JPS635029A - 緑膿菌感染症ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は緑膿菌（シュードモナス・アエルギノサ、ｐｓ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　Ｗ染
症に有効なワクチンに関するものである。さらに詳しく
は、本発明は、緑膿菌感染症に有効な、能動免疫のため
の防御的緑膿菌鞭毛（Ｈ）抗原を含有するワクチン、並
びに、受動免疫のための免疫グロブリン□ Ｇ含有製剤？提供するものである。

従来技術 緑膿菌は、主として火傷を負った人々、嚢胞性線維症患
者ま念は器質機能欠損患者、並びに腫瘍患者等の免疫防
ａを損傷されている患者の院内感染に伴ってしばしば見
出される日和見感染性病原体である。シュードモナス属
による感染に対する抗生物質の効果は、耐性菌が出現す
ることによって制限されており、緑膿菌培養物に対して
有効な免疫学的手段の開発が試みられていた。

感染の引き金となるのは種々の、０群抗原を産生ずる菌
株またはＨ−抗原を産生ずる菌株である。

アンソーブ（Ａｎｓｏｒｇ、　（Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、
　　Ｈｙｇ、　Ｉ。

Ａｂｔ、ｏｒｉｇ、）Ａ２４２．２２８−２３８（１９
７８））によると、緑膿菌は、免疫螢光法によって１部
分抗原頌ａ□＋ａ１　＋ａ２＋ａ３＋ａ４からなる複合
体鞭毛（Ｈ）抗原ａと、単一の鞭毛（、Ｈ）抗原セに分
類することができる。部分因子ａ。〜ａ、は独立の決定
基であるので、数個のＨ型を有する抗原パターンが得ら
れる。０群とＨ群とは自由な組み合わせ全示す。

緑膿菌培養物の調製に用いられた菌株、および生産され
た抗原類？下記の表１１Ｃ示す。

表１ １　　１７０００１　−　　ｂ Ｍ−２−ｂ ２　　　　５１４２　　　　−　　　ａ０３　　　　５
９４０　　　　　　　　”Ｏ’ａ２”％５９８９　　　
　　　　　　Ｑ３ ５　　　　５９３３　　　　−　　　ａ０、ａｌ、ａ２
１２１０　　　　−、　　ａ０、ａ１＋ａ２１６９９０
　　　−　　　ａ０、ａｌ　、ａ２６　　１７００１８
　−　　ａ０、ａ３．ａ４振盪、ホモシネ−ジョンおよ
び遠心分離によって単離された鞭毛抗原のフィラメント
〔アンソーブ（Ｒ，Ａｎｓｏｒｇ）、シュミット（Ｗ、
Ｓｃｈｍｉ　ｔ　ｔ）メト・マイクロバイオ口・イムノ
ロ（Ｍｅｄ、　Ｍｉ　ｃ　ｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、ノコは鞭毛と鞭毛フラクションからなると共に、
リポ多糖類（ＬＰＳ）と栄養培地由来の不趣物とを伴っ
ている。そのような製剤は本来発熱性であり、ヒトに投
与するには不適当である。

ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ３６１０３９７４には１つの精
製工程によって得られた、発熱物質不含の多分散形の天
然の緑ｉ１３菌鞭毛（Ｈ）抗原（ＦＡＧ〕の構造が記載
されている。それらの抗、児は、それぞれ、以下の単量
体成分： ａ）アミノ酸類：アスパラギン酸またはアスパラギン（
Ａｓｐ／Ａｓｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓ
ｅｔ）ｓグルタミン酸またはグルタミン（、Ｇ　１　ｕ
／Ｇ　ｌ　ｎ　）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａ
ｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、
ロイシン（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルア
ラニン（Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ）％アルギニン（Ａ
ｒｇ）、および場合によりトリプトファン（Ｔｒｐ）ｆ
含有しており、 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン−ロイシン−スレオ
ニン−バリン−アスパラギン−スレオニン−アスパラギ
ン−イソロイシン−アラニン−？含有しており、 Ｃ）分子量が４３．５００〜５３．０５０であって、 ｄ）プロリン（Ｐｒｏ）、メチオニン（Ｍ　ｅ　ｔ　）
セミシスティン（１／２Ｃｙｓ）およびヒスチジンを含
んでいない単量体成分を含有している。

また、個々の型の鞭毛（Ｈ）抗原は、アミノ酸：アスパ
ラギン酸ま念はアスパラギン、スレオニン、セリン、グ
ルタミンａｔたはグルタミン、グリシン、アラニン、バ
リン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルア
ラニン、リジンおよびアルギニンとそれぞれある比率で
含有している単量体からなることを特販とする。単量体
形鞭毛ｔＨ）抗原の上記の比率および分子量を表２に示
す。

発明の構成および目的 多分散形の天然の緑膿菌鞭毛（Ｈ）抗原を得るｆＣＷ）
　Ｇ（、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ３６１０３９７４に従
って最小培地中で細胞培養全開始して増殖させた後、界
面活性剤で処理して鞭毛（Ｈ）抗原を培養から分離した
。この場合、界面活性剤処理の前ＶＣ＠胞培養を壊し、
剪断処理にはすか、あるいは界面活性剤の存在下で剪断
力を課してもよい。

界面活性剤と加えることにより維胞塊から抗原を分層し
易くなる。ついで、溶液中の抗原を分離する。

次に、クロマトグラフィー精製法により、上記のクロ＜
にしてａ　ｆ＠塊から分離した抗原を、それに物から分
離することができる。さらに、残っている界ｈａ性剤を
カラムクロマトグラフィーによる精製工程を経て除去す
る。

これまでは、これらの抗原が防御作用を有しているか否
かは仰られていなかつ之。しかし、本発明者らは、ＰＣ
Ｔ特許出願公開ＷＯ８６／ｌ）　３９７４８に記載され
ている全ての型の鞭毛（Ｈ）抗原に、防御作用のあるこ
と金兄い出した。従って、これを用いて一価または多価
ワクチン？製造し、ｆｌ、１用することができる。これ
が本発明の目的である。。

特に本発明は緑１濃菌思染症、と２つわけ火傷の危険性
の高い人々、例えば消防隊員や１人等、並びに免疫抑制
治療を受けている人々′Ｌ分いて有効な緑１！１２菌思
染症の免疫予防法を得ることを目附とするものである。

また本発明は、免疫グロブリンＧ含有製剤であって、緑
１１農菌感染症に対する受動免疫に適した製剤全提供す
ることを目的とするものである。

本発明のワクチンは、血清型ａおよびｂの防御的鞭毛（
Ｈ）抗原であって、それぞれ、以下の単量体成分： ａ）アミノ酸類：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニ
ン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒｌ、グルタミンケ（Ｇ　
１　ｕ）、グリシン（ＧＩｙ）、アラニン（Ａｌａ）、
バリン（Ｖａｌ）、イソロイシンｔｌｌｅ）、ロイシン
（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（
Ｐｈｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、
およびおそらくトリプトファン（ＴｒｐＪおよびメチオ
ニン（Ｍ　ｅ　ｔ　）を含有しており。

ｂ）　Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン（Ａｌａ）−ロイ
シン（Ｌｅｕ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａ
ｌノーアスパラギン（Ａｓｎ）−スレオニン（Ｔｈｒ）
−アスパラギン（Ａｓｎノーイソロイシン（ｌｌｅ）−
アラニン（Ａｌａ）を含有しており、 Ｃ）分子量が４３．５００〜５３．０５０であって、 ｄ）プロリン、セミシスティンおよびヒスチジンを含ん
でいない単量体成分からなる鞭毛（ＨＪ抗原を含有して
おり、発熱成分を含有していないことを特徴としている
。

さらに詳しくは、本発明のワクチンの構成成分である６
種類の特異的なＨ−血清型は下記の特徴を有する。

Ｈ−血清ｆｆ１ａ０、ａ３、ａ４の鞭毛（Ｈ）抗原であ
って、その単量体型はアミノ酸：アスパラギン酸、スレ
オニン、セリン１グルタミン酸、グリシン、アラニン、
バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニル
アラニン、リジンおよびアルギニン″ｆ：６４：３３：
３５：４２：４・シ：６８：２９：２９：３７ｉ１１０
：１９：１５の比率で含有しておりその分子量は４３．
５００である。

Ｈ−血清型ａ０、ａ３　　の鞭毛（Ｈ）抗原であって、
その単量体型はアミノ酸：アスパラギン酸、スレオニン
、セリン１グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン
、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニ
ン、リジンおよびアルギニンを６９＝３５：３８：４４
：４７：７３：３０：３０：６０：３：１２：２１：１
６の比率で含有しておりその分子量は４６．７００であ
る。

Ｈ−血清型ａ。の鞭毛ｔＨ）抗原であってその単量体型
はアミノ酸：アスパラギン酸、スレオニン、セリン１グ
ルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジンお
よびアルギニンを７４：５０：４９：４９：４９：８９
：３７：２９：４４：５：１１１１１６の比率で含有し
ており、その分子量は５２．７２０である。

Ｈ−血清型すの鞭毛（Ｈ）抗原であって、そのフェニル
アラニン、リジンおよびアルギニンを７４：４８：４８
：４９：５１：９１：３８：３０：４３：１１３：１８
ｊ１８の比率で含有しておりその分子量は５３．０５０
である。

Ｈ−血清型ａ０、ａｌ、ａ２の鞭毛（Ｈ）　、ｘ原でち
って、その単量体型はアミノ酸：アスパラギン酸、スレ
オニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、
バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニル
アラニン、リジンおよびアルギニン’ｒ７６：４４：４
０：５２：５０：８１：３２：３２：４１：４：１２：
２０：１８０比率で含有しておりその分子量は５１．２
５０である。

Ｈ−血清型ａ０、ａ２の鞭毛ｔＨ）抗原であって、その
単量体型はアミノ酸：アスパラギン酸、アラ０′・パす
′・　４７″′イ″・△チｏ′７・　７エ二ルアラニン
、リジンおよびアルギニン？６８：４１：３７：４６：
４４：’１３：２９：２９：３７：３二１０：１６：１
６の比率で含有しておりその分子量は４５．９００であ
る。

本発明のワクチンの製造方法は、緑膿菌の培養物から得
、積装した鞭毛（Ｈ）抗原と滅菌濾過し、随意、Ａ　１
　（ＡＯＨ）　３等のアジュバント、並びに所望により
、マーチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）等の保存
剤等を加えることからなる。

さらに本発明は、緑膿菌感染症の予防および治療に有効
な免疫グロブリン−〇−含有裂剤であって、防御的鞭毛
（Ｈ）抗原によって免疫され念ヒト供与体または哺乳類
の血漿から得た鞭毛（Ｈ）抗体を含有することを特徴と
する製剤を提供するものである。

これらの鞭毛（Ｈ）抗体は、緑膿菌の能動運動を阻害す
るとともに、該菌に対する食細胞作用および細胞内殺菌
作用を促進し得る。

本発明の好ましい実施態様においては、防御的な鞭毛（
Ｈ）抗原によって免疫されたヒト供与体または哨乳類の
血漿を硫酸アンモニウム等のタンパク沈降剤で処理し、
析出した免疫グロブリン−Ｇ−含有画分を溶解させた後
、精製しく精製は、該溶液を単量体または重合体の形の
精製鞭毛抗原を共有結合させた担体媒質に通し、ｐＨを
変化させるか、またはＮＨ４ＳＣＮのようなカオトロピ
ック試薬金柑いることによってゲルから鞭毛特異的抗体
を溶離することによって都合よく行なえる）、これ全生
薬製剤に製剤化することにより、緑膿菌思染症の予防お
よび治療に有効な免疫グロブリン−Ｇ−含有製剤全製造
する。

以下、実施例を挙げ本発明をさらに詳しく説明する。実
施例１〜３はワクチンの製造法に関し、実施例４は免疫
グロブリン−〇−含有製剤の製造に関する。

実施例１　緑膿菌Ｍ−２鞭毛ワクチンの型造緑膿菌Ｍ−
２培養から得、上記のζ口く界面活性剤処理、せん断処
理、並びにクロマト処理によって精製した鞭毛溶液を発
熱物質不含の蒸留水でタンパク質濃度が１００μｇ／ｙ
ｔｌになるように希釈し、固形塩化ナトリウムとアーチ
オレートと？加えて（終濃度、ＮａＣｌ　　０、９％、
マーチオレート０．０１％つ等損性にした。次いでこの
溶液全サルトリウス（５ａｒｔｏｒｉｕｓｕ）の使い捨
てフィルター（０，２μｍ）によって滅菌濾過した。

滅菌濾過した試料のタンパク質を測定した後、鞭毛浮遊
液を、滅菌ＮａＣ１−マーチオレート溶液（０，９％７
０．０１％）でタンパク質濃度２５μｇ／　ｒｚｌに調
節し、さらに滅菌ＮａＣｌ−／マーチオレー・ト溶液中
１％水酸化アルミニウム懸濁夜を加えてタンパク質１度
２０μｇ／ｍｌに調節した。

補助薬を加えて得られた完全なワクチンは、１肩ｌ中に
、 鞭毛タンパク質　２０μｇ ＡＩ（ｏＨ）３　　　２〜 ＮａＣｌ　　　　　　　９〜 マーチオレート　　０．１η 全含有していた。

実施例２　緑膿菌１２１０鞭毛ワクチンの製造緑曝菌１
２１０培養から得、上記の７口＜界面活性剤処理、せん
断処理、並びにクロマト処理によってＭ製した鞭毛溶液
２発熱物質不含の蒸留水でタンパク質濃度が１００μｇ
／ｍｌ　ｆｃなるように希釈し、固形塩化ナトリウムと
マーチオレートとを加えて（終濃度、ＮａＣ１０、９％
、マーチオレート０．０１％〕等張性にした。次いでこ
の溶液をサルトリウス（５ａｒｔｏｒｉｕｓｕ）の使い
捨てフィルター（０，２μｍ）によって滅菌−過した。

滅菌濾過した試料のタンパク質を測定した後、鞭毛浮遊
液金、滅！］ＮａＣ１−マーチオレート溶液（０，９％
１０．Ｏ１％〕でタンパク質濃度２５μｇ／ゴに調節し
、さらに滅菌ＮａＣ１／マーチオレート溶液中１％水酸
化アルミニウム懸濁液を加えてタンパク質濃度２０μｇ
　／　ｒｇｌに調節した。

補助薬を加えて得られた完全なワクチンは、１肩ｌ中に
、 鞭毛タンパク質　２０μｇ Ａｔ（ｏＨ）３　　２ダ ＮａＣＩ　　　　　　　　　　９　Ｗ 、マーチオレート　０．１〜 を含有していた。

実施例３　緑膿菌鞭毛多価ワクチンの製造緑膿菌Ｍ−２
）２１０，５１４２，５９３９，５９４０および１７０
０１８各型の緑膿菌培養がら得、上記の７口＜界面活性
剤処理、剪断処理、並びにクロマト処理によって精製し
た鞭毛溶液を、それぞれ発熱物質不含の蒸留水でタンパ
ク質感度が１００μｇ　／　ｔｓｌになるように希釈し
、同じ割合で混合し、固形塩ｒヒナトリウムとマーチオ
レートとを加えて（終ａ度、ＮａＣ１０，９％、マーチ
オレー　）　０．０１％つ等損性にした。次いでこの溶
液をサルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓｕ）の使い捨て
フィルター（０，２μｍ）によって滅菌濾過した。

滅菌濾過した試料のタンパク質？測定した後、鞭毛浮遊
液を、滅菌ＮａＣｌ−マーチオレート溶液Ｃ０，９％１
０．０１％ってタンパク質を到度２５μｇ／　ｍｌ　Ｃ
τ調節し、さらに滅菌ＮａＣ１−／マーチオレート溶液
中１％水酸化アルミニウム懸濁液を加えてタンパク質濃
度２０　ｌｉｇ／ｘｉ　に調節した。

補助薬を加えて得られた完全なワクチンは、ｌ肩ｌ中に
、 鞭毛タンパク賞　２０μｇ Ａ１（ＯＨ）３２ダ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　９η マーチオレート　　０．１り 全含有していた。

実施例４　発熱性テスト 上記の方法で得られたワクチンが発熱物質を含有してい
ないこと全下記の如くにしてテストした。

このテストは、基本的に、３またはそれ以上の成体家兎
に生産物を静注投与した後、各兎の体温を３時間測定し
くＥｕｒ−Ｐｈ−＋第２版、１９８０、パート１．Ｖ、
２．１．４）、それぞれの体温の叢大上外を記録してそ
の値企生産物の発熱性の目安とするものである。

このテストの実施Ｖ？−際して使用したもの２次に示す
：サーモデス（ｔｈｅｒｍｏｄｅｓ　）　　（Ｃｕ　−
コンスタンクン、兎用島電対、Ｐｈシェンク（ＳＣｈｅ
ｎｋＪ〕；温度記録計（６カラーポイントプリンター５
ＴＤ６２Ａ型、測定範囲３６〜４２℃、測定精度±０．
０８℃〕；合成は料製の滅菌した発熱物質不合注射用シ
リンジ；滅菌した発熱物質不含注射針；首固定器の付い
たスチール製の発熱試験用の箱；６個の発熱試験用の箱
のためのハヵリ；サーモスタット付きの水浴；温度計；
ハカリ逼すウター（Ｓａｕｔｅｒ）　ＥＳ　１２０゜ 用いた被検動物は、体重１．５００ｇ以−ヒの健康な雌
雄両性の成体家兎であって、これらは、抗生物質不含の
栄養価の高い標準食を与えられており、試験前数週間、
体重減少を示していなかつｉ？。

使用した試ｑは、補助薬不含のＭ−２鞭毛ワクチンであ
って、これを注射に先立って約３８℃に加温しておいた
。テストは３羽の兎を一群として行ない、これらを少な
くとも試験開始９０分前Ｃ・こ発熱試験用の箱に入れて
おい友。

被検溶液の投与前４０分以内に、３０分の間隔をおいて
各兎の体温を２回測定して得た温度の平均値に基ついて
初期値を定めた。この初期値測定時に、２回の連続した
温度測定値の開きが０．２℃以上あつ之兎は、以後のテ
ストから外した。初期値の変化が０、１℃を越えなかっ
た兎のみをテストに用いた。主要なテストには、初期体
温が３９．８℃以上、菫たは３８℃以下の兎を用いなか
った。

各兎の周縁耳静脈に試料ｆ　１　ｘｔ　／　ｋｙ体重の
割合で徐々に注射した。注射時間は多くとも４分間であ
った。注射後３時間目に記録した最高体温に基づき各兎
の最大体温を決定した。各兎の体温測定は１　　　　　
被検物質投与の少な（とも９０分前に開始し、注射後３
時間目に終了し、その間、大抵の場合、３０分分きに行
なった。各兎の最大体温と初期値との差を結果とした。

負の変化をゼロと評価した。

評価：　評価に際しては、温度変化を合計した。

３羽の兎からなる群の場合は、個々の値の合計が１．１
５℃以下であれば、その試料は要求を満たすものとする
。菫た、合計が２．６５℃以上であれば、その試精は要
求を満たさないものとする。

結果が上記の値の中間にある時は、既述の方法によって
再試験する必要がある。最大＠３回繰り返して行なった
。

繰り返し試験後の評価には全被検動物（３，６，９，ま
たは最高１２羽）を用いた。試験基準金三羽の個々の合
計が１．１５℃以下であるが、または、繰り返し実験の
場合には、上記の表の条件を満たしておれば、試料は試
験に合格したものとする。

Ｍ−２型鞭毛ワクチン１肩ｌ　／　ｋｇ　（兎）を注射
し次段、得られた三羽の兎それぞれのへｔ′ｆ！：以下
に示す。

ワクチンａ度 １０μｇ／ｍ１　０．１°　０．１°　０．３　　乏△
ｔＯ０５℃１０μＩＩ／ｍｌ　　０．３°　０．４°　
０．２°　乏△ｔ０．９℃２０μｇ／ｙｔ１　０．３°
　０．５°　０．２°　乏△ｔ１．ｏ℃２０μｇ／ｍｅ
　　０、２°　０．１°　０，２°　ミ△ｔｏ、５℃２
０μｇ　／ｍｌ　　０．１°　０．４’　　０．２°　
≧△ｔＯ１７℃このように、テストに用いた製剤は発熱
物質を含有していないと考えられる。

実施例５　受動免疫に用いるためのＩｇＧの、マウス超
免疫血漿からの単隋 防御的Δ４−２型鞭毛（Ｈ）抗原で免疫された、マウス
血漿を採取し、振盪下、５６℃で３０分間加温し、フィ
ブリン？沈澱させた。１０．０００ｘｇて３０分間運８
した後、固形硫酸アンモニウムをａ度２５（ｗ／ｖ長ま
で加えて沈澱を析出させた。得られた懸濁ｅ全２０分間
攪拌した後、室温で１時間放置した。次いで、この懸濁
液を、■０．０００ｘｇで３０分間還６した後、飽和硫
酸アンモニウム溶液で１回洗浄した。沈澱′ｆ！１０ｒ
ｒ′ＬＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５），５０
ｍＭＮａＣ１に溶かし、次いで、該１援衝液に対して一
夜透析した。

遠心後、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ−５２セ
ルロース（Ｗｈａｔｍａｎ　）　）にかけた。通過した
容積中には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧＪが含有されてい
る。工ｇＧ試験の後、アミコンセル（ａｍｉｃｏｎ　　
ｃｅｌｌ　）　　を用いて溶液金もとの容量まで濃縮し
、０．９％ＮａＣ１に対して一夜透析した。

次いで、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ−
２００を用いてゲルクロマトグラフィー２行なった。ア
ミコンセル？用い、ＩｇＧ陽性画分を初期容量まで濃縮
した。

この方法はウェアーＣＤ、Ｍ、Ｗｅｉｒ）の実験免疫学
便覧（Ｅｄｉｔｉｏｎ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　
　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌｏ
ｇｙ　）第３版、ｌ　９　？　８゜第■、１章記載の方
法に改良を加えたものである。

緑膿菌の鞭毛抗原に単一特異的に活性な免疫グロブリン
類を生産するためには、硫酸アンモニウム沈降性以外の
既卸の方法、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、プロティン
Ａアフィニティークロマトグラフィー、あるいは当業者
にとって既典の組み合わせ？用いることができる。さら
に、免疫グロブリンＧ製品をイムノアフィニティークロ
マトグラフィーにかけて精嚢し、単一特異的免疫グロブ
リン？得ることができる。

単一特異的免疫グロブリンの調製は免疫吸着剤として担
体媒質（好ましくはセファロース４Ｂ）と用いて好都合
に行なうことができ、単量体または重合体形の純（ｔ、
鞭毛抗原をこの吸着剤に共有結合的に結合させる。次い
で、好ましくは流速１〜２力ラム容１／時間でアフィニ
ティー樹脂上にＩｇＧ含有溶液全ポンプで通過させる。

高イオン強度の援衝液（例、０．５Ｍ　　ＮａＣ１）で
樹脂を洗浄した後、ｐＨ変化またはカオトロピック試薬
（例。

３Ｍ　　ＮＨ５ＣＮ）によりゲルから鞭毛特異抗体を溶
層することができる。

本発明の防御的な抗原および抗体の有効性全以下に示す
。

本発明のワクチンに用いる抗原の防御効果を緑膿菌感染
症患者の血清中鞭毛（Ｈ）抗体？解明することによって
行なった。

抗鞭毛抗体の測定には免疫吸収分析（イムノアブンーペ
ントアツセイ、ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔａｓｓ
ａｙＪ即ち酵素結合吸収分析（ＥＬＩＳＡ）またはラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）’？採用した。

本明細書に記載の方法で得た高純度の鞭毛（Ｈ）抗原を
強い界面活性剤で解重合した後、合成表面に非特異的な
相互作用に基いて結合させ、ヒト血清試料と接触させる
。ヒト血清中に鞭毛（Ｈ）抗体が存在していれば、それ
らは固相に固定化された抗原と特異的に結合する。漂識
した抗ヒ）ＩｇＧ抗体を用い合成表面上に形成された頭
毛（Ｈ）抗原−抗体コンプレックス？検出することがで
きる。

この方法はそのまま定量にも容易（て利用できる。

種々の型の鞭毛抗原Ｖこ対する抗体？用いて血清試料を
スクリーニングした結果を表３：ｃ示す。

天然の緑ｉＱ菌鞭毛（Ｈ）抗原の免疫原性は、無作為に
進出した供与体の血清中鞭毛（Ｈ）抗体の検出結果？示
した表３により証明されている。

体内に浸入してきた外来の細菌に対する戦いは、抗体に
よって様々な方法で開始される。体液性防御システム（
補体系）によると、抗体によって認識された外来生物は
一連の溶菌作用を受けて死滅する。さらに、外来生物と
結合した抗体は、補体系の構成成分と協力して、外来生
物の、免疫系の防御細胞（例、顆粒細胞〕への取り込み
（食細胞作用）？誘導し得る。通常、顆粒球に取り込ま
れた外来細胞は死滅する。

有類毛絽菌の場合には、抗体の防御作用は運動性の阻害
、即ち感染中心の拡散の阻止を目的としで、細菌の運動
系に向けられる。

鞭毛（Ｈ）抗体の運動性阻害作用は、表１に記載した血
清型の鞭毛（Ｈ）抗原で免疫したマウスから得た抗鞭毛
（Ｈ）血清を用いて証明することができる。抗血清に浸
漬したリング状Ｐ紙を運動性寒天プレート上におき、該
リング内部の寒天にホモローガス（同質）なシュードモ
ナス株の浮遊液を接種する。２４時間インキュベーショ
ンした後、ｒ紙のリング外側に認められる細胞の量によ
って運動性阻害作用？分析する。鞭毛（Ｈ）抗原によっ
て得られたマウスの抗血清がホモローガスなシュードモ
ナス菌株の運動性を阻害することが分かつ念。結果を表
４に示す。

表−４種々の量のホモローがスな抗鞭毛血清による運動
性阻害作用 Ｍ−２−−−十−＋− １２１０＋　　　　　　　十　　　　　十５９４０　　
−　　〜　　　−　　−一５１４２　　　　　　　　　
　　　　＋−トー　　　　　トー１７００１８　　　　
−　　　　　　　トー　　　　　　　　ト一　　　　　
　Ｆ〜＊　：病原体浮遊液、病原体１０３／Ｉ！Ｉｌ−
二Ｆ３紙の輪の外側に細胞認めず。

＋−：沖紙の輪の外側の数１のスポットにのみ細胞が存
在。

＋　：押爪の輸の外側に僅かに細胞が増殖。

十＋：押爪の輪の外側に著しい剋胞増殖が存在。

正常なマウスの血清は常に細胞増殖（＋＋）’Ｌ示した
。

感染中心に存在する細菌の運動性を阻害することによっ
て、患者の体内でコロニー？形成した後の伝播を防止す
ることはできるが、該中心に存在している細菌は毒素や
プロテアーゼ類全遊離することによって尚も患者の器官
に影響全没ぼし得る位置にある。従って、感染に対する
真の防御は、能動免疫によって形成された抗体が迅速に
侵入細菌？死滅させることによって、始めて保障される
。

本発明の鞭毛（Ｈ）抗体のホモローガスなシュードモナ
ス菌株に対する食細胞作用の誘導作用、並びに細胞内殺
菌の促進作用を以下に示す。

食細胞作用を試験するために、表３の血清＝３および＝
５、並びに表３に記載されていない血清ゴ１６を緑膿菌
株Ｍ−２非鞭毛性突然変異体ｆｌａ”）Ｃモンチェ（Ｍ
ｏｎｔｉｅ、　’ｒ、ｃ、　）、ドイルノ）ンチンが−
ＣＤ、　Ｄｏｙｌｅ−Ｈｕｎｔｚｉｎｇｅｒ　）　％ク
ラヴエン（Ｒ−Ｃ−Ｃｒａｖｅｎ）　、ホルダーＣ１，
Ａ、Ｈｏ１ｄｅｒ）　（１９８２）インフエクトイミュ
ーン（Ｉｎｆｅｗｃｔ、　　Ｉｒｒｍｕｎ−）　：］と
−緒にインキュベートし、血清から全ての非鞭毛−特異
的抗体を除去した。

単離したヒト顆粒球を用い、未処理の、並びに予め吸収
処理（プレアブソーブト）した血清中での緑膿菌株Ｍ−
２およびアイソジェニックな非鞭毛性突然変異体に対す
る細胞内殺菌作用を調べた。

その結果、表５に示すように、鞭毛（Ｈ）抗体は緑膿菌
の鞭毛性株の食細胞作用を誘発し次いで、細胞内穀雨作
用を誘導することが示され、該抗体は本発明にかかる病
原体による感染症の予防効果を有することが分かった。

能動免疫に用いる抗原の防御作用全直接証明する唯一の
方法は、動物をモデルとする実験である。

緑膿菌思染症にかかり易い患者、という状況を設定する
ために文献記載の２種類の動物モデル？採用した二火傷
マウス〔スチーリッツ（５ｔｉｅｒｉｔｚ。

Ｄ、Ｄ、〕　およびホルダーＣＩ　、Ａ、Ｈｏｌ’ｄｅ
ｒ　）　（１９７５）インフエクト・ディス）　（）、
　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、）１３１，６８８−６９１）およびエンドキサ
ン（Ｅｎｄｘａｎ　）マウスモデル：Ｃクライソ（Ｃｒ
ｙｚｌＳ−Ｊ−Ｊｒ−）１、フユーレル（Ｆｕｒｅｒ、
　Ｅ−）。

ゲルマニエル（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ、　Ｒ，）（１９８
３）インフエクト・イムニテイー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ）４０．６５９−６６４）。両モデルの
非免疫動物における緑膿菌のＬＤ５ｏ　用量を求めた。

エンドキサンモデルの場合には動物は免疫抑制下にあり
、火傷マウスモデルの場合には、火傷の大きさ？−定に
した。表６記載の鞭毛（Ｈ，ｌ抗原で免疫した後、火傷
または免疫抑制動物それぞれを、ホモローがスな緑暖菌
株の予め定め次ＬＤ５ｏ　病原体数で多重感染させた。

表６に、各ａ度の抗原で免疫されたエンドキサンマウス
モデルおよび火傷マウスモデルにおいて、１００％の動
物が相容性？示した、多重感染のしＤ５ｏ病原体数金示
す。

表７は１Ｍ−２鞭毛抗原の防御作用の用量依存性に関す
るものである。この場合には２種類のモデルの動物を用
い、漸増量の鞭毛抗原で免疫し、テストヲ行なった。い
ずれの場合にも、免疫に用いた鞭毛抗原の用層に依存し
た防御作用を明確足認めることができる。

受動免疫に用いる抗体の防御作用を直接証明する唯一の
方法は、動物をモデルとする実装である。

緑膿菌感染症にかかり易い患者、という状況を設定する
ために文献記載のエンドキサンマウスモデル：〔クライ
ッ（Ｃｒｙｚ、　Ｓ、　）、Ｊｒ、）、　　フｘ−ｖル
：　（Ｆｕｒｅｒ、　Ｅ、）、ゲルマニエル（Ｇｅｒｍ
ａｎｉｅｒ。

Ｒ，）ｔ１９８３）：実験的白血球減少度マウスンζ分
ける、緑膿菌ｊ♂染症に対する受動的な防御作用（Ｐａ
５ｓｉｖｅ　　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　　Ａｇａｉｎｓ
ｔ　　Ｐｓｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　　１ｎｆｅｃｔ
ｉ□：ｎ　　ｉｎ　　ａｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
　Ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ　　Ｍｏｕｓｅ　　Ｍｏｄｅｌ
）インフエクト・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｒ
ｒｒｎｕｎｉｔｙＪ４０．６５９−６６４Ｊｅ用いた。

この場合には免疫抑制動物における緑膿菌病原体のしＤ
５ｏ用量を求めた。

この実験においてはその値は９．５Ｘ１０”　　病原体
である。免疫抑制動物を、マウスの抗緑膿圀Ｍ−２超免
疫血棗（該血漿のＥＬＩＳＡ　　に２ける抗体力価は１
：１．６００の希駅段階である〕で受動免疫処理した後
、ホモローガスな緑膿菌株の予め定めたしＤ５０病厚体
数で多市忍染させた。

表８は、受動免疫処理全受けた動物が、ＬＤ５゜周囲の
３０倍の量の病原体に対するチャレンジンておいて保、
獲されていることを示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清型ａおよびｂの防御的鞭毛（Ｈ）抗原を含む緑
   膿菌感染症に有効なワクチンであつて、該抗原はそれぞ
   れ、以下の単量体成分： ａ）アミノ酸類：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニ
   ン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌ
   ｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリ
   ン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ
   ｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈ
   ｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およ
   び場合によりトリプトファン（Ｔｒｐ）およびメチオニ
   ン（Ｍｅｔ）を含有しており、 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン（Ａｌａ）−ロイシ
   ン（Ｌｅｕ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａｌ
   ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−
   アスパラギン（Ａｓｎ）−イソロイシン（Ｉｌｅ）−ア
   ラニン（Ａｌａ）を含有しており、 ｃ）分子量が４３，５００〜５３，０５０であつて、ｄ
   ）プロリン、セミシステインおよびヒスチジンを含んで
   いないことを特徴とするものであり、発熱性成分を含有
   していないことを特徴とするワクチン。 ２、Ｈ−血清型ａ＿０、ａ＿３、ａ＿４の鞭毛（Ｈ）抗
   原であつて、その単量体成分はアミノ酸：アスパラギン
   酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、ア
   ラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、
   フェニルアラニン、リジンおよびアルギニンを６４：３
   ３：３５：４２：４４：６８：２９：２９：３７：３：
   １０：１９：１５の比率で含有しており、分子量が４３
   ，５００である抗原を含有している第１項記載のワクチ
   ン。 ３、Ｈ−血清型ａ＿０、ａ＿３の鞭毛（Ｈ）抗原であつ
   て、その単量体成分はアミノ酸：アスパラギン酸、スレ
   オニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、
   バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニル
   アラニン、リジンおよびアルギニンを６９：３５：３８
   ：４４：４７：７３：３０：３０：６０：３：１２：２
   １：１６の比率で含有しており、分子量が４６，７００
   である抗原を含有している第１項記載のワクチン。 ４、Ｈ−血清型ａ＿０の鞭毛（Ｈ）抗原であつて、その
   単量体成分はアミノ酸：アスパラギン酸、スレオニン、
   セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、
   イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン
   、リジンおよびアルギニンを７４：５０：４９：４９：
   ４９：８９：３７：２９：４４：５：１４：１７：１６
   の比率で含有しており、分子量が５２，７２０である抗
   原を含有している第１項記載のワクチン。 ５、Ｈ−血清型ｂの鞭毛（Ｈ）抗原であつて、その単量
   体成分はアミノ酸：アスパラギン酸、スレオニン、セリ
   ン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、イソ
   ロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リ
   ジンおよびアルギニンを７４：４８：４８：４９：５１
   ：９１：３８：３０：４３：４：１３：１８：１８の比
   率で含有しており、分子量が５３，０５０である抗原を
   含有している第１項記載のワクチン。 ６、Ｈ−血清型ａ＿０、ａ＿１、ａ＿２の鞭毛（Ｈ）抗
   原であつて、その単量体成分はアミノ酸：アスパラギン
   酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、ア
   ラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、
   フェニルアラニン、リジンおよびアルギニンを７６：４
   ４：４０：５２：５０：８１：３２：３２：４１：４：
   １２：２０：１８の比率で含有しており、分子量が５１
   ，２５０である抗原を含有している第１項記載のワクチ
   ン７、Ｈ−血清型ａ＿０、ａ＿２の鞭毛（Ｈ）抗原であ
   つて、その単量体成分はアミノ酸：アスパラギン酸、ス
   レオニン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン
   、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニ
   ルアラニン、リジンおよびアルギニンを６８：４１：３
   ７：４６：４４：７３：２９：２９：３７：３：１０：
   １６：１６の比率で含有しており、分子量が４５，９０
   ０である抗原を含有している第１項記載のワクチン。 ８、血清型ａおよびｂの防御的鞭毛（Ｈ）抗原であつて
   、それぞれ、以下の単量体成分： ａ）アミノ酸類：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニ
   ン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌ
   ｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリ
   ン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ
   ｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈ
   ｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およ
   び、場合によりトリプトファン（Ｔｒｐ）およびメチオ
   ニン（Ｍｅｔ）を含有しており、 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン（Ａｌａ）−ロイシ
   ン（Ｌｅｕ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａｌ
   ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−
   アスパラギン（Ａｓｎ）−イソロイシン（Ｉｌｅ）−ア
   ラニン（Ａｌａ）を含有しており、 ｃ）分子量が４３，５００〜５３，０５０であつて、 ｄ）プロリン、セミシステインおよびヒスチジンを含ま
   ない単量体成分からなる抗原を含有しており、発熱成分
   を含有していない緑膿菌感染症に有効なワクチンの製造
   方法であつて、緑膿菌の培養物から鞭毛（Ｈ）抗原を得
   、該鞭毛（Ｈ）抗原を精製し、得られた純化鞭毛（Ｈ）
   抗原を滅菌ろ過してガレヌス製剤に製剤化する工程から
   なる方法。 ９、滅菌ろ過後、アジユバントを加えることを含む第８
   項記載の方法。 １０、アジユバントがＡｌ（ＯＨ）＿３である第９項記
   載の方法。 １１、ガレヌス製剤に製剤化する前に保存剤を加える第
   ８項記載の方法。 １２、保存剤がマーチオレートである第１１項記載の方
   法。 １３、ガレヌス製剤に製剤化する前にアジユバントを混
   合し、保存剤を加える第８項記載の方法。 １４、アジユバントがＡｌ（ＯＨ）＿３であり、保存剤
   がマーチオレートである第１３項記載の方法。 １５、緑膿菌感染症の予防および治療に有効な免疫グロ
   ブリンＧ含有製剤であつて、血清型ａおよびｂの防御的
   鞭毛（Ｈ）抗原であり、それぞれ、以下の単量体成分： ａ）アミノ酸類：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニ
   ン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌ
   ｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリ
   ン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ
   ｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈ
   ｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およ
   び、場合によりトリプトファン（Ｔｒｐ）およびメチオ
   ニン（Ｍｅｔ）を含有しており、 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン（Ａｌａ）−ロイシ
   ン（Ｌｅｕ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａｌ
   ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−
   アスパラギン（Ａｓｎ）−イソロイシン（Ｉｌｅ）−ア
   ラニン（Ａｌａ）を含有しており、 ｃ）分子量が４３，５００〜５３，０５０であつて、 ｄ）プロリン、セミシステインおよびヒスチジンを含ん
   でいない単量体成分からなる鞭毛（Ｈ）抗原、によつて
   免疫されたヒト供与体または哺乳類の血漿から得た鞭毛
   （Ｈ）抗体を含有している製剤。 １６、鞭毛（Ｈ）抗体が緑膿菌に対して運動阻害作用、
   高められた食細胞作用、並びに高められた細胞内殺菌作
   用を有する第１５項記載の製剤。 １７、血清型ａおよびｂの防御的鞭毛（Ｈ）抗原であっ
   てそれぞれ、以下の単量体成分： ａ）アミノ酸類：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニ
   ン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン（Ｇｌｕ
   ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン
   （Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅ
   ｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ
   ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、および
   、場合によりトリプトファン（Ｔｒｐ）およびメチオニ
   ン（Ｍｅｔ）を含有しており、 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列：アラニン（Ａｌａ）−ロイシ
   ン（Ｌｅｕ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−バリン（Ｖａｌ
   ）−アスパラギン（Ａｓｎ）−スレオニン（Ｔｈｒ）−
   アスパラギン（Ａｓｎ）−イソロイシン（Ｉｌｅ）−ア
   ラニン（Ａｌａ）を含有しており、 ｃ）分子量が４３，５００〜５３，０５０であつて、 ｄ）プロリン、セミシステインおよびヒスチジンを含ん
   でいない単量体成分からなる鞭毛（Ｈ）抗原によつて免
   疫されたヒト供与体または哺乳類の血漿から得られる鞭
   毛（Ｈ）抗体を含有している緑膿菌感染症の予防および
   治療に有効な免疫グロブリンＧ含有製剤の製造方法であ
   つて、該血漿をタンパク沈降剤で処理した後、溶解させ
   、沈澱した免疫グロブリンＧ含有画分を精製することか
   らなる方法。 １８、鞭毛（Ｈ）抗体が緑膿菌に対して運動阻害作用、
   食細胞作用の推進能、並びに 細胞内殺菌の昂進作用を有する第１７項記載の免疫グロ
   ブリンＧ含有製剤の製造方法。 １９、タンパク質沈降剤が硫酸アンモニウムである第１
   ７項記載の方法。 ２０、沈澱した免疫グロブリンＧ含有画分の精製が、純
   化鞭毛抗原を共有結合的に結合させた担体媒質に溶液を
   通し、次いで、ゲルから鞭毛特異的抗体を溶離すること
   からなり、それをガレヌス製剤に製剤化することからな
   る第１７項記載の方法。 ２１、単量体形の純化鞭毛抗原を共有結合的に結合させ
   た担体媒質に溶液を通す第２０項記載の方法。 ２２、重合体形の純化鞭毛抗原を共有結合的に結合させ
   た担体媒質に溶液を通す第２０項記載の方法。 ２３、ｐＨ変化によつてゲルから鞭毛特異的抗体を溶離
   する第２０項記載の方法。 ２４、カオトロピック試薬を用いてゲルから鞭毛特異的
   抗体を溶離する第２０項記載の方法。 ２５、カオトロピック試薬がＮＨ＿４ＳＣＮである第２
   ４項記載の方法。