JPH0210157A - ヒトｔ細胞の分化成熟度検査薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒ）Ｔ細胞の分化成熟度検査薬に関する。

〔従来の技術〕

例えば、骨髄性白血病、Ｔ細胞腫瘍等の造血器の腫瘍は
、極めて多様性に冨む腫瘍で、各腫瘍の種類によって治
療法も異なる。このため、治療方針を決定するにあたっ
ては、対象となる腫瘍化細胞がどのような分化酸μ）段
階にあるかを明らかにする必要がある。

従来、造血器腫瘍の分化成熟度の検査には、分化抗原マ
ーカーを認識するモノクローナル抗体が用いられている
。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、ヒ１−Ｔ細胞の分化成熟度を容易かつ
正確に検査することができる新規な検査薬を提供するこ
とにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、特定のモノクローナル抗体が、ヒ）Ｔ細
胞の分化成熟度に応じてそのヒトＴ細胞に結合しあるい
は結合しないことから、分化成熟度の検査に有用である
ことを見出した。

即し、本発明は、ヒト染色体２１番が導入されていて該
ヒト染色体２１番からコードされる膜タンパク質を合成
するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＩＩＯ細胞）
で、免疫された動物から取得した抗体産生細胞と、ミエ
ローマ細胞とを融合させて得られたハイブリドーマによ
り産生され、前記のヒト染色体２１番からコードされる
膜タンパク質を合成するＣｌｌ０細胞に結合するが、正
常なＣｌｌ０細胞には結合しないモノクローナル抗体か
らなるヒトＴ細胞の分化成熟度検査薬を提供するもので
ある。

本発明に用いられるモノクローナル抗体は、本発明者ら
が先に特願昭６２−２１８１４９号に開示したものであ
り、その製造は、ヒトの染色体２１番が導入されていて
該ヒト染色体２１番からコードされる膜タンパク質を合
成するＣ１１０細胞で動物を免疫し、該動物から取得し
た抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリ
ドーマを形成させ、選択、スクリーニングおよびクロー
ニングにより目的とするモノクローナル抗体産生能を有
するハイブリドーマを得、該ハイブリトーマを培養する
ごとにより行なうことができる。

」二記のスクリーニングは、本発明に用いられるモノク
ローナル抗体が有する、前記の免疫に用いられたＣｌｌ
０細胞には結合し得るが、正常なＣ１１０細胞には結合
し得ないという性質を利用して行なう。

上記の製法で、免疫に用いられるヒト染色体２１番が導
入されていて該ヒト染色体２１番からコ１−′される膜
タンパク質を合成するＣ１１０細胞は、公知の細胞融合
技術によって得られる。このようなＣ１１０細胞の例と
しては、２Ｆｕ’と称されているものがある（Ｄ、Ｐａ
Ｌｔｅｒｓｏｎら、Ｓｏｍ、Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、
−］−９１〜１１０（１９７５）参照）。

上記の方法に用いる免疫される動物としては、例えば、
マウス、ラットなどのげっ菌類があげられるが、通常、
マウスが用いられる。

抗原の動物への投与の経路および計画は種々変えて行う
ことができる。例えば好ましい投与様式では、抗原をマ
イトマイシン処理し、次いで数回に分りで腹腔内に注射
する。抗原の投与により該動物の肺臓に抗体が産生ずる
。抗体産生細胞としては、通常、肺細胞が用いられる。

次に、得られた抗体産生細胞と融合させるミエローマ細
胞としては、例えば、ＢＡｌ、Ｂ／ＣマウスＭＯＰＣ２
１骨髄腫から誘導された細胞（ＭＳ−１と称される）が
用いられる。このＮＳ−’１は、８−アザグアニンに対
し耐性があり、酵素ヒボキサンチン・グアニン・ホスホ
リボシルトランスフェラーゼを欠くためにヒボキサンチ
ンーアミノプテリンーチミゼンを含ｈ゛する培地（ＩＩ
ＡＴ培地）中で死滅するものであるため、得られるハイ
ブリトーマの選択的培養に好都合である。細胞融合の融
合剤としては、通常、ポリエチレングリコールが用いら
れる。以」二の融合技術および用いられるミエローマ細
胞等はそれ自体公知である〔ミエローマ細胞にδ旧ｅｒ
　ｅｔ　ａｌ。

［ｉｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　６，２９２〜２
９５　（１９７６）。融合方法にδ）ＩＩｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、＋同上、６．５１．１〜５１６　（１９７６））
。

次にハイブリドーマをスクリーニングし、前記免疫に用
いられたＣ１１０細胞（即ぢ、ヒト染色体２１番が導入
されていて該ヒト染色体２１番からコードされる膜タン
パク質を合成するＣ１１０細胞）には結合するが、正常
なＣ１１０細胞には結合しないモノクローナル抗体を産
生ずるものを選択する。こうしてスクリーニングされた
ハイブリドーマは、次いでクローニングされ、各系統か
らの個々のハイフリドーマの子孫が得られる。この細胞
系統部らりじｌ−ンを細胞培養液（生体外培養）または
ｉｎ　ｖｉｖ。

（生体内培養）において無限に増殖させ、目的とするモ
ノクローナル抗体を合成・分泌させ続りる。

産生されたモノクローナル抗体は当該業界で既知の方法
により回収される。

本発明に用いられるモノクローナル抗体は、特願昭６２
−２１．８１４９号に開示したように、数が異常である
ヒト染色体２１番からコードされる膜タンパク質成分を
有するヒト繊維芽細胞に特異的に結合し、正常なヒト繊
維芽細胞には結合しない性質を有する。

また、本発明に用いられるモノクローナル抗体ば、ヒト
］゛細胞への結合性、即ち結合するか否かが、そのヒト
Ｔ細胞の分化成熟度に依存することがわかった。このヒ
トＴ細胞は、正常なＴ細胞でも腫瘍化した白血病細胞で
もよい。したがって、本発明の検査薬は、腫瘍化Ｔ細胞
の分化成熟度を検査するのに有用である。

本発明の検査薬の使用法は、いずれの免疫学的試験方法
、例えば、免疫螢光法、免疫粘着血球凝集反応法、放射
性免疫測定法等を利用するものであってもよい。例えば
、免疫螢光法を利用する場合を示すと、ヒトの細胞を本
発明のモノクローナル抗体で処理し、次いで螢光色素（
例えば、ＦＩＴＣ）でラヘルされた抗マウスＩｇＧと反
応させ、これを螢光顕微鏡にセットし、発光状態をチエ
ツクすることによりヒトＴ細胞の分化成熟度を容易に検
査することができる。

〔実施例〕

モノクロ−ル　　の （１）（抗体の産生） ヒトの染色体２１番が導入されており、この染色体２１
番からコードされる膜タンパク質を有するＣ１１０細胞
（２Ｆｕ’）をマイトマイシンＣで処理し、ＰＢＳ（Ｉ
Ｊン酸緩衡液）で洗浄した。５Ｘ１０６セル１０．５ｃ
ｃの２Ｆｕ’のＰＢＳ懸濁液をＢＡＬＢ／Ｃマウスのメ
スの腹腔に注射（免疫化）した。２週間後同様にｌＸ１
０’セル１０．５ｃｃ、更に２期間後ＩＸ’ｌＯ７セル
１０．５ｃｃを注射し、それから３日後に同マウスの肺
臓を摘出し、ＲＰＭＴ−１６４０培地中で細砕し、遠心
分離（１５００ｒｐｍ）により３回洗い、同培地中に再
懸濁した。

（２）（細胞融合） 前記で得られた肺細胞１．　Ｌ　Ｘ１０３個およびＲＰ
Ｍ１１６４０培地で１回洗ったＢＡＬＢ／Ｃマウスのミ
エローマ細胞（ＮＳ−１）　１．　ＯＸ　１０７個を混
合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを調製
した。次いで、ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエチレン
グリコ−ル（１５４０）を溶解して５０ｗｔ％とした液
１ｍＡを撹拌下に加え、さらに総量が１０ｍ７！になる
ように！？ＰＭＩ−１６４０培地を加え撹拌した。終了
後、１１０００ｒｐで５分間遠心分離を行い融合剤のポ
リエチレングリコールを除去した後、ＲＰＭＩ−１６４
０培地にウシ胎児血清（Ｆｅ２）２０　ｖｏ１％を添加
した培地４０ｍ１に再懸濁した。

（３）（選択゛、スクリーニング、クローニング）９６
穴組織培養平板の１９２穴の各人に上記懸濁液０．２ｍ
７！（細胞数５Ｘ１０６個）を入れ、２〜３日おきに培
養上清液の半量をＩＩＡＴ培地（ヒボキサンチン１３６
．１　ｍｇ／ｍβ、アミノプテリン１．７６ｍｇ　／　
ｍ　（！、チミジン３８．７５　ｍｇ／　ｍ　／ｌ　）
で置換した。培養条件ば３７°Ｃ１１００％湿度、ＣＯ
□ガス濃度７％である。

１０口後、１１９穴（出現率６２％）にハイブリト−マ
が観察された。陽性結果を示した１１９穴の上清を２Ｆ
ｕ’で酵素抗体法（ＩＥＬＩＳＡ法）により抗体を産生
ずるか否かをチエツクしなからスクリーニングしたとこ
ろ、２０穴がプラスだった（全入の１０．６％）。

この２０穴各々の細胞をＢ糺Ｂ／Ｃマウス胸腺細胞１．
０Ｘ１０７個／ｍβを補充した１１訂培地で限界希釈し
、９６穴組織培養用平板の各人に０．２ｍｆｆずつ入れ
培養した。この時、ハイプリ１−マの１穴当りの数と穴
数は、１セル／穴が４８穴、５セル／穴が４５穴、２０
セル／穴が３穴であった。培養条件は−１−と同しであ
る。その上清液について前述したＥＬＴＳＡ法により、
Ｃ１１０細胞マイナス、２Ｆｕ’プラスのものをスクリ
ーニングした結果２穴にクローンが得られた。更に、残
った３穴の細胞を限界希釈法により２回再りローニング
操作を行い、得られたハイブリドーマを夫々０Ｒ−１、
ＯＫ−２（ｍ工研条寄第１８０２号）、ＯＫ−３（同第
１８０３号）と命名した。

ハイブリドーマＯＫ−１、ＯＫ−２およびＯＫ−３から
産生されるモノクローナル抗体は、抗マウス抗体を用い
た酵素抗体法で調べたところ、それぞれクラスがＩｇＭ
、　ＩｇＧ、およびＩｇＭのものであることが判明した
。

また、ＯＫ−１，ＯＫ〜２およびＯＫ−３が産生ずるモ
ノクローナル抗体が認識結合するタンパク質は次のとお
りである。

・ＯＫ−１産生モノクロ一ナル抗体： ヒトの白血病細胞株ＴＡＬＬ−１の細胞タンパクのウェ
スタンブロッティングにおいて、４本のハンドを認識す
る。

・ＯＫ−２産生モノクロ一ナル抗体： ヒトの白血病細胞株ＴＡＬＬ−１細胞タンパクのウニス
タンプコンテイングにおいて、４０および９０十ロダル
トンのバンドを認識する。

・ＯＫ−３産生モノクロ一ナル抗体： ＴＡＬＬ−１細胞タンパクのウェスタンブロッティング
において、８６．４．７４．２．６１．４および３６．
４キロダルトンの４本のバンドを認識する。２Ｆｕ’細
胞タンパクのウェスタンブロッティングにおいては、８
９、８２および４５キロダルトンの３本のハンドを認識
する。

実施例１　（免疫螢光法によるヒ）Ｔ細胞分化成熟度の
検査） 分化酸μ）度の異なるＴ細胞白血病細胞株（ＮＡＬＭ１
６、ＭＯＬＴ−１０，ＨＰＢ−八ＬＬ、ＴＡＬＬ−１，
ＭＯ１，Ｔ−４，ＳＫ誓、ＭＴ−２（ＭＡＭＭＡＬＴ八
Ｎ　　ＣＩへＬＬ　　Ｃ［ＩＬＴＵＲＥ　　ＴＥＣＩＩ
ＮＯＬＯＧＹ、Ｍ、５ｈｉｋｉｔａ他編集、　５ｏｆｔ
　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（東京
）発行。

ｐ、、１４１〜１６２参照）を各々培養した。培地は、
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を使
用した。

培養後、５Ｘ１０６個の細胞を３％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊さ
せ、１．００Ｏｒｐｍで、５分間、３回遠心することに
より、細胞の洗浄を行った。前記調製例で得たハイブリ
ドーマＯＫ−１、ＯＫ−２およびＯＫ−３から得られた
２種のモノクローナル抗体の各々について、モノクロー
ナル抗体を、０．０２Ｍアジ化ナトリウムおよび３％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳで４００倍希釈して得たモノクローナ
ル抗体溶液５０μｌに、前記洗浄後の細胞を浮遊させ、
室温で１時間反応させた。反応後、細胞を上記と同様の
方法で洗浄した。

洗浄後、細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２００倍希
釈したフルオレセインイソチオシア２−　ト（ＦＩＴＣ
）結合抗マウスＬｇＧあるいばＩｇＭ抗体溶液に浮遊さ
せ、室温で３０分間反応させた。

反応後、細胞を遠心洗浄した。この後、細胞を、７％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳに浮遊させ、螢光顕微鏡観察を行った
。

結果を表１に示す。この結果０Ｒ−１、ＯＫ−２および
ＯＫ−３は、それぞれ固有のパターンで、ヒトＴ細胞白
血病細胞の分化酸ｖ１度を識別することができることが
判明した。

〔発明の効果〕

本発明のヒ）Ｔ細胞の分化成熟度検査薬は、用いられる
モノクローナル抗体に応じて異なったパターンで、ヒト
Ｔ細胞白血病細胞に結合するので、１種で、または必要
に応じ２種以上併用することによりヒ）Ｔ細胞の分化成
熟度を正確かつ簡便に検査することができ、ヒト白血病
の診断等に有用である。

代理人　弁理士　　岩見谷　　同志

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト染色体２１番が導入されていて該ヒト染色体２
   １番からコードされる膜タンパク質を合成するチャイニ
   ーズハムスター卵巣細胞で、免疫された動物から取得し
   た抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて得ら
   れたハイブリドーマにより産生され、 前記のヒト染色体２１番からコードされる膜タンパク質
   を合成するチャイニーズハムスター卵巣細胞に結合する
   が、正常なチャイニーズハムスター卵巣細胞には結合し
   ないモノクローナル抗体からなるヒトＴ細胞の分化成熟
   度検査薬。 ２）特許請求の範囲第１項記載の検査薬であって、前記
   のハイブリドーマがＯＫ−１、ＯＫ−２またはＯＫ−３
   である検査薬。