JPH0160237B2

JPH0160237B2 -

Info

Publication number: JPH0160237B2
Application number: JP21569682A
Authority: JP
Inventors: Yoshitada Takazawa; Keiichi Inuzuka; Kazumi Araki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1982-12-09
Filing date: 1982-12-09
Publication date: 1989-12-21
Also published as: JPS59106295A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は発酵法によるＬ−イソロイシンの製造
法に関する。

さらに詳しくは、コリネバクテリウム属に属
し、アルギニンを生育に要求する微生物を用いる
発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法に関す
る。その目的とするところは、経済的に有利なＬ
−イソロイシンの工業的生産方法を提供すること
にある。

従来、発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法
の主たるものは、ミクロコツカス・グルタミクス
に属するスレオニン、メチオニン、ホモセリンま
たはロイシン要求株を用いる方法（特公昭38−
7091）、ブレビバクテリウム・フラブムのα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性でかつプリンま
たはリジン要求株を用いる方法（特開昭49−
85288）、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性
でＯ−メチルスレオニン耐性の変異株を用いる方
法（特開昭49−93586）、ブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属のα−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸耐性で同時にエチオニン、２−チ
アゾールアラニンおよびＳ−（２−アミノエチル）
Ｌ−システインのうちの少なくとも１つに耐性の
変異株を用いる方法（特開昭50−101582）およ
び、ブレビバクテリウム属に属し、イソロイシン
アナログに耐性でかつメチオニンまたはリジン要
求性の変異株を用いる方法（特開昭51−73188）、
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属のビタミンＰ耐性の変異株を用いる方法（特開
昭57−2687）が知られている。しかしながら、こ
れらの方法は、経済的なＬ−イソロイシンの工業
的生産をとつてまだ満足すべき生産性を有してい
ない。

本発明者らは、すぐれたＬ−イソロイシン生産
菌を誘導する研究の過程で、コリネバクテリウム
属に属するアルギニン要求性変異株がＬ−イソロ
イシンを蓄積する能力を有することを見出し本発
明を完成した。

従来、アルギニン要求性のＬ−イソロイシン生
産菌については全く報告がなく、本発明はかかる
新規な知見に基づいている。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明に使用する微生物の代表例としては、コ
リネバクテリウム・グルタミクムM295−９およ
びコリネバクテリウム・グルタミクムSS−39−
21をあげることができる。M295−９は、コリネ
バクテリウム・グルタミクムの野性株FERM−
P3295から紫外線照射を用い常法によつて誘導さ
れたアルギニン要求株であり、またSS−39−21
は、上記のM295−９から、さらにＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理によ
つて常法により誘導されたアルギニン要求性でか
つＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性
の性質を有する変異株である。

以下にコリネバクテリウム・グルタミクム
M295−９およびコリネバクテリウム・グルタミ
クムSS−39−21の具体的誘導方法で示す。

コリネバクテリウム・グルタミクムFERM Ｐ
−3295を常法により紫外線照射処理（99.99％死
滅）した後、常法によりアルギニン要求性株を採
取した。このアルギニン要求性株の中からＬ−イ
ソロイシン生産能の高い菌株M295−９を選んだ。

上記で得られたコリネバクテリウム・グルタミ
クムM295−９を常法によりNTG処理（PH５のト
リスマレイン酸溶液中100μｇ／ml、30℃で30分
間）した後、遠心洗浄し、Ｓ−（２−アミノエチ
ル）−Ｌ−システイン1000μｇ／ml、スレオニン
1000μｇ／mlを含む最少寒天培地〔グルコース0.5
％、（NH₄）₂SO₄0.15％、KH₂PO₄0.15％、
K₂HPO₄0.05％、NaCl0.01％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、CaCl₂・2H₂O1μｇ／ml、MnCl₂・
4H₂O7μｇ／ml、FeSO₄・7H₂O10μｇ／ml、チア
ミン塩酸塩0.1μｇ／ml、ビオチン0.03μｇ／ml、
アルギニン塩酸塩0.01％、寒天1.5％、PH7.2〕に
プレートに当り10⁷個の割で撒き、30℃５日間培
養した。生育した50のコロニーの中からＬ−イソ
ロイシン生産能の高い菌株SS−39−21を選んだ。

これらの微生物を用いてＬ−イソロイシンを生
産せしめるにはとくに困難はなく、炭素源、窒素
源、無機塩類、生育要子等を有する通常の発酵培
地を用いて、常法によつて行うことができる。

使用する炭素源としては、グルコース、シユー
クロース、廃糖密、デンプン加水分解物などの炭
水化物、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、ピル
ビン酸、フマール酸などの有機酸類、メタノー
ル、エタノール、プロパノール等のアルコール類
を単独あるいは組合せて使用することができる。

窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン安、
尿素、アンモニア、その他を使用できる。また、
使用菌の要求するアルギニンその他の物質は、純
標品として、もしくはそれらを含有する天然栄養
物の形で添加することができる。

Ｌ−イソロイシンの発酵生産のための発酵条件
としては、通気培養がよく、発酵温度は24〜37
℃、発酵日数は２〜７日間である。発酵液のPHは
５〜９の範囲内に継続されるが、PH調整には、無
機あるいは有機の酸あるいはアルカリ、さらには
尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用
することができる。

発酵液からのＬ−イソロイシンの単離は通常イ
オン交換樹脂法、その他公知の方法を組合わせて
行われる。

以下に実施例を示す。

実施例１コリネバクテリウム・グルタミクムM295−９
（アルギニン要求性）（FERM Ｐ−6832）および
SS−39−21（アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミ
ノエチル）−Ｌ−システイン耐性株）（FERM Ｐ
−6830）を、各々20mlの種培地（グルコース５
％、酵素エキス１％、ペプトン１％、尿素0.3％、
NaCl0.25％、コーン・ステイーブ・リカー0.5％、
ビオチン50μｇ／、PH7.2）を含む300ml容三角
フラスコに接種し、28℃で、24時間、210rpmの
回転数のロータリーシエーカー上で振盪培養し
た。この種培養液２mlを、20mlの発酵培地を含む
300ml容三角フラスコに接種して、72時間、上記
の種培養と同様の方法で培養した。

培養終了液中のＬ−イソロイシンの蓄積量は、
M295−９の場合0.5mg／mlであり、SS−39−21の
場合は8.3mg／mlであつた。対照とした親株
FERM Ｐ−3295（野生株）のＬ−イソロイシン
蓄積量は0.1mg／ml以下であつた。用いた発酵培
地の組成は次のとおり。廃糖密（グルコース換
算）８％、コーン・ステイープ・リカー0.5％、
塩安２％、尿素0.2％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、FeSO₄・7H₂O0.001％、MnCl₂・
4H₂O0.001％、CuSO₄・5H₂O0.001％、CaCl₂・
2H₂O0.001％、ZnSO₄・7H₂O1mg／、NiCl₂1
mg／ml、（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O1mg／、
CoCl₂・6H₂O1mg／、パントテン酸カルシウム
10mg／、ビオチン50μｇ／、アルギニン塩酸
塩500μｇ／ml（PH7.4）。

Claims

【特許請求の範囲】

１コリネバクテリウム属に属し、生育にアルギ
ニンを要求しかつＬ−イソロイシンを生成蓄積す
る能力を有する微生物を、培地に培養して培養物
中にＬ−イソロイシンを蓄積せしめ、該培養物か
らＬ−イソロイシンを採取することを特徴とする
Ｌ−イソロイシンの製造法。