JPH01502158A - ジペプチドの酸素的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ジペプチドの酵素的製造方法 本発明は、ジペプチドおよびジペプチド誘導体ならびに請求の範囲第１項の導入 部分に述べた種類の化合物の酵素的製造方法に関する。

最近、Ｄ−フンフイギュレーションのアミノ酸残基を含有していてもよいジペプ チドおよびジペプチド誘導体に対する興味が、その薬理学的効果、たとえば抗生 物質としての可能性から、高まりつつある。また、ヒトおよび家畜の人工栄養、 甘味剤、さらには除草剤のような農薬の分野においても、ジペプチドに大きな興 味がもたれてきた。

このようなジペプチドＨ−Ａ−Ｂ−Ｙは、公知の化学的カップリング反応によっ て製造できるが、これらの方法はすべて、一般に関連アミノ酸、Ａｒ３よびＢの それぞれアミノ基およびカルボン酸基を、またさらに側鎖が官能基を有するなら ば多くの場合、側鎖も保護する必要があるという特徴をもっている。しかも、使 用する試薬および条件のため、化学的カップリング工程の間に副反応が起こると いう固有の危険がある。主な副反応はとくにＡ成分のラセミ化である。化学的カ ップリング工程を、緩和な条件下に進行する酵素的カップリングｒ程で置き換え ることにより、このようなｐｊ反応およびラセミ化が回避でき、立体化学的に純 粋な生成物が得られる。

アミノおよびカルボキシル保ＩＭの存在は、化学的カップリングでもエンドプロ テアーゼを用いた酵素的カップリングでも同様に必須であり、また従来の知謀で ジペプチドの酵素的エキソプロテアーゼ触媒による形成でも基質の７ミノ官能基 には必要とされている。これは、上述の方法の工業的規模における経済性に著し く影響するいくつかの望ましくない特徴を付加し、とくにジペプチドの合成の場 合とくに顕著である。

不利益はこれらの基の導入と除去に関連し、また操作工程でのこれらの基の存在 は全過程の経費および所要時間を増大させ、総酸率に影響する。

共通して用いられるアミノ保護基の代表例としては、カルボベンゾキシ（Ｚ−） および三級ブトキシカルボニル（ＢＯＣ−）型の基があり、これらの分を量はア ミノ酸残基のそれにほぼ匹敵する。まず、保ＩＬｉは、別個の反応工程において 、適切な高価な試薬により出発原料に導入し、ついで分離工程に付さねばならな い。現在のところ、これらの疎水性の基はその中間体および反応生成物の溶解度 に著しい影響を与える場合が多く、その処理に必要な溶媒の性質および場の両者 、ならびに精製および脱保護の難易に影響する。脱保護にも別個の工程を行うこ とになり、ついでｍ製工程が必要になる。

この目的には、一連の反応を利用できるが、それ自体工業的には問題のある接触 水素添加を除いて、これらの方法は激しい、多くの場合、強酸性または強塩基性 条件下に行われ、一連の副反応が起こることが多く、不純な生成物を生じ、面倒 なｍ製が必要になる。

この比較的長い一連の合成工程の最終工程はかなり包括的な脱保護となり、所望 のペプチドが祷られるが、はとんど回避できない二次反応により、所望の高純度 の生成物を得るにはかなり面倒な精製操作を必要とすることが多い。

ジペプチドの製造におけるアミノ末端保護を回避する試みは、ＥＰ−ＡＩ−０７ ４０９５号およびＥ　Ｐ−Ａ　２−１０２５２９号に記載されたアスパルテーム の生成の場合の発酵工程のように微生物発酵の方向で検討されてきた。この方法 は基本的に合成的アブ０−チとは異なり、それぞれのペプチドごとに特異的な生 物に依存するもので、一般的に応用できるものではない。しかも、収率は低いこ とが多く、発酵培地からの回収も繁雑である。

したがって、アミノおよびカルボキシ末端上の保１１を回避できることが、全過 程の経済性という点で有利なことは自明である。本発明の目的は、これを、セリ ン６よびチオールカルボキシペプチダーゼ触媒によって仲介されるジペプチド合 成において可能にすることにある。

ある場合には、側鎖保護基は有しても末端保ａはないジペプチドを製造できるこ とは興味深く、本発明の方法によれば、側鎖は保護されているが、アミンないし カルボキシは保護されていない出発原料に出発することが以下に示すように可能 になる。この場合、同時に、緩和な反応条件と全過程の経済性という利点が達成 される。所望により、側鎖保護基は化学的または酵素的手段で切断できる。

側鎖非保１７ミノＭ誘導体と、Ｃ＊端は保護されていなくてもよいＢ成分（求核 性）の使用を可能にする酵素触媒カップリング反応は知られている［たとえばＤ Ｋ特許（出願第５２０２／８０号および相当するＥＰ特許出願第１７４８５号（ ＥＰ−８１−１７４８５号）参照］。

ＥＰ−ｔ３１−１７４８５号には、一般式％式％ （式中、Ａ１はＮ末端保護アミノ酸残基、またはＣ末端Ｌ−アミノ酸残基を有し Ｎ末端が保護されていてもペプチド残Ｎ″ｒ−あり、Ｂ　はＬ−アミノ酸残基で あり、Ｚ１は０１（またはＣ末端保護基である）で示されるペプチドを、ｉ＊酸 成分アミン成分との酵素の存在下に反応させ、ついで所望により任意の末端保ｆ ｆ３ｊを切断して、式％式％ で示されるペプチドに導くことによって１ｉＴ１する方法において、アミノ酸エ ステル、ペプチドエステル、デブシベブチドまたはＮがｇ換されていてもよいア ミノ酸アミド、またはＮ末端が保護されていてもよい式％式％ （式中、Ａ　は先に定義したとおりであり、Ｒ１はアルキル、アリール、ヘテロ アリール、アラールキルまたはアミノ酸残基のα−デスアミノフラグメントであ り、ＲおよびＲ２′はそれぞれ水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールまた はアラールキルであり、ｘｌはし−７ミノｉＩ列基である）で示されるペプチド から選ばれる基質成分を、式 ％式％ （式中、Ｂ　は先に定義したとおりであり、Ｒ３およびＲ３′はそれぞれ水素、 ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはアラールキル であり、Ｒ４は水素、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはアラールキル である）で示されるＮが置操されていてもよいし一アミノ酸アミド、し−アミノ 酸またはＬ−アミノ酸エステルと、酵母もしくは動物、植物または他の微生物起 原の酵素、Ｌ−特異性セリンまたはチオールカルボキシペプチダーゼの存在下、 ｐＨ５〜１０．５の水性溶液または分散液中、好ましくは２ｏ〜５０℃で反応さ せることを特徴とする方法が記載されている。好ましい酵素は酵母からのカルボ キシペプチダーゼＹであり、以下ＣＰＤ−Ｙと呼ぶ（この記号の意味の混乱を避 けるために付言するが、上述の記号の意味はＥＰ−８−１７４８５号に用いられ た意味と同じではない）。

したがって、ジペプチドをＥＰ−３−１７４８５号の方法によって製造する場合 、基質成分は必ずＮ末端保護７４７８８８体でなければならないし、ｌＩｒ１ｔ アミノ酸は必ずＬ−アミノ酸でなければならない。

さらに一般的には、基質成分におけるＮ末端アミノ基保護の必要性は、ペプチド 残基の鎖長が長くなるに従い低下し、３個のアミノ酸からなるペプチド残基では 、その種類および配列によっては保護の必要がなくなるといわれている。

これは、Ｂｒｅｄｄａｍらにより、“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅｓｕｂ ｓｔｒａｔｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｎ　ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ 　ＹＣａｔａｌｙＺｅｄ　ｐｃｐｔｔｄｅ　ｂｏｎｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”　 、Ｃａｒｌｓｂｅｒａ　Ｒｅｓ。

Ｃｏ５５ｕｎ、、第４５　巻、　３６１　〜３６７　頁　（１９８０年　１２月 ３０日）に例示されていて、Ａｃ−Ａｌ　ａ−Ａｊ　ａ　−Ａｊａ−ＯＭｅおよ びＨ−Ａｌ　ａ−Ａｊ　ａ−Ａｔ　ａ−ＯＭｅが）Ｉ−ＬｅｕＮＨ２とＣＰＤ− Ｙの存在下にカップリングされ、それぞれＡｃ−Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ −ＬｅｉＵＮＨ２およびＨ−Ａｊａ−Ａｌａ−Ａｊａ−ｔ−ｅｕＮＨ２が９０％ および８０％の収率で得られている。

ＢｒｅｄｄａＩらは、ＣＰＤ−Ｙ触媒ペプチド合成におけるカップリングの収率 に対するアミノ酸のコンフィギユレーションの重要性も検討し、次表のような結 果を得ている０表中、ＡｊａはＬ−アラニンを、ａｌａはＤ−７５二ンを示して いる。

暴　賀　生　成　物　収率 １−１−Ａｊａ−Ａｊａ−Ａｊａ−ＯＭｅ　Ｈ−Ａｊａ−Ａｊａ−ＡＪａ−Ｌｅ ｕＮＨ２８０Ｈ−Ａｊａ−ａｊａ−Ａｊａ−ＯＭｅ　Ｈ−Ａｊａ−ａｊａ−Ａｊ ａ−ＬｅｕＮＨ２４０Ｈ−Ａｊａ−Ａｊａ−ａｊａ−ＯＭｅ　Ｈ−Ａｊａ−Ａｊ ａ−ａｊａ−ＬｅｕＮＨ２０条件二基質２５ｇ＋Ｈ，Ｏ，ＩＨＫＣｊ、１■ＨＥ ＤＴＡ。

ｐＨ９，５、ＣＰＤ−Ｙｌ　２μｍ、０．２８　ＬｅｕＮＨ２、反応は２０分後 に停止させた。

表から明らかなように、Ｃ末端がＨ−Ａｌａ−Ａｌａ−ａｌａ−ＯＭｅのように Ｄ型であるとエステルが反応しないため、ペプチド合成が起こらない、Ｈ−Ａｊ ａ−の隣にあると、反応は起こるがカップリングの収率は純粋なし一フンフイギ ュレーションのＨ−Ａｌａ−Ａｊａ−Ａｊａ−ＯＭｅの場合の８０％に対し４０ ％に低下する。

さらに、一部のエンドプロテアーゼは、Ｌ−コンフィギユレーションを有するあ る種のＮ−非保１アミノ酸エステルのオリゴメリゼーションを触媒できることは 以前から知られていたが、単純なダイマーではないジペプチドの製造にこれを用 いることは、従来試みられたことがない。一般に、このような観察の結果は、一 連のオリゴマーの混合物であって、時には長く、そして単一の生成物を単離でき たとしても生成物沈殿の場合のみであった。

この理由から、ペプチド合成におけるエンドプロテアーゼの使用は、米国特許第 ４．０８６．１３６＠に例示されているように、アミノおよびカルボキシ末端保 護出発原料を用いる場合に限られていた。

また、米国特許第３，９７２．７７３号に例示されたように７スパルテートエン ドプロテアーゼを使用する場合、またＥＰ−ＡＩ−００９５８５号においてＺ− Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＯＭｅ−Ｐｈｅ　ＯＭｅ塩の合成に例示されたようにメタロエ ンドプロテアーゼを使用する場合も、これらの種類の出発原料が必須である。

最後に、Ｄ、Ｌ：Ｌ、Ｄおよびり、Ｄ−コンフィギユレーションのジアステレオ −マージペプチドならびにアミノ非保護出発化合物からのβ−アミノ酸残基を含 むペプチドの合成は、これまでカルボキシペプチダーゼによっては不可能であっ たし、一般にどんなタンパク分解酵素（分類ＥＣ３，４）でも可能ではなかった 。別の分類の酵素、タトえばＥＰ−ＡＩ−０８６０５３号１ｃ例示されているよ うなアミノアシル−ｔ−ＲＮＡ−シンテターゼ（分類ＥＣ６，１）である努力が 行われたことはある。

この場合には、アミノ酸残基の各タイプ毎に特定の酵素を使用しなければならな いし、さらにＡＴＰのような高価な補因子が必要である。しかも、収率は低く、 ある種の生成物が単離され同定されたとしても、通常１０倍もの過剰の補因子、 １００倍過剰の核試薬、ＩＩで１０００倍まで過剰の酵素が必要であった。

本発明は、驚くべきことに、ＥＰ−８１−１７４８５号に用いられたセリンおよ びチオールカルボキシペプチダーゼが、ジペプチドおよびジペプチドｉ　５％体 の合成のための制御反応における基質成分としてＮ−非保護アミノ酸エステルを 使用できること、そして基質のオリゴメーションの可能性を抑えることが可能な ことを発見したものである。

さらに驚くべきことに、これらの反応では、Ｄ−コンフィギユレーションのＮ− 非保護アミノ酸誘導体を基質として使用することも可能で、Ｌ、Ｌ−ジペプチド のはかり、Ｌ−ジペプチドも合成できることが明らかにされた。Ｄ基質の反応速 度は均一な条件ではし一基質の反応速度に比べてやや低いが、以下に例示するよ うに、相当するＮ−保護アミノ酸エステルの場合のｏ−ｉ質がＬ−基質の反応速 度よりはるかに低速度でしか反応しないのに比べて、反応速度の差ははるかに小 さい。収率は以下の例に示すように、非保護Ｌ−一基質場合に比べて非保ＩＤ− 基質はほぼ同じか、わずかに高い。

さらにもつと驚くべきことに、この構造の基質とは、Ｄ−コンフィギユレーショ ンの核試薬は、他の場合には合成点の７ミノ側でＬ−特異的であることが知られ ていたこれらの酵素によってカップリングできることが明らかにされた。この方 法で導入されるアミノ酸エステルは加水分解されない。

したがって、本発明の方法は、請求の範囲第１項の特徴部の定義によって特徴づ けることができるものである。

有用なアミノ酸の例には、モノアミノモノカルボン酸たとえばグリシン（Ｇｌｙ ）、アラニン（Ａｊａ）、バリン（Ｖａｊ）、ノルバリン（Ｎｖａオ）、ロイシ ン（Ｌｅｕ）、イソ０イシン（ｉｓｏ−１−ｅｕ）およびノル０イシン（Ｎｊｅ ｕ）、ヒトＯキシアミノ酸たとえばセリン（Ｓｅｒｅ、スレオニン（Ｔｈｒ）お よびホモセリン（ｈｏｍｏ−８ｅｒ）、含硫アミノ酸たとえばメチオニン（Ｍｅ ｔ）またはシスチン（ＣｙｓＳ）Ｒよびシスティン（Ｃｙ　ｓ　）−１）　、モ ノアミノジカルボン酸たとえばアスパラギンＭ（ＡＳＤ＞、グルタミンＭ（ＧＪ ｕ）およびそれらのアミドたとえばアスパラギン（Ａｓｎ＞およびグルタミン（ Ｇｉｎ）、ジアミノモノカルボン酸たとえばオルニチン（Ｑｒｎ）およびリジン （Ｌｙｓ）、アルギニン（ＡｒＱ）のような脂肪族アミノ酸、フェニルアラニン （Ｐｈｅ）およびチロシン（Ｔｙｉのような芳香族アミノ酸、ならびにヒスチジ ン（１−１ｉｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）のよう な異項環アミノ酸がある。もつと例外的な有用なアミノ酸の例としては、ペニシ ラミン（Ｐｅｎ）、アミノホスホン酸たとえばアラニンホスホンＭ　（Ａｊ　ａ Ｐ）　、アミノスルホン酸たとえばタウリン（Ｔａｕ）、ω−アミノ酸たとえば β−アラニン（βＡｊａ）を挙げることができる。上述のように、これらは基質 成分中にＤ型で包含されてもよいし請求核試薬成分中にＤｐ！１で存在してもよ い。

上述の公知の方法に対する本発明の方法の利点は、側鎖保護を最小または不要と し、基質成分はＤ−およびし−コンフィギユレーションのいずれでもよく、保護 は必要なく、ラセミ化の危険がなく、合成工程は少なく、比較的純粋な最終生成 物が期待でき、これらの総合により著しく単純で、経済的な製造方法を与えるこ とである。

好ましい基質成分は　Ｒ１が１個から６個までの炭素原子を有する直鎖状もしく は分岐状アルキルたとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、 イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミルおよびヘキシル、またはアラールキルた とえばベンジルであるエステルである。

とくに適当な核性成分は、ＲがＨでＲ３がＨもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルである 遊ｗＩＬ−アミノ酸もしくはアミノ酸アミド、またはＲ４が１個から６個までの 炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐状のアルキルたとえば上述の基のアミノ酸 エステルである。上述のように、アルキル、アリールまたはアラールキルであっ て、不活性置換基たとえばヒドロキシまたはニトロで任意に賦換されていてもよ い。

本発明はまた、基 が含有するペプチドを中間的に形成し、ついでこの基を除去してカルボキシル１ ９２ｍを形成することを包含する方法である。この除去はペプチドの形成に使用 したのと異なるまたは同じ酵素を触媒とすることができる。

酵素はまた、側鎖保：ｉ基の切断にも使用できる。適用できる酵素は、その保護 基の性質に応じて、タンパク分解酵素、リパーゼおよびエステラーゼである（“ ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ、＾ｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ”　、　Ｖｏｌ、９．５ｐｅｃｉａｌ　Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｐｅｐ ｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｐａｒｔ　Ｃ，Ｊ、＾。

Ｇｌａａｓ、Ｅｎｚｙｓａｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｐｒｏｔ ｅｃｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐｓｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９８７、参照）。

本発明の方法は、ＣＰＤ−Ｙを用いて実ｉすることができる。これは現在のとこ ろ好ましい酵素であり、ＥＰ−８１−１７４８５号に詳細に特徴が述べられてい ダーゼ、たとえば以下の一覧表に示すＷｉ素も、これらはアシル酵素中間体を介 して共通の活性機構を有するので、本発明の方法に使用できる。

酵素　起原 菌 ベニシロカルボキシペプチダーゼ　ＰｅｒｌｉＣ７ｌｌｉｔｌｌｌＳ−１ｊａｎ ｔｈｉｒｘｌｌｕｉ＋ カルボキシペプチダーゼ　ＡＳｐｅｒＱｉｌｌｔｌＳａｉｔｏｉ −Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｙｚａｅ 植物 カルボキシペプチダーゼＣオレジンの葉オレンジの皮 カルボキシペプチダーゼＣＮ　Ｃ１ｔｒｕｓ　ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉａｙａｔ ａ ファセオリン　豆の葉 カルボキシペプチダーゼ　発芽大麦またはモルトワタの胚芽 トマト スイカ プロメリン（パイナラ プル）末 上述のカルボキシペプチダーゼ門の近縁関係についてはにｕｂｏｔａら：　Ｃａ ｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｃ，Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅａ、、　７４　ニア５７ 〜７７０　（１９７３）に記載されている。モルト、小麦および他の原料からの カルボキシペプチダーゼについてはＢｒｅｄｄａｓ　：　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　 Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｅ、、　５ユニ８３〜１２８（１９８６）に述べられている。

使用されるカルボキシペプチダーゼは化学的に修飾されたもの、または天然型の 生合成変異体であってもよい。

以下にさらに詳細に例示するように、本発明の方法はかなり単純ではあるが、反 応混合物のｐＨ（ｉはかなり一定に保持することがＩ！要である。このｐＨｆｌ ｌは５〜１０．５であるが、好ましくは７〜９．５で、また具体的な出発原料、 生成するペプチドおよび酵素によって変動する。

反応は水性反応メジウム中で実施されるが、所望により、水に混和性または非混 和性で、特定の条件下に酵素と適合性のある有機溶媒７０％までを含有させるこ とができる。好ましい溶媒は低級アルコール、ジメチルホルムアミド、ジメチル スルホキシド、ジメトキシエタン、エチレングリコールおよび酢酸エチルである 。

反応温度は室温およびそれ以上、２０〜５０℃が好ましいが、他の条件下の方が 有利な場合は０〜６０℃の範囲の温度も使用できる。

２つの反応成分の濃度は、広い限界内で変化させることができるが、多くの場合 、求核試薬成分は過剰とし、基質成分はそのオリゴメリゼーションを避けるため に全反応期間中に間隔をおいて少石ずつ加えることが多い。

使用するエステルがエチルまたはより高級な場合には驚くべきことにオリゴメリ ゼーションは起こらず、副反応を伴わないで高い基質濃度を使用することができ る。

Ａ−Ｂのホモジベ１チドを単一の出発化合物から、オリゴメリゼーションを起こ すことなく生成させるには、このエステルの加水分解により核性成分をｉｎ　５ ｉｔｔ＋で生成させる。これは場合により、さらに技術的な利点がある（第２図 参照）。

基質成分の最初の濃度は通常０．００５〜２モルであり請求核性成分は別個に添 加する場合０．００５〜３モルである。多くの場合、過剰の核性成分、および基 質成分からの加水分解生成物は回収でき、必要に応じて再エステル化して再使用 できる。両成分の循環は、その橘造が簡単で、副反応および脱保護による喪失が ないのでとくに容易である。

酵素濃度も同様に広く変動させることができるが、多くの場合、Ｎ保護アミノ酸 エステル基質を使用するときの適当なｍ度よりいくらか高く（５〜５０μｍ）す る。

しかしながら、以下の実施例に例示するように、合成の目的で必要な量は安定な 固定化酵素プレバレージョンを使用することにより１０分の１以下に低減でき、 またこれにより酵素を連続過程で使用することが可能になる。

反応メジウムには、酵素の基質への結合に影響する塩、たとえば食塩、ならびに 酸素を安定化するために存在する金スイオンの複合結合剤たとえばＥＤＴＡを含 有させることもできる。

最初に述べたＤ−およびＬ−基質間での反応速度の差は第１図に例示する。第１ 図は保護および非保護アミノ酸エステル（Ｔｙｒ−ＯＥｔ）Ｄ−およびＬ−型の ＣＰＤ−Ｙ加水分解に対する反応順序を示している。

図から明らかなように、Ｌ−ＡｃＴｙｒＯＥｔはほとんど即時に加水分解される が、Ｄ−ＡＣＴ／ｒＯＥｔでは２時間後にも有意でない加水分解（５％未満）が 起こっているにすぎない。

これに対して、非保護エステルのし−およびＤ−型の差はわずかである。

この驚くべき加水分解順序は、酵素ＣＰＤ−Ｙおよびモルトカルボキシペプチダ ーゼＩＦ　（ＣＰＤ−Ｍｆｆ）　、小麦カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ　Ａ　− Ｗ　’）を用いて本発明の方法による各種ジペプチドの製造を例示した以下の実 施例に明らかである。

１〜１５の一般的方法 反応容ｆＡｌｄの分析Ｍ模で実施した反応はｐＨスタット中で行い、選択したｐ Ｈ値はＩＮ　ＮａＯＨの自動添加によって一定に保持した０反応温度はとくに指 示のない限り室温とした６表には、反応濃度、有様溶媒含量、生成物および収率 も掲げる。反応時間は通常０．５〜５時間、酵素濃度はとくに指示のない限り通 常１０〜２０μｍである。

生成物の同定および生成物の収率の決定は、ＯｓＬトリエチルアンモニウムホス フェート、ｐＨ３，０，０〜８０％アセトニトリルを含有する適当な勾配溶出系 を流速２ｄ／分で用いる逆相ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒＳ　６０００Ａポンプ、６６ ０勾配ブレンダー、ＵＫ６インジエクター）により実施した。溶出はＵ■検出器 （Ｗａｔｅｒｓ　４８０）により、２３０ｎｓ、２５４ｎａ、２７８ｎ−または ２９０ｎ−で実施した。

生成物は、推定される生成物ピークに相当するＨＰＬＣ分析分画のアミノ酸分析 および／または化学的に合成した標品生成物とのＨＰ　Ｌ　Ｃ比較によって同定 した。標品生成物は公知の原理に従い、通常、ＢＯＣ−カルボニル−コハク酸イ ミドエステル誘導体と使用される核性成分との間の反応、ついでＮ末端アミノ駁 残基の脱保護により製造した。いずれの場合も、ジアステレオ−マーＤＬ−およ びＬＤ−ジペプチド生成物か゛らＬＬ−および００−ジペプチドを分離すること ができた。

２３０　ｎｓでしか検出できない生成物については、生成物の収率は、化学的に 合成した標品化合物の吸収／濃度曲線によって決定した。他の生成物については 、生成物または反応原料が吸収を示す波長に相当する溶出クロマトグラムのピー ク下の積分面積の比に基づいて決定した。

製造例１６〜２１の反応条件は各側に記載する０反応は上述のように分析ＨＰＬ Ｃで追跡した。相当する分析反応条件を至適化する試みはなされていない。

し 基質成分としてし一チロシンエチルエステル（５０膳Ｈ）、求核試薬としてＭｌ ｌｌ！アミノ酸によるり、Ｌ−ジペプチドのカルボキシペプチダーゼＹａ）触媒 合成求核試薬　（８；１度）　溶媒　団　生　成　物　収率％アラニン　（１， ９Ｍ）　水　９．５　ＴｙｒＡｊ！ａＯＨ１０アルギニン　（０，８Ｍ）　水　 ９，５　ＴｌｙｒＡｒＧＩＯｌ（３１システイン　（１Ｍ）　水　８．ＯＴｙｒ ＣｙｓＯＨ３０Ｄし一システィン　（２Ｍ）　水　８．０　ＴｙｒＣｙｓＯＨ（ ＬＬ）　４０ロイシン　（０，２Ｍ＞　水　８．ＯＴｙｒＬｅｕＯＨ１リジン　 （２Ｍ）　水　９．５　ＴｙｒＬｙｓＯ）−１１８メチオニン　（０，３Ｍ）　 水　８．ＯＴｙｒＭｅｔＯｔ（８メチオニン　（０，３Ｍ）　水　９．ＯＴｙｒ ＭｅｔＯＨ９３０％ メチオニン　（０，３Ｍ）　ＤＭＳＯ９，ＯＴｙｒＭｅｔＯＩ（１５１５％ メチオニン　（０，３Ｍ）　ＥｔＯＨ９，ＯＴｙｒＭｅｔＯＨ７グルタミン　（ ０，８Ｍ）　水　９．５　ＴＶｒＧｊｒｌＯＨ８ペニシラミン　（０，５Ｍ＞　 水　８．ＯＴｙｒＰｅｎＯＨ７ａ）　１０ａＭ１１ａＨＥＤＴＡ 鼠λ 求核性成分としてのし一メチオニン（０，３Ｍ）によるｐＨ９，０の水中でのり 、Ｌ−ジペプチドのカルボキシペプチダーゼＹａ）触媒合成 基質（５０１１８＞　生成物　収率％ ロイシンメチルエステル　ＬｅｕＭｅｔＯＨ３０ロイシンイソプロピルエステル 　ＬｅｕＭｅｔＯＨ３６メチオニンエチルエステルｂ）　ＭｅｔＭｅｔＯＨ２５ フエニルアラニンメチルエステル　ＰｈｅＭｅｔＯＨ１６フエニルアラニンエチ ルエステル　ＰｈｅＭｅｔＯＨ１９フエニルアラニンイソプロピルエステル　Ｐ ｈｅＭｅｔＯＨ２３セリンイソプロピルエステルｃ）　ＳｅｒＭｅｔＯＨ２１ト リプトフアンメチルエステル　ＴｒｐＭｅｔＯＨ２６チロシンベンジルエステル ”　ＴｙｒＭｅｔＯＨ１９ａ）１０ａＭ、１ｍ　ＥＤＴＡ、　ｂ）５ｍＭ。

ｃ）　反応Ｂｉｌ＞２０ａＨＩ］、　ｄ）３０％ＤＭＳＯ例３ Ｍ質成分としてＬ−チロシンニゲルエステル（５０ｍＨ）　請求核試薬としてし 一アミノ酸アミドまたはエステルを用いるり、Ｌ−ジペプチドのカルボキシペプ チダーゼＹａ）触媒合成 Ｗ　質　請求核試薬　（ｍｌ）　溶　媒　扉　生　成　物　収率％ＴＹｒＬｅＵ ＯＨ４ ＴＶｒＯＥｔ　リジンアミド　（０，３Ｍ）　水　９．５　ＴＶｒＬｙＳＮＨ２ ２０Ｔｙｒｔｙｓｏ＋　２２ ＴｙｒＯＥｔ　アルギニンアミド　＋０．２Ｍ）　水　９．ｏ　ＴｙｒＡｒｏＮ ）Ｉ２　５０ＴＶｒＯＥｔ　バリンアミド　（０，３１（）　水　９．ＯＴｙｒ ＶａｌＮ）（２７７３ｏπ ＴＶｒＯＥｔ　Ｏイシンメチルエステル　（０，２Ｈ）　ＤＭＳＯ９，ＯＴｙｒ ＬｅｕＯＨ６ａ）２０ａＭ、１ｓＨＥＤＴＡ ｂ）　反応１１１間〉２０時闇、５０％の基質が変換例４ 単一の出発化合物から、ＥＩＨ８，５の水中でのＬＬ−ホモペプチドのカルボキ シペプチダーゼＹａ）触媒合成基質　（渡度）　生成物　収率％ メチオニンメチルエステル　（０，５Ｍ）”ｃ）　ＭｅｔＭｅｔＯｌ−１１４メ チオニンエチルエステル　（０，５Ｍ）　ＭｅｔＭｅｔＯＨ１６メチオニンイソ プロピルエステル　（０，５Ｍ）　ＭｅｔＭｅｔＯＨ１４チロシンメチルエステ ル　（０，２Ｍ）　ＴｙｒＴｙｒＯＨ１チロシンエチルエステル　（０，２Ｍ） 　ＴｙｒＴｙｒＯＨ１フエニルアラニンエチルエステル　（０，２Ｍ）ｂ）ｅ） 　ＰｈｅＰｈｅｏＨ２ｆ）ｄ） ７ラニンアミド　（０，２Ｍ）　ＡｊａＡｊａＮＨ２ｂ）ａ）１０ａＭ　ＣＰＤ −Ｙ、Ｍ４　ＥＤＴＡ。

ｂ）　１１合、Ｃ）　ｆ殿、ｄ）ｒ＃９．Ｏ，ｅ）３０％　ＤＭＳＯ。

ｔ）　５０ａＭ　ＣＰＤ−Ｙ、ＩＬＬｌ１４ＥＤＴＡ鼠１ 基質としてＤ−チロシンニゲ・ルエステル（５０閣８）＃よび核試薬として遊１ ｌＩＬ−アミノ酸を用い、水中での、Ｄ、Ｌ−ジペプチドのカルボキシペプチダ ーゼＹａ）触媒合成 求核試薬　（濃度）　聞　生　成　物　収率％アルギニン　＜ＩＭ）　９．０　 ｔｙｒＡｒｏＯＨ７５システイン　（１Ｍ）　８．０　ｔｙｒｃｙｓＯＨ８６Ｌ Ｄ−システィン　（２Ｍ）　８．０　ｔｙｒｃｙｓＯＨ（ＤＬ）　４５０イシン 　（０，２Ｍ）　８．０　ｔｙｒＬｅｕＯＨ２２メチオニン　（ＩＭ＞　９．０ 　ｔ’ｙｒＭｅｔＯＨ６５ペニシラミン　（ＩＭ）ｂ）　８．０　ｔｙｒＰｅｎ ｏｌ−１２７ａ）１０ＭＭ、ｌ１ｌＨＥＤＴＡ ｂ）　反応時間〉２０時間 例６ 求核性成分としてＬ−メチオニン（０，３Ｍ）を用い、ｐＨ９，０、水中でのり 、Ｌ−ジペプチドのカルボキシペプチダーゼＹａ）触媒合成 りＩ質（５０１１４）　生成物　収率％ロイシンメチルエステル　ｊｅｕＭｅｔ ＯＨ５０ロイシンイソプロピルエステル　ｊｅｕＭｅｔＯＨ７１メチオニンエチ ルエステル　ｍｅｔＭｅｔＯ８６８フエニルアラニンエチルエステル　ｐｈｅＭ ｅｔＯＨ７１フエニルアラニンイソプロピルエステル　ｐｈｅＭｅｔＯＨ７２セ リンイソプロピルエステル　ｓｃｒＭｅｔＯＨｂ）　４６トリブトフアンエチル エステル　ｔｒｐＭｅｔＯＨ７２ａ）１５ＭＭ、１ｓｌＨＥＤＴＡ、ｂ）　反応 ｒｆ１間−５日例７ 基質成分としてＤ−チロシンまたは 請求 ミドを用い、水中でのり、Ｌ−ジペプチドアミドのカルボキシペプチダーゼＹａ ）触媒合成 基　質　求核試薬　（濃度）　−生　酸物　収率％ｔＶｒＯＥｔ　Ｏイシンアミ ド　（０，２Ｍ）　９．ＯｔＶｒＬｅＵＮＨ２８２ｔｙｒＬｅｕＯＨ２ ｔ　ｙｒＯＥ　ｔ　バリンアミド　（０，３Ｍ）　９．０　ｔｙｒＶａｊＮＨ２ ９４ｔｙｒＯＥｔ　アルギニンアミド　（０，２Ｍ）　９．０　ｔｙｒＡｒｏＮ Ｈ２８６ｐｈｅＯＥｔ　アラニンアミド　（０，８Ｍ）　９．０　ＰｈｅＡｊａ ＮＨ２ｂ）　５０８１　１５ＭＭ、１ｍ４　ＥＤＴＡ ｂ）一部重合が認められる セ１８ Ｏ−ａ＊質エステル成分な核性成分としても作用させ、ｐＨ９，０，水中でのり 、Ｄ−ホモベ１チドエステルのカルボキシペプチダーゼＹａ）触媒合成 り一基質　（濃度）　生　成　物　収率％チロシンエチルＸステＪＬｔ　（０， ０５Ｍ）　ｔＶｒｔｙｒＯＥｔ　９フエニルアラニンエチルエステル　（０，１ Ｍ）　ｐｈｅｐｈｅＯＥｔ　１０チロシンエチレングリコールエステ７Ｌ／　（ ０，０５Ｍ）　ｔｙｒｔｙｒＯＥｔＯＨ１メチオニンメチルエステル　（０，１ Ｍ）　ｍｅｔｍｅｔＯＨ３ａ）　１５ＭＭ、１ｍ＋４　ＥＤＴＡ 例９ 基質成分としてＬ−ＴＶｒＯＥｔ　（５０ｍＭ）　請求核試薬として側鎖保Ｗ！ Ｌ−アミノ酸およびアミドを用いた側鎖保護カルボキシ末端アミノ酸のり、Ｌ− ジペプチドのカルボキシペプチダーゼＹａ）触媒合成求核性試薬　（鯉）　聞　 溶　媒　生　成　物　収率％７セタミドメチル システィン（１Ｍ）８．５　水　ＴＹｒＣＹｓ　（−８Ａｃｍ）ＯＨ１゜アセタ ミドメチル システィン７ミト（０，４Ｍ）　８．５　水　Ｔｙｒ’ｃｙｓ　（−８Ａｃｍ） ＮＨ２１２ＴｙｒＣｙｓ　（−８Ａｃｍ）ＯＨ１ ”ｒｙｒＧｌｕ　（ＯｔＢｕ）ＯＨ１２１−メチル グルタミンＭ　（０，３Ｍ）　８．５　水、　ＴｙｒＧｌｕ　（ＯＭｅ）Ｏｆ− １２０γ−エチル グルタミン酸　（０，３Ｍ）　８．５　水　ＴＹｒＧ４ｕ　（ＯＥｔ）ＯＨ１８ ａ）　１０ａＭ、１１１１Ｎ　ＥＤＴＡｂ）　２５１Ｍ！！質、２０ａｍ 特表平１−５０２１５８　（９） 例１０ 基質成分としてｏ−ＴｙｒｏＥｔ　（５０ｍＭ）　請求核に薬として側鎖保ＩＬ −７ミノ！！みよびアミドを用いた側鎖保護カルボキシ末端アミノ酸のカルボキ シペプチダーゼＹａ）触媒合成 求核性試薬　（濃度）　開　溶　媒　生　成　物　収率％システィンアミド　（ ０，４Ｍ）　８．５　水　ｔｙｒｃｙｓ　＜−８Ａｃｍ）ＮＨ，、７１ｔｙｒＣ ｙｓ　（−３Ａｃｍ）ＯＨ６ ｔｙｒＧｚｕ　（ＯｔＢｕ）ＯＨ１゜ ｂ）２５１８塁質、２０μｍ 例１１ 側鎖保護基質成分（２５ａＭ）からの側鎖保護アミノ末端アミノ酸残基と核成分 としてし一メチオン（０，３Ｍ）、ｐＨ９，０，３０％ＤＭＳＯ中でのり、Ｌ− ジベブ基質　生成物　収率％ Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステル”　Ａｓｐ（ＯＢｚｊ）ＭｅｔＯＨ６５ Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル　Ｇｊｕ（ＯＢｚｊ）ＭｅｔＯＨ７０ａ） 　２０ａＭ、１ｍ　ＥＤ−ｒＡ、反応時間〉２０時時間）　３５％変換において Ｃ）　６０％変換において 堡二＋２ し−およびＤ−アミノ酸エステル基質を水中５ＱｍＨならびに核試薬としてβ− アラニンおよびβ−７ラニンアミドからのω−アミノ酸含有ジペプチドエステル およ基質　請求核試Ｎ　（ＩＬＫ）　開　生成物　収率％ｔｙｒｏＥｔ　β−ア ラニンメチルエステル　（０，２Ｍ）　８．５　ｔｙｒＢＡｊａＯＭｅ　５１ｔ ｙｒｏｔ：ｔ　β−アラニンメチルエステル　（０，５Ｈ）　８．５　ｔｙｒＢ ＡｊａＯＭｅ　７２ｐｈｅＯＥｔ　β−アラニンメチルエステル　（０，５Ｍ） 　９．ＯｐｈｅＢＡｊａＯＭｅ　８３ＰｈｅＯＥｔ　β−アラニンメチルエステ ル　（０，５Ｍ）　９．ＯＰｈｅＢＡＪ！ａＯＭｅ　ｌ５ｐｈｅＯＥｔ　β−７ ５ニン７ミ’ｔ’　（０，５Ｍ）　９．ＯｏｉｅＢＡｊａＮＨ２７０ＰｈｅＯＥ ｔ　β−７ラニンアミド　（０，５Ｍ）　９．ＯＰｈｅＢＡｊａＮＨ２３ａ）　 ２０ａＭ、１１１ＨＥＤ丁Ａ 例１３ 基質成分としてＬ−およびＤ−チロシンならびにし一フェニルアラニンのヒドロ キシアルキルエステル（５０１Ｍ）と請求核に桑として遊１１１１−−メチオニ ン（ｏ、３Ｍ）、ｌ］）１９．Ｏ，水／エチレンゲルコール中からのり。

Ｌ−およびり、Ｌ−ジペプチドのカルボキシペプチダーゼＹａ）触媒合成 基　質　％グリコール（Ｖ／Ｖ）　生　成　物　収率％’ｒｙｒｏＥｔｏＨＯＴ ｙｒＭｅｔＯＨ１０ＴｙｒＯＥｔＯＨ４０ＴｙｒＭｅｔＯＨ８ＴＶｒＯＥｔＯＨ ６０ｂ）ＴｙｒＭｅｔＯＨ５ｔｙｒＯＥｔＯＨＯｔｙｒＭｅｔＯＨ５６ＰｈｅＯ ＥｔＯＨＯＰｈｅＭｅｔＯＨ１６ａ）５ｕＭ、１１８　ＥＤＴＡ ｂ）１０ａＭ、１１８　ＥＤＴＡ 例１４ Ｄ）１８．０：＃ける水中り一基質エステルＩＩ！５０ａｌ求核成分としてＬ− アミノ酸およびアミドから、大麦および小麦のカルボキシペプチダーゼによるり 、Ｌ−ジペプチドの触媒合成 酵素　基質　請求關薬　（該）　生成物　収率％ＣＰＤ−ＭＩＤ”　ＰｈｅＯＥ ｔ　メチオニン　（０，４Ｍ）　ＰｈｅＭｅｔＯＨ１０ｃｐｏ−ｗ”　ＰｈｅＯ Ｅｔ　ｙルギニン　（０，８Ｍ）　ＰｈｅＡｒｏＯＨ８ａ）　２０ａＭ、　１ａ ＨＥＤＴＡ、　２Ｍ　ＮａＣｊｂ）１０ａＭ、　ｌｌ１８　ＥＤＴＡ 例１５ ａｌ１８．０における水中Ｄ−フェニルアラニン初期１１度５０１Ｍと請求核成 分としての１１１−アミノ酸から、大麦および小麦のカルボキシペプチダーゼ触 奴にょるり。

Ｌ−ジペプチドの合成 酵　素　基　質　請求核試薬　（１１度）　生　成　物　収率％ＣＰＤ−ＭＩ［ ”　ｐｈｅＯＥｔ　メチオニン　（０，４Ｍ）　ｐｈｅＭｅｔｏｌ−１１５ｃｐ ｏ−ｗｂ）　ｐｈｅｏＥｔ　アルギニン　（０，８Ｍ）　ｐｈｅＡｒｏＯＨ１３ ＣＰＤ−Ｗ”　ｐｈｅＯＥｔ　メチオニン　（０，４Ｍ）　ｐｈｅＭｅｔＯＨ４ ０ａ）２０ａＭ、１ｇ＋　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｊｂ）　１０ａＭ、１ｓＨＥ ＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｊ、反応時間〉２０時間、変換　５０％未満 例１６ Ｌ、Ｌ−チロシルシスティンＴｙｒＣｙＳＯＨの製造帆立羞 盪立 し−チロシンエチルエステル塩酸塩（１，５ｇ、６ミリモル）とＬ−システィン （１５，２９，１２５ミリモル）を１　ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．ＩＭ　ＫＣ ：ｊ溶″ａｉｉ。

−に溶解した。ｌ）Ｈをトリエチルアミンで８．０に調整した。カルボキシペプ チダーゼＹ溶液（１６＃ｙ／ｄ）７．５ｄを加えて反応を開始させ、反応期間中 、空温で撹拌を続番プながらトリエチルアミンを添加してｐＨを８．０に保持し た。基質の残部（１３，５９，５４ミリモル）は１．５９ずつ１時間で添加した 。０．５Ｍ間後にチロシンの沈殿が始まり、　３．５１１１ｉｆｌ後に４５℃に ２０分間加熱して反応を停止した。

生成したチロシンを濾去し、濾液を６０ｕｌＣ１８−粒子を充填したカラム（５ ，７Ｘ３０ａ＋）２本と溶出液として５０１Ｍ酢酸を用いてＲ−ＩＪ造ＨＰ　Ｌ 　Ｃ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｅｐ。

Ｌ　Ｃ／Ｓｙｓｔｅｍ　５００Ａ）により錆製した。純粋な生成物を含む分画を 集め、繰り返し無水エタノールを添加して真空中で蒸発乾固した。残留物をジエ チルエーテルと撹拌した。続いて、３．８８ｇのり、Ｌ−チロシンシスティン（ １４ミリモル、２２％）がＷ３！Ｉ１５よび乾燥によって単離された。

１亙 塩化物および酢酸塩は検出されず、生成物は両性イオンとして存在した。

酸加水分解およびＣｙＳの７クリロニトリルによる誘導体化後のアミノ酸分析の 結果は次のとおりであった。

Ｔｙｒ　（１，００） Ｃｙｓ　（１，０８＞ システィン側鎖の７クリロニトリルによる誘導体化後、シリカゲル６０−Ｆ上、 ニンヒドリン検出を用いたＴＬＣで唯一のスポットのみが検出された（ＲｆＯ１ ７３、溶出Ｆ＆：酢酸エチル、ブタノール、酢酸および水（１：１：１：１）） 。

ＨＰＬＣ−Ｉｉｌｉ度：９９．５％（ヌクレオシド　７０１８．０．１Ｍアンモ ニウムホスフェート、ｐＨ３，０／アセトニトリル、２２０ｎｌ） Ｕｖ定１：９８．５％（２９３ｎａ、０．１ＭＮａＯＨ中チロシン吸収） λ１ユ Ｌ、Ｌ−メチオニン−メチオニンＭｅ！ｔＭｅｔＱｌ−１の製造的合成 操作 Ｌ−メチオニンエチルエステルｍ酸塩（２４，６９，１１５ミリモル）とＬ−メ チオニン（２０，６９，１３８ミリモル）を、１１８　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍ　 ＫＣｊ溶液１９０ｄに溶解した。ＤＨを水酸化ナトリウム溶液で９．０にｒ１４ ！１シ、カルボキシペプチダーゼＹ溶液（２０ｑ／Ｉｄ）１４．２１ｄを加えて 反応を開始させた０反応液を室温で一夜撹拌し、このｌ：！９８−スタットによ り水酸化ナトリウム溶液を添加してｌ）Ｈを９．０に保持した６反応終了時に、 ＨＣｊ−溶液でＤＨを３．０に調整した。

沈殿したメチオニンを濾去し、濾液を例１６に記載したようにしてＲ−製造ＨＰ ＬＣで精製した。純粋な生成物を含む分画を集め、蒸発させて濃縮し、最後に凍 結乾燥した。この操作でし一メチオニルーし一メチオニン１０．６９　（３７， ８ミリモル、３３％）が無定形の粉末として得られた。

同定 塩化物は検出されず、酢酸塩１．９％（Ｗ／Ｗ）のみが定日され、生成物は大部 分両性イオンの形であった。酸加水分解後のアミノ酸分析ではメチオニンが認め られ、加水分解しないサンプルには遊離のメチオニンは存在しなかった。

１里 ＨＰＬＣによる純度：９９．８％（ヌクレオシド７Ｃ４８，０，１Ｍ７ンモニウ ムホスフエート、ｐＨ３，０／アセトニトリル、２２０ｒｖ） トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮ８Ｓ）との反応およびＵｖ−検出による定 １ｍ：９２．５％カールフィッシャーによる水含１：１．５％Ｌ、Ｌ−チロシル バリンアミドＴ　ｙｒ　Ｖ　ａ　Ｉ　Ｎ　Ｈ２の１１豊直１ 操作 Ｌ−チロシンエチルエステル塩＊ｉ　（１６，Ｏｙ、６５ミリモル）およびし− バリンアミド塩酸塩（６０ｇ、３９０ミリモル）を水１１５０ｄに溶解し、２０ ｍＨＭＤＴＡ６５１１１を加えた。　ＤＨを水酸化ナトリウム溶液で９．０に調 整し、カルボキシペプチダーゼＹ溶液（２０■／ｄ）１２Ｉｄを加えて反応を開 始した。反応液を室温で４Ｆｍｍ撹拌し、ｐＨは水酸化ナトリウム溶液を添加し て９．０に保持した。変換が完結したのち、ｐＨを１１に上昇させて反応を停止 させた。

変性解索を濾去し、反応混合物を希釈し、連続的にＤｏｗｅｘ　Ａ　６１　Ｘ　 ４カラム上陰イオン交換およびＤｏｗｅｘＡ６５０ＷＸ４カラム上陽イオン交換 を行い、それぞれ酢酸ナトリウムおよびアンモニウム塩勾配を用いて溶出して精 製し、最後に１８１塩した。生成物の分画を合し、真空下、繰り返し無水エタノ ールを添加して蒸発乾固すると、Ｌ、Ｌ−チロシルバリンアミド１１．２９　（ ４０ミリモル、６２％）が白色粉末として得られた。

同定 １．８％（Ｗ／Ｗ）の酢ｌ塩が検出された。生成物は大部分両性イオン型であっ た。

酸加水分解後のアミノ酸分析では、以下の結果が得られた。

Ｔｙｒ　（１，０１） Ｖａｌ　（０，９９） ４亘 ＨＰＬＣ−純度：９９．５％（Ｎｏｖａｐａｋ　Ｃ１ｇ、０．１Ｍアンモニウム ホスフェート含有アルキルスルホネート、ｐＨ４，５／７セトニトリル、２２０ ｒｌｌ）Ｕｖ一定＠：９７．８％（２９３ｎｇ＋、０．１ＭＮａＯＨ中チロシン 吸収） 例１９ Ｄ、Ｌ−チロシル−アルギニンＤＬ−ｔｒＡｒＯＨの製造的合成 Ｌ−アルギニン１０５９　（１０５９，６０３ミリモル）を水４００ｍに溶解し 、ｐＨを１４Ｃ１溶液で９．０に調整した。Ｄ−チロシンエチルエステル塩１［ （６，１ｇ、ｐＨを再び９．０に調整した。カルボキシペプチダーゼＹ溶液（２ ０ａｙ／ｄ）７ａ＋ｅを加えて反応を開始させ、ｐＨはＮａＯＨ溶液の添加によ って９．０に保持した。４時間後にＨＣＩ溶液でｐＨを３に調整して反応を停止 させた。

反応混合物を希釈し、Ｄｏｗｅｘ　Ａ６５０ＷＸ４カラム上、酢酸アンモニウム 塩勾配を用いて陽イオン交換により精製し、最後に１！２ｓした。生成物の分画 を集めて、蒸発させて濃縮し、最後に凍結乾燥すると、Ｄ、Ｌ−チロシル−アル ギニン６．４５ＳＦ　（１９ミリモル、７７％）が白色の粉末として得られた。

風室 酢酢塩および塩化物は検出されず、生成物は両性イオンとして存在した。

酸加水分解後のアミノ酸分析では、以下の結果が得られた。

Ａｒｏ　（１，０３） Ｔｙｒ　（０，９７） 純度 ＨＰＬＣ−純度：９９．５％（Ｎｏｖａｐａｋ　Ｃ１ｇ、０．１Ｍアンモニウム ホスフェートとアルキルスルホンＭ、ｌｌＨ４，５／アセトニトリル、２２Ｏｎ −）カールフィッシャーによる水含１ａ：３．４％例２０ 固　化カルポキシペプチ　−ゼＹを　いたＤ　−フ互三Ｌタコし≧Ａ、Ｉｆノ三 虹乙工旦−ユニ」と■ミニカルボキシペプチダーゼＹを、［３Ｉ！ｉ者の勤選す る操作に従ってＥｕｐｅｒｏｉｔ　Ｃに固定化した。固定化はリン酸塩ＩＩ衝液 中、ｐｔ１７，５において行い、残った活性ゲル基はｐ）１８．０においてエタ ノールアミンによって遮断し、ついで洗浄した。

酵素の９３％がゲルに結合し、２．５ｑタンパク質／ｄを含有した。酵素がカッ プリングしたＥｕｐｅｒｏｉｔ　Ｃは１０ｍＨＰＩＰＥＳ、１ｍＨＥＤＴＡ、０ ．　０５　％ヒ　ドロキシ安息香酸エチルエステル、１））１７．０中、４℃で 保り−フェニルアラニンエチルエステル［ｅｍ＜５．７９．２５ミリモル）およ びＬ−メチオニン（２９，８，２００ミリモル）を水４００ｍに溶解し、０．１ ＮＥＤＴＡ５ｄを加え、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．０に調整し、反応容 量を５００ｄとした、。反応混合物を絶えず撹拌し、水酸化ナトリウム溶液でＩ ）Ｈを９．０の一定に保持し、この間溶液は固定化ＣＰＤ−Ｙのカラム上に流速 ３１ｄ／分で循環させた。上述のようにして調整したＥｕｐｅｒｌＪｉｔ　Ｃ上 に同定化ＣＰＤ−Ｙを含有するカラムは２．５ＱＩＸ５．５ａ＋、容ｆｆ１２７ ｍ、計６７ηのＣＰＤ−Ｙを含有した。循環を１０時間続【すたのち、ｐＨをＨ Ｃｊ溶液で７に調整し、生成物は例１６に記載したＲ−製造ＨＰＬＣによってｌ 製した。

純粋な生成物を含む分画を合し、真空中で蒸発させ、最後に凍結乾燥すると、Ｄ 、Ｌ−フェニルアラニルメチオニン３．５９（１２ミリモル、４８％）が白色無 定形粉末として得られた。

素プレバレーシヲンの安　性 同じ酵素ゲルプレバレージョンを数口反復使用して実験を行っても、変換率に明 らかな低）はなく、相当する結果が得られた。したがって、ｉ？素は反応条件下 においてかなり安定で、さらに過程の経済性が改良された。

生成物は塩化物を含まなかったが、酢ｉ！ＰＡ７．０％（Ｗ／Ｗ）を含有し、一 部が酢酸塩型であった。

アミノ酸分析では、遊離アミノ酸は存在せず、加水分解後には以下の比が得られ た。

Ｍｅｔ　（０，９８） Ｐｈｅ　（１，０３） ナトリウムのＤ線を用い、２５℃、水中Ｃ−０，２５での旋光度は−１２８，９ ’であった。

先区生立且Ｉ ＨＰＬＣ：９９．６％（ヌクレオシド７Ｃ１８，０，１Ｍアンモニウムホスフェ ート、ｐＨ３／アセトニトリル、２２Ｏｎｇ＋） カールフィッシャーの水含ｆａ：２．８％例２１ Ｄ、Ｄ−フェニルアラニルフェニルアラニンエチルエステル塩！１１！、Ｄ、Ｄ −ｐｈｅｐｈｅＯＥｔ−ＨＣｊの艷ｌ豊皇１ １立 Ｄ−フェニルアラニンエチルエステルｔｉｉｌ！（２，５９，１１ミリモル）を 水４５ｍに溶解し、０．ＩＮＥＤＴＡｏ、５ｄを加えた。ｐＨを水酸化プトリウ ムで９．０に：Ｉ！１ｔ、、、基質は最初一部油状の懸濁液として存在した。カ ルボキシペプチダーゼＹ溶液（２０η／Ｓ！＞３．４−を加えて反応を開始し、 空温で２．５時間撹拌し、水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを９．０に保持し た。ＨＣＪ溶液でｐＨを３に調整して反応を停止させた。

反応混合物を１１１″Ａし、例１６に記載したようにＲ−製造ＨＰＬＣによって 精製した。

生成物の分画を集めて真空中で蒸発させて濃縮し、ＨＣ１溶液を加えて凍結乾燥 すると、生成物０．４９ｇ生成物は、クロリド９．２％（Ｗ／Ｗ）を含有し、酢 ｉ！塩は存在しなかった。生成物は塩酸塩として存在した。

アミノ酸分析では酸加水分解後にフェニルアラニンが認められ、酸加水分解前に はフェニルアラニンはみられなかった。

生成物は塩基でさらに加水分解され、Ｄ、Ｌ−ＰｈｅＰｈｅＯＨとはクロマトグ ラフィーで異なる生成物を与えた。この生成物自体は、使用したＨＰＬＣＭでり 、Ｌ−ＰｈｅＰｈｅＯＥｔ標品と共溶出した。

最後に、ナトリウムＤ線を用い、２５℃、酢酸中Ｃ−０，５で比旋光度を測定し たところ、−４２，７°であった。比較のため純粋なり、Ｌ−Ｐｈｅ−ＰｈｅＯ Ｅｔの標品についても同じ条件で測定したところ、＋５２．１＠の値が得られた 。この場合の矛盾は、合成したペプチドの純度が低いことによると考えられる。

ＨＰＬＣＩ［！度：８２．３％（ヌクレオシド７Ｃ１８，０，１Ｍ７ンモニウム ホスフエート、ｐＨ３／アセトニトリル、２２０ｎｌ） 検出された不純物は、基質、基質加水分解物、生成物加水分解物またはそれらの ジアステレオ−マーと一致しなかった。

カールフィッシャーによる水含１ニア、５％０　３０　６０　９０　１２０　Ｔ ＩＭＥ　（ＭＩＮ）Ｚ　Ａ　２５０ 一＾−々Ｔ−ＯＨ １、事件の表示 一一盛一一−１゜ ｐｃ士／Ｄ　Ｋ　８８１０　［１０２２２、発明の名称 ジペプチドの酵素的製造方法 ３、補正をする者 事件との間係　特許出願人 屯代理人 ５、補正命令の日付 昭和　年　月　日 昭和６３年埼月２日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 Ｈ−Ａ−Ｂ−Ｙ （式中、Ａは側鎖が保護されていてもよいＬ−もしくはＤ−α−アミノ酸または ω−アミノ酸であり、Ｂは側鎖が保護されていてもよいＡと同種もしくは異種の Ｌ−もしくはＤ−α−アミノカルボン酸、Ｌ−もしくはＤ−アミノホスホン酸ま たはし−もしくはＤ−アミノスルホン酸、または相当するω−アミノ酸、または その塩および水和物であり、ＹはＯＨまたはＣ末端保護基である）を有するジペ プチドを製造する方法において、式Ｈ−Ａ−ＯＲ１または▲数式、化学式、表等 があります▼（式中、Ａは先に定義したとおりであり、Ｒ１は水素、アルキル、 アリールもしくはアラールキルであつて不活性置換基によって置換されていても よく、またアミノ酸のα−デスーアミノフラグメントであり、Ｒ２およびＲ３は 同種または異種であつて、それぞれ水素、アルキル、アリールまたはアラールキ ルであつて不活性置換基で置換されていてもよい）を有するアミノ酸誘導体であ る基質成分を、Ａ＝Ｂの場合はｉｎｓｉｔｕで形成されてもよい、 （ａ）式 Ｈ−Ｂ−ＯＨ を有するＬ−アミノ酸、 （ｂ）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＢはＬ−アミノ酸であり、Ｒ２およびＲ３は上述の意味を有するが、Ｒ ２が水素の場合にはＲ３はヒドロキシまたはアミノであつてもよい）を有するＬ −アミノ酸アミド、 （ｃ）式 Ｈ−Ｂ−ＯＲ４ （式中、ＢはＬ−アミノ酸であり、Ｒ４はアルキル、アリールまたはアラールキ ルである）を有するＬ−アミノ酸エステル、および （ｄ）式 ＮＨ２ＣｘＨｚＰＯ３ＨまたはＮＨ２ＣｘＨｚＳＯ３Ｈ（式中、ｘは１〜６であ り、ｚは２〜１２である）を有し、酸基が保護されていてもよい直鎖状または分 岐状アミノホスホン酸またはアミノのスルホン酸から選ばれる求核成分とを、酵 母、動物、植物または他の微生物源からのセリンまたはチオールカルボキシペプ チダーゼの存在下、ＰＨ値５〜１０．５、所望により有機溶媒および／または塩 を含有する水性溶液または懸濁液中で反応させ、ついで所望により、存在する側 鎖保護基もしくは保護基Ｙの切断および／または、所望により、得られたジペプ チド誘導体の塩または水和物への変換を行うことを特徴とする製造方法。
2. （２）カルボキシペプチダーゼとして、酵母からのカルボキシペプチダーゼＹを 使用する請求の範囲第１項による製造方法。
3. （３）使用されるカルボキシペプチダーゼは、重合樹脂骨格と複数個のカツプリ ングされたべンジルスクシニル基からなるアフィニティ樹脂上アフィニテイクロ マトグラフィーによつて精製されている請求の範囲第２項による製造方法。
4. （４）使用されるカルボキシペプチダーゼは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎ ｔｈｉｎｅｌｌｕｍからのべニシロカルボキシペプチダーゼＳ−１もしくはＳ− ２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏ ｒｙｚａｅからのカルボキシペプチダーゼ、オレンジの葉もしくは皮からのカル ボキシペプチダーゼＣ、Ｃｉｔｒｕｓ　ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ　Ｈａｙａｔａ からのカルボキシペブチダーゼＣＮ、豆の葉からのフアセオリン、または発芽大 麦、モルト、ワタの胚芽、トマト、スイカもしくはブロメリン（パイナツプル） 末からのカルボキシペプチダーゼである請求の範囲第１項による製造方法。
5. （５）使用されるカルボキシペプチダーゼは、天然型の化学修飾された酵素また は生合成変異体である請求の範囲第１項から第４項までによる製造方法。
6. （６）使用されるカルボキシペプチダーゼは、固定化されている前記請求の範囲 のいずれかによる製造方法。
7. （７）有機溶媒０〜７０％を含有する水性反応溶液または反応分散液を使用する 前記請求の範囲のいずれかによる製造方法。
8. （８）有機溶媒はアルコール類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド 、ジメトキシエタン、エチレングリコールまたは酢酸エチルから選ばれる請求の 範囲第７項による製造方法。
9. （９）基質成分として、不活性置換基で置換されていてもよいベンジルエステル または直鎖状もしくは分岐状のＣ１〜Ｃ６アルキルエステルから選ばれるＤ−ま たはＬ−アミノ酸エステルを使用する前記請求の範囲のいずれかによる製造方法 。
10. （１０）求核成分として、式 Ｈ−Ｂ−ＯＨまたはＨ−Ｂ−ＮＨＲ３ （式中、Ｒ３は素またはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、ＢはＬ−アミノ酸残基であ る）を有するアミノ酸またはアミノ酸アミドアミドを使用する前記請求の範囲の いずれかによる製造方法。
11. （１１）求核成分として、式 Ｈ−Ｂ−ＯＲ４ （式中、Ｂはアミノカルボン酸残基であり、Ｒ４はＣ１〜Ｃ３アルキルである） を有するエステルを使用する請求の範囲第１項による製造方法。
12. （１２）得られたジペプチドが１個または２個以上のＣ末端保護基Ｙを包含し、 この１個または２個以上の基を酵素的に、好ましくは前の反応で使用したと同じ カルボキシベプチターゼ酵素により切断寸る前記請求の範囲のいずれかによる製 造方法。
13. （１３）得られたジペプチドが１個または２個以上の側鎖保護基を包含し、この １個または２個以上の基を酵素的に、好ましくはエステラーゼもしくはリパーゼ またはタンパク分解酵素によって切断する前記請求の範囲のいずれかによる製造 方法。