FI95003B - Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden sekä immunoglobuliini-G-pitoisten, Pseudomonas aeruginosa-bakteeria vastaan vaikuttavien valmisteiden tuottamiseksi - Google Patents

Description

S5003

Menetelmä Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden sekä immunoalobuliini-G-pitoisten, Pspndomonas aeruginosa-bakteeria vastaan vaikuttavien valmisteiden tuottamiseksi

Keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen menetelmä sellaisten Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden, etenkin rokotteiden, valmistamiseksi, joiden vaikutus ulottuu osa-flagella (H) -antigeenien a0, au a2, a3, a4 ja b kaikkiin yhdistelmiin ja jotka on tarkoitettu aktiivista immunisointia varten- Keksintö koskee myös patenttivaatimuksen 7 johdannon mukaista menetelmää immunoglobuliini-G-pitoisten, Pseudomonas aeruginosa -bakteeria vastaan vaikuttavien valmisteiden tuottamiseksi, jotka valmisteet on tarkoitettu passiivista suojaa varten.

Pseudomonas aeruginosa-bakteeri on opportunistisesti patogeeninen taudinaiheuttaja, jota esiintyy usein sairaalainfektioissa, pääasiassa potilailla, joilla on heikentynyt vastustuskyky, sekä palovammapotilailla, henkilöillä, joilla on kystinen fibroosi tai joilla on orgaanisia virhetoimintoja, ja tuumoripotilailla. Antibiootit ovat vain rajoitetusti tehokkaita Pseudomonas-infektioita vastaan resistenssin esiintymisen johdosta, mistä syystä yritetään löytää immuno-• logisia menetelmiä Pseudomonas aeruginosan aiheuttamien in fektioiden torjumiseksi.

Infektioita voivat aiheuttaa lukuisat kannat, jotka voidaan karakterisoida O-antigeeneillä (lipopolysakkaridi) ja H-an-tigeeneillä (flagellit), jolloin H- ja O-antigeenityypit ovat vapaasti yhdistettäviä.

On tunnettua, että Pseudomonas aeruginosan motiliteetti (liikkuvuus) edistää taudinaiheuttajan virulenssia (elinvoimaisuutta) (Montie et ai., Infect. Immunity 38, 1296 - 1298, 1982). Liikkuvilla Pseudomonas aeruginosa-kannoilla on yksi ainoa flagelli. Burned Mouse-mallitutkimukset ovat osoittaneet, että suurempi prosenttimäärä hiiristä jää eloon, jos 95003 2 liikkumattomia Pseudomonas aeruginosa-kantoja inokuloidaan kokeellisesti tuotettuihin palovammoihin, kuin jos käytetään liikkuvia kantoja (Montie et ai., ks. yllä). Muut tutkimukset Pseudomonas aeruqinosan patogeneesistä ovat osoittaneet,että eläimet, jotka immunisoitiin flagelli-antigeenivalmisteilla, olivat suojattuja, kun niille aiheutettiin palovamma ja infektoitiin bakteerien liikkuvilla kannoilla (Holder et ai., Infect. Immunity 35, 276 - 280, 1982).

Pseudomonas aeruginosa-flagelleja tukittiin serologisilla menetelmillä ja osoitettiin, että voitiin erottaa kaksi pää-antigeenityyppiä, joita nimitetään R. Ansorgin mukaan (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A, 242, 228 - 238, 1978) a-tyypiksi ja b-tyypiksi.

a-tyypin flagella(H)-antigeenissä käyttämällä epäsuoraa im-munofluoresenssiteknilkkaa voidaan erottaa osa-antigeenit a0, äj, a2, a3 ja a4, jotka ilmaistaan (exprimieren) Pseudomonas aeruginosa-kannoista erilaisina yhdistelminä, jolloin osa-antigeeni a0 havaitaan kaikissa a-tyyppisissä flagelleissa. b-tyypin flagella(H)-antigeeni käytäytyy serologisesti yhtenäisesti, s.o. mitään alaryhmiä ei voida identifioida.

Kaikkiaan Ansorgin mukaan Pseudomonas aeruqinosassa voidaan erottaa 17 H-tyyppiä, nimittäin yksi H-tyyppi b ja flagella-antigeenin a 16 H-tyyppiä, jotka koostuvat kaikissa a-tyy-peissä esiintyvästä osa-antigeenistä a0 ja mahdollisesti osa-antigeeneistä β! ja/tai a2 ja/tai a3 ja/tai a4. Pseudomonas aeruginosa-kantojen 5142 ja 13030 flagellien perusteelliset tutkimukset, jotka kannat Ansorg karakterisoi kuuluviksi ·· yksinomaan alaryhmään a0, osoittivat nämä biokemiallisesti ja immunologisesti identtisiksi b-tyypin flagellien suhteen (Montie et ai., Infect. Immunity 49(3), 770 - 774, 1985).

Polydisperssien natiivisten (luontaisten) flagella(H)-antigeenien (FAg) talteenotto on esitetty PCT-julkaisussa Wo 86/03974. Tätä varten kasvatetaan bakteeriviljelyltä minimaalisella alustalla ja käsitellään tämän jälkeen detergen-tillä, minkä jälkeen FAg erotetaan viljelystä. Tällöin bak-

II

3 95003 teeriviljely hajotetaan detergenttikäsittelyn edellä ja alistetaan leikkausprosessiin. Lisäämällä detergenttiä saadaan aikaan se, että antigeeni voidaan erottaa bakteerimassasta. Tällöin suspensiossa olevat antigeenit voidaan erottaa soluista erotussentrifugoinnin avulla.

Tämän jälkeen yllä esitetyllä tavalla bakteerimassasta erotetut antigeenit voidaan vapauttaa kromatografisen puhdistuksen avulla kiinnittyneistä epäpuhtauksista, kuten lipopo-lysakkarideista, nukleiinihapoista, suoloista, polysakkarideista ja vastaavista. Vielä esiintyvä detergentti voidaan poistaa toisen pylväskromatografisen puhdistusvaiheen avulla.

Pseudomonas aeruginosa-bakteeriviljelyj en valmistukseen sopivat kannat ja tuotetut antigeenit on esitetty seuraavassa taulukossa:

Kanta H-tyyppi M-2 b 5142 a0 (b) 5940 a0a2 WR-5 a0a2 5939 a0a3 1210 a0aja2 170018 a0a3a«

Julkaisusta EP-A-0 252 064 nähdään, että kaikilla PCT-jul-kaisussa WO 86/03974 esitettyjen tyyppien yksittäisillä flagelliantigeeneillä on rokotteiden aineosina suojaava vaikutus ja että seerumi, joka otettiin talteen hiiristä, jotka .: oli immunisoitu aktiivisesti PCT-julkaisussa WO 86/03974 esitetyillä flagelliantigeeneillä, soveltuu hiirien passiiviseen immunisointiin.

Tosin yksittäisten antigeenien ja näistä johdettujen vasta-aineiden suojaava vaikutus voitiin osoittaa ainoastaan eläin-mallissa ja ainoastaan homologisessa järjestelmässä, s.o. voitiin havaita ainoastaan vaikutus sen flagelliserotyypin taudinaiheuttajia vastaan, jota käytettiin immunisointiin.

, 95003 4 Lääkärin kannalta esiintyy tarve Pseudomonas aeruqinosa-ro-kotteista, joiden vaikutus ulottuu osa-flagella(H)-antigeenien a0, alf a2, a3, a, ja b kaikkia yhdistelmiä vastaan, koska 300 kliinisen Pseudomonas aeruginosa-isolaatin analyysi Ansorgin (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A242, 228 - 238, 1978) ehdotetulla H-antigeenitypisointikaaviolla osoitti, että 98 %:ssa kaikista liikkuvista Pseudomonas-taudinaiheut-tajista voitiin osoittaa a- ja/tai b-tyypin osa-antigeenejä.

Julkaisussa EP-A-0 252 064 esitettyjen tietojen mukaisesti tällaisen rokotteen tulee sisältää pakostakin kaikki osa-antigeenit, s.o. sen on oltava polyvalenttinen rokotusaine.

Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan monovalenttisia tai bivalenttisia rokotteita, jotka sisältävät ainoastaan yhtä tai kahta antigeeniä, jotka muodostavat ihmisessä vasta-aineita, jotka vaikuttavat osa-flagella(H)-antigeenien aO - a4 ja b kaikkien yhdistelmien liikkuvia Pseudomonas aeruginosa-taudinaiheuttajia vastaan ja siten kaikkia kliinisesti relevantteja serotyyppejä vastaan, jolloin ne estävät taudinaiheuttajien motiliteetin ja edelleenleviämisen ja lisääntymisen ja indusoivat tuhoamisen ihmisen immuunijärjestelmän kautta.

Edelleen tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan valmisteita, jotka sisältävät vasta-aineita näitä antigeenejä vastaan ja joita voidaan käyttää passiiviseen immunisointiin Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti siten, että valmistetaan rokotteet, jotka sisältävät a-serotyypin yhtä ainoaa flagella(H)antigeeniä tai ne sisältävät a-serotyypin yhden ainoan flagella(H)-antigeenin ja b-serotyypin flagella (H) -antigeenin yhdistelmää.

Edullisesti rokotteet muodostetaan bivalenttisiksi ja ne sisältävät sekä a-serotyypin yhtä ainoaa flagella(H)-antigeeniä että b-serotyypin flagella(H)-antigeeniä.

5 95003 Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, mitä on esitetty patenttivaatimusten 1 ja vastaavasti 7 tunnusmerkkiosissa.

On osoittautunut, että immunoglobuliinit, jotka muodostetaan keksinnön mukaisten rokotusaineiden käytön jälkeen, pystyvät sitoutumaan vähintään 95 %:iin kaikista Pseudomonas aeruqi-nosan kliinisesti relevanteista kannoista ja estämään niiden motiliteetin. Tämä vasta-aineiden sitoutuminen saa edelleen aikaan liikkuvien taudinaiheuttajien opsonisaation ja tuhoutumisen ihmisen immuunijärjestelmän fagosytoivien solujen ansiosta. Keksinnön mukaan aikaansaatavat esimerkkirokotteet voivat sisältää: serotyypin a0a2 yhtä ainoaa flagella(H)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 68:41:37:46:44:73:29:29:37:3:10:16:16 ja jonka molekyyli-paino on 45.900; tai serotyypin a^aj yhtä ainoaa flagella (H)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 76:44:40:52:50:81:32:32:41:4:12:20:18 ja jonka molekyyli-paino on 51.250; tai serotyypin a0a3 yhtä ainoaa flagella (H)-antigeeniä, joka • # koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 69:35:38:44:47:73:30:30:60:3:12:21:16 ja jonka mo-lekyylipaino on 46.700; tai serotyypin a0a3a4 yhtä ainoaa flagella(H)-antigeeniä, joka e 95003 koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniinia, seriiniä, glutamiinihap-poa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 64:33:35:42:44:68:29:29:37:3:10:19:15 ja jonka molekyyli-paino on 43.500.

Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti mainitut keksinnön mukaan tuotettavat rokotteet sisältävät vielä lisäksi b-sero-tyypin flagella(H)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 74:48:48:49:51: 91:38:-30:43:4:13:18:18 ja jonka molekyylipaino on 53.050.

Rokotteet valmistetaan keksinnön mukaan siten, että Pseudomonas aeruginosan viljelyistä saatu (saadut), puhdistettu (puhdistetut) flagella(H)-antigeeni(t) steriilisuodatetaan, sekoitetaan mahdollisesti adjuvantin, kuten Al(OH)3:n kanssa, haluttaessa lisätään säilöntöainetta, kuten mertiolaattia, ja valmistetaan galeeniseksi valmisteeksi.

Immunoglobuliini-G-pitoiset, Pseudomonas aeruginosa-infekti-oita vastaan vaikuttavat valmisteet valmistetaan keksinnön mukaan siten, että vastaavalla (vastaavilla) flagella(H)antigeeneillä immunisoitujen luovuttajien (ihmisten) plasma käsitellään proteiininsaostusaineilla, kuten ammoniumsulfaatilla, liuotetaan saostettu immunoglobuliini-G-pitoinen fraktio, puhdistetaan ja valmistetaan galeeniseksi valmis-teeksi.

Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien esimerkkien avulla, jolloin esimerkit 1 ja 2 havainnollistavat rokotteiden valmistusta ja esimerkki 3 havainnollistaa immunoglobuliini-G-pitoisten valmisteiden valmistusta.

li 7 95003

Esimerkki 1

Rokoteohje monovalenttista Pseudomonas aeruqinosa-flaqelli-rokotusainetta varten

Pseudomonas aeruginosa 5940-bakteerin viljelystä valmistettu ja yllä esitetyllä tavalla detergenttikäsittelyllä, leikkaamalla ja kromatografisella käsittelyllä puhdistettu flagel-liliuos säädettiin tislatulla pyrogeenivapaalla vedellä 100 yg/ml:n proteiinikonsentraatioon ja tehtiin isotoniseksi lisäämällä kiinteää natriumkloridia ja mertiolaattia (lop-pukonsentraatio 0,9 % NaCl:a tai vastaavasti 0,01 % mertiolaattia). Tämän jälkeen liuos steriilisuodatettiin 0,2 ym:n steriilisuodattimen läpi.

Steriilisuodatetun näytteen proteiinimäärityksen jälkeen flagellisuspensio säädettiin NaCl/mertiolaattiliuoksella (0,9 %/0,01 %) 25 yg/ml:n proteiinikonsentraatioon ja laimennettiin tämän jälkeen 20 yg/ml:n proteiinikonsentraatioon lisäämällä 1 %:sta aluminiumhydroksidiliuosta steriilissä NaCl/mertiolaattiliuoksessa.

Valmiiksi adjuvantoitu rokote sisälsi ml:aa kohden: 20 yg serotyypin a(ja2 flagelliproteiinia 2 mg aluminiumhydroksidia 9 mg NaCl:a 0,1 mg mertiolaattia stabilisaattorina

1 · I • I

Vastaavasti voidaan valmistaa muita monovalenttisia rokotteita Pseudomonas aeruginosa-kannoilla 1210 (serotyyppi a0ala2)' 5939 (serotyyppi 8083) ja 170018 (serotyyppi a0a3a4)·

Esimerkki 2

Rokoteohje bivalenttista Pseudomonas aeruc[inosa-flagellirokotusainetta varten

Bakteerikantojen M-2 ja 5939 viljelyistä valmistetut ja yllä esitetyllä tavalla detergenttikäsittelyllä ja geelisuodatta-malla puhdistetut flagellisuspensiot säädettiin tislatulla • 95003 pyrogeenivapaalla vedellä 100 myg/ml:n proteiinikonsentraa-tloon ja tehtiin Isotoniseksi lisäämällä kiinteää natrium-kloridia ja mertiolaattia (loppukonsentraatio 0,9 % NaCl:a tai vast. 0,01 % mertiolaattia). Tämän jälkeen liuos sterii-llsuodatettiin 0,2 ym:n suodattimen läpi.

Steriilisuodatettujen näytteiden proteiinimäärityksen jälkeen flagellisuspensiot laimennettiin steriilillä NaCl/mer-tiolaattiliuoksella (0,9 %/0,01 %), jolloin M-2-flagellien suspensio säädettiin konsentraatioon 50 yg/ml ja 5939-fla-gellien suspensio säädettiin konsentraatioon 25 yg/ml. Molemmat suspensiot yhdistettiin samoiksi määriksi ja säädettiin tämän jälkeen 20 tai vastaavasti 10 yg/ml:n antigeeni-konsentraatioon lisäämällä 1 %:sta aluminiumhydroksidiliuos-ta steriilissä NaCl/mertiolaattiliuoksessa.

Valmiiksi adjuvoltu rokote sisälsi ml:aa kohden: 20 myg b-serotyypin flagelliproteiinia 10 myg serotyypin aQa3 flagelliproteiinia 2 mg aluminiumhydroksidia 9 mg NaCl:a 0,1 mg mertiolaattia stabilisaattorina.

Yllä esitetyn Pseudomonas-kannan 5939 flagellien suspension sijasta voidaan käyttää vastaavasti muiden kantojen serotyypin aQa3 flagelleja sekä serotyyppien a(ja2; aoala2 tai 398384 flagelleja ja serotyypin b flagelleja esim. yllä esitetyssä seoksessa ja valmistaa rokotteiksi.

Esimerkki 3 3.1 Plasmaluovuttajien immunisointi flagellirokotteilla 50 vapaaehtoista koehenkilöä saivat kukin 20 myg esimerkin 1 mukaisesti viljelystä 5940 valmistettua rokotusainetta sub-kutaanisesti. 4 viikon kuluttua 40 koehenkilöä saivat jälleen kukin 20 yg subkutaanisesti ja vielä 4 viikon kuluttua immunisoitiin uudelleen 20 yg:llä flagelliantigeeniä. Fla-gelliantigeenien muodostusta seurattiin immunisoinnin aikana -myöhemmin selitettävällä flagelli-ELISA-menetelmällä. Immu- 9 95003 nisoinnln jälkeen kerättiin kolme kertaa immunisoitujen koehenkilöiden plasma ja yhdistettiin.

3.2 Spesifisen Pseudomonas aeruginosa-flagelli-immunoglobu-liinivalmisteen valmistus

Vasta-aineita Pseudomonas aeruginosaa vastaan sisältävien immunoglobuliinien eristys tapahtui julkaisussa AT-B -359.641 esitetyn menetelmän mukaisesti. Tätä varten säädettiin luovuttajilta saatu yhdistetty plasma pH-arvoon 7,0 - 7.2 ja pidettiin -2*C:n lämpötilassa. Liuokseen lisättiin 8 paino-% etanolia, jolloin saostui sakka, joka sisälsi pääasiassa fibrinogeeniä. Tämän sakan erottamisen jälkeen eta-nolikonsentraatiota korotettiin 25 paino-%:iin ja lämpötilaa alennettiin -6*C:seen. Saostuva sakka, joka koostui pääasiassa raa'asta immunoglobuliinista, uutettiin fosfaatti-asetaatti-puskurissa ja siihen lisättiin 12 paino-% etanolia pH-arvossa 5,3 -2*C:ssa. Sakka (joka sisälsi alfa- ja beta-globuliinia) heitettiin pois ja emäliuoksen etanoli-konsen-traatiota korotettiin pH-arvossa 7,2 ja -10*C:n lämpötilassa 25 paino-%:iin, jolloin immunoglobuliini saostui. Näin valmistettu kerätty pastamainen gamma-globuliinifraktio käsiteltiin keksinnön mukaisesti edelleen seuraavasti: 1 kg immunoglobuliinipastaa liuotettiin 2 Iraan 0,9 %:sta NaCl-liuosta sekoittaen ja dialysoitiin. Tämän jälkeen pro-teiinikonsentraatio saatettiin arvoon 20 g/1 sekä ionivah-vuus arvoon 0,15 ja pH-arvossa 6,25 lisättiin 176 g/1 ammo-niumsulfaattia, sakka heitettiin pois ja emäliuokseen lisättiin edelleen ammoniumsulfaattia 275 g/l:n loppukonsen-traation asti ja pH asetettiin arvoon 7,2. Saostuva immu-noglobuliinipitoinen sakka liuotettiin veteen ja dialysoitiin vesijohtovettä vastaan. Sitten liuokseen lisättiin 80 g/1 polyetyleeniglykolia glukoosin (150 g/1) läsnäollessa pH-arvossa 6,0 ja ionivahvuuden ollessa 0,15. Sakka heitettiin pois ja polyetyleeniglykolikonsentraatiota korotettiin 95 g:aan/l pH-arvossa 6,5 - 6,6. Uudelleen saostuva sakka heitettiin pois.

1“ 95003

Nyt liuoksen polyetyleeniglykoli-pitoisuutta korotettiin 180 g:aan/l pH-arvossa 7,2, jolloin saostui epäpuhtauksista vapaa immunoglobuliini. Tuote sentrifugoitiin ja se pestiin viisi kertaa vielä esiintyvän polyetyleeniglykolin poistamiseksi.

Näin saatu suonensisäisesti annettava spesifinen Pseudomo-nas-flagelll-lmmunoglobuliinl rekonstituoitiin tislatulla vedellä (Aqua dest.) 5 %:seksi (p/t) liuokseksi. Spesifisesti serotyypin aoa2 flagelleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden tiitteri määritettiin flagelli-ELISAtssa ja se on esitetty taulukossa 2. Tällöin suhteella 1:25.000 esitetty tiitteri koskee 5 %:sen immunoglobuliiniliuoksen l:25.000-laimen-nusta, joka tuotti ELISA-testissä vielä selvästi osoitettavan positiivisen reaktion.

Tämän menetelmän mukaisesti valmistettiin myös kaikki muut, alla mainitut Pseudomonas aeruginosa-flagelli-immunoglobu-liinivalmisteet.

Keksinnön mukaisten rokotteiden ja keksinnön mukaisten immu-noglobuliini-G-pitoisten Pseudomonas aeruqlnosa-bakteerl-infektioita vastaan vaikuttavien valmisteiden (Pseudomonas aeruginosa-flagelli-immunoqlobuliinivalmisteiden) vaikutuksen dokumentoimiseksi osoitetaan ensin, että flagella(H)-antigeenit (serotyypit b, b(ao), aQa2, aoaia2/ 2983 ja 808384, jotka sisältävät kaikki kuusi kliinisesti relevanttien Pseudomonas-taudlnalheuttajien osa-antigeenit), johtavat ihmisessä vasta-aineiden muodostumiseen.

Tätä varten yllä esitettyjen kuuden relevantin serotyypin flagellit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee-silla mahdollisesti vielä kiinnittyneistä, minimaalisista epäpuhtauksista. Flagellikaistat, jotka sisälsivät detergen-tillä SDS ja merkaptoetanoli depolymerisoidun flagelliinin, saatiin seuraavissa molekyylipainoissa: b-tyyppi: 53.050, ao-tyyppi; 52.000, aoa1a2-tyyppi: 51.250, aQa2-tyyppi: 45.900; aoa3a4-tyyppi: 43.500; aoa3-tyyppi: 46.700. Molekyy- n il 95003 lipalnot laskettiin standardiproteiinien karboanhydraasi (mp: 31.000), ovalbumiini (mp: 45.000) ja BSA (66.200) kul-kuvalien (Laufstrecken) kautta. Proteiinikaistat siirrettiin sähkösiirron (Elektrotransfer) avulla polyakryyliamidigee-listä nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen kun vapaat pro-teiinisidoskohdat nitroselluloosakalvolla oli pidätetty kyllästämällä Tween 80:llä, kalvoa inkuboitiin ihmisen seerumin sopivassa laimennuksessa. Tämä seerumi saatiin luovuttajilta, jotka oli immunisoitu useaan kertaan monovalentti-silla flagellirokotteilla, jotka sisälsivät yllä mainittuja antigeenejä. Edellä oli ELISA-kontrolleilla varmistettu, että luovuttajien seerumit eivät sisältäneet ennen immunisointia mitään merkittäviä flagellivasta-ainetiittereitä.

Flagellispesifisten vasta-aineiden läsnäolo immunisoinnin jälkeen voitiin osoittaa sitomalla nämä vasta-aineet kulloinkin kyseessä olevaan flagelliinikaistaan nitroselluloosakalvolla, joka voidaan tehdä näkyväksi kalvolla kehittämällä entsyymileimatulla toisella vasta-aineella ja kromo-geenisella substraatilla. Värjäyksen intensiteetti sallii rajoitetusti päätelmät sidotun spesifisen vasta-aineen määrästä.

Tulokset on esitetty taulukossa 1, jolloin arviointia varten homologisella antiseerumilla saadut värjäysintensiteetit merkittiin merkillä "++" ja arvioitiin vasta-aineiden sitoutuminen muiden serotyyppien flagelliiniin sen suhteen. Jos nitroselluloosakalvolla ei havaittu mitään kaistaa, taulukossa on merkintä 12 95003

Taulukko 1 H-antiseerumeiden ristireaktiot Western-täplissä

Seerumi H- Antigeeni Western-täplällä tyyppiä vastaan b b(ao) aga2 aoala2 aoa3 aoa3a4 b ++ ++ ( + ) (+) - (+) b(a0) ++ ++ - - aoa2 + + ++ + + ++ a0ala2 + + + ++ ++ +++ aoa3 + + + + ++ + a0a3a4 + + + + + ++

Taulukosta 1 nähdään ristireaktiivisuus, koska esim. määrättyä a-tyypin flagelliinia vastaan vaikuttava seerumi reagoi myös muita a-tyypin antigeenejä vastaan. Nähdään jopa se, että a-tyypin flagelliinia vastaan vaikukttavat vasta-aineet eivät sitoudu ainoastaan tähän, vaan myös b- tai vastaavasti b(ao)-tyypin flagelliiniin. Tämän sitoutumisen intensiteetti on kuitenkin useimmiten selvästi heikompi kuin erilaisissa ä-tyypeissä havaittu keskinäinen ristireaktio. Sitä vastoin b- tai vastaavasti b(aQ)-tyypin flagelliineja vastaan vaikuttavat vasta-aineet eivät sitoudu tai sitoutuvat ainoastaan hyvin heikosti a-tyypin flagelliiniin.

Sen osoittamiseksi, että flagella(H)-antigeenejä b, b(ao), a0a2' aoala2· a0a3 ja aoa3a4 voidaan käyttää korkeatiitte-risten vasta-aineiden tai vastaavasti korkeatiitteristen ihmisperäisten, intravenoosisesti annettavien immunoglobu-liini-G-pitoisten valmisteiden valmistamiseksi, immunisoitiin kliinisen tutkimuksen vaiheen I puitteissa vapaaehtoisia koehenkilöitä säännöllisin välein useita kertoja mono-valenttisilla antigeeneillä b, aQ, aoa2' a0ala2' a0a3 ja a0a3a4* Näiltä luovuttajilta kerättiin plasma ja yhdistettiin serotyyppien mukaisesti erotettuna. Tästä valmistettiin esimerkissä 3 esitetyn menetelmän mukaisesti immunoglobuliini-. G-pitoisia valmisteita suonensisäistä käyttöä varten. Näitä 13 95003 nimitetään seuraavassa Pseudomonas-flagelll-immunoglobulii-niksi (PsH) lisäämällä kulloinkin kyseessä oleva serotyyppi. Esimerkiksi PsHb merkitsee niiden luovuttajien plasmasta valmistettua valmistetta, jotka oli immunisoitu b-tyypin antigeenin flagelli-rokotteella.

H-serotyypille spesifinen tiitteri selvitettiin flagelliini-ELISArlla. Tätä varten erittäin puhtaita flagellivalmisteita inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa natriumdo-dekyylisulfaatin 1 %:sessa liuoksessa, mikä sai aikaan fla-gellien depolymeroinnin flagelliinimonomeereiksi. Tämän jälkeen flagelliiniliuos puskuroitiin uudelleen geelisuodatus-pylvään läpi karbonaattipuskuria, pH 9,6, vastaan ja säädettiin proteiinimäärityksen jälkeen 0,5 yg/ml:n konsentraa-tioon. Tämän liuoksen flagelliini sidottiin sitten kiinteään kantoaineeseen (mikrotiitterilevyn kouru tai päällys (Kamm)). Vapaiden proteilnisidoskohtien pidätyksen jälkeen Tween 20:n 0,05 %:sella liuoksella fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ainoastaan flagellispesifiset vasta-aineet pystyivät enää sitoutumaan immobilisoituun flagelliiniin kantoaineella.

Useiden pesuvaiheiden jälkeen sidotut vasta-aineet osoitettiin entsyymileimatulla toisella vasta-aineella (anti-human-IgG POD-konjugaatti) ja määritettiin kolorimetrisesti kvan-·; titatiivisesti. Selvitetyt tiitterit on esitetty taulukossa 2 ja ne koskevat erilaisten flagelllantlgeenien samoja yg-määriä.

Tiitteriarvot ilmaisevat 5 %:sten Pseudomonas-flagelll-lmmu-noglobuliiniliuosten laimennuksen, jotka saivat aikaan ELI-SA-testissä vielä selvästi positiivisen reaktion.

Immobilisoidun proteiinin määrä määritettiin kulloinkin 10 ELISA-harjanteelle sidotun proteiinin hydrolyysin jälkeen aminohappoanalyysin avulla, jota varten käytettiin puhdistettujen flagelliantigeenien julkaisussa EP-A - 0 252 064 esitettyjä aminohappokoostumuksia.

14 95003

Taulukko 2

Inununoglobuliinivalmisteiden ELISA-tiitterit H-serotyyppl_Kanta_Tiltterl_

PsH-b M-2 1:10.000

PsH-aQa2 5940 1:25.000

PsH-a0a3 5939 1:30.000

PsH-aoaia2 1210 1:25.000

PsH-a0a3a4 170018 1:35.000

Seuraavaksl osoitetaan, että näin valmistetuista Pseudomo-nas-immunoglobuliinivalmistelsta peräisin olevat vasta-aineet sitoutuvat homologisen flagelliserotyypin flagelliini-molekyyleihin ja että tämän lisäksi yksittäisten luovuttajien seerumissa havaittu ristireaktiivisuus (taulukko l) pätee myös hyperimmunoglobuliinivalmisteissa.

Tätä varten valmistettiin yllä esitetyllä tavalla Western-täplät flagellivalmisteista. Ensimmäisinä vasta-aineina käytettiin ihmisen seerumin sijasta viiden hyperimmunoglobulii-nivalmisteen liuoksia, jotka oli säädetty flagelli-ELISA:n mukaisesti samoihin tiittereihin ja sitten laimennettu sopivasti edelleen. Blottien edelleenkehitys ja arviointi tapahtui taulukossa 1 esitetyllä tavalla.

Tulokset on esitetty taulukossa 3.

11 15 95003

Taulukko 3

Flagellispesifisten Pseudomonas-immunoglobuliinivalmisteiden ristireaktiivisuus

Vasta- Antigeeni Wester-täplällä aine_b b(ap) apa2 apajaa apa3 apa3a4_

PsHb ++ ++ (+) (+) (+) +

PsHa0a2 + + ++ ++ ++ +++

PsHaQaia2 + + + ++ ++ +++

PsHaga3 + + ++ ++ ++ ++

PsHaQa3a4 + + ++ + + ++

Kuten jo yksittäisten luovuttajien seerumeilla osoitettiin, myös tutkituissa immunoglobuliinivalmisteissa voidaan havaita voimakas kaikkien a-tyypin flagelleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden ristireaktiivisuus kaikkien a-alaluokan koostumusten flagelliinimolekyylien kanssa. Samoin on selvää, että voi tapahtua a-tyypin flagelleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden (heikompi) sitoutuminen b-tyypin fla-gelliiniin. Suhteellisesti heikosti, mutta selvästi osoitettavissa on b-tyypin vasta-aineiden sitoutuminen a-tyypin flagelliiniin.

Keksinnön mukaisten vasta-aineiden vaikutus liikkuviin Pseudomonas aeruginosa-taudinaiheuttajiin voidaan katsoa johtuvan niiden liikkuvuuden - ja siten infektiopesäkkeen leviämisen - estosta.

Tämä motiliteetin esto voidaan osoittaa pehmeästä agarista valmistetuilla parveilulevyillä (Weichagar-Schwärmplatten). Tätä varten pyöreä suodatuspaperiaihio kostutettiin 20 • myi:11a PsH:n 0,5 %:sta liuosta HBSSGrssä. Tämä asetettiin istutteen päälle, jossa oli 105 itiötä 10 yl:ssa sen jälkeen, kun itiösuspensio oli tunkeutunut pehmeään agariin. Motiliteetin eston aste määritettiin samalla levyllä olevan kontrollin suhteen, jossa istutteen päälle oli laitettu gelatiinia sisältävässä Hank's Balance Salt Solution-liuok- 16 95003 sessa (HBSSG) kostutettu pyöreä suodatuspaperiaihio. Samalla tavoin kuin Western-täplällä voitiin todeta ristireaktioita erilaisia a-serotyypin flagelleja vastaan vaikuttavien vasta-aineiden ja kaikkien tutkittujen itiöiden välillä, joissa oli erilaisia a-alatyypin koostumuksen omaavia flagelleja. Samoin havaittiin Western-täplällä havaittu a-tyypin vasta-aineiden ja b-flagellien välinen ristireaktio. Selvemmin kuin Western-täplällä esiintyi b-tyypin vasta-aineiden ja kaikkien alaluokkien a-tyypin flagellien välinen ristireaktio.

Tulokset on esitetty taulukossa 4, jolloin vasta-aineilla inkuboitujen itiöiden parvelualueiden (Schwärmzonen) läpimittaa verrattiin samalla levyllä oleviin vasta-ainevapai-siin kontrolleihin: merkillä "++" on merkitty parveilualueen läpimittaa, joka on vähintään 40 % pienempi kuin kontrollin; läpimitta vähintään 20 %, mutta korkeintaan 40 % pienempi kuin kontrollin.

Taulukko 4 H-vasta-aineiden ristireaktiot motiliteetin estotestissä

Vasta-aine Itiön H-antigeeni parveilulevyllä H-tyyppiä vastaan b b(ao) aoala2 aoa2 a0a3 a0a3a4 b ++++++++ ++ a0ala2 + + + + + + aQa2 + + ++ ++ ++ + a(ja3 + + + ++++++ a0a3a4 ++ + + ++ + ++

Taulukon 4 tulokset osoittavat, että flagella(H)-antigeeneillä valmistetut keksinnön mukaiset vasta-aineet estävät Pseudomonas-bakteerikantojen motiliteetin.

Estämällä infektiopesäkkeessä olevien bakteereiden mobiliteetti estetään tosin niiden edelleenleviäminen kolonisoitu-malla potilaan kehossa, mutta pesäkkeessä olevat bakteerit

II

17 95003 pystyvät kuitenkin edelleen kuormittamaan potilaan elimistöä luovuttamalla esim. toksiineja, proteaaseja jne. varma suoja infektiota vastaan on tästä syystä taattu ainoastaan silloin, kun aktiivisessa immunisoinnissa muodostuneet vasta-aineet johtavat sisääntunkeutuneiden bakteereiden nopeaan tuhoutumiseen.

Seuraavassa osoitetaan, että flagella(H)-vasta-aineet indusoivat homologisen Pseudomonas-bakteerikannan fagosytoosin ja solusisäisen tuhoutumisen.

Fagosytoosikokeiden suorittamiseksi kasvatettiin kantojen M-2 (b), WR-5 (a0a2), 1210 (aoa^), 5939 (a0a3) ja 170018 (aoa3a4) itiöitä Luria Broth Medium-alustassa ja laimennettiin vähän ennen stationaarista kasvufaasia HBSSG:ssä elävien itiöiden määrään 8 . 108 itiötä/ml.

Kaikista 5 %:sista flagelli-immunoglobuliinivalmisteista valmistettiin 1:18-, 1:72- ja 1:288-laimennus HBSSG:ssä. Kulloinkin 450 μΐ näitä liuoksia inkuboitiin itiösuspension (50 yl) ja HBSSG:n (4,5 ml) kanssa 2 tunnin ajan jään päällä. Tässä inkubaatiossa tapahtui spesifisten vasta-aineiden sitoutuminen bakteerisoluihin.

Fagosytoivina soluina käytettiin ihmisen granulosyyttejä. Nämä otettiin talteen juuri eristetystä koaguloituneesta veli riplasmasta (buffy coats). Koaguloitunut veriplasma vapau tettiin suurimmaksi osaksi erytrosyyteistä kerrostamalla (Unterschichten) suolaliuos-dekstroosi-dekstraani-liuoksel-la. Tämän jälkeen suoritettuun useita sentrifugointivaihei-ta, joiden avulla poistettiin pitkälti jäljellä olevat eryt-rosyytit ja trombosyytit. Pestiin suolaliuoksessa ja sitten solumäärä määritettiin Coulter-solulaskimessa ja säädettiin arvoon 1 . 107 solua/ml HBSSG:ssä. Tästä solususpensiosta valmistettiin verenkuva. Tällöin granulosyyttien suhde lym-fosyytteihin tulisi olla normialueella n. 6:4. Monosyyttien pitoisuus on normaalisti 4 - 8 %. Soluisolaatteja, jotka täyttävät nämä kriteerit, voidaan käyttää fagosytoositestis-sä.

ie 95003

Komplementtilähteenä käytettiin absorboitua ihmisen seerumia (ABA) veriryhmän AB omaavien luovuttajien yhdistelmästä.

Tämä seerumi oli adsorboitu edellä kaikkiin yllä mainittuihin itiöihin, jolloin 1 ml seerumia/itiö inkuboitiin viisi kertaa 5 x 109 itiöllä 0,5 tunnin ajan jään päällä. Jokaista inkubaatiota seurasi sentrifugointivaihe, joka kesti 5 minuuttia 8.000 g:ssä. Viimeisen inkubaation jälkeen sentrifu-goitiin lisäksi 15 minuutin ajan 14.000 g:ssä. Absorption jälkeen seerumin komplementtipitoisuus testattiin C'H50-yk-siköissä. Tämä oli 15 % vähemmän kuin lähtöseerumin pitoisuus. Näin talteenotettu ABA-seerumi esilaimennettiin Hank'in puskurissa 1:50 ja käytettiin fagosytoositestissä.

Fagosytoositestierää varten sekoitettin 100 μΐ granulosyyt-tisuspensiota, 60 yl itiösuspensiota ja 40 μΐ absorboitua ABA-seerumia mikrotiitterilevyn kourussa. Heti sekoittamisen ja tunnin ajan 37*C:ssa kestävän inkuboinnin jälkeen otettiin 25 μΐ testierästä ja laimennettiin 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä. Tällöin granulosyytit liuotettiin (lysie-ren) osmoottisesti ja vapautettiin siihen sisältyvät bakteerisolut. 25 μΐ tätä suspensiota päällystettiin elävien itiöiden määrän määrittämiseksi. Kuolleisuusmäärä laskettiin 0- ja 60 min-arvon koloniamäärällä seuraavan kaavan mukaisesti: luku_t_=_60 kuolleisuus %:na * 1 - _ vertaili^ _ x 100 luku t 0

Kontrolliarvon laskemiseksi toimivat t = 0 ja t = elävien itiöiden 60 min-arvot, jotka oli saatu testin kohdasta, jossa käytettiin vasta-ainekuormitettujen itiöiden sijasta kuormittamattomia itiöitä. Näin saatujen 60- ja 0-min-arvo-jen osamäärää käytettiin kontrollina yllä esitetyssä kaavassa.

Fagosytoositestin tulokset on esitetty taulukossa 5.

11 is 95003

Taulukko 5

Pseudomonas aeruqlnosan tuhoutuminen flagellivasta-aineilla suoritetun opsonisaation jälkeen ihmisen granulosyyteillä VA H- Itiön H-antigeeni fagosytoositestissä tyyppiä vastaan b aoala2 aoa2 a0a3 a0a3a4

PsHb 1: 30 korkea*) korkea 40 27

PsHa0a2 1: 60 102 120 86 65

PsHaoa3 1: 78 105 korkea 108 84

PsHa(jaia2 1: 60 200 korkea 125 72

PsHaQa3a4 1: 78 korkea 190 80 78 *): Kaikissa vasta-ainekonsentraatioissa tuhottiin vähemmän kuin 50 % käytetyistä itiöistä.

Taulukossa esitetyt tiitteriarvot osoittavat H-tyypille spesifisen flagelli-immunoglobuliinivalmisteen konsentraation, joka oli säädettävä opsonisoitaessa 4 x 10® itiötä 5 ml:n erässä, jotta fagosytoositestissä tuhotaan 50 % käytetyistä itiöistä. Tämä fagosytoositiitteri laskettiin homologisten vasta-ainetiittereiden flagelli-ELISA:ssa selvitettyjen absoluuttisten arvojen ja fagosytoosikokeessa määritettyjen lai-mennustekijöiden osamääränä, joissa 50 % käytetyistä itiöistä tuhottiin kulloinkin kyseessä olevalla (homologisella tai heterologisella) flagelli-immunoglobuliinilla.

Taulukosta 5 nähdään, että Pseudomonas-flaqelli-immunoqlobu-liinivalmisteet opsonisoivat itiöitä, joissa on homologisia ja heterologisia flagelliserotyyppejä. Tällöin on erittäin huomiota herättävää kaikkien PsHa-valmisteiden ristireaktio kaikkien a-tyypin ja b-tyypin itiöiden kanssa. PsHaQa2:n erittäin alhaiset konsentraatiot indusoivat a- ja b-tyypin flagelleja sisältävien itiöiden fagosytoosin. b-tyypin itiöiden tuhoamiseksi tarvitaan PsHa-valmisteita korkeampina konsentraatioina kuin PsHb-valmisteita.

Nämä tulokset osoittavat, että a(ja2-spesifisyyden omaavilla vasta-aineilla on suojavaikutus kaikkia kliinisesti rele- 20 95003 vantteja flagelliserotyyppejä sisältäviä itiöitä vastaan ja että tämän suojavaikutuksen täytyy olla voimakkaampi seoksessa, joka koostuu aQa2-vasta-aineista ja b-vasta-aineista, b-tyypin flagelleja sisältävien itiöiden suhteen.

Tähän mennessä ei ole ollut tunnettua, onko vasta-aineilla, jotka on eristetty erittäin puhtailla flagellivasta-aineilla immunisoitujen luovuttajien plasmasta, suojavaikutus Pseudomonas aeruqinosan aiheuttamia infektioita vastaan. Yllä esitetyllä fagosytoositestillä tämä osoitettiin PsH-valmisteil-le, joilla on spesifisyys kaikkien kliinisesti relevanttien H-serotyyppien suhteen.

Seuraavassa taulukossa on esitetty keksinnön mukaisen mono-valenttisen vasta-ainevalmisteen PsHaoa2 vaikutus ja keksinnön mukaisten bivalenttisten valmisteiden PsHb/aQa2, PsHb/aoaia2, PsHb/aoa3 ja PsHb/aoa3a4 vaikutus, jotka valmistettiin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.

Taulukko 6

Terapeuttisten Pseudomonas-immunoglobuliinivalmisteiden vaikutus fagosytoositestissä VA H-tyyp- Itiön H-antigeeni fagosytoositestissä piä vastaan b a0ala2 aoa2 a0a3 aQa3a4 0 PsHba0a2 1: 60 102 120 86 65 87 ; Standardi 1: 3 19 31 28 9 18

PsHb/a0a2 1: 6 24 30 80 20 32

PsHb/a0a1a2 1: 5 28 59 32 13 27

PsHb/a0a3 1: 11 23 32 25 7 20

PsHb/a0a3a4 1: 19 34 15 54 6 26 4

Taulukossa 6 on esitetty ensinnäkin PsHaoa2-valmisteen vaikutus fagosytoositestissä. Tällöin tiitteriarvot koskevat immunoglobuliinin sitä konsentraatiota, joka on säädettävä kuormitettaessa itiöt, jotta tämän jälkeen fagosytoositestissä tuhottaisiin 50 % itiöistä. Kuviossa 1 on esitetty, . miten tämä tiitteri on selvitetty: 450 pl:aan 5 %:sen

II

21 95003

PsH-a0a2-liuoksen 1:18-, 1:72- ja l:288-esilaimennuksla lisätään 50 μΐ suspensiota, jossa on 8 x 108 5940-itiötä/ml, ja 4,5 ml Hank'in puskuria, joka sisältää gelatiinia. Näin saadaan 1:200-, 1:800- ja 1:3200-loppulaimennuksia.

PsHaoa2:n flagelli-ELISA:ssa selvitetty tiitteri on arvossa 1:25.000. Siten ovat flagellivasta-aineiden konsentraatiot bakteereiden kuormituksen aikana 1:125, 1:31,5 ja 1:7,8. Kuviossa 1 on esitetty fagosytoositestissä aikaansaatu itiöiden tuhoutuminen näitä immunoglobuliinikonsentraatioita vastaan. Näistä tuhoutumiskäyristä voidaan selvittää taulukossa esitetyt immunoglobuliinin konsentraatiot, joissa 50 % tutkitusta itiöstä tuhoutuu.

PsHa(ja2-valmisteen vaikutuksen arvioimiseksi vertailuna toimii standardi, joka on seos kaikista viidestä taulukossa 6 esitetystä PsH-valmisteesta, jolloin kaikki yksittäiskompo-nentit säädettiin ELISA-tiitteriin 1:2.000.

Taulukko 6 osoittaa edelleen PsHb:stä ja valmisteista PsHaQa2 tai vast. PsHaQaia2 tai vast. PsHa(ja3 tai vast. PsHaQa3a4 koostuvien seosten vaikutuksen. Nämä seokset säädettiin anti-b-tiitteriin, joka oli n. 1:7.500, ja samansuuruiseen anti-a-tiitteriin. Taulukko 6 osoittaa fagosytoosi-tiitterin, joka selvitettiin näillä immunoglobuliiniseoksil-la Pseudomonas aeruginosa-kannoille, jotka sisälsivät kaik-kie kliinisesti relevanttien serotyyppien flagelliepitoopit.

Nämä tiitterit koskevat immunoglobuliiniseoksen konsentraa-tiota, joka oli säädettävä lähdettäessä molempien komponenttien tiitteristä 1:7.500 kuormitettaessa itiöillä, jotta tämän jälkeen fagosytoositestissä voitiin tuhota 50 % käytetyistä itiöistä.

Kuviosta 2 voidaan nähdä, miten tämä tiitteri selvitettiin PsHb:n ja PsHaoa3:n seokselle: Seos, jossa oli 1 ml PsHb:tä ja 0,33 ml PsHaoa3:a, jolloin b- ja aoa3~tiitterit olivat 1:7.500, kuten yllä on esitetty, esilaimennettiin ja käytettiin fagosytoositestissä. Kuviossa 2 on esitetty fagosytoo- 22 95003 sitestissä aikaansaatu tuhoutuminen bakteerien kuormituksessa esiintyvää vasta-ainetiitteriä vastaan yksittäiskomponen-teille b ja 8003.

Taulukosta 6 nähdään, että PsHa(ja2-valmiste vaikuttaa tosin kaikkia relevantteja serotyyppejä vastaan, mutta sen vaikutus ei ole kuitenkin niin selvä kuin standardin. Sitä vastoin seoksilla, jotka koostuvat PsHb:stä ja jostakin valmisteista PsHa(ja2, PsHaga]^/ PsHaQa3 tai PsHaoa3a4, on vaikutus, joka on lähes yhtä hyvä kuin standardivalmisteen ja selvästi parempi kuin yksittäiskomponenttivalmisteiden (vrt. taulukko 5). Tämän havainnollistamiseksi sarakkeessa 0 on esitetty keskimääräinen tiitteri eri valmisteille tai vastaavasti seoksille.

Immunoglobuliinivalmisteet, jotka valmistettiin sekoittamalla luovuttajien plasma, jotka oli immunisoitu serotyypin b flagelliantigeenillä ja jollakin neljästä a-alatyypin yhdistelmästä, pystyvät siten indusoimaan kaikkien kliinisesti relevanttien serotyyppien flagelleja sisältävien itiöiden tuhoutumisen. Luonnostaan yllä esitettyjen tulosten mukaisesti myös keksinnön mukaiset bivalenttiset rokotteet, jotka koostuvat flagelliantigeenistä b ja jostakin antigeeneistä aoa2' a0ala2' aoa3 tai aoa3a4, tai niitä käyttämällä valmistettu keksinnön mukainen immunoglobuliinivalmiste pystyvät suojaamaan flaqelleja sisältävien Pseudomonas aeruginosa-bakteereiden aiheuttamia infektioita vastaan.

Aktiiviseen immunisointiin käytettävien antigeenien suojavaikutuksen suora osoitus voidaan suorittaa ainoastaan eläinmallissa ja sitä selitetään seuraavassa.

Tilanteiden simuloimiseksi, jotka altistavat (predisponoi-vat) potilaat Pseudomonas-infektioille käytettiin kahta kirjallisuudessa esitettyä eläinmallia: burned mouse-malli (Stieritz, D. D. ja I. A. Holder (1975) J. Infect. Dis. 131, 688 - 691) ja endoksaani-alli (Cryz, S. J. Jr., Filrer, E., Germanier, R. (1983), Infect. Immunity 40, 659 - 664).

23 9 5 0 0 3

Molempia malleja varten selvitettiin Pseudomonas aeruqinosan LD5Q-arvo immunisoimattomissa eläimissä, jotka endoksaani-mallissa immunosuppressoitiin. Burned mouse-mallissa aiheutettiin määrätyn suuruinen palovamma. Taulukossa 7 esitetyillä flagella(H)-antigeeneillä suoritetun immunisoinnin jälkeen eläimet, joilla oli palovamma, tai vast, immunosup-pressoidut eläimet infektoitiin homologisen Pseudomonas-kannan edellä selvitetyn LDsp-itiöluvun kerrannaisella. Taulukko 7 esittää LD5Q-itiölukujen kerrannaiset, jotka 100 % antigeenin esitetyllä konsentraatiolla immunisoiduista eläimistä sietivät endoksaani- ja burned mouse-mallissa. Tulokset osoittavat bivalenttisen flagellirokotteen vaikutuksen normaalissa ja immunosuppressoiduissa eläimessä.

Taulukko 7

Aktiivinen suojakoe Pseudomonas aeruqlnosa-flaqelllrokot-teilla

Antigeeni Määrä/hiiri Immunis. Endoksaani- Burned out-adjuvoitu päivät mallin suo- out-mallin Ai(OH)3:11a ennen ai- jatekijä suojatekijä _tistamlsta (x LD5q)_(x LD50) b 3 yg 14 b 3X101 >104 a0a3_1,5 yg_14_a0a3 2x1ο1 103_ b/apa3 3/1,5 yg 14 b 102 >104 b a0a2 4X101 103 aoaia2 a0aia2 2X101 104 aoa2 aoa3 ΙΟ2 104 apa3 _apa3a4 102 >104 apa3a4

Claims (7)

24 95003

1. Menetelmä sellaisten Pseudomonas aeruginosa-infektioita vastaan vaikuttavien divalenttisten rokotteiden valmistamiseksi, joiden vaikutus ulottuu kaikkia osaflagella(H)- antigeenien a0, alf a2, a3, a4 ja b kaikkiin yhdistelmiin ja jotka sisältävät serotyypin a yhden ainoan flagella(H)-antigeenin ja serotyypin b flagella(H)-antigeenin yhdistelmää, tunnettu siitä, että steriilisuodatetaan Pseudomonas aeruginosa -viljelmistä saatu (saadut), puhdistettu (puhdistetut) flagella(H)-antigeeni(t), sekoitetaan mahdollisesti adjuvantin, kuten Al(OH)3:n kanssa, haluttaessa lisätään säilöntöainetta, kuten mertiolaattia, ja valmistetaan ga-leeniseksi valmisteeksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan divalenttinen rokote, joka sisältää serotyypin a0a2 flagella(H)-antigeeniä, joka koostuu monomee-risistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina aspara-giinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, gly-siiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, ty-rosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 68 : 41 : 37 : 46 : 44 : 73 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 16 : 16 ja jonka molekyylipaino on 45.900.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan divalenttinen rokote, joka sisältää serotyypin a0a]a2 f lagella (H)-antigeeniä, joka koostuu mono-meerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina aspara-giinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, gly- ; siiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, ty- rosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 76 : 44 : 40 : 52 : 50 : 81 : 32 : 32 : 41 : 4 : 12 : 20 : 18 ja jonka molekyylipaino on 51.250.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan divalenttinen rokote, joka sisältää serotyypin a0a3 flagella(H)-antigeeniä, joka koostuu monomee- 25 95003 risistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina aspara-giinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, gly-siiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, ty-rosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 69 : 35 : 38 : 44 : 47 : 73 : 30 : 30 : 60 : 3 : 12 : 21 : 16 ja jonka molekyylipaino on 46.700.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokote, joka sisältää serotyypin a0a3a4 flagella (H)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhteessa 64 : 33 : 35 : 42 : 44 : 68 : 29 : 29 : 37 : 3 : 10 : 19 : 15 ja jonka molekyyli-paino on 43.500.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 2-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokote, joka sisältää lisäksi vielä b-serotyypin flagella(H)-antigeeniä, joka koostuu monomeerisistä aineosista ja joka sisältää aminohappoina asparagiinihappoa, treoniiniä, seriiniä, glutamiinihappoa, glysiiniä, alaniinia, valiinia, isoleusiinia, leusiinia, tyrosiinia, fenyylialaniinia, lysiiniä ja arginiinia suhtees-sa 74 : 48 : 48 : 49 : 51 : 91 : 38 : 30 : 43 : 4 : 13 : 18 : 18 ja jonka molekyylipaino on 53.050.

7. Menetelmä sellaisten immunoglobuliini-G-pitoisten valmisteiden tuottamiseksi, jotka estävät Pseudomonas aeruginosa-itiöiden motiliteettiä, parantavat näiden itiöiden fagosytoo-sia ja tuhoavat opsonisoidut itiöt, tunnettu siitä, serotyypin a yhden ainoan flagella(H)-antigeenin ja serotyypin b flagella(H)-antigeenin yhdistelmällä immunisoitujen luovuttajien plasma käsitellään proteiininsaostusaineilla, kuten ammoniumsulfaatilla, liuotetaan saostettu immunoglobu-liini-G-pitoinen fraktio, puhdistetaan ja valmistetaan ga-leeniseksi valmisteeksi. ,β 95003 2ο