JPH02108634A - シュードモナス・アエルギノーサに対して活性なワクチンおよび免疫グロブリンｇ含有製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、シュードモナス・アエルギノーサ感染症に対
して活性な製剤、とりわけその効果が部分べん毛（Ｈ）
抗原ａｏ１ａＩＳａ！、ａ３、ａ４およびｂのいずれか
の組み合わせに対するものである、能動免疫を意図する
ワクチン、並びに細菌、シュードモナス・アエルギノー
サに対して活性な、受動的保護を意図する免疫グロブリ
ンＧ含有製剤に関するものである。

細菌、シュードモナス・アエルギノーサはしばしば、主
として、火傷に罹患している患者、のう飽性繊維症に罹
患しているかまたは器官機能不全を有する患者および腫
瘍患者の様な、免疫防御機能障害を有する患者において
、病院重感染症を起こすことのある病原微生物である。

耐性が生じるため、抗生物質は限られた範囲でのみシュ
ードモナス感染症に対して活性であり、従って、シュー
ドモナス・アエルギノーサに起因する感染症に抗するた
めの免疫学的方法を見いだすため、鋭意研究が続けられ
てきた。

感染症は、〇−抗原（リボ多糖）およびＨ−抗原（べん
毛）、Ｈ−および〇−抗原タイブの自由な組み合わせに
よって特性化し得る種々の株によって惹起される。

シュードモナス・アエルギノーサの運動性が、この病原
菌の悪性の原因であるということは、知られている（モ
ンティエ等（Ｍｏｎｔｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅ
ｃｔ。

Ｉａ＋ｎ＋ｕｎｉｔｙ　３ｇ、　１２９６−１２９８．
１９８２））。運動性シュードモナス・アエルギノーサ
株は、１本のべん毛を有している。火傷マウスモデルで
の検定では、非運動性シュードモナス・アエルギノーサ
株が試験的に作られた火傷に接種される場合、運動性株
が使用される場合より高割合のマウスが生き残るという
ことが示された（モンティエ等、上記参照）。

シュードモナス・アエルギノーサの病原性についての別
の検定から、べん毛抗原製剤で免疫された動物は、火傷
を設定し、運動性細菌株に感染させた時、保護されたと
いうことが証明された（ホルダー等（Ｈｏｌｄｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、＋　　Ｉｎｒｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　
３５．２７６−２８０．１９８２戸。

シュードモナス・アエルギノーサのべん毛は、血清学的
方法で研究され、アンソーブ（Ｒ，＾ｎｓｏｒｇ）によ
って、タイプａおよびタイプｂと呼称される２つの主要
なタイプに分類し得ることが示された（Ｚｂｌ、Ｂａｋ
ｔ、Ｈｙｇ、１．Ａｂｔ、Ｏｒｉｇ、Ａ、　２４２．２
２８−２３８．１９７８）。

べん毛（Ｈ）抗原タイプａでは、間接免疫蛍光法の使用
によって、部分抗原ａ。％ａ１％ａｔ、ａ３およびａ４
に分類することができ、これらは、シュードモナス・ア
エルギノーサ株によって種々の組み合わせで発現され、
部分抗原ａ０はタイプａの全てのべん毛に見いだされる
。べん毛（Ｈ）抗原タイプｂは、血清学的に均一な作用
を示し、サブグループを識別することはできない。

アンソーブによると、シュードモナス・アエルギノーサ
については、合計１７種類のＨタイプ、即ち、１種類の
Ｈタイプｂべん毛抗原および、全てのａタイプに存在す
る部分抗原ａ。、および任意に部分抗原ａ、および／ま
たはａ、および／またはａ、および／またはａ４からな
る１６種類の日タイプべん毛抗原ａを分類することがで
きる。アンソーブによって全くサブグループａ。に属し
ていると特性化されたシュードモナス・アエルギノーサ
５１４２および１３０３０株のべん毛を詳しく研究した
ところ、これらは生化学的および免疫学的にべん毛タイ
プｂに一致することがわかった（モンティエ等（Ｍｏｎ
ｔｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｉｎｆｅｃｔ、　ＩＩ１ｍ
ｕｎｉｔｙ４９（３）、　７７０−７７４（１９８５）
）。

多分散性べん毛（Ｈ）抗原（ＦＡｇｓ）の調製法は、Ｐ
ＣＴ公開Ｗｏ８６１０３９７４に記載されティる。細菌
培養を最小培地で生育させ、次いで、界面活性剤で処理
し、その後、培養物からＦＡｇｓを分離する。界面活性
剤で処理する前に、細菌培養を分散させ、せん断工程に
付す。界面活性剤を加えることによって細菌叢からの抗
原の分離を促進し、次に、分別遠心によって分散液中の
抗原を細胞から分離することができる。

次いで、この様にして細菌叢から分離した抗原を、クロ
マトグラフィー精製によって、リボ多糖類、核酸類、塩
類、多糖類等の様な付着している不純物から遊離させる
ことができる。残存する界面活性剤は、更にカラムクロ
マトグラフィー精製工程に付すことによって除去するこ
とができる。

シュードモナス・アエルギノーサ細菌培養を調製するた
めに使用した株および得られた抗原を、以下の表に挙げ
る。

林　　　　　　　Ｈタイプ Ｍ−２ｂ ５１４２　　　　　　　ａ、　（ｂ） ５９４０　　　　　　　　　ａ、ａ。

ＷＲ−５ａｏａ　。

５９３９　　　　　　　ａｏａ３ １２１０　　　　　　　ａｏａ、ａ。

１７００１８　　　　　ａｏａ、ａ。

ヨーロッパ特許公開０２５２０６４の記載から、ＰＣＴ
公開ＷＯ３６１０３９７４にワクチンの成分として記載
されたタイプの各べん毛抗原全てが保護作用を示し、Ｐ
ＣＴ公開ＷＯ３６１０３９７４に記載されたべん毛抗原
で能動免疫されたマウスから得た血清がマウスの受動免
疫に好適であることが理解される。

しかしながら、各抗原およびそれに由来する抗体の保護
効果は、動物モデルおよびホモローガスな系においての
み検出し得、即ち、活性は免疫化のために使用されたべ
ん毛血清型の病原体に対してのみ観察された。

アンソーブにより提案されたＨ抗原血清型検出概要（Ｚ
ｂｌ、　Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ、　１．　Ａｂｔ、　Ｏｒ
ｉｇ、　Ａ２４２．２２ｇ−２３８゜１９７ｇ）による
３００の臨床上シュードモナス・アエルギノーサ単離体
の分析から、全ての運動性シュードモナス病原体の９８
％にタイプａおよび／またはｂの部分抗原が実際に検出
されたことが示されたので、部分べん毛（Ｈ）抗原ａ０
、ａｌ、ａ２、ａ３、ａ４およびｂのいずれの組み合わ
せに対しても効果のあるシュードモナス・アエルギノー
サワクチンを入手したいという医師の方からの要望があ
る。

ヨーロッパ特許公開０２５２０６４に記載の知見による
と、この種のワクチンは、必然的にこれらの部分抗原全
てを含有していなければならず、即ち、多価ワクチンで
なければならない。

本発明は、ヒトにおいて、部分べん毛（Ｈ）抗原ａｏ−
ａ、およびｂのいずれかの組み合わせの運動性シュード
モナス・アエルギノーサ病原体に対して、即ち臨床上重
要な全ての血清型に対して活性な抗体の生成を誘導する
１または２種の抗原を含有し、病原体の運動およびそれ
以上の増殖および再生産を阻害し、ヒト免疫系によるそ
の殺滅を誘導する単価または二価ワクチンを提供するこ
とを目的とするものである。

更に、これらの抗原に対する抗体を含有し、シュードモ
ナス・アエルギノーサ感染症に対する受動免疫のために
使用し得る製剤を提供することも、本発明の目的である
。

本発明によると、この目的は、ワクチンに血清型ａの単
一べん毛（Ｈ）抗原１種を含有させるか、またはワクチ
ンに血清型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原と血清型すのべん
毛（Ｈ）抗原の組み合わせを含有させることで達成され
る。

本発明のワクチンは、血清型ａの単一べん毛（Ｉ４）抗
原および血清型すのべん毛（Ｈ）抗原の両者を含有して
いる二価の構造からなるのが好ましい。

本発明のワクチンの投与によって生成される免疫グロブ
リンは、シュードモナス・アエルギノーサの臨床上重要
な全林の少なくとも９５％と結合し、その運動を阻害し
得るということが証明された。更に、抗体のこの結合が
、ヒト免疫系の食菌細胞による運動性病原体の食菌およ
び殺滅を誘導する。

本発明のワクチンの代表例は、 抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、アスパラ
ギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン
、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシ
ン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニンを６８
：４１：３７：４６：４４ニア３：２９：２９：３７：
３：１０：１６：１６の割合で含有し、４５，９００の
分子量を有する、血清型ａｏａ、の１種類の単一べん毛
（Ｈ）抗原、 または、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、
アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、
グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン
、チロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニ
ンを７６：４４：４０：５２：５０：８１：３２：３２
．：４１：４：１２：２０：１８の割合で含有し、５１
，２５０の分子量を有する、血清型ａ０ａ１ａ２の１種
類の単一べん毛（Ｈ）抗原、 または、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、
アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、
グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン
、チロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニ
ンを６９　：　３５　：　３８：４４：４７：７３：３
０：３０：６０：３：　１２：２１：１６の割合で含有
し、４６．７００の分子量を有する、血清型ａ。ａ３の
単一べん毛（Ｈ）抗原、 または、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、
アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、
グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン
、チロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニ
ンを６４　：　３３　：　３５４２：４４：６８：２９
：２９・３７：３：１０：１９：１５の割合で含有し、
４３，５００の分子量を有する、血清型ａ。ａ３８４の
単一べん毛（Ｈ）抗原 を含有し得る。

好ましい態様によると、上記本発明のワクチンは更に、
抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、アスパラ
ギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン
、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシ
ン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニンを７４
：４８：４８：４９：５１：９１：３８：３０：４３：
４：１３：１８：１８の割合で含有し、５３，０５０の
分子量を有する、血清型すのべん毛（Ｈ）抗原を含有す
る。

本発明のワクチンは、シュードモナス・アエルギノーサ
培養から得た精製べん毛（Ｈ）抗原を滅菌濾過し、所望
によりＡｆ２（ＯＨ）、の様なアジＳ”ントと混合し、
所望により、メルチオラートの様な保存剤を加え、ガレ
ン製剤に製剤化することによって製造される。

シュードモナス・アエルギノーサ感染症に対シて活性な
本発明の免疫グロブリンＧ含有製剤は、各べん毛（Ｈ）
抗原で免疫されたヒト供与者の血漿を硫酸アンモニウム
の様なタンパク沈澱剤で処理し、沈澱した免疫グロブリ
ンＧ含有フラクションを溶解し、それを精製し、それを
ガレン製剤に製剤化することによって製造される。

以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。実
施例１および２はワクチンの製造を例示し、実施例３は
免疫グロブリンＧ含有製剤の製造を例示する。

実施例１　　単価シュードモナス・アエルギノーサべん
毛ワクチン用ワクチン製剤 記述した如く、細菌、シュードモナス・アエルギノーサ
５９４０培養から得、界面活性剤で処理し、せん断し、
クロマトグラフィー処理することによって精製したべん
毛溶液を、蒸留した発熱原（パイロジエン）不含の水で
ｌｏｏｍｙｇ／ｍ＋のタンパク濃度に調節し、固形塩化
ナトリウムおよびメルチオラートを加えて等優性にした
（終濃度、０゜９％ＮａＣａおよび０．０１％メルチオ
ラート）。次いで、溶液を０．２ｍｙｍ滅菌フィルター
で滅菌濾過した。

滅菌濾過試料をタンパク測定した後、べん毛懸濁液を滅
菌ＮａＣｌ２／メルチオラート溶液（０，９％１０．０
１％）で２５ｍｙｇ／ｉｔタンパクに調節し、次いで、
滅菌ＮａＣｌ２／メルチオラート溶液中１％水酸化アル
ミニウム溶液の添加によって、２０ＩＩｙｇ／ｍｌに希
釈した。

アジュバントを加えたワクチンは、ｌ＋ｎｌ当たり、２
０ｍｙｇ　　べん毛タンパク血清型ａ。ａ。

２ｍｇ　　水酸化アルミニウム ９ｍｇ　　ＮａＣ＋２ ０．１１％ｇ　　メルチオラート（安定剤として）を含
有した。

シュードモナス・アエルギノーサ１２１０（血清型ａ０
ａ１ａ２）、５９３９（血清型ａ。ａ、）および１７０
０１８（血清型ａｏａ、ａ、）株を使用し、同様に別の
単価ワクチンを製造することができる。

実施例２　二価シュードモナス・アエルギノーサべん毛
ワクチン用ワクチン製剤 細菌株Ｍ−２および５９３９の培養から得、前記の様に
して界面活性剤で処理し、ゲル濾過することによって精
製したべん毛懸濁液を、蒸留した発熱原不含の水で１０
０ｍｙｇ／ｍｌのタンパク濃度に調節し、固形塩化ナト
リウムおよびメルチオラートを加えて等優性にした（終
濃度、０．９％ＮａＣａおよび０．０１％メルチオラー
ト）。次いで、溶液を０．２ｍｙｍフィルターで滅菌濾
過した。

滅菌濾過試料をタンパク測定した後、べん毛懸濁液を滅
菌ＮａＣ（２／メルチオラート溶液（０，９％１０．０
１％）で希釈し、Ｍ−２べん毛懸濁液を５０ａｙｇ／ｓ
ｌに、５９３９べん毛懸濁液を２５　ｒＱｙｇ／ｍｌに
調節した。この２＠濁液を等容量で合し、滅菌ＮａＣ（
２／メルチオラート溶液中１％水酸化アルミニウム溶液
の添加によって、それぞれ２０および１０　ｍｙｇ／　
ｍ　ｌの抗原濃度に調節した。

アジュバントを加えたワクチンは、ｌ＋１当たり、２０
＋ｙｇ　　べん毛タンパク血清型ｂ１０ｍｙｇ　　べん
毛タンパク血清型ａ。ａ３２ａＩｇ　　水酸化アルミニ
ウム Ｓｍｇ　　ＮａＣ＆ ０．１ｍｇ　　メルチオラート（安定剤として）を含有
した。

上記のシュードモナス５９３９株のべん毛の懸濁液の代
わりに、前記血清型すのべん毛と混合したその他の株か
らの血清型ａ０ａ３のべん毛、および血清型ａｏａｔ：
　ａｏａｌａ２またはａ　ｏａ　３ａ　、のべん毛を使
用し、同様にワクチンに製剤化することができる。

実施例３ ３、ｌ、べん毛ワクチンによる、血漿供与者の免疫 ５０人の自発被験者（ボランティア）にそれぞれ、実施
例１の５９４０培養から製造したワクチン２０…ｙｇを
皮下投与した。４週間後、４０人の被験者にそれぞれ更
に２０ａｙｇを皮下投与し、更に４週間後、２０ａｙｇ
のべん毛抗原で再び免疫した。

免疫によるべん毛抗体の生成を、下記の様なべん毛ＥＬ
ＩＳＡで追跡した。免疫後、３回免疫した被験者から血
漿を採取し、貯蔵した。

３．２．特異性シュードモナス・アエルギノーサべん毛
免疫グロブリン製剤の製造 、米国特許第４，２７６．２８３号に記載の方法によっ
て、抗シュードモナス・アエルギノーサ抗体を含有して
いる免疫グロブリンを分離した。供与者から得た貯蔵血
漿を７．０〜７．２のｐＨに調節し、−２℃の温度に維
持した。この溶液を８重量％のエタノールと混合すると
、実質上フィブリノーゲンを含有する沈澱が生成した。

この沈澱の分離後、エタノール濃度を２５重量％に高め
、温度を一６℃に低下させた。実質上粗製免疫グロブリ
ンからなる生成した沈澱を、リン酸酢酸緩衝液で抽出し
、１２重量％エタノール（ｐＨ５，３、−２℃）と混合
した。沈澱（アルファーおよびベータグロブリンを含有
）を捨て、上清のエタノール濃度を２５重量％（ｐＨ７
，２および温度−１０℃）に高めたところ、免疫グロブ
リンが沈澱した。この様にして製造し、集めたペースト
状ガンマ−グロブリンフラクションを、本発明の以下の
方法で更に処理した； 免疫グロブリンペースト１ｋｇを撹拌下、０．９％Ｎａ
Ｃｌ２溶液２Ｑに溶解し、透析した。その後、タンパク
濃度を２０ｇ／Ｉに調節し、イオン強度を０．１５に調
節した。６．２５のｐＨで１７６ｇ／ｌの硫酸アンモニ
ウムを加え、沈澱を捨て、上清を２７５ｇ／ｌの濃度に
なるまで硫酸アンモニウムと混合し、ｐＨを７，２に調
節した。生成した免疫グロブリン含有沈澱を水に溶解し
、水道水に対して透析した。次いで、１５０ｇ／Ｉグル
コースの存在下、６．０のｐＨおよび０．１５のイオン
強度にて、この溶液に８０　ｇ／　ｌのポリエチレング
リコールを加えた。沈澱を捨て、ポリエチレングリコー
ル濃度を９５　ｇ／　１（ｐＨ６，５〜６．６）に高め
た。新たに生成した沈澱を捨てた。

溶液のポリエチレングリフール含有量を１８０ｇ／　１
（ｐＨ７、２）に高めると、不純物を含まない免疫グロ
ブリンが沈澱した。生成物を遠心し、５回洗浄すること
によって、残存するポリエチレングリコールを除去した
。

この様にして得た静脈内投与用特異性シュードモナスべ
ん毛免疫グロブリンを、蒸留水で５％（Ｗ／ｖ）溶液に
復元した。血清型ａ０ａ３のべん毛に対する特異抗体の
力価を、べん毛ＥＬｆＳＡで測定し、第２表に示す。ｌ
　：　２５．０００で示された力価は、ＥＬＩＳＡで明
瞭に検出し得る陽性反応を示した５％免疫グロブリン溶
液のｌ：２５．０００希釈を表す。

この方法によって、以下に記載のその他のシュードモナ
ス・アエルギノーサべん毛免疫グロブリン製剤全てを製
造した。

本発明のワクチンおよび本発明の、細菌シュードモナス
・アエルギノーサ感染症に対して活性な免播りロプリン
Ｇ含有製剤（シュードモナス・アエルギノーサべん毛免
疫グロブリン製剤）の効果を証明するために、まず、べ
ん毛（Ｈ）抗原（血清型す、ｂ（ａ、）、ａＯａｆｓ　
”１ｌａｌａｆＳａｏａ３およびａ０ａ１ａ２（合計す
ると、臨床上重要なシュードモナス病原菌の６種の部分
抗原全てを含有する）がヒトにおいて抗体を生成させる
ことを説明する。

最後に、上記６種類の重要な血清型のべん毛を、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、付着残存してい
る可能性のある極微量の不純物から分離した。界面活性
剤ＳＤＳとメルカプトエタノールによって脱重合された
フラジェリン（べん毛抗原）を含有しているべん毛バン
ドを、以下の分子量で得た：タイブｂ：５３，０５０、
タイプａ０：５２．０００、タイプａ、ａ、ａ、：　５
　ｔ、２５０、タイプａ、ａ、＋４５，９００、タイプ
ａ　６ａ　ｓａ　ａ　：４３．５００、タイプａ。ａ、
：４６，７００゜分子量は、標準タンパクカルボン酸無
水物（３１，ＯＯＯＭＷ）、オバルブミン（４５，ＯＯ
ＯＭＷ）およびＢＳＡ（６６，２００）のレーンから算
出した。タンパクのバンドをエレクトロトランスファー
によって、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロー
ス箔に移した。ツウィーン８０を飽和させることによっ
て、遊離タンパク結合をニトロセルロース箔上でブロッ
クした後、適当な希釈度のヒト血清中で箔をインキュベ
ートした。この血清は、上記抗原を含有している単価べ
ん毛ワクチンで数回免疫した供与者から得た。最初に、
供与者の血清が免疫前に有意なべん毛抗体力価を有して
いないことをＥＬＩＳＡ対照群によって確かめた。

免疫後のべん毛特異抗体の存在は、ニトロセルロース箔
上の各フラジェリンバンドに対するこれらの抗体の結合
によって検出することができた。

これは、酵素標識した第２の抗体および発色性基質と一
緒に展開させることによって、箔上で見えるようにする
ことができる。染色強度によって、結合した特異抗体の
量を限定的に推断することができる。

結果を第１表に示す。評価のために、ホモローガスな抗
血清で得た染色強度を“＋＋”で記載し、他の血清型を
有するフラジェリンへの抗体の結合をそれに関連づけて
評価する。ニトロセルロース箔上にバンドが認められな
かった場合、表に“を記載した。

第１表　ウェスタンプロットにおけるＨ抗血清の交差反
応 ブ血清 ウェスタン ｂ　　　ｂ（ａｏ） ロットに ａｏａｔ　　　　ａｏａ＋ａｔ　　ａｏａ＋Ｉ　　ａｏ
ａ３ａ４１）　　　　　　　＋＋　　　　＋＋　　　　
　＋　　　　　＋　　　　−ｂ（ａｏ）　　　＋＋　　
　　４４ ａｏＢ、　　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋＋　　
　　　＋　　　　　＋　　　　　＋＋ａｏａ＋ａｔ　　
　＋　　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋＋　　　　
＋＋　　　　＋＋＋ａｏａｓ　　　　　　＋　　　　　
　　＋　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　
十＋　　　　　　＋ａｏａ３ａ４　　＋　　　　　＋　
　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋　　　　　＋＋第
１表から、例えば、ある種のａタイプフラジェリンに対
する血清は、タイプａのその他の抗原に対しても反応す
るので、交差反応性をみることができる。また、抗ａタ
イプフラジェリン抗体は同じａタイプだけでなく、ｂお
よびｂ（ａＯ）タイプフラジェリンにも結合する。しか
しながら、この結合の強さは通常、種々のａタイ１間で
観察される交差反応より明らかに小さい。一方、抗すお
よび抗ｂ（ａｏ）タイプフラジェリン抗体は、タイプフ
ラジェリンに結合しないか、またはかろうじて結合する
。

べん毛（Ｈ）抗原す、ｂ（ａ、）、ａ、ａ２、ａｏａ。

ａ　ｔｓ　ａ　Ｏａ　３、ａ　、、ａ　、ａ　、を使用
して、高力価抗体および静脈内投与用高力価ヒト免疫グ
ロブリンＧ含有製剤を入手し得ることを証明するために
、臨床研究のフェーズＩにおいて、自発被験者を単価抗
原１）−、ａＯｌａ、ａ、、ａ　、ａ　、ａ　ｔｌａ　
、ａ　３およびａ、ａ、ａ、にて定期的間隔で数回免疫
した。これらの供与者から血漿を集め、血清型によって
別個に貯蔵した。これから、実施例３に記載の方法によ
って、静脈内投与用免疫グロブリンＧ製剤を製造した。

以下、これを、それぞれのべん毛血清型を加えたシュー
ドモナスべん毛免疫グロブリン（ＰｓＨ）として記載す
る。即ち、例えばｐｓＨｂはタイプｂ抗原からのべん毛
ワクチンで免疫された供与者の血漿から回収された製剤
を意味する。

フラジェリンＥＬＩＳＡによって、Ｈ血清型特異性力価
を調べた。高純度べん毛製剤を、ドデシル硫酸ナトリウ
ムの１％溶液中、室温で３０分間インキュベートし、こ
れによってべん毛を脱重合してフラジェリンモノマーと
した。次いで、フラジェリン溶液を炭酸バッファー（ｐ
Ｈ９，６）に対してゲル濾過カラムで再緩衝化し、タン
パクの評価の後、０．５ｍｙｇ／ｍｌの濃度に調節した
。次に、この溶液からのフラジェリンを固相担体（微量
滴定トレーまたは巣板のウェル）に結合させた。遊離タ
ンパク結合をリン酸緩衝化食塩水中０，０５％ツイーン
２０溶液でブロックした後、べん毛特異抗体のみが担体
上固定化フラジェリンに結合し得た。

数回洗浄後、結合した抗体を酵素標識した第２の抗体（
抗ヒトＩｇＧ−ＰＯＤコンジュゲート）によって検出し
、比色分析法によって定量的に調べた。測定した力価を
第２表に示し、種々のべん毛抗原の等ｍｙｇｉｌに関連
づける。

力価は、ＥＬＩＳＡにおいてなお明瞭に陽性の反応を示
す５％シュードモナスべん毛免疫グロブリン溶液の希釈
度を示す。

１０個のＥＬＩＳＡ巣板それぞれに結合したタンパクを
加水分解した後、固定されたタンパクの量を、ＥＰ−Ａ
−０２５２０６４に記載の精製べん毛抗原のアミノ酸成
分を使用し、アミノ酸分析によって測定した。

第２表　免疫グロブリン製剤のＥＬＩＳＡ力価５Ｈ−ｂ ＰｓＨ−ａｏａ。

ＰｓＨ−ａｏａｓ ＰｓＨ−ａ、ａ、ａ。

ＰｓＨ−ａｏａ、ａ。

Ｍ−２１１０，０００ ５９４０１：２５，０００ ５９３９　　　　１：３０，０００ １２１０　　　　１２５．０００ １７００１８　　１：３５，０００ 次に証明することは、この様にして得たシュードモナス
免疫グロブリン製剤からの抗体がホモローガスなべん毛
血清型のフラジェリン分子に結合し、更に単一供与者の
血清で観察された交差反応性・（第１表）が高免疫グロ
ブリン製剤でも起こることである。

前記と同様にしてべん毛製剤のウェスタンプロットを調
製した。ヒト血清の代わりに、５種類の高免疫グロブリ
ン製剤の溶液を第１の抗体として使用し、これらをべん
毛ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって等力価に調節し、次に更に適
当に希釈した。第１表の記載と同様にして、プロットの
展開および評価を行った。

結果を第３表に示す。

第３表　べん毛特異的シュードモナス免疫グロブリン製
剤の交差反応性 ＰｓＦＩｂ　　　　　　　＋＋　　　　　＋＋　　　　
　　（＋）　　　　　（＋）　　　　　（＋）ＰＳＨａ
ｏａｓ　　　＋　　　　　　　　　＋＋　　　　＋＋　
　　　＋＋ＰＳＨａｏａ＋ａ！＋　　　　＋　　　　＋
　　　　＋＋　　　　＋４ＰｓＨａｏａｓ＋＋＋＋÷十
＋＋ 単一供与者の血清で既に証明された様に、ａサブクラス
成分のいずれかのフラジェリン分子を有するａタイプべ
ん毛に対して導かれた全ての抗体の強い交差反応性は、
調べた免疫グロブリン製剤についても観察される。ａタ
イプべん毛に対して導かれた抗体の（より弱い）結合が
ｂタイプフラジェリンに対してもおこり得ることが、同
様に明らかである。ａタイプフラジェリンに対す２るｂ
タイプ抗体の結合は比較的弱いが、なお明瞭に検出する
ことができる。

運動性シュードモナス・アエルギ／−サ病原体に対する
本発明の抗体の活性は、その運動の阻害およびそれによ
る感染の病巣の広がりの阻害によるものであると考えら
れる。

運動の阻害は、軟寒天遊送集落トレーにおいて証明する
ことができる。濾紙周縁をＨＢＳＳＧ中０．５％ＰｓＨ
溶液２０ｍｙｌに浸した。これを、病原体懸濁液を軟寒
天に浸透させた後のｌＯｍｙｌ中１０ｈ５病原体の接種
物の上に置いた。運動の阻害の程度を、同様のトレーに
適用した対照によって調べた。この場合、ゼラチンを加
えたバンク（Ｈａｎｋ’　ｓ）平衡塩類溶液に浸した濾
紙周縁を接種物の上に置いた。ウェスタンプロットと同
様に、種々のａ血清型べん毛および調べた全ての病原体
に対する抗体と、種々のａサブタイプ成分のべん毛の間
に交差反応が認められた。ウェスタンプロットにおいて
観察されたａタイプ抗体とｂべん宅間の交差反応も、観
察することができた。ｂタイプ抗体と全てのサブクラス
のａタイプべん宅間の交差反応は、ウェスタンプロット
より顕著であた。

結果を第４表に示し、抗体と一緒にインキ１ベートした
病原体の遁走ゾーンの直径を、同一トレー上抗体不含の
対照群と比較した。“十＋”は、遊走ゾーンの直径が対
照のそれより少なくとも４０％小さいことを意味し、“
＋”は、直径が対照のそれより少なくとも２０％、多く
とも４０％小さいことを意味する。

第４表　運動阻害試験におけるＨ抗体の交差反応ｂ　　
　　　　　　＋＋　　　　　＋＋　　　　　＋＋　　　
　　＋ａｏａ＋ａｔ＋十＋＋ ａｏａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋
　　　　　＋＋　　　　　＋＋ａｏａ３　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋　　　　　
＋＋第４表の結果は、べん毛（Ｈ）抗原で得た本発明の
抗体がシュードモナス細菌株の運動を阻害することを示
している。

病巣に存在する細菌の運動を阻害することによって、患
者の体内においてコロニー形成した後にそれが更に広が
ることは妨害されるが、病巣に存在する細菌は、例えば
毒素、プロテアーゼ類等を放出することによって患者の
生体を圧迫するその活性をなお保持している。従って、
感染症に対する適切な保護は、能動免疫によって生成さ
れた抗体が侵入物である細菌を急速に殺滅する場合にの
み保証される。

以下に、べん毛（Ｈ）抗体が食菌作用およびホモローガ
スなシュードモナス細菌株の細胞内殺滅を誘導する証拠
を提供する。

食菌作用試験を行うために、Ｍ−２（ｂ）、ＷＲ５（ａ
、ａ、）、１２１０（ａ、ａ、ａ、）、５９３９（ａｏ
ａｓ）および１７００１８（ａ、ａ、ａ、）株の病原体
をルリアブロス培地（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ　Ｍｅｄ
ｉｕｍ）で増殖させ、ＨＢＳＳＧ中定常増殖期の開始直
前に、１ｇ＋１当たり８．１０ｈ８病原体の生存病原体
数に希釈した。

５％べん毛免疫グロブリン製剤全てについて、ＨＢＳＳ
Ｇ中１：１８．１ニア２および１：２８８希釈液を調製
した。これらの希釈液からの各々４５０ｓ＋ｙｌを、５
０ｍｙｌ病原体懸濁液および４．５１１１ＨＢｓｓＧと
一緒に、氷上で２時間インキュベートした。このインキ
ュベージクンの間に、細菌細胞に対する特異抗体の結合
が生じた。

食菌細胞として、ヒト顆粒細胞を使用する。これらは、
新たに分離した軟膜（白血球層）から得た。

この軟膜は、食塩水デ牛ストロースデキストラン溶液処
理によって赤血球の大部分が除去された。

次に遠心工程を数回行うことによって、残存する赤血球
および血小板が大部分除去された。食塩水中で洗浄後、
クルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）計数器で細胞の数を調べ、
１．１０ｈ７細胞／ＩＩＩＨＢｓｓＧに調節した。この
細胞懸濁液から、血球分画をとった。

リンパ球に対する顆粒細胞の割合を、約６：４の標準範
囲とした。単核細胞の含有率は通常、４〜８％の範囲で
ある。食菌作用試験では、これらの基準に適合する細胞
単離物を使用することができる。

血液型ＡＢの供与者の貯蔵血液からの吸収ヒト血清（Ａ
ＢＡ）を、補体供給源として使用した。その前に、血清
を前記の全ての病原体に吸着させ、病原体当たり１ｍｌ
の血清を５Ｘ１０ｈ９病原体と一緒に氷上で０．５時間
インキュベートした。それぞれインキュベーションした
後、８，０００ｇで５分間遠心した。最後のインキュベ
ーション後、これを１４，０００ｇで１５分間、更に遠
心した。

吸収後、Ｃ’８５０単位中の血清の補体含有量を検定し
た。これは、出発物質である血清のそれより１５％低か
った。この様にして得たＡＢＡ血清をバンク（Ｈａｎｋ
″Ｓ）緩衝液中、ｌ：５０に予め希釈し、食菌作用試験
で使用した。

食菌作用試験混合物に、顆粒細胞懸濁液１００ｎ＋ｙｌ
、病原体懸濁液６０ｍｙｌおよび吸収ＡＢ血清４０１１
１ｙｌを微量滴定トレーのウェル中で混合した。

混合直後および３７℃で１時間インキュベートした後、
試験混合物から２５ｏ＋ｙｌを採取し、２回蒸留水５ｍ
ｌで希釈した。これによって、顆粒細胞は浸透圧により
崩壊され、それに含有された細菌細胞が放出される。こ
の懸濁液２５ｍｙｌをプレートし、生存病原体数を調べ
た。０および６０分の値のコロニー数に基づき、以下の
式： ｔ＝６０における数 によって殺滅割合を算出した。

対照値の算出は、抗体が負荷された病原体の代わりに非
負荷病原体が使用された試験で得られたｔ＝Ｑおよびｔ
＝６０分の生存病原体値に基づいた。この様にして得た
６０および０分の値からの商を上の式において対照値と
して代用した。

食菌作用試験の結果を第５表に示す。

第５表　ヒト顆粒細胞による、べん毛抜体でオブソニン
化された後のシュードモナス・アエルギノーサの殺滅 ＰｓＨｂ　　　　　１：　　３０ ＰｓＨａｏａ！ｌ：　　６０ ＰＳＨａａａｓ　　　１：　　７８ ＰｓＨａｏａＩａｘ　　１：　　６０ ＰｓＨａｏａｓａａ　　１：　　７８ 高い＊　高い　　４０ １０５　　　高い　１０８ ２００　　　高い　１２５ 高い　）９０　　８０ ＊：使用された病原体の５０％までが、全ての抗体濃度
で殺滅された。

表に記載された力価は、食菌作用試験で使用された病原
体の５０％の殺滅割合に達するために、混合物５ａｌ中
４Ｘ１０ｈ８病原体のオプソニン化のために調節されね
ばならなかったＨタイプ特異的べん毛免疫グロブリン製
剤の濃度を示す。これらの食菌作用力価は、べん毛ＥＬ
ＩＳＡで求められたホモローガスな抗体力価の絶対値お
よび使用された病原体の５０％がそれぞれ（ホモローガ
スまたはへテロローガス）のべん毛免疫グロブリンによ
って殺滅された食菌作用検定で求められた希釈因子から
の商として算出された。

第５表から、シュードモナスべん毛免疫グロブリン製剤
がホモローガスおよびヘテロローガスなべん毛血清型を
有する病原体をオブソニン化することがわかる。とりわ
け印象的なことは、全てのＰｓＨａ製剤とａタイプおよ
びｂタイプ病原体との交差反応である。とりわけ低濃度
のＰｓＨａ。

ａ、がａタイプおよびｂタイプべん毛を有する病原体の
食菌作用を生じる。ｂタイプ病原体を殺滅するためには
、ＰｓＨｂ製剤より高濃度のＰｓＨａ製剤が必要とされ
る。

これらの結果は、ａ、ａ、特異性を有する抗体が全ての
臨床上重要なべん毛血清型を有する病原体からの保護作
用を示し、この保護作用は、ａｏａ。

抗体およびｂ抗体からなる混合物においては、ｂタイプ
べん毛を有する病原体について増強されるに違いないこ
とを示している。

高純度のべん毛抗原で免疫された供与者の血漿から分離
された抗体が、シュードモナス・アエルギノーサ感染症
に対する保護作用を有するか否かは、いままで知られて
いなかった。前記食菌作用試験によって、全ての臨床上
重要なＨ血清型に特異性を有するＰｓＨ製剤について、
この作用が証明された。

以下の第６表に、本発明の単価抗体製剤ＰｓＨａｏａ、
の効果および実施例２に記載の方法によって製造された
本発明の二価製剤であるＰｓＨｂ／ａ、ａ、、Ｐ　ｓＨ
ｂ／　ａ　ｏａ　ｌａ　ｔ、ＰｓＨｂ／ａ　ｏａ　３お
よびＰ　Ｓ　Ｈｂ　／　ａ　６　ａ　３　ａ　４の活性
を示す。

第６表 食菌作用試験における治療用シュードモナス免疫グロブ
リン製剤の効果 ＰｓＨａｏａ＊　　　　１：　　　６０　　１０２　　
１２０　　８６　　６５標準　　　　１：　　　３　　
１９　　３１　　２８　　９ＰｓＨｂ／ａｏａｔ　　　
ｌ：　　　　６　　２４　　３０　　８０　　２０Ｐｓ
Ｈｂ／ａｏａ、ａ＊ｌ：　　　　５　　２８　　５９　
　３２　　１３ＰｓＨｂ／ａｏａｓ　　　１：　　　１
１　　２ａ　　　３２　　２５　　　７ＰｓＨｂ／ａｏ
ａｓａａｌ：　　　１９　　３４　　１５　　５４　　
　６第６表では、食菌作用試験における製剤ＰｓＨａｏ
ａ、の効果が最初に記載されている。力価データは、次
の食菌作用試験において病原体の５０％殺滅に達せしめ
るために病原体を負荷する時に調節、されるべきこれら
の免疫グロブリン濃度を表す。

第１図は、これらの力価を調べた方法を示している。即
ち、この方法は、５％ＰｓＨａ　ｏａ　、溶液の１：１
８．１ニア２および１　：　２８８前希釈液４５０ｍｙ
ｌを、８Ｘ１０ｈ８　５９４０病原体／ｍｌの懸濁液５
０＋ｓｙｌおよびゼラチンを加えたバンク緩衝液４．５
ｍｌと混合する。その後、１：２００、ｉ　：　ｓｏｏ
およびｌ：３，２００の最終希釈液とする。べん毛ＥＬ
ＩＳＡで求めたＰｓＨａ　ｏａ　ｔの力価は、１　：　
２５，０００である。細菌を負荷する間のべん毛抗体の
濃度を、１　：　１２５、ｌ：３１．３および１ニア、
８で評価する。第１図では、食菌作用試験で得られた病
原体殺滅割合（絶滅）を、これらの免疫グロブリン濃度
に対してグラフ化する。これらの殺滅曲線から、調べた
病原菌の５０％が殺滅される、表に示された免疫グロブ
リンの濃度を求めることができる。

ＰｓＨａ　ｏａ　、製剤の効果を評価するために、第６
表に記載の５種類のＰｓＨ製剤全ての混合物である標準
物質を、各成分全てを１：２，０００のＥＬＩＳＡ力価
に調節した対照として使用した。

更に、第６表は、ＰｓＨｂと、製剤ＰｓＨａ　ｏａ　、
、ＰｓＨａｏａ、ａｔ、ＰｓＨａ、ａ３およびＰｓＨａ
　、ａ　ｆｆａ４各々との混合物の効果を示す。これら
の混合物を、約１ニア、５００の抗−す力価および同程
度のホモローガスな抗−ａ力価に調節した。第６表は、
全ての臨床上重要な血清型のべん毛エピトープを有する
シュードモナス・アエルギノーサ株について、これらの
免疫グロブリン混合物で求めた食菌作用力価を示す。

これらの力価は、ｌニア、５００の力価に基づくと、次
の食菌作用試験で使用される病原体の５０％殺滅を得る
ために、病原体を負荷するときに免疫グロブリン混合物
濃度を両成分について調節しなければならなかったとい
うことを表している。

第２図から、ＰｓＨｂおよびＰＳＨａｏａｓの混合物に
ついて、これらの力価が求められた方法を理解すること
ができる。即ち、１７，５００のｂ−およびａ。ａ３力
価を生じる、ＰｓＨｂ　　ｆｍｌおよびＰｓＨａｏａｓ
　Ｏ，３３ｉ１の混合物を前記の様に更に希釈し、食菌
作用試験で使用した。第２図では、食菌作用試験で得ら
れた殺滅割合を、細菌を負荷している時に存在するｂお
よびａ。ａ３３成分についての抗体力価に対してグラフ
化した。

第６表は、ＰｓＨａ　ｏａ　を製剤は全ての関連血清型
に対して活性であるが、その効果は標準物質の効果はど
明瞭ではないということを示゛している。

一方、ＰｓＨｂおよび製剤ＰｓＨａｏａｔ、ＰｓＨａ。

ａ、ａ２、ＰｓＨａｏａａまたはＰｓＨａｏａｓａ４の
うちの１種からなる混合物は、標準物質である製剤の効
果にほとんど等しい効果を有しており、個々の成分の製
剤の効果より明らかに大きい（ｃｌ第５表）。この事実
を説明するために、種々の製剤および混合物についての
平均力価をコラム０に記載する。

血清型すおよびこれから試験しようとする４種類のａサ
ブタイプの組み合わせの１つのべん毛抗原で免疫された
供与者の血漿から、混合することによって得られた免疫
グロブリン製剤は、全ての臨床上重要な血清型のべん毛
を有する病原体の殺滅を誘導することができる。上の結
果によると、べん毛抗原すおよび抗原ａｏａｔ、ａＧａ
ｌａ、、ａ８ａ、またはａ。ａ３ａ、の１種からなる本
発明の二価ワクチン、またはその適用後に得られる本発
明の免疫グロブリン製剤も、当然、べん毛を有するシュ
ードモナス・アエルギノーサ細菌を有する感染症から保
護し得る。

能動免疫に使用しようとする抗原の保護的作用の直接の
証明は、動物モデルにおいてのみ可能であり、以下に説
明する。

患者がシュードモナス感染症に罹患し易い状況を模倣す
るために、文献記載の２種類の動物モデル、即ち、火傷
を有するマウスモデル（ステイエリッツおよびホルダー
（Ｓｔｉｅｒｉｔｚ、Ｄ、Ｄ、　ａｎｄ　　１．ＡＨｏ
ｌｄｅｒ　（１９７５）　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉ
ｓ、　１３１．６８８−６９１乃、およびエンドキサン
（Ｅｎｄｏｘａｎ）モデル（クリッノ、ヒューラー、ジ
ャーマニア−（Ｃｒｙｚ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｊｒ、　、　
Ｆｕｒｅｒ。

Ｅ、、　Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ、Ｒ，（１９８３）、　　
１ｎｆｅｃＬ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４０゜６５９−６６
４戸を使用した。

両モデルについて、非免疫動物におけるシュードモナス
・アエルギノーサのＬＤ５０投与１を調べた。エンドキ
サンモデルの場合、免疫抑制され、火傷マウスモデルの
場合、一定サイズの火傷が設定された。第７表に記載の
べん毛（Ｈ）抗原で免疫した後、火傷動物および免疫抑
制動物を、複数の、予め決められたＬＤ５０病原体数の
ホモローガスなシュードモナス株で感染させた。第７表
は、工ンドキサンおよび火傷マウスモデルにおいて、記
載の抗原濃度で免疫された動物が１００％耐性な、ＬＤ
５Ｑ病原体数（倍数）を示す。結果は、正常および免疫
抑制動物における二価べん毛ワクチンの効果を実証して
いる。

第７表　シュードモナス・アエルギノーサべん毛ワクチ
ンによる能動的保護の検定 アシュバンチャレンシエント　　ンノ　マウストとして
の前免疫日数モデル　　　モデルＡｌ　（ＯＨ）　ｓ量
　　　　　　保護因子　　保護因子ｂ　　　　３ｍｙｇ
　　　　　１４　　　　ｂ　　　　３ＸｌＯ’　　＞１
０’ａａａｓ　　１，５ａ＋ｙｇ　　　　１４　　　　
ａｏａ３２ｘｌＯ’　　１０３ｂ／ａｏａａ　３／Ｌ　
５ＩＩＩｙｇ ｂ　　　　　１０” ａｏａｔ　　４ｘｌＯ’ ａａａ＋ａ＊　２Ｘ１０’ ａｏａ３１０” ａｏａ＋ａｔ Ｏａｗ ｏａ３

【図面の簡単な説明】

図面の第１図は、食菌試験における免疫グロブリン濃度
と病原体殺滅割合の関係を示すグラフであり、第２図は
、食菌試験における抗体力価と病原体殺滅割合の関係を
示すグラフである。 特許出願人　イムノ・アクチェンゲゼルシャフト・フユ
ールｅへミシューメディツィニッ シェ・プロデュクテ 代　理　人　弁理士　青　山　　葆　　はか１名殺滅割
合（％） 殺滅割合（％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス・アエルギノーサ感染症に対して活
   性な、部分べん毛（Ｈ）抗原ａ＿０、ａ＿１、ａ＿２、
   ａ＿３、ａ＿４およびｂのいずれかの組み合わせに対す
   る効果を有するワクチンであって、血清型ａの単一べん
   毛（Ｈ）抗原、または血清型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原
   と血清型ｂのべん毛（Ｈ）抗原の組み合わせを含有する
   ことを特徴とするワクチン。 ２、血清型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原、または清型ａの
   単一べん毛（Ｈ）抗原と血清型ｂのべん毛（Ｈ）抗原の
   組み合わせを含有するワクチンで免疫された供与者の血
   漿から得た免疫グロブリンＧ含有製剤であって、シュー
   ドモナス・アエルギノーサ病原体の運動を阻害し、該病
   原体の食菌作用を促進し、オプソニン化された病原体の
   殺滅を誘導する免疫グロブリンＧ含有製剤。 ３、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、アス
   パラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリ
   シン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チ
   ロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニンを
   ６８：４１：３７：４６：４４：７３：２９：２９：３
   ７：３：１０：１６：１６の割合で含有し、４５，９０
   ０の分子量を有する、血清型ａ＿０ａ＿２のべん毛（Ｈ
   ）抗原を含有する請求項１に記載のワクチン。 ４、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、アス
   パラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリ
   シン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チ
   ロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニンを
   ７６：４４：４０：５２：５０：８１：３２：３２：４
   １：４：１２：２０：１８の割合で含有し、５１，２５
   ０の分子量を有する、血清型ａ＿０ａ＿１ａ＿２のべん
   毛（Ｈ）抗原を含有する請求項１に記載のワクチン。 ５、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、アス
   パラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリ
   シン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チ
   ロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニンを
   ６９：３５：３８：４４：４７：７３：３０：３０：６
   ０：３：１２：２１：１６の割合で含有し、４６，７０
   ０の分子量を有する、血清型ａ＿０ａ＿３のべん毛（Ｈ
   ）抗原を含有する請求項１に記載のワクチン。 ６、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち、アス
   パラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリ
   シン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チ
   ロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギニンを
   ６４：３３：３５：４２：４４：６８：２９：２９：３
   ７：３：１０：１９：１５の割合で含有し、４３，５０
   ０の分子量を有する、血清型ａ＿０ａ＿３ａ＿４のべん
   毛（Ｈ）抗原を含有する請求項１に記載のワクチン。 ７、更に、抗原が単量体成分からなり、アミノ酸、即ち
   、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸
   、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシ
   ン、チロシン、フェニルアラニン、リシンおよびアルギ
   ニンを７４：４８：４８：４９：５１：９１：３８：３
   ０：４３：４：１３：１８：１８の割合で含有し、５３
   ，０５０の分子量を有する、血清型ｂのべん毛（Ｈ）抗
   原を含有する請求項３、４、５または６に記載のワクチ
   ン。 ８、シュードモナス・アエルギノーサ感染症に対して活
   性な、部分べん毛（Ｈ）抗原ａ＿０、ａ＿１、ａ＿２、
   ａ＿３、ａ＿４およびｂのいずれかの組み合わせに対す
   る効果を有する、血清型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原、ま
   たは血清型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原と血清型ｂのべん
   毛（Ｈ）抗原の組み合わせを含有してなるワクチンの製
   造方法であって、シュードモナス・アエルギノーサ培養
   からべん毛（Ｈ）抗原を得、精製および滅菌濾過し、ガ
   レン製剤に製剤化することからなる製造方法。 ９、べん毛（Ｈ）抗原をアジュバントと混合する請求項
   ８に記載の方法。 １０、アジュバントがＡｌ（ＯＨ）＿３である請求項９
   に記載の方法。 １１、べん毛（Ｈ）抗原を保存剤と混合する請求項８に
   記載の方法。 １２、保存剤がメルチオラートである請求項１１に記載
   の方法。 １３、シュードモナス・アエルギノーサ感染症に対して
   活性な、血清型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原、または血清
   型ａの単一べん毛（Ｈ）抗原と血清型ｂのべん毛（Ｈ）
   抗原の組み合わせを含有してなるワクチンで免疫された
   供与者の血漿から得た免疫グロブリンＧ含有製剤の製造
   方法であって、各べん毛（Ｈ）抗原で免疫されたヒト供
   与者の血漿をタンパク沈澱剤で処理して免疫グロブリン
   Ｇ含有フラクションを沈澱させ、該免疫グロブリンＧ含
   有フラクションを溶解し、精製し、ガレン製剤に製剤化
   することを特徴とする製造方法。 １４、タンパク沈澱剤が硫酸アンモニウムである請求項
   １３に記載の方法。