på det strukturelle geninnskudd med det formål å oppnå enklere måter for rensing av det ønskede rekombinante protein, eller innskudd i ekspresjonsvektoren av transaktiverende sekvenser.
Det fremmede DNA-innskudd av interesse omfatter en hvilken som helst DNA-sekvens som koder for gag-forløper eller varianter derav, innbefattende enhver syntetisk sekvens med denne kodende kapasitet eller enhver slik klonet sekvens eller kombinasjon derav. Eksempelvis er et gag-forløper- protein kodet og uttrykt av en fullstendig syntetisk DNA-sekvens omfattet av foreliggende oppfinnelse. Gag-forløper-DNA er nå tilgjengelig, f.eks. ATCC deponeringsnr. CRL 8543.
Ekspresjonsvektorer
Anvendbare vektorer for konstruksjon av eukaryotiske ekspresjonssystemer for produksjon av rekombinant gag-forløper omfatter DNA-sekvensen for gag-forløper eller variant derav, operativt kjedet dertil med egnede transkripsjonene aktiver-ings-DNA-sekvenser, slik som en promoter og/eller operator. Andre typiske trekk kan innbefatte egnede ribosombindings-seter, termineringskodoner, forøkere, terminatorer eller replikonelementer. Disse ytterligere trekk kan være innskudd i vektoren ved det egnede sete eller seter ved konvensjonelle spleiseteknikker slik som restriksjonsendonucleaseoppslutning og ligering.
Det rekombinante gjærekspresjonssystem eksemplifisert her, ble valgt av foreliggende søkere av hensiktsmessige grunner. Gjærvektor pKHl2-2 ble konstruert ved innføyelse av et 1.5 kb BamHI- Smal gag-fragment av DNA i gjærekspresjons-vektoren pCl/1-pGAP(B)tADHl. Smal-setet ble innført ved sete-rettet mutagenese ved en lokalisering 5 bp nedstrøms og 3<1>av termineringskodonet av gag-regionen. Således er det typiske rekombinante protein uttrykt i gjærcellen med denne spesifikke konstruksjon, en gag-forløper med full lengde som er ubearbeidet på grunn av fravær av HIV-proteaser i gjærcellen. Proteolytisk bearbeidelse kan finne sted ved nærvær av endogene gjærproteaser, og det er innlysende at foreliggende oppfinnelse omfatter de resulterende fragmenter utviklet dertil, forutsatt at de fremdeles er store nok til å immunokjemisk reagere med antistoffer spesifikke for en nativ eller naturlig form av gag-forløper.
Gjærekspresjonssystemer som er et utall av rekombinante eukaryotiske ekspresjonssystemer, anvender generelt Saccharomyces cerevisiae som den valgte art for ekspresjon av rekombinante proteiner. Imidlertid vil det være innlysende for fagmannen at for ekspresjon av gag-for- løperen vil valg av en vertstamme eller celle også strekke seg til arter fra andre slekter av gjær innen familiene Saccharomycetaceae og Cryptococcaceae, innbefattende, men ikke begrenset til Pichia, Candida, Hansenula, Torulopsis, Kluyveromyces og Saccharomycopsis. På lignende måte vil valg av en vertstamme eller celle også strekke seg til andre arter av slekten Saccharomyces. Mange av artene av denne slekt er i stand til å krysses med S. cerevisiae og utviser sannsynligvis promotorer som er analoge eller identiske med promotorer i S. cerevisiae, innbefattende, men ikke begrenset til, GAP491, GAL10, ADH2, og/eller alfa-tilpassende faktor-promotorer. Det vil således være innlysende for fagmannen at for ekspresjonen av rekombinante gag-forløper-polypeptider vil valg av vertstamme strekke seg ut til andre arter av slekten Saccharomyces, innbefattende, men ikke begrenset til carlsbergensis, uvarum, rouxii, montanus, kluyveri, elongisporus, norbensis, oviformis og diastaticus.
Gjærvektorer som er anvendbare for konstruksjon av rekombinante gjærekspresjonssystemer for ekspresjon av gag-forløper, innbefatter, men er ikke begrenset til, skyttel-vektorer, kosmidplasmider, chimere plasmider, og de med sekvenser avledet fra 2-mikrons sirkelplasmider. Et utall av promotorer og andre gjær-transkripsjonelle kontroll-sekvenser kan anvendes for å uttrykke den innskutte DNA-sekvens som koder for gag-forløper, innbefattende de av GAP491, GAL10, ADHI eller ADHII, PH05 og den alfa-tilpassende faktor. Følgende liste av gjærvektorer er bare angitt for illustrative formål:
pAAH5
pAH5
pAAR6
pFRPn
pGALlO-MFal
pJC197
pMA56
pABADE8
pAXall
pAH9
pAHIO
pAH21
pMAC561
pLG669
pMA91
pMA301
pYEHBs
pAM82.
Innføyning av den egnede DNA-sekvens som koder for gag-forløper eller variant derav, i disse vektorer, vil i prinsipp resultere i et anvendbart rekombinant gjærekspresjonssystem for gag-forløper hvor den modifiserte vektor er innskutt i den egnede vertcelle ved transformasjon eller andre midler.
Rekombinante pattedyrekspresjonssystemer er et annet middel for fremstilling av den rekombinante gag-forløper ifølge oppfinnelsen. Generelt kan en pattedyrvertcelle være en hvilken som helst celle som er blitt effektivt klonet i cellekultur. En ekspresjonsvektor for pattedyrceller skal ha en selekterbar markør, slik som neo-genet som bevirker resistens overfor visse antibiotika, slik at nærvær av vektoren i cellen kan påvises. DNA-formidlet transfeksjon, transveksjon eller transformasjon av cellen kan utføres ved f.eks. calciumfosfatteknikken, elektroporering eller mikro-injeksjon. Transaktiverende sekvenser kan være nødvendig for praktisk talt fullstendig ekspresjon, og deres innføy-else i egnede vektorer er en vanlig modifikasjon av foreliggende oppfinnelse.
Pattedyrvertceller som er anvendbare for det formål
å konstruere et rekombinant pattedyrekspresjonssystem, innbefatter, men er ikke begrenset til, Vero-celler, NIH3T3-, GH3-, COS-,murine C-127- eller muse-L-celler. Pattedyr-ekspres jonsvektorer kan være basert på virusvektorer, plasmid-vektorer som kan ha SV40, BPV eller andre virale replikoner, eller vektorer uten et replikon for animalske celler. Detaljerte diskusjoner vedrørende pattedyrekspresjonsvektorer
kan finnes i Gluzman, Y. (red.) "Eukaryotic Viral Vectors", Cold Spring Harbor Laboratory 1982; Pouwels, P.H. et al., "Cloning Vectors: A Laboratory Manual" Elsevier 1985;
Rigby, P.W.J., J. Gen. Virol. 6A, 255 (1983), Subramani, S.
et al., Anal. Biochem. 135, 1 (1983); og Glover, E.M. (red.) "DNA Cloning: A Practical Approach", IRL 1983, vol. I og II.
Rensing av gag- forløper
For å motvirke ustabilitet og nedbrytning av gag-forløperen under renseprosedyrene innbefatter buffere generelt proteaseinhibitorer slik som fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) eller EDTA. De foretrukne inhibitorer er EDTA
i kombinasjon med benzamidin, pepstatin, aprotinin, PMSF og E-64.
Typiske proteaseinhibitorer egnet for prosedyrer og protokoller ifølge oppfinnelsen, innbefatter metall-chelaterende midler, tungmetallioner, SH-blokkerende reagenser, substrat-lignende forbindelser av proteaser eller polypeptider som inhiberer proteaser. Enkelte anvendbare proteaseinhibitorer er som følger:
Ag++, Hg++, Cu++ og andre tungmetallioner
antithrombin III
antithrombin III - heparin
a-^-antitrypsin
aprotinin
basiske aminosyrer
benzamidin
bestatin
a,a 1-bipyridyl, Na-fluorid
4-brom-fenacylbromid
kyllingeggehvite-trypsininhibitor
chymostatin
citrat
cystein
4-dinitrofenol-diethylfosfat
DFP (diisopropylfosfofluoridat)
DTT (dithiothreitol)
E-64 [ trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidin)-butan, Boehringer Mannheim]
EDTA og andre chalterende midler
formaldehyd
guanidiniumklorid
heparin
hirudin
4-hydroxykvikksølvbenzoat
jodacetamid
jod-eddiksyre
leupeptin
c^-makroglobulin
mercaptoethanol
p-kvikksølvbenzoat
kvikksølvklorid
a-mikroglobulin
a-N-(p-nitrobenzyl-oxycarbonyl)-L-arginylklormethylketon oxalat
pepstatin fra et utall kilder, innbefattende Streptomyces 1,10-fenanthrolin
2-fenanthrolin
fenothiazin-N-carbonylklorid
fosforamidon
PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid)
pyrofosfat
SH-blokkerende reagenser
sølvnitrat
soyabønne-trypsininhibitor
p-toluensulfonylfluorid
TLCK(L-l-klor-3-(4-tosylamido)-7-amino-2-heptanon-hydro-klorid)
Triton<®>X-100 og andre detergenter ved lave konsentrasjoner TPCK(L-l-klor-3-(4-tosylamido)-4-fenyl-2-butanon) trypsininhibitor fra hønseegg
ZPCK (benzyloxycarbonyl-L-fenylalanin)
Bufrede løsninger inneholdende én eller flere av de angitte inhibitorer, kan tilpasses ett eller flere trinn ved fremgangsmåten for rensing av gag-forløperen. En foretrukket buffer egnet for rensing av gag-forløperen, inneholder EDTA, benzamidin, pepstatin A, aprotinin, PMSF og E-64.
Gjærklaret ekstrakt
Gjærceller transformert med ekspresjonsvektorer som koder for gag-forløper, p55, eller varianter derav, dyrkes og høstes. Hvis lagring av cellene er ønskelig, vaskes cellene i buffer, f.eks. PBS [fosfatbufret saltvann bestående hovedsakelig av 1 mM CaCl2(vannfri), 2,7 mM KC1, 1,47 mM KH2P04, 0,5 mM MgCl2-6H20, 137 mM NaCl, 8,06 mM Na2HP04-7H20 i vann] under dannelse av en cellepasta. Lagring av cellepastaen foretas typisk ved frysing i flytende N2<Rensingen starter typisk som følger. En sats av fryst cellepasta tines og suspenderes i buffer inneholdende proteolytiske inhibitorer, f.eks. PBS i 2 mM PMSF, hypertoniske fosfatbuffere, fortrinnsvis reagens 3 [0,1 M HEPES pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM benzamidin, 1,0 yg/ml pepstatin A, 0,13 trypsin-
Inhiberende Enheter (TIU)/ml aprotinin, 2 mM PMSF, 0,1 mM trans-epoxysucciny1-L-leucylamido-(4-guanidino)-butan].
Lave temperaturbetingelser, f.eks. 4°C, er også foretrukket for å nedsette til et minimum enhver rest endogen proteolytisk aktivitet. Cellene oppbrytes deretter, fortrinnsvis på mekanisk måte. Et utall av kommersielt tilgjengelige celleoppbrytere og fluidiserere er egnet og lett tilpassbare.
Gjærcelleoppbrytningen resulterer i et råekstrakt. Det er nødvendig ved dette punkt å klare ekstrakten ved fjerning av cellerester slik at mekanisk sammenklumpning i etterfølgende rensetrinn unngås. Sentrifugering ved ca. 14.000 x g i 45 minutter ved 4°C er blitt funnet å være tilstrekkelig, men det skal forstås at forskjellige sentri-fugeringshastigheter i forskjellige tidsrom ved forskjellige temperaturer også er mulig. Nærværet av gag-forløperen kan bestemmes ved denaturerende geler kombinert med immunoblotting.
Ytterligere trinn ved renseprosessen utføres på 14.000 x g supernatanten, også betegnet som klaret gjær ekstrakt. Pelleten kastes bortsett fra når prøvene bibeholdes for analytiske bestemmelser. Den klarede gjærekstrakt fryses rutinemessig ved -70°C. Foreliggende søkere har funnet at det totale utbytte forbedres hvis den klarede ekstrakt lagres ved -70°C i lange tidsperioder, dvs. minst 24 timer, fortrinnsvis minst 72 timer.
Denaturert pellet
Foreliggende søkere har også oppdaget at frysing av den klarede gjærekstrakt i minst 24 timer resulterer i spontant utfelt gag-forløper slik at enkel sentrifugering eller pelletisering av den tinede ekstrakt resulterer i hovedsakelig rensing. Etter tining av den fryste, klarede gjærekstrakt utføres suksessive trinn for pelletisering etterfulgt av homogenisering av pelleten i forskjellige buffere, med eller uten detergenter for å vaske den utfelte gag-forløper for å fjerne membraner, uønskede membranbundne proteiner og andre membranaktige materialer. Den resulterende vaskede pellet oppløseliggjøres deretter under dannelse av en denaturert pellet.
I det minste omfatter fremstilling av den denaturerte pellet som angitt i foregående avsnitt, følgende trinn: (a) tining av den fryste, klarede gjærekstrakt etter minst 24 timers frysing; (b) pelletisering av gag-forløperen ved sentrifugering ved mellom 10.000 x g og 100.000 x g i et tidsrom på mellom 10 minutter og 120 minutter, og deretter separering av supernatanten fra pelleten; og (c) blanding og homogenisering av pelleten med en bufret løsning som er effektiv for oppløseliggjøring av membraner og membranbundne proteiner. Løsningen omfatter typisk buffer med en detergent. (d) Repelletisering av gag-forløperen foretas deretter, og dette foretas ved sentrifugering ved mellom 10.000 x g og 100.000 x g i et tidsrom på mellom 10 minutter og 120 minutter, hvorpå supernatanten separeres fra pelleten, og (e) vasketrinnene i (c) og (d) supra gjentas 0-3 ganger med samme løsning, eller en forskjellig bufret detergent, eller buffer alene, eller en hvilken som helst kombinasjon derav. Produktet er en vasket pellet. (f) Den vaskede pellet oppløses i bufret denaturerende eller chaotropt middel under dannelse av en denaturert pellet som er klar for hydrofob interaksjonskromatografi.
Nærmere bestemt utføres tiningen som et første trinn [trinn (a) supra] generelt fortrinnsvis ved romtemperatur eller ved 37°C, men andre temperaturer i området 4 - 40°C er brukbare og innen oppfinnelsens ramme.
Sentrifugeringskrefter for pelletisering av gag-forløperen i henhold til trinn (b), (d) eller (e) kan varieres, såvel som rotasjonstid og temperatur. Det skal forstås at modifikasjoner i slike variabler ved pelletiseringsprosessen lett kan foretas, vanligvis ved visuell inspeksjon. I
trinn (c) supra er detergenten i den bufrede løsning for opp-løseligg jøring av membraner og membranbundne proteiner, en hvilken som helst egnet ikke-ionisk eller ionisk detergent, eller en hvilken som helst egnet kombinasjon derav, innbefattende detergenter av nonoxynolseriene, octoxynylseriene, polyoxyethylenalkoholseriene, polyoxyethylen (20)-sorbitan-mono-oleatseriene, deoxycholat eller octylglucopyranosid og lignende. Zwitterioniske detergenter er også anvendbare og egnede midler. Fortrinnsvis skal tilstrekkelig bufret løsning med detergent tilsettes til pelleten i trinn (c) under dannelse av en sluttkonsentrasjon på mellom 1% (w/v) og 10%
(w/v) octylfenoxypolyethoxyethanol (markedsført under vare-merket Triton<®>X-100). Fortrinnsvis er sluttkonsentrasjonen 5% (w/v) Triton<®>X-100, i reagens 3.
Så snart den vaskede pellet fra trinn (d) eller (e) er fremstilt, denatureres den i trinn (f) med et denatureringsmiddel eller chaotropt middel for å gjøre den egnet for neste trinn for hydrofob interaksjonskromatografi. Generelt er et hvilket som helst denatureringsmiddel av formel I egnet for denatureringsformål:
hvori
R er amino, lavere alkylthio, lavere alkyloxy eller svovel;
X er amino, svovel eller oxygen; og
Y er hydrogen eller amino.
Denne formel innbefatter guanidin«HC1hvori R er amino, X er amino og Y er hydrogen. Det foretrukne middel for denaturering av den vaskede pellet i trinn (f) er guanidin-HC1 ved konsentrasjoner mellom 2M og 8M i reagens 3, fortrinnsvis 6M. Etterfølgende fortynning av denaturerings-midlet kan utføres umiddelbart før hydrofob interaksjons-kromatograf i .
Hydrofob interaksjonskromatografi
Gag-forløperen i den denaturerte pellet renses nå ytterligere ved hydrofob interaksjon i kolonnekromatografi. Den foretrukne harpiks for dette formål er Fenyl-Sepharose<®>
(Pharmacia). Andre harpikser er også egnet og innbefatter f.eks. Octyl-Sepharose<®>(Pharmacia), Butyl-Sepharose<®>
(Pharmacia) og lignende derivater av agarose, slik som amino-alkylagarose fra Miles Research eller hexyl-agarose. Denatureringsmidler av formel I anvendes, fortrinnsvis guanidin HC1.
I en typisk protokoll ekvilibreres kolonnen i buffer eller fortrinnsvis bufret 2M guanidin HC1, hvoretter den denaturerte pellet innføres, kolonnen vaskes i buffer inntil elueringen når en grunnlinje med hensyn til absorbans. Kolonnen inneholdende gag-forløperen bundet dertil, fremkalles med en gradient av buffer i økende konsentrasjon av denatureringsmidler. Ettersom konsentrasjonen øker, finner det sted selektiv oppløseliggjøring. Fraksjoner fra kolonnen oppsamles og overvåkes med hensyn til nærvær av gag-forløper, f.eks. ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese eller Western blotting. Oppsamlede fraksjoner inneholder gag-forløper. På
Fenyl-Sepharose<®>elueres gjær-rekombinant gag-forløper ved ca. 3M guanidin HC1.
Vannløselig rekombinant gjær- gag- forløper
En annen oppdagelse er at bearbeidelse av proteinet ved dette trinn via omvendt fase-høytrykksvæskekromatografi (RP-HPLC) under bestemte betingelser resulterer i et vann-løselig gag-forløperprodukt. Det er også funnet at en erstatningsprotokoll med gelfiltrering under bestemte betingelser resulterer i et vannløselig gag-forløperprodukt.
A. RP-HPLC
Generelt kan en hvilken som helst omvendt fase-høytrykksvæskekromatografimetode under anvendelse av gradienteluering anvendes, forutsatt at kolonnen pakkes med egnede porøse partikler belagt med alkyl- eller fenylgrupper som virker som en ikke-polar stasjonær fase. C^, Cg, C-^g eller fenylgrupper er egnet for oppfinnelsens formål. C^g er den foretrukne gruppe.
Kolonnen ekvilibreres i en stasjonær fase på ca. 0,1%
(v/v) trifluoreddiksyre (TFA) i 20% (v/v) acetonitril i vann, som er typiske betingelser for RP-HPLC. Etter at prøven av oppsamlede fraksjoner er konsentrert og tilført kolonnen, fremkalles kolonnen med en mobil fase av samme konstitusjon som den stasjonære fase, men med en gradient av økende acetonitrilkonsentrasjon. Fraksjoner identifisert til å inneholde gag-forløper, oppsamles og tørkes deretter i vakuum og resuspenderes i sterilt destillert vann. Det resulterende protein er gag-forløper (^95%) som er løselig i vann eller IM urea.
Andre egnede stasjonære fase-mobile fasebetingelser innbefatter fosforsyre med acetonitrilgradienter på 10-40%; fosforsyre eller TFA med isopropanolgradienter. Andre modifikasjoner av HPLC som er anvendbare for fremstilling av vannløselig gag-forløper, erkjennes lett av fagmannen, og innbefatter følgende: anvendelse av andre kolonner, mobile faser, organiske faser; bestemmelse av vanninnhold i den mobile fase, ionestyrke, pH, temperatur; og vurdering av ione-par og ione-utvekslingseffekter. Se f.eks. Waterfield, M.D., "Separation of Mixtures of Proteins and Peptides by HPLC",
i Darbre, A. (red.), Practical Protein Chemistry, Wiley 1986, s. 181-205).
B. Gelfitrering i organiske løsningsmidler
Vannløselig gag-forløper kan også fremstilles ved gelfiltreringskromatografi i organiske løsningsmidler istedenfor RP-HPLC. Gelfiltreringsmatrisen må være forenlig med de anvendte organiske løsningsmidler. Enkelte av de egnede matriser innbefatter Sepharose<®>(Pharmacia), Sepharose<®>CL (Pharmacia), Sephacryl<®->baserte harpikser (Pharmacia), Sephadex<®>LH (Pharmacia), Sephasorb<®>(Pharmacia) og "Bio-Beads" S-X (Bio-Rad). De foretrukne matriser er Sephadex<®>LH eller enhver Sephacryl<®->basert harpiks, innbefattende Sephacryl<®>S-300 eller Sephacryl<®>S-200HR, hvor den sistnevnte har de mest foretrukne karakteristika for til-fredsstillende separering av protein fra guanidin HCl-salt-forurensninger.
I prinsippet kan et hvilket som helst organisk løs-ningsmiddel anvendes. Typisk innbefatter løsningsmidlet lave konsentrasjoner av en vandig syre slik som TFA eller fosforsyre, i organiske løsningsmidler slik som acetonitril, iso-propanol, methanol eller methylenklorid. Et foretrukket område for løsningsmiddelsystemer er 0,1% (v/v) TFA/>_30% acetonitril/H20. Det mest foretrukne løsningsmiddelsystem er ca. 0,1% (v/v) TFA/70% acetonitril/H20.
Ytterligere trinn
Andre konvensjonelle eller kjente trinn som normalt anvendes ved rensing av rekombinante proteiner, kan tilføyes fremgangsmåten for rensing av gag-forløperen. Disse trinn innbefatter: (a) selektiv adsorpsjon eller fordeling på en fast-fase, f.eks. silicagel, calciumfosfatcarbon, eller celitt-alumina; (b) selektiv ekstraksjon med løsningsmidler eller reagenser. Ekstraksjon med andre løsningsmidler eller reagenser for andre formål kan være nød-vendig i forskjellige trinn. (c) Utfelling er et annet trinn som er anvendbart for isolering av gag-forløper og kan utføres med salter slik som ammoniumsulfat, eller på en pH-gradient ved isoelektrisk utfelling. Andre metoder innbefatter (d) kromatografi ved en hvilken som helst standard-metode, innbefattende papir, tynnskikts-, molekylær sikt, molekylær eksklusjon, ionebytter, ligandaffinitet, immunoaffinitet eller ved elektroforese; (e) høytrykksvæskekromatografi ved størrelses-eksklusjon, adsorpsjon eller fordeling i den normale fase; (f) løsningsmiddeltraksjonering med to-fase-ekstrak-sjoner, f.eks. med PEG og dextran [Anderson, E. et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 413, 115 (1983)], (g) dialyse, ultrafiltrering, konsentrering eller diafiltrering; (h) densitetsgradientsentrifugering; (i) elektrofokusering;
(j) frysetørking, lyofilisering; eller (k) krystallisering.
Denne liste er på ingen måte utfyllende. Dens rekke-følge er ikke en indikasjon på den foretrukne rekkefølge for rensetrinn. Det skal forstås at en vellykket rensing av gag-forløperen kan utføres med et hvilket som helst eller alle trinn av (a)-(k) i forbindelse med utfelling ved frysing, hydrofob interaksjonskromatografi og vannoppløseliggjøring ved enten RP-HPLC eller gelfiltreringskromatografi i organiske faser. Trinn (a)-(k), såvel som andre renseteknikker, kan til-føyes som et ytterligere trinn ved et hvilket som helst punkt eller punkter ved høyrenseprosessen.
Vaksinene ifølge oppfinnelsen kan effektivt adminis-treres, enten ved perioder med preeksponering og/eller post-eksponering, i kombinasjon med effektive mengder AIDS-antivirale midler, immunmodulatorer, antibiotika eller vaksiner som angitt i etterfølgende tabell I [kilde: Market Letter,
30. nov. 1987, s. 26-27; Genetic Engineering News, jan. 1988, vol. 8, s. 23 ] .
"'"Forkortelser: AIDS (ervervet immunsvekkende syndrom); ARC (AIDS-beslektet kompleks); CMV (cytomegalovirus som forår-saker en opportunistisk infeksjon resulterende i blindhet eller død i AIDS-pasienter; HIV (humant immunsvekkende virus, tidligere kjent som LAV, HTLV-III eller ARV); KS (Kaposis sarcoma); PCP (Pneumonocystis carinii pneumonia, en opportunistisk infeksjon); PGL (vedvarende generalisert lymfadenopati).
D. Vaksiner
Hvilke som helst av et utall av AIDS- eller HIV-vaksiner som for tiden er til undersøkelse og utvikling, kan anvendes i kombinasjon med vaksinene ifølge oppfinnelsen ved behandling eller forhindring av AIDS og sykdommer av lignende karakter forårsaket av HIV.
Det skal forstås at rammen for kombinasjoner av vaksinene ifølge oppfinnelsen med AIDS-antivirale midler, immunmodulatorer, antibiotika eller vaksiner, ikke er begrenset til listen i den foregående tabell, men innbefatter i prinsipp enhver kombinasjon med et hvilket som helst farma-søytisk preparat anvendbart for behandling av AIDS. AIDS-eller HIV-vaksinene ifølge oppfinnelsen innbefatter vaksiner for å anvendes til pre- eller post-eksponering eller for å behandle HIV-infeksjon eller sykdom, og er i stand til å produsere en immunrespons som er spesifikk for immunogenet.
Formen av immunogenet innen vaksinen antar forskjellige molekylære konfigurasjoner, og en bærer, vektor eller adjuvans kan tilsettes som en immunologisk bærer i henhold til konvensjonell immunologisk testing og praksis. Eksempelvis er en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse den profylaktiske vaksinasjon av pasienter med en suspensjon av alunadjuvans som bærer og rekombinant gjær-gag-forløper (eller variant derav) som immunogen.
Det vil fremgå for fagmannen at immunogenet alternativt kan bestå av gag-forløper-aminosyresekvenser (eller variant derav) bundet, enten covalent eller ikke-covalent, til determinanter kjent for å forøke immunogenisitet. Slike determinanter er typisk aminosyresekvenser som fremkaller hjelper-T-celle, cytolytisk T-celle- eller B-celle-immunitet. Det er ønskelig å utelate aminosyresekvenser som fremkaller suppressor T-celleimmunitet. Et eksempel på disse determinanter er den Hepatitis B preS2 aminosyresekvens som er kjent for å forøke hjelper-T-celle- og B-celle-immunitet.
Så snart det er bestemt ved konvensjonell immunologisk praksis at en determinant for forøkning av immunogeni sitet er ønskelig, kan den fusjoneres covalent til antigenet (Ag), f.eks. kan carboxyenden av det hele Hepatitis B-kjerne-antigen eller del derav fusjoneres via en peptidbinding eller annen covalent binding til aminoenden av rekombinant p55, eller rekombinant gjær Ty:Ag-partikler. Disse fusjonskon-struksjoner fremstilles lett, f.eks. ved spleising av DNA som koder for de tilsvarende strukturelle proteiner, ekspresjon av det spleisede DNA og isolering av fusjonsproteinproduktet. Alternativt eller i tillegg kan ikke-covalente interaksjoner som binder antigen til slike determinanter, danne partikulære former med varierende størrelser eller enkle aggregater hvor hvilke som helst av disse er anvendbare ved forøkning av immunogenisiteten. Det skal også nevnes andre vaksineformer: peptidcocktailen inneholdende et bredt spektrum av MHC-begrensede peptider, og DNA-rekombinanter av DNA-sekvenser for Ag og vacciniavektor.
Adjuvanser kan eventuelt tilsettes under fremstilling av vaksinene ifølge oppfinnelsen. Alun er den typiske og foretrukne adjuvans i humane vaksiner. Andre innbefatter Freunds ufullstendige adjuvans eller liposomer.
Fremstilling, formulering og testing av disse vaksiner med forøket kapasitet til å utvikle spesifikk immunitet under anvendelse av determinanter som fremkaller T-celle-immunitet, cytolytisk T-celle-eller B-celle-immunitet, krever generelt konvensjonell og rutinemessig kunnskap innen immuno-logi, rekombinant DNA og beslektede fag.
I eksemplene ble følgende materialer erholdt fra kommersielle kilder: guanidin»HCl, International Biotechno-logies, Inc.; Triton<®>X-100, Boehringer Mannheim.
I foreliggende beskrivelse kan gag-forløperen eller HIV p55 overvåkes ved denaturerende geler slik som elektroforese på SDS polyacrylamidgeler, ved Western blotting [Burnette, W.N. , Anal. Biochem. 112, 192 (1981)] eller begge deler.
Eksempel 1
Konstruksjon av gjær-ekspresjonsvektor for HIV gag-forløper med et innført stoppkodon umiddelbart nedstrøms av gag-forløper- stoppkodonet
Plasmid pBL4-3-2 (alternativt pNL4-3) er pUC18 med et ca. 22 kb innskudd omfattende 9,7 kb av HIV DNA, bestående av 5'-halvdelen av New York HIV-isolat nr. 5 fusjonert til 3'-halvdelen av LAV-isolatet [A. Adachi et al., J. Virol. 59, 284-291 (1986)]. Et utall av andre plasmider inneholdende AIDS-virale sekvenser, kan anvendes istedenfor pBL4-3-2 (eller pNL4-3) ved denne prosedyre for konstruksjon av gjær-ekspres jonsvektor for HIV gag-forløper, og valget av de egnede genetiske konstruksjonsprosedyrer med et hvilket som helst slikt plasmid faller innenfor fagmannens kunnskapsområde.
Plasmid pBL4-3-2 (alternativt pNL4-3) ble oppsluttet med Hindlll under dannelse av en delvis oppslutning, og det resulterende 5,7 kb HindiII-fragment som bærer de gag- pol-kodende regioner, ble subklonet i pUC13 under dannelse av to identiske plasmider, betegnet Pl og P2. Begge plasmider ble deretter bearbeidet separat på identisk måte som beskrevet i det etterfølgende. Plasmid Pl (eller P2) ble deretter oppsluttet med Hgal pluss Ndel. Det resulterende 4,4 kb Hgal- Ndel gag- pol-fragment ble gjort stump-endet med Klenow-fragmentet av DNA polymerase I. (Det innfylte Hgal-sete utvikler en stumpe-ende ved stilling +3 av den gag-kodende sekvens). Det 4,4 kb stump-endede fragment ble ligert med en syntetisk oligonucleotidadapter med strukturen:
Ligering av adapteren til det glatt-endede Hgal-sete gjenoppbygger ATG-initieringskodonet for gag-genet og til-føyer en gjær-lignende ikke-translatert mRNA-leder pluss Hindlll- og BamHI-klonende seter. Ligering av denne adapter til det glatt-endede Ndel-sete resulterer i addisjon av et translasjons-stoppkodon pluss BamHI- og Hindlll-klonende seter 27 bp nedstrøms av det naturlige pol-translasjons-stoppkodon. Ligeringsblandingen ble deretter oppsluttet med Hindlll, og 4,4 kb HindiII-fragmentet som bærer gag- pol-kodende regioner, ble gelrenset og deretter klonet i Hindlll-setet av pAAH5 [G. Ammerer Methods in Enzymology 101, 192-201 (1983)]. Etter transformasjon i E. coli ble plasmid p64-30 erholdt fra det opprinnelige plasmid Pl, og p50-81 ble avledet fra plasmid P2.
Plasmidet p64-30 ble oppsluttet med BamHI pluss HincII, og 1760 bp BamHI- HincII-fragmentet (som bærer den gag-kodende region) ble gelrenset og deretter subklonet i BamHI pluss HincII som på forhånd var blitt oppsluttet med BamHI pluss HincII. Under anvendelse av teknikken for oligo-nucleotid-rettet mutagenese [M.J. Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983)] ble et Smal-sete innført
5 bp nedstrøms av c[ac[-trans las jons-stoppkodonet. Oligo-nucleotidet anvendt i mutagenesen, hadde følgende struktur:
Det mutageniserte plasmid ble oppsluttet med Bglll pluss HincII, og 0,44 kb Bglll- HindlI-fragmentet inneholdende 3'-enden av den gag-kodende region, ble gelrenset. Plasmidet p50-81 ble oppsluttet med BamHI pluss Bglll, og
1,3 kb BamHI- BgllI-fragmentet inneholdende 5'-enden av den gag-kodende region ble gelrenset. De ovenfor angitte 0,44 kb og 1,3 kb fragmenter ble ligert sammen med vektoren pGEM-4 som på forhånd var blitt oppsluttet med BamHI pluss HincII. Det resulterende plasmid, pKH-GAG (4,6 kb), inneholder et rekonstruert gag-gen med en gjærlignende 5' ikke-translatert ledersekvens og et Smal-sete 5 bp nedstrøms translasjonsstoppkodonet .
pKH-GAG ble oppsluttet med BamHI pluss Smal. Det resulterende 1,5 kb BamHI- Smal gag-fragment ble glatt-endet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og gelrenset. Gjær-ekspresjonsvektoren pCl/l-pGAP(B)tADHl inneholder den konsti-tutive promotor for gjær-glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-
genet (GAP491) pluss den transkripsjonene terminator for gjær- ADHI-genet. Et særegent BamHI-sete er lokalisert mellom promotoren og terminatorelementene. Denne vektor er funk-sjonelt identisk med GAP4 91-ekspresjonsvektoren tidligere beskrevet av P. Kniskern et al., Gene £6, 135-141 (1986). pCl/l-pGAP(B)tADHl ble oppsluttet med BamHI og gjort glatt-endet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I. Vektor-fragmentet og 1,5 kb gag-fragmentet ble ligert sammen under dannelse av pKH12-2. Dette rekombinante plasmid ble deretter transformert inn i Saccharomyces cerevisiae stamme U9 (MATa, leu2-04, adel, ura3, cir°). Stamme U9 er et spontant ura3-isolat avledet fra S. cerevisiae stamme 2150-2-3 ( MATa, leu2-04, adel, cir°).
Transformante kloner ble utvalgt og forsterket. Cellelysater ble fremstilt, elektroforesebehandlet i polyacrylamidgeler og ble underkastet Western blotting til nitro-cellulose. Immunoblotting med HIV-positive humane sera viste nærværet av et HIV-spesifikt 55 kilodalton protein i trans-formantene. Dette 55-kDa protein reagerte også med anti-p24 antistoffer ved RIA som bekrefter dets identitet som HIV
gag p55-proteinet.
Det klonale isolat U9 nr. 5-1 ble utvalgt for å fremstille en Master Seed (PF413) for alle ytterligere fermen-terings- og proteinrensingsstudier. Hovedsæden ble lagret fryst ved -60 til -80°C i nærvær av 17% (v/v) glycerol.
Prøver av U9 nr. 5-1, Pl og P2 ble deponert ved eller før innleveringsdatoen for foreliggende søknad ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD 20852, med deponeringsnr. 20876, 67669 og 67670.
Eksempel 2
Fremstilling av klaret gjærekstrakt
Fryste rekombinante gjærceller ifølge eksempel 1 ble tint. Oppbrytningsbuffer [0,1 M HEPES pH 7,5, 10 mM EDTA,
10 mM benzamidin, 1Mg/ml pepstatin A, 0,13 TIU/ml aprotinin, 2 mM PMSF, 0,1 mM transepoxysucciny1-2-leucylamido-(4-guanidino)-butan] ble tilsatt for å fremstille en tilnærmet 25% (w/v) cellesuspensjon. Celler ble oppbrutt ved trykk-fremkalt lyse ved 4°C. Etter sentrifugering ved 14.000 x g i 45 minutter ved 4°C ble pelleten kastet. Supernatanten var klaret gjærekstrakt og ble fryst rutinemessig ved -70°C i minst 72 timer.
Eksempel 3
Rensing av klaret gjærekstrakt, første variant
A. Denaturert pellet
En 800 ml aliquot av fryst, klaret gjærekstrakt ifølge eksempel 2 ble tint i et vannbad ved romtemperatur og ble deretter sentrifugert ved 30.000 opm (105.000 x g) i 60 minutter ved 4°C. Supernatanten ble fjernet, og en pellet i hvert sentrifugerør ble bibeholdt. Mengder på 5 ml 5% (w/v) Triton<®>X-100 (Boehringer Mannheim) i reagens 3 [0,1 M HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA, 10 ug/ml pepstatin A, 0,13 TIU/ml aprotinin, 10 mM benzamidin•HC1, 25 uM transepoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)-butan, 0,1% (w/v) 2-mercaptoethanol] ble tilsatt til pelleten i hvert sentrifugerør for å oppløseliggjøre pelletmembranene og assosierte membranbundne proteiner. Pelleten ble homogenisert, resulterende i en suspensjon i ca. 2,5% (w/v) Triton<®>X-100. Suspensjonen ble repelletisert ved 30.000 opm pr. minutt i 30 minutter ved 4°C. Den resulterende Triton® supernatant I ble fjernet, men pelleten i hvert sentrifugerør ble bibeholdt. Hver pellet ble deretter oppløseliggjort igjen ved tilsetning til hver pellet av 5 ml reagens 4 [6 M guanidin•HCl, 0,1 M HEPES
(pH 7,5), 10 mM EDTA, 10 ug/ml pepstatin A, 0,13 TIU/ml aprotinin, 10 mM benzamidin•HCl, 25 MM transepoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)-butan og 0,1% (w/v) 2-mercaptoethanol], etterfulgt av homogenisering og sluttelig blanding over natten på en "end-over-end"-blander under avkjøling.
Den resulterende blanding var den denaturerte pellet som kan lagres ved -20°C eller ved -70°C etter 15 x fortynning i reagens 4.
B. Hydrofob interaksjonskromatografi
En kolonne ble fremstilt fra Fenyl-Sepharose<®>
(Pharmacia) pakket i reagens 3. Etter fylling av den denaturerte pellet ble kolonnen fremkalt med reagens 3. Den store avbrytelse via toppen av 280 nm absorberende materiale ble oppsamlet og fjernet. Kolonnen ble underkastet en lineær gradienteluering med reagens 3 til reagens 4. Ettersom guanidin•HCl-konsentrasjonen øker oppstår selektiv oppløselig-gjøring på kolonnen. Fraksjoner ble oppsamlet, og de som inneholdt rekombinant p55 gag-protein (eluering ved ca. 3 M guanidin•HCl) ble identifisert ved SDS polyacrylamidgelelektroforese under dannelse av Fenyl-Sepharose<®->oppsamlingen. Analytiske prøver ble fremstilt for elektroforese ved MeOH-utfelling i nærvær av bærer-BSA for å fjerne det denaturerte guanidin•HCl. Guanidin*HCl-konsentrasjonen ble overvåket og standardisert ved elektriske ledningsevnemålinger. Fenyl-Sepharose<®->oppsamlingen kan ved dette punkt dialyseres mot 10 mM HEPES som kvantitativt utfeller p55 (85-90% rent). Utfellingen kan oppløseliggjøres i en løsning av 6 M guanidin «HCl og 6% 6-mercaptoethanol.
C. Vannløselig, rekombinant gjær gag- forløperprotein Fenyl-Sepharose<®->ansamlingen ble konsentrert, deretter gjort vannløselig ved bearbeidelse gjennom et C-^g omvendt fase HPLC-(høytrykksvæskekromatografi) system. HPLC-kolonnen ble ekvilibrert med blanding 1 inneholdende ett volum av reagens 5 [1,0 ml trifluoreddiksyre i 999 ml acetonitril] og fire volumer reagens 6 [1,0 ml trifluoreddiksyre i 999 ml vann]. Den konsentrerte Fenyl-Sepharose<®->ansamling ble fremstilt ved oppvarming til 95°C i 10 minutter og ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 14.000 x g for å fjerne cellerester. En prøve av supernatanten inneholdende gag-forløperen oppløst i reagens 4 ble injisert i den ekvilibrerte HPLC-kolonne. Løsningsmiddelutløpssystemet vasket deretter kolonnen ved suksessive vasketrinn med blanding 1, eluering med en buffergradient av blanding 1 til blanding 2 [fire volumer av reagens 5 og ett volum av reagens 6], og sluttelig vasking med blanding 3 [ni volumer av reagens 5 og ett volum av reagens 6]. Hovedtoppen som absorberte ved 260 nm, ble funnet å være en vannløselig gjær-rekombinant gag-forløper i hovedsakelig ren form (>_95%), som bedømt ved sølvbeising på SDS-geler etter elektroforese eller Western blotting. Løsningsmidlet ble fjernet ved rotasjonsfordampning, hvorpå sterilt destillert vann ble tilsatt. Denne HPLC-rensede gag-forløper ble funnet å være fullstendig løselig i vann eller i 1 M urea, i motsetning til det aggregerte materiale funnet etter cellelyse, hvilket materiale bare var løselig i sterke denatureringsmidler. Totalt utbytte etter HPLC var i området på 2 til 4 mg protein fra hver 50 ml av en 20% suspensjon av celler.
Sterilfiltrering av alunadsorpsjon ble rutinemessig utført for å fremstille den egnede vaksine.
Eksempel 4
Rensing av klaret gjærekstrakt, andre variant
A. Denaturert pellet
En 800 ml aliquot av fryst, klaret gjærekstrakt fra eksempel 2 ble tint i et vannbad ved romtemperatur og ble deretter fortynnet til et volum på 1600 ml med reagens 3 for å redusere uønsket utfelling. Den resulterende blanding ble sentrifugert ved 14.000 opm (30.000 x g) i 30 minutter ved 4°C. Supernatanten ble fryst ved -20°C (supernatant I), og pelleten i hvert sentrifugerør ble tatt vare på. Et volum på 10 ml av en 5% (w/v) Triton<®>X-100 (Boehringer Mannheim)
i reagens 3 ble tilsatt til pelleten i hvert sentrifugerør for å oppløseliggjøre pelletmembranene og assosierte membranbundne proteiner. Pelletene ble homogenisert, resulterende i en suspensjon på ca. 5% (w/v) Triton<®>X-100. Suspensjonen ble deretter fryst ved -20°C (fryst pellet).
Ytterligere operasjoner på den fryste supernatant I ble funnet å øke utbytte på ca. 50% i stor skala som følger. Fryst supernatant I ble tint i et vannbad ved romtemperatur, ble sentrifugert ved 14.000 opm (30.000 x g) i 30 minutter ved 4°C, og pelletene ble behandlet hver med ytterligere 10 ml volum av 5% (w/v) Triton<®>X-100 i reagens 3 og ble deretter homogenisert under dannelse av homogeniserte restpelleter.
Fryste pelleter ble tint i et vannbad ved romtemperatur og ble kombinert med restpelleter i en beholder. Den kombinerte pellet ble deretter brakt til et volum på ca.
200 ml med 5% (w/v) Triton<®>X-100 i reagens 3, og blandingen ble homogenisert og deretter sentrifugert ved 14.000 opm i 30 minutter ved 4°C. Den resulterende Triton<®>supernatant I ble kastet, hvorpå 20 ml 5% (w/v) Triton<®>X-100 i reagens 3 ble tilsatt etterfulgt av homogenisering. Blandingen ble brakt til et volum på ca. 200 ml med 5% (w/v) Triton<®>X-100 i reagens 3, homogenisering ble utført og sentrifugeringen gjentatt ved 14.000 x g i 30 minutter ved 4°C. Den resulterende Triton<®>supernatant II ble kastet, pelleten ble deretter behandlet med 25 ml av reagens 4, ble homogenisert og blandet over natten på en "end-over-end"-blander under avkjøling.
Den resulterende blanding er den denaturerte pellet som kan lagres ved -20°C eller ved -70°C etter 15 x fortynning i reagens 4.
B. Hydrofob interaksjonskromatografi
En kolonne ble fremstilt av Fenyl-Sepharose<®>pakket i kolonnebuffer [to volumer reagens 3 og ett volum reagens 4]. Kolonnen ble således ekvilibrert i buffer inneholdende 2 M guanidin«HCl istedenfor bare buffer (som i eksempel 3). Før fylling av kolonnen ble den denaturerte pellet sentrifugert ved 30.000 opm (105.000 x g) i 30 minutter ved 4°C for å fjerne cellerester, og supernatanten ble brakt til 2 M guanidin*HClved tilsetning av beregnede mengder av reagens 3. Etter fylling ble kolonnen fremkalt i kolonnebuffer, en 2 M guanidin*HCl-buffer. Den store gjennombrytningstopp av 260 nm absorberende materiale ble oppsamlet og fjernet.
Kolonnen ble deretter underkastet lineær gradienteluering av kolonnebuffer til reagens 4, dvs. en 2 M til 6 M guanidin*HCl-gradient. Ettersom guanidin*HCl-konsentrasjonen øker, finner det sted selektiv oppløseliggjøring. Da gag-forløperproteinet ikke eluerer i 2 M guanidin*HCl med det hule volum, er hydrofob interaksjon den sannsynlige forklaring for bindingen av proteinet til Feny1-Sepharose<®>.
Fraksjoner som kom ut av kolonnen, ble oppsamlet, og de som inneholdt rekombinant gag-forløperprotein, ble deretter identifisert ved SDS polyacrylamidgelelektroforese som etter hensiktsmessig oppsamling ga Fenyl-Sepharose<®->ansam-lingen. Gag-forløperprotein eluerte ved ca. 3 M guanidin.HCl. Guanidin•HCl-konsentrasjonen ble overvåket og standardisert ved elektriske ledningsevnemålinger.
C. Vannløselig, rekombinant gjær p55 gag-forløper-protein
Fenyl-Sepharose<®->ansamlingen ble konsentrert og deretter gjort vannløselig ved å gjenta HPLC-prosedyren beskrevet i eksempel 3C.
Eksempel 5
Rensing av klaret gjærekstrakt, tredje variant.
Gelkromatografi som sluttrinn
Fenyl-Sepharose<®->ansamlingen fra eksempel 4B ble konsentrert og deretter anbrakt på en kolonne av Sephacryl<®>S-200HR ekvilibrert i 70% CH3CN/0,1% TFA/H20. Kolonnen ble fremkalt i samme løsningsmiddel, og fraksjoner ble oppsamlet, tørket i vakuum og resuspendert i vann. Gag-forløper-holdige fraksjoner ble identifisert ved elektroforese på polyacrylamidgeler. De resulterende gag-forløperpreparater var >_ 95% i renhet og var ikke skilbare fra RP-HPLC-renset materiale med hensyn til vannløselighet.
Eksempel 6
In vivo immunogenisitet
A. Afrikanske grønnaper
Alun-adsorbert, rekombinant gjær-gag-forløper renset
i henhold til eksempel 2, ble inokulert i afrikanske grønn-aper ved flere dosenivåer. Hver dose ble avgitt intramuskulært ved 0 og 1 måned. Dosenivåene var 0, 1,0, 10,0 og 100,0 ug, og tre dyr ble anvendt for hvert dosenivå; Apene
ble tappet for blod 2 uker etter den andre dose, og utvikling av anti-gag-forløper-antistoff ble bestemt ved spesifikk enzymkjedet immunoadsorbentbestemmelse (ELISA). Alle dyrene inokulert med enten to 10,0 Mg eller to 100,0 ug dose^utviklet signifikante anti-gag-forløper-antistoffnivåer. Positive nivåer ble også oppnådd i to av tre dyr som mottok to 1,0 Mg doser. Ingen av dyrene inokulert med 0 Mg doser (alun-placebo), utviklet anti-gag-forløpertitere. Se tabell II.
B. Mus
Alun-adsorbert, rekombinant gjær-gag-forløper, renset i henhold til eksempel 2, ble inokulert i mus (stamme ICR) ved flere dosenivåer. Hver dose ble gitt én gang intraperitonealt. Dosenivåene var 0,1, 1,0, 10,0 og 100,0 Mg. 10 mus ble anvendt for hvert dosenivå. Dyrene ble tappet for blod 28 dager etter inokulering, og utvikling av anti-gag-forløper ble bestemt ved spesifikk enzymkjedet immunoadsorbentbestemmelse (ELISA). Antall individuelle antistoff-positive dyr ved hvert dosenivå ble anvendt til å beregne en 50% effektiv dose (EDr^) for antigenet. Dette var det dosenivå
DU
som var forventet å seroomdanne, ved induksjon av anti-gag-f orløper-antistof f , halvparten av de inokulerte mus. ED5q for gag-forløperen var 1,5 ug.
C. Sjimpanser
Alun-adsorbert, rekombinant gjær-gag-forløper, renset ifølge eksempel 2, ble inokulert intramuskulært i to sjimpanser i 100,0 yg doser ved 0, 1 og 6 måneder. En ytterligere sjimpanse ble inokulert på lignende måte med alun-placebo. Dyrene ble undersøkt med hensyn til utvikling av anti-gag-forløper-antistoff etter et skjema for blodtagninger og analyse ved ELISA. Dyrene ble også undersøkt med hensyn til utvikling av en hvilken som helst immunologisk unormalitet.
Fire uker etter siste inokulering ble alle tre sjimpanser utfordret med en titrert dose av intakt HIV, omfattende 25,0 sjimpanse-infektiøse doser gitt intravenøst. Etter utfordring ble sjimpansene undersøkt med hensyn til vedvarende HIV-infeksjon, såvel som spesifikt antistoff og enhver immunologisk unormalitet.
D. Ytterligere testing på mus
For å vise at gag-forløperproteiner primer immun-systemet for hurtig respons på HIV-omhyllingsprotein etter utfordring av det primede dyr med intakt HIV, ble følgende for-søksplan fulgt. Mus ble inokulert intraperitonealt på forskjellige dager med 10,0 Mg doser av alun-adsorbert, rekombinant gjær-gag-forløper, renset i henhold til eksempel 2. Hver mus ble utfordret med en enkel sub-immunogenisk dose av intakt HIV. Hvert dyr ble undersøkt med hensyn til utvikling av antistoffer spesifikke for HIV-omhyllingsproteinet for å vise hvorvidt musen inokulert med gag-forløperen, utviklet spesifikke anti-omhyllings-antistoffer mens alun-placebo-musen ikke utviklet dette.
Eksempel 7
Gjær- rekombinant gag- forløper myristoyleres
Gjærceller som uttrykker gag-forløper ifølge eksempel 1, såvel som kontroll-ikke-uttrykkende gjærceller,
ble merket med<3>H-myristinsyre (New England Nuclear) i henhold til Towler, D. et al., Proe. Nat'1. Acad. Sei., £3, 2812-2816
(1986). Merkede cellepelleter ble lysert i HEPES pH 7,5
(100 mM), EDTA (10 mM), pepstatin A (10 uM), benzamidin (10 mM), aprotinin (0,13 TIU/ml), E-64 (25MM), NaCl (150 mM), NP-40 (1%), nadeoxycholat (1%) og SDS (0,1%) under anvendelse av 0,5 mm glassperler og under risting. Etter sentrifugering for å fjerne ubrutte cellerester ble monoklonalt antistoff spesifikt for p55, tilsatt til begge ekstrakter og inkubert over natten ved 4°C. Antistoffkomplekset ble høstet ved tilsetning av geite-anti-muse-IgG-^-antistoff koblet til Sepharose<®>. Antistoffkomplekset fjernet med Sepharose<®>, ble eluert under anvendelse av 0,5 M eddiksyre, ble tørket i vakuum, analysert ved SDS-PAGE og autoradiografert.
Et klart bånd som co-vandrer med HPLC-renset gag-forløper og et ytterligere 41 kDa bånd, var de eneste merkede arter som ble observert. Intet merket bånd var til stede i kontroll-sporet av gelen.
Eksempel 8
Konstruksjon av insekt- ekspresjonsvektor for HIV- gag- forløper
Et baculovirus-genekspresjonssystem [Summers, M.D.
et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment
Station, bulletin nr. 1555, mai 1987] ble anvendt for ekspresjon av HIV gag- pol-genene som følger. Fra plasmidklon Pl ifølge eksempel 1 ble 4,4 kb Hgal- Ndel-fragmentet inneholdende gag-pol-genene, skåret ut. Endene av denne 4,4 kb dupleks ble "fylt inn" med Klenow DNA-polymerase, og følgende syntetiske oligonucleotidduplekser ble ligert til de resulterende stump-ender:
De gjenværende "klebrige" ender skapte således inn-satte BamHI-restriksjonsendonuclease-gj enkjennelsesseter,
mens resten av den ligerte sekvens innbefatter en gjær-translasjons-gjenkjennelsessekvens. Det symmetriske linker-modifiserte 4,4 kb fragment ble subklonet i plasmid AH5, fra hvilket det kunne gjenvinnes som et BamHI-fragment. Dette gjenvundne BamHI-fragment ble innskutt i det særegne BamHI-sete av baculovirus-ekspresjonsplasmidet pAc373 [Summers,
M.D. et al., supra]. Kloner som bærer genet innskutt i den riktige orientering i forhold til baculovirus-polyhedrin-promotoren i pAc373, ble identifisert ved restriksjonsanalyse. I tillegg til den native gag-pol pAc373-ekspresjonsvektor
ble et andre pAc373-klon, hvori gag-pol-sekvensen var modifisert til å inneholde en' rammeskiftet mutasjon med Klenow DNA-polymerase-innfylling av et indre Bglll-sete, også fremstilt.
Hver av de to vektorer ble anvendt for separate co-transfeksjoner med Autographa californica Nuclear Polyhedrosis viral DNA av Spodoptera frugiperda-cellelinje Sf9 i henhold til metodene ifølge Summers, M.D. et al., supra. Rekombinante virale plakker av hver vektor hvori viruset var blitt modifisert ved homolog rekombinasjon til å inneholde gag-pol-genet under transkripsjonen regulering av den siste virale polyhedrinpromotor, ble identifisert ved plakkmorfologi, og de utskårne agaroseplugger (fra plakkplaten) inneholdende det tilsvarende virus, ble deretter eluert over natten i vekst-medium og anvendt for å infisere mikrotiterplatekulturer av Sf9-celler. Infiserte celler ble i sin tur undersøkt med hensyn til gag-ekspresjon ved immunodot blot med HIV-positivt antiserum i henhold til Whang, Y. et al., J. Virol. 61, 1796
(1987). Positive virale ansamlinger ble "plakkrenset" og undersøkt på nytt med hensyn til ekspresjon ved Western blot. Det native gag-pol virale vektor-ekspresjonssystem (AcGAG-A-15-3) ble funnet å uttrykke en hoved immunoreaktiv polypeptidart ved ca. 55 kDa og en mindre art ved ca. 40 kDa. Det rammeskiftede gag-pol-virale vektor-ekspresjonssystem (AcGAG-B-1-3) akkumulerte primært en ca. 40 kd art. Disse resultater er kvalitativt lik resultatene erholdt ved ekspresjon av de samme to åpne leserammer i gjær.
Eksempel 9
Gag- forløpersekvenser
Nucleotidsekvensering av pKH12-2 ifølge eksempel 1 ble utført ved dideoxytermineringsmetoden med modifisert T7-polymerase. Den utledede aminosyresekvens er angitt i etter-følgende tabell III.
TABELL III

Claims (17)

1. Gjær-rekombinant gag-forløper med mer enn 95% renhet eller like ren variant derav.
2. Gag-forløper ifølge krav 1, karakterisert ved at forløperen er myristoylert.
3. Insekt-rekombinant gag-forløper.
4. Gag-forløper ifølge krav 1 eller 2 eller 3, med sekvens som angitt i tabell III i eksempel 9.
5. Gag-forløper ifølge krav 1 eller 2 eller 3, i kombinasjon med hvilke som helst av antivirale midler, immuno-modulatorer, antibiotika eller vaksiner ifølge tabell I.
6. Gag-forløper ifølge krav 1 eller 2 eller 3, i kombinasjon med hvilke som helst av de antivirale midler, immuno-modulatorer, antibiotika eller vaksiner ifølge tabell I, hvilken gag-forløper har sekvensene angitt i tabell III ifølge eksempel 9.
7. Gjær-rekombinant gag-forløper eller variant derav anvendbare som en vaksine overfor AIDS.
8. Insekt-rekombinant gag-forløper eller variant derav, anvendbare som en vaksine overfor AIDS.
9. AIDS-vaksine omfattende mer enn 95% ren gjær-rekombinant gag-forløper i en egnet adjuvans, hvilken gag-forløper er blitt fremstilt fra gjær-ekspresjonssystem U9 nr. 5-1, hvilken vaksine skal anvendes for pre- eller post-eksponering for å forhindre eller behandle HIV-infeksjon eller sykdom, hvilken vaksine er i stand til å produsere antistoffer spesifikke for gag p55 av HIV, serotype New York nr. 5.
10. Fremgangsmåte for fremstilling av en protein-gjær-rekombinant gag-forløper med mer enn 95% renhet, eller variant derav, omfattende trinnene: (a) tining av en mengde av fryst, klaret gjærekstrakt, hvilken ekstrakt inneholder gjær-rekombinant gag-protein-forløper eller variant derav, uttrykt i et rekombinant gjær-ekspresjonssystem; (b) utfelling av gag-forløperen ved frysing i et tidsrom på minst 24 timer; (c) pelletisering ved sentrifugering av den dannede gag-forløperutfelling, og deretter separering av pelleten fra supernatanten; (d) blanding av pelleten med en løsning som er effektiv for å oppløse membraner og uønskede membranbundne proteiner; (e) repelletisering av gag-forløperen ved sentrifugering under dannelse av en andre pellet, og deretter separering av den andre pellet fra supernatanten; (f) oppløsning av pelleten fra det foregående trinn i en løsning som er effektiv til å oppløse gag-protein-forløperen under dannelse av denaturert pellet; og (g) den denaturerte pellet underkastes hydrofob interaksjonskromatografi, og isolering av fraksjoner med gag-forløper deri, under dannelse av gjær-rekombinant gag-forløper med renhet større enn 95%, eller en like ren variant derav.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, omfattende ytterligere vasketrinn mellom trinn (e) og trinn (f) ifølge krav 10, omfattende (el) blanding av den andre pellet med en bufferløsning eller en løsning som er effektiv til å oppløseliggjøre membraner og uønskede membranbundne proteiner; og (e2) repelletisering av gag-forløper ved sentrifugering under dannelse av en tredje pellet, og deretter separering av den tredje pellet fra supernatanten.
12. Fremgangsmåte for fremstilling av vannløselige preparater av gjær-rekombinant gag-forløper eller variant derav, omfattende trinnene: (a) uttagning av en del av hovedsakelig rent, aggregert gag-protein eller variant derav; og (b) underkastelse av proteinet for omvendt fase-høytrykksvæskekromatografi under dannelse av hovedsakelig ren vannløselig gjær-rekombinant gag-forløper eller like ren vannløselig variant derav.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, omfattende det ytterligere trinn etter trinn (g) ifølge krav 10, omfattende (h) oppsamling av fraksjonene fra trinn (g); og (i) de oppsamlede fraksjoner underkastes omvendt fase-høytrykksvæskekromatografi under dannelse av vannløselig gjær-rekombinant gag-forløper med en renhet over 95% eller en like ren vannløselig variant derav.
14. Fremgangsmåte for fremstilling av vannløselige preparater av gjær-rekombinant gag-forløper eller variant derav, omfattende trinnene: (a) opptagelse av en del av hovedsakelig rent, aggregert gag-protein eller variant derav; og (b) proteinet underkastes gelfiltreringskromatografi i organisk fase, under dannelse av hovedsakelig ren, vann-løselig gjær-rekombinant gag-forløper eller like ren vann-løselig variant derav.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 10, omfattende det ytterligere trinn etter trinn (g) ifølge krav 10, omfattende (h) oppsamling av fraksjonene fra trinn (g); og (i) de oppsamlede fraksjoner underkastes gelfiltreringskromatografi i organisk fase, under dannelse av vannløse-lig gjær-rekombinant gag-forløper med renhet over 95% eller like ren, vannløselig variant derav.
16. Renset gjær-rekombinant gag-forløper med en renhet større enn 95%, eller like ren variant derav, som renset ved fremgangsmåten ifølge krav 10 eller 11 eller 12 eller 13 eller 14 eller 15.
17. Renset gjær-rekombinant gag-forløper eller fragment derav med en renhet på mer enn 95%, som renset ved fremgangsmåten ifølge krav 10-15, og med aminosyresekvensen ifølge tabell III i eksempel 9.
NO89891691A 1988-04-25 1989-04-24 Rekombinant gag-forloeper for hiv. NO891691L (no)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18562688A 1988-04-25 1988-04-25
US18557288A 1988-04-25 1988-04-25
US18571188A 1988-04-25 1988-04-25
US28214488A 1988-12-09 1988-12-09
US28214688A 1988-12-09 1988-12-09
US28214588A 1988-12-09 1988-12-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO891691D0 NO891691D0 (no) 1989-04-24
NO891691L true NO891691L (no) 1989-10-26

Family

ID=27558760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO89891691A NO891691L (no) 1988-04-25 1989-04-24 Rekombinant gag-forloeper for hiv.

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0340837A1 (no)
JP (1) JPH0213391A (no)
AU (1) AU3335689A (no)
DK (1) DK192389A (no)
FI (1) FI891917A (no)
IL (1) IL90048A0 (no)
NO (1) NO891691L (no)
PT (1) PT90354A (no)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AP129A (en) * 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
ATE199394T1 (de) * 1992-06-04 2001-03-15 Univ Osaka Res Found Gag-env fusion-antigen aus hiv
US20050112139A1 (en) * 2003-10-23 2005-05-26 Nmk Research, Llc Immunogenic composition and method of developing a vaccine based on factor H binding sites
JP6199533B2 (ja) 2006-07-13 2017-09-20 インスティチュート フォー アドバンスド スタディ ウイルス阻害性ヌクレオチド配列およびワクチン

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6713287A (en) * 1986-01-06 1987-07-09 F. Hoffmann-La Roche & Co. Expression of htlv-iii gag-gene
NZ221440A (en) * 1986-08-20 1991-11-26 Genetic Systems Corp Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections
IL84154A0 (en) * 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same

Also Published As

Publication number Publication date
FI891917A0 (fi) 1989-04-21
AU3335689A (en) 1989-11-23
DK192389D0 (da) 1989-04-20
PT90354A (pt) 1989-11-10
FI891917A (fi) 1989-10-26
DK192389A (da) 1989-10-26
JPH0213391A (ja) 1990-01-17
IL90048A0 (en) 1989-12-15
EP0340837A1 (en) 1989-11-08
NO891691D0 (no) 1989-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6140059A (en) Methods for the obtention of human immunodeficiency virsus Type 1 envelope glycoproteins in native and oligomeric form employing recombinant chimeric antigens containing collagenase recognition sites.
Henderson et al. Gag proteins of the highly replicative MN strain of human immunodeficiency virus type 1: posttranslational modifications, proteolytic processings, and complete amino acid sequences
Henderson et al. Molecular characterization of gag proteins from simian immunodeficiency virus (SIVMne)
CA1340896C (en) Synthetic peptides which induce cellular immunity to the aids virus and aids viral proteins
DK174910B1 (da) Antigen, fremgangsmåde til fremstilling af antigenet, fremgangsmåde til diagnosticering samt immunogene præparater
Zhang et al. Effects of nucleocapsid mutations on human immunodeficiency virus assembly and RNA encapsidation
Hansen et al. Characterization of a transpositionally active Ty3 element and identification of the Ty3 integrase protein
US5795577A (en) Viral vector coding for a glycoprotein of the virus responsible for A.I.D.S.
JP2023529432A (ja) 新型コロナウイルス感染症の経口ワクチン及びその調製と応用
NO328824B1 (no) Vaksinesammensetninger som omfatter fusjonsproteiner av HIV-1 NEF-proteiner, fremgangsmate for fremstilling av vaksinesammensetning og protein samt nukleinsyre, proteiner og vert.
US11773144B2 (en) Mosaic HIV-1 envelopes to induce ADCC responses
US20060281075A1 (en) Purification of viruses, proteins and nucleic acids
JP2719917B2 (ja) Aidsの原因ウィルスの糖蛋白質、該糖蛋白質の製造方法及びワクチン
US5081226A (en) Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
Morikawa HIV capsid assembly
AU596154B2 (en) Fusion proteins
NO891691L (no) Rekombinant gag-forloeper for hiv.
WO1989012095A1 (en) A method of evaluating recombinant vaccines against immunodeficiency virus
US5130247A (en) Expression of fusion protein of HIV envelope and HBsAG
CA2593864C (en) Synthesis using peptide intermediate fragments iii
WO1998041536A9 (en) Glycosylation deficient siv and hiv envelope glycoproteins
WO2005010033A1 (en) New soluble and stabilized trimeric form of gp41 polypeptides
WO1988002757A1 (en) Hybrid proteins or polypeptides
WO2022006095A2 (en) Mosaic hiv-1 envelopes to induce adcc responses
EP0421626A1 (en) Vaccine for aids and hepatitis B